Introduction
I recenti progressi nel settore farmaceutico hanno portato ad un crescente interesse nell'utilizzo di microarray cellulari nel processo di scoperta della droga per lo screening di farmaci e analisi cytotoxicological 1,2,3. Lo sviluppo di test in vitro in high-throughput e metodi di screening utilizzando microarrays di cellule faciliterebbe lo sviluppo rapido ed efficace di farmaci candidati, così come anticipo la comprensione fondamentale della cella 1,4. L'approccio tradizionale allo screening con celle utilizza piattaforme e piastre convenzionali; tuttavia questo approccio è limitata a causa del costo elevato, produttività limitata, e la limitata capacità di informazioni quantitative sulla funzione delle cellule 1,5. A causa di queste limitazioni, la ricerca nel campo delle tecnologie di microarray cellulare è fiorente per la caratterizzazione molecolare biologica, ingegneria dei tessuti, e la droga lo screening 1,6. I vantaggi di microarrays cellulari includono l'uso campione più piccolo, effetti minimi difenotipo cellulare eterogeneità mascheratura informazioni, e soprattutto la capacità di automatizzare saggi per più applicazioni high-throughput 1,7,8.
L'industria farmaceutica utilizza attualmente high-throughput cell-based test di screening con colture monostrato di cellule 2D per lo screening di stupefacenti in pozzetti microtiter 9. Cellule multiplexing in pozzetti di piastre microtiter offre la possibilità di throughput più elevato con opzioni di sperimentazione uniche. Inoltre, le attuali tecnologie di microarray cellulari permettono alle cellule di asciugare in grado di modificare radicalmente il fenotipo delle cellule in vivo 10,11. Per superare questi problemi, la MFCA è stata progettata ed è mostrato in Figura 1. Il disegno dei fluidica MFCA 3D consente la punta della testina di stampa di figura 1 per essere abbassato in un bagno e compresso contro una superficie per formare un sigillo. La punta morbido silicone della testina di stampa si comporta come unguarnizione e forma una guarnizione reversibile. La tecnologia MFCA è in modo unico adatta per interfacciarsi con superfici sommerse, che è richiesto per entrambe le colture cellulari e sistemi fetta dei tessuti, ed è difficile o impossibile con la maggior parte degli altri approcci. Pins o stampa ink-jet non funzionano, e dispositivi microfluidici 2D non sono adatti per la deposizione o l'interfacciamento con grandi array di punti discreti. Inoltre, da miniaturizzazione e localizzare l'esperimento - il microarray cellulare - il MFCA supera i principali problemi connessi con high-throughput a base di cellule test di screening.
Il CFM utilizza le reti di canali 3D per ciclo di piccoli campioni di fluido del volume oltre riprese piatte microscopici su una superficie di 12,13. Mediante stampa con flusso, biomolecole, cellule e altri reagenti sono mantenuti in un ambiente liquido durante il processo di stampa, consentendo la stampa di biomolecole e cellule sensibili senza esposizione all'aria, che ostacola le tecniche di stampa cella corrente. E 'anche possibile stampare direttamente da materiale grezzo come ibridoma o surnatanti forniti vi è un meccanismo di cattura sulla superficie dell'array. L'obiettivo di questo manoscritto è spiegare in dettaglio la stampa sommersa di due tipi di cellule su una superficie.
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Protocol
1. Cella Cultura Preparazione
- Conservare le scorte di cellule NIH/3T3 in azoto liquido fino al momento dell'uso.
- Preparare completa supporti per cellule NIH/3T3 utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 10 mM tampone HEPES, 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina.
- Scongelare cellule per 2-3 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Risospendere le cellule in 5 ml di mezzo completo e centrifugare a 1500 xg per 3 min.
- Rimuovere il surnatante cellulare senza disturbare il pellet.
- Risospendere le cellule in 5 ml di media e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Rimuovere 10 ml di sospensione cellulare e posto in una provetta da 0,5 ml.
- Aggiungere 10 ml di Trypan Blue alla sospensione cellulare e mescolare con la punta della pipetta.
- Pipettare 10 ml di cellule colorate in una camera emocitometro.
- Contare le celle in emocitometro a 10xingrandimento.
- Contare le cellule vive (piccole palline bianche) per 4 dei 9 grandi piazze. Contare solo le cellule vive che non appaiono blu scuro dalla macchia Trypan Blue.
- Calcolare il numero medio di cellule per piazzale, causando il numero di cellule x 10 4 cellule / ml nel cellule sospensione originale.
- Alveoli ad una densità di 1 x 10 5 cellule / ml con un totale di 5 ml in ciascuna beuta T25.
- Cellule di coltura tra il 70% e l'80% di confluenza prima degli esperimenti di inizio. Aggiorna i media ogni 2-3 giorni o secondo necessità.
2. Stampa Preparazione della superficie
- Mark un rettangolo con pennarello sul fondo di una cultura trattati tessuto polistirene (TCTPS) 12 pozzetti la dimensione della testina di stampa (7 mm x 19 mm).
- Pipettare 50 microlitri di siero fetale bovino in area rettangolare e diffonderla sull'intera regione con la punta.
- Lasciare la piastra di Petriin una sterile biosicurezza cappuccio O / N per consentire al posto del siero si asciughi completamente. Queste piastre devono essere preparati non più di due giorni prima dell'uso.
3. Stampa sommerso
- Lavare la testina di stampa con acqua distillata.
- Riempire una capsula di Petri 60 mm Con acqua distillata e ancorare la testina di stampa sulla superficie.
- Fluire acqua distillata attraverso ciascuna delle linee per 2 min a 150 ml / min usando una pompa pneumatica.
- Eliminare l'acqua dalla piastra di Petri e riempirlo con acqua pulita.
- Spostare la testina di stampa su e giù in acqua 3 volte.
- Ancorare il centro della testa di stampa sul posto siero rivestite in 12 piastra ben pre-preparati.
- Prime la testina di stampa con i media completi pre-riscaldato, 300 ml per canale.
- Stampa cellule sospeso ad una concentrazione di 50.000 cellule / ml sulla superficie e 60 microlitri / min, 100 microlitri per canale.
- Posizionare la testina di stampa, a sinistra ancorata contro ilsuperficie, e il collettore in un incubatore di coltura cellulare impostato a 5% di CO 2 e 37 ° C per 2 h.
- Dopo l'incubazione 2 ore, rimuovere la testina di stampa e posizionare il coperchio sul piatto di coltura. Il momento in cui la testina di stampa rimosso è considerato il punto di tempo 0 ore.
4. Standard di coltura cellulare
- Aggiungere 1 ml di supporti preriscaldata a una piastra TCTPS 12 pozzetti siero-spotted preparato al punto 2.
- Prelevare 1 ml della sospensione cellulare residua dal passaggio 2 e pipetta in un singolo pozzetto di una 12 pozzetti TCTPS piastra. Ciò produrrà una coltura contenente 50.000 cellule nel piatto.
- Posizionare la piastra di coltura cellulare in un incubatore a 37 ° C per 2 h.
- Dopo l'incubazione 2 hr iniziare il cronometraggio; coerenza tra campioni stampati e di semina, questo è considerato il punto di tempo 0 ore.
5. Culture Visualization
- Dopo 0, 2, 24, e 48 hr cellule prese da ciascuno dei due metodi described sopra e immagine utilizzando un microscopio invertito standard.
- Colorare le cellule con ioduro di propidio, una macchia rosso fluorescente che è incorporato solo nel nucleo delle cellule morte.
- Lavare delicatamente le cellule 3 volte con 1 ml di tampone fosfato isotonico con calcio e magnesio (PBS + +) per rimuovere eventuali detriti.
- Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato PBS + + a ciascun recipiente di coltura.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di ioduro di propidio magazzino (1 mg / ml) per ogni nave cultura.
- Incubare le cellule colorate con ioduro di propidio a 37 ° C per 10 min.
- Immagine le cellule utilizzando un microscopio invertito a 10x e 40x di ingrandimento.
- Colorare le cellule con ioduro di propidio, una macchia rosso fluorescente che è incorporato solo nel nucleo delle cellule morte.
- Eliminare le celle in un contenitore a rischio biologico appropriato.
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Representative Results
Le cellule NIH/3T3 linea cellulare di fibroblasti sono stati stampati o seminate su una superficie immersa. Le cellule sono state coltivate ad una densità di 5 x 10 4 cellule per ml. Le cellule sono state seminate utilizzando tecniche di coltura cellulare tradizionali. Le cellule sono state stampate usando una grande formato, dodici flusso testina cella in cui i canali sono più grandi (~ 500 micron) che l'CFM usato per proteine e altre biomolecole. Le cellule sono state stampate o seminate su una superficie rivestita siero. Il processo di stampa è illustrato nella Figura 1.
Dopo la stampa e la semina, le cellule sono state visualizzate per valutare la densità e morfologia a punti pertinenti tempo (0, 2, 24 e 48 ore). La densità cellulare e la morfologia delle cellule in questi momenti è stata valutata utilizzando 10X e 40X ingrandimenti al microscopio. Le immagini mostrano che le cellule possiedono fenotipi quasi identici ad ogni tempo e ad ogni ingrandimento Figura 2. Sulla base di questi dati, l'effetto dila stampa era determinato a essere minima.
La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando una macchia PI. Come mostrato in Figura 3, la vitalità cellulare per la cella stampata non era significativamente differente rispetto alle cellule inseminate per ogni punto temporale. La principale differenza tra le due modalità di apposizione delle cellule alla superficie è la densità delle cellule stampati. Densità delle cellule diminuisce al punto 2 ore di tempo di oltre il 50% in entrambe le cellule semi e stampati. Ulteriore studio è garantito per determinare la causa di questa diminuzione; Tuttavia, i rapporti di densità complessiva stampati rispetto alle teste di serie rimane significativamente più alto. La densità cellulare stampato in cella a flusso è stata di circa dieci volte più densa ad ogni tempo come le cellule inseminate cellule considerando state stampate alla stessa densità di semina, ma in un'area più piccola (0,6 cm 2 zona per una cella di flusso, a 3,8 cm 2 per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti). Al punto finale di tempo le cellule sono alla stessa densità which è probabilmente dovuto alla motilità cellulare e risorse limiti di consumo.
Figura 1. (A) Immagine del CFM. (B) Schema di una cella di flusso. (C) SEM Immagine della testina di stampa che mostra le singole flowcells. (D) Schema di stampa sommerso dove banchine della testina di stampa a superficie compatibile coltura di tessuti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Immagini confrontando morfologia seminati contro cellule stampati. In (A) 3T3sono stati microfluidically stampato su BSA e valutati a 0, 2, 24, e 48 hr. In (B) 3T3 cellule sono state seminate anziché stampati. La morfologia cellulare è simile se non identico. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Confronto della densità cellulare e la vitalità delle cellule e tra la stampa semina delle cellule in vari momenti tra cui 0, 2, 24, e 48 ore. In (A) è stata valutata la densità cellulare in cellule per mm 2. In (B) la vitalità delle cellule è stato determinato. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figuri.
Figura 4. 10x ingrandimenti delle quattro celle di flusso del microarray cella di microspotter flusso continuo in cui le cellule sono state NIH/3T3 scorreva attraverso. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La tecnologia di stampa 3D microfluidica qui descritta è l'unica in grado di stampa microfluidically array di celle in un liquido riempito bene, cioè una superficie sommersa. Stampando sulle superfici sommerse, microarray di cellule possono essere prodotti che mantengono il fenotipo cellulare fisiologicamente rilevanti di cellule così come la capacità di multiplex cellule sul fondo di un singolo pozzetto Figura 4. I risultati di questo studio mostrano che microfluidically stampa cellule risultati in l'adesione delle cellule con morfologia cellulare comparabili e vitalità; tuttavia, le cellule possono essere stampate più densamente attaccati in una posizione definita quindi tempi complessivi di studio più brevi. Tempi di studio più brevi potrebbero portare a significativi risparmi sui costi per farmaci ad alto rendimento di screening 14.
Microfluidics è stata precedentemente utilizzata per microarray cellulari e screening di farmaci high-throughput. Decine di studi hanno descritto come il flusso saggi basaeliminare i problemi di flusso statici; Sfortunatamente, questi studi utilizzano microfluidica 2D (da non confondere con le culture di tessuti 2D e 3D), che limita la densità, multiplexing e l'integrazione microscopio per le analisi altamente paralleli 15-19. Microfluidica digitali e microfluidica basata gocciolina, sono stati proposti per questi tipi di applicazioni e possono operare in altamente parallelo, configurazioni multiplex 15,17,18, ma si sono limitati a gruppi di cellule singole o piccole e perdere tutti e 3-D, multi- struttura del tessuto tipo di cellula durante la preparazione del campione. Elevato throughput citometria a flusso è stato utilizzato per lo screening cellulare rapida; Tuttavia, il flusso richiede citometria cellule a rimanere in sospensione, che non è ideale per lo screening di linee cellulari aderenti che, in vivo, sono legati alla matrice extracellulare 20. Co-colture soffrono anche per la mancanza di una vera rappresentazione del tessuto 19. Al contrario, la tecnologia 3D MFCA permette de completamente automatizzatoposizione delle biomolecole e la consegna di reagente a macchie cellulari o fette di tessuto intatti in una matrice densamente. Il sistema proposto non solo sarebbe in grado di generare matrici, ma potrebbe farlo in un ambiente "fluire", che consente per gli studi di sollecitazioni di taglio, consegna di diversi composti, e le condizioni di crescita di queste matrici e porterà alla droga più predittivi in vitro strumenti di screening. Una varietà di applicazioni può essere immaginato che consente l'innovazione continuare all'infinito. Tale strumento consente la scoperta di farmaci cellulare romanzo e saggi cytotoxicological in una moltitudine di campi di ricerca critiche come cancro, diabete, infiammazioni, infezioni e malattie cardiovascolari.
Mentre il MFCA è il metodo preferito per distribuire celle a una superficie immersa, la sfida rimane per fissare la cella alla superficie, in particolare per linee cellulari non aderenti. Direzioni future di questa tecnologia si concentreranno sui metodi per il fissaggio delle cellule perla superficie. Tecniche per patterning cellulare su superfici artificiali attualmente esistenti e comprendono: stampa a getto d'inchiostro, microestrusione o filamento tracciato, ibridazione del DNA, e laser trasferimento avanti 21. Di queste tecniche, l'attaccamento di cellule utilizzando la tecnologia di ibridazione DNA possiede diverse caratteristiche uniche e importanti. In primo luogo, il sistema di attacco delle cellule non dipende recettori posseduti da singole cellule così sia cellule aderenti e non aderenti sono in grado di essere modellato utilizzando questo metodo 22. Successivamente, il metodo patterning cellulare DNA consente la generazione di matrici cellulari complesse comprendenti molti tipi cellulari mediante l'uso di più legati alla superficie sequenze di DNA 23. Le future applicazioni o direzioni si concentreranno sull'uso di tecnologie di ibridazione del DNA per l'adesione delle cellule 19,24
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Disclosures
Gli autori sono dipendenti e gli azionisti di Wasatch Microfluidics che produce reagenti e / o strumenti utilizzati in questo manoscritto.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Chris Morrow per l'assistenza tecnica. Il finanziamento è stato fornito dal NIH SBIR (R43) concedere 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous flow microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | Base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | Cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | Cell media additive |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | Cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | Stain cell sfor counting |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | Cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | Rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | Used to remove cells from surface |
References
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