Introduction
Nylige fremskritt innen den farmasøytiske industrien har ført til økt interesse for å bruke mobilnettet mikromatriser i drug discovery prosessen for narkotika screening og cytotoxicological analyse 1,2,3. Utviklingen av in vitro-high-throughput screening-analyser og fremgangsmåter som benytter celle mikromatriser vil lette rask og kostnadseffektive utviklingen av medikamentkandidater, så vel som på forhånd den grunnleggende forståelse av cellen 1,4. Den tradisjonelle tilnærmingen til screening med celler bruker konvensjonelle vel-plate plattformer; Men denne fremgangsmåten er begrenset på grunn av de høye kostnader, begrenset gjennomstrømning, og begrenset evne for kvantitativ informasjon om cellefunksjon 1,5. På grunn av disse begrensningene, er forskning i cellulær mikromatriseteknologi spirende for molekylær biologisk karakterisering, tissue engineering, og narkotika screening 1,6. Fordelene med cellulære mikromatriser omfatter mindre utvalg bruk, minimale effektercellulær fenotype heterogenitet maskeringsinformasjon, og viktigst muligheten til å automat analyser for mer høy gjennomstrømning 1,7,8.
Den farmasøytiske industrien i dag benytter high-throughput cellebasert screening-analyser med 2D-celle ettlagskulturer for narkotika screening i mikrptiterbrønn plater ni. Multiplexing celler i brønner av mikrotiterplater gir potensial for høyere gjennomstrømning med unike eksperimentering alternativer. Videre er de nåværende teknologier for cellulære mikromatriser tillate cellene å tørke noe som dramatisk kan endre fenotypen av cellene fra in vivo 10,11. For å overvinne disse problemer ble MFCA konstruert og er vist i figur 1.. Utformingen av MFCA 3D lufthåndtering muliggjør hodet spissen i figur 1 for å bli senket ned i et bad og komprimeres mot en overflate for å danne en tetning. Den myke silikonspissen av skrivehodet oppfører seg som enpakning og danner en reversibel tetning. Den MFCA teknologien er unikt tilpasset grensesnitt med neddykkede flater, som er nødvendig for både cellekulturer og vev slice systemer, og er vanskelig eller umulig med de fleste andre tilnærminger. Pins eller blekk jet utskrift vil ikke fungere, og 2D microfluidic enheter er ikke egnet for deponering eller grensesnitt med store matriser av diskrete flekker. Videre, ved miniaturizing og lokalisering av forsøket - det cellulære mikromatrise - den MFCA overvinner de hovedproblemer forbundet med high-throughput screening-celle-baserte analyser.
CFM bruker 3D-kanal nettverk for å sykle små volum væskeprøver enn mikroskopiske stikk steder på en flate 12,13. Ved å skrive ut med strømning, blir biomolekyler, celler og andre reagenser som opprettholdes i et flytende miljø i hele trykkeprosessen, slik at trykkingen av følsomme biomolekyler og celler uten eksponering for luft, noe som hindrer den aktuelle celle trykkteknikk. Det er også mulig å ut direkte fra råmaterialet slik som hybridom-supernatanter, eller forutsatt at det er en utløsermekanisme på matriseoverflaten. Formålet med dette manuskriptet er å forklare i detalj en neddykket trykking av to celletyper på en overflate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Cell Culture Forberedelse
- Oppbevar NIH/3T3 celle aksjer i flytende nitrogen til den er klar til bruk.
- Klargjør fullstendig media for NIH/3T3 celler ved hjelp av Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, 10 mM HEPES-buffer, 50 enheter / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin.
- Tin-celler i 2-3 min i et ryste-vannbad ved 37 ° C.
- Resuspender celler i 5 ml av komplette medier og sentrifuger ved 1500 xg i 3 min.
- Fjern celle supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Suspender cellene i 5 ml av media og telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Fjern 10 ul av cellesuspensjonen, og plasser i et 0,5 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett 10 pl av Trypan blå til cellesuspensjonen og røres med spissen av pipetten.
- Pipetter 10 ul av de fargede celler i et hemocytometer kammer.
- Telle celler i hemocytometer på 10xforstørrelse.
- Tell levende celler (små, hvite baller) for fire av de ni store firkanter. Bare telle de levende celler som ikke vises mørkeblå fra Trypan blå flekken.
- Beregn det gjennomsnittlige antall celler pr store plassen, noe som resulterer i antall celler x 10 4 celler / ml i den opprinnelige celler suspensjon.
- Seed celler ved en tetthet på 1 x 10 5 celler / ml med totalt 5 ml i hvert T25 kolbe.
- Kultur celler til mellom 70% og 80% confluency før begynnelsen eksperimenter. Oppdater media hver 2-3 dager eller etter behov.
2. Utskrift Overflatebehandling
- Mark et rektangel med markør på bunnen av en vev-kultur-behandlet polystyren (TCTPS) 12 brønners plate størrelsen på skrivehodet (7 mm x 19 mm).
- Pipetter 50 ul av føtalt bovint serum i det rektangulære området, og spre den over hele området med spissen.
- La petriskåleni en steril biosikkerhet hette O / N slik at serum sted å tørke helt. Disse plater må være forberedt på ikke mer enn 2 dager før bruk.
Tre. Submerged Utskrift
- Skyll skrivehodet ut med destillert vann.
- Fyll en 60 mm petriskål med destillert vann og forankre skrivehodet på overflaten.
- Strømnings destillert vann gjennom hver av linjene i 2 min ved 150 mL / min ved hjelp av en pneumatisk pumpe.
- Kast vannet fra petriskål, og fyll den med rent vann.
- Flytt skrivehodet opp og ned i vannet tre ganger.
- Dokk skrivehodet sentrum over serum-belagt plass i den pre-forberedt 12 bra plate.
- Prime skrivehodet med forvarmet komplett media, 300 mL per kanal.
- Trykk suspendert celler ved en konsentrasjon på 50.000 celler / ml på overflaten og 60 mL / min, 100 ul per kanal.
- Plasser skrivehodet, forlot kai motoverflaten, og manifolden i et cellekulturinkubator innstilt på 5% CO2 og 37 ° C i 2 timer.
- Etter to timers inkubasjon fjerne skrivehodet og legg på lokket kulturen fatet. Tidspunktet det skrivehodet fjernet regnes 0 hr tidspunkt.
4. Standard Cell Culture
- Tilsett 1 ml av forvarmet media til en av serum-spotted TCTPS 12-brønns plate fremstilt i trinn 2..
- Ta 1 ml av den gjenværende cellesuspensjonen fra trinn 2 og pipette inn i en enkelt brønn av en 12-brønns plate TCTPS. Dette vil gi en kultur som inneholder 50 000 celler i fatet.
- Plasser cellekulturplate i en inkubator ved 37 ° C i 2 timer.
- Etter to timers inkubasjon begynne timing; for konsistens mellom trykte og seeding prøver, regnes dette som den 0 hr tidspunkt.
5. Kultur Visualisering
- Etter 0, 2, 24 og 48 timers take-celler fra hver av de to metoder described ovenfor og bilde ved hjelp av en standard invertert mikroskop.
- Beis cellene ved hjelp av propidium-jodid, et rødt fluorescerende flekk som bare er innarbeidet i kjernen av døde celler.
- Forsiktig skylle cellene 3 ganger med 1 ml fosfatbufret saltvann med kalsium og magnesium (PBS + +) for å fjerne eventuelle rester.
- Tilsett 1 ml av forvarmet PBS + + til hver kulturbeholderen.
- Legg 1 mL av propidium-jodid-stamoppløsning (1 mg / ml) til hver kulturbeholderen.
- Inkuber cellene farget med propidium-jodid ved 37 ° C i 10 min.
- Bilde cellene ved hjelp av en invertert mikroskop på 10x og 40x forstørrelse.
- Beis cellene ved hjelp av propidium-jodid, et rødt fluorescerende flekk som bare er innarbeidet i kjernen av døde celler.
- Kast cellene i en passende biologisk beholder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fibroblast cellelinje NIH/3T3 celler ble trykt eller sådd ut på en neddykket overflate. Cellene ble dyrket til en densitet på 5 x 10 4 celler pr ml. Celler ble sådd ved hjelp av tradisjonelle cellekulturteknikker. Celler ble skrevet ut på en stor-format, tolv-flow celle skrivehode hvor kanalene er større (~ 500 mikrometer) enn CFM brukes til proteiner og andre biomolekyler. Cellene ble sådd ut på trykket eller et serum belagt overflate. Trykkeprosessen er vist i figur 1..
Etter trykking og såing, ble cellene visualisert for å vurdere densitet og morfologi på relevante tidspunkter (0, 2, 24 og 48 timer). Den celletetthet og morfologien til cellene på disse tidspunkter ble målt ved bruk av 10X og 40X forstørrelse mikroskopisk. Bildene viser at cellene har nesten identiske fenotyper ved hvert tidspunkt, og at hvert forstørrelse Figur 2. Basert på disse figurer, effekten avutskrift var fast bestemt på å være minimal.
Cellen levedyktighet ble vurdert ved hjelp av en PI flekken. Som vist i figur 3, blir cellelevedyktigheten for den trykte cellen var ikke signifikant forskjellig enn de tilsådde celler for hvert tidspunkt. Den store forskjell mellom de to fremgangsmåter for å feste cellene til overflaten er tettheten av cellene som skrives. Celletettheten avtar ved 2 timers tidspunkt med over 50% i begge seeded og trykte celler. Videre studier er garantert å finne årsaken til denne nedgangen; imidlertid generelle skrives tetthetsforhold i forhold til foret forblir vesentlig høyere. Den trykte celletetthet i Flowcell var omtrent ti ganger så tett ved hvert tidspunkt som seeded celler vurderer celler ble trykt på det samme tetthet som såing, men på et mindre område (0,6 cm2 område for en strømningscelle, 3,8 cm 2 for en brønn av en 24-brønns plate). På den siste tidspunkt cellene er ved samme tetthet wjør skyldes sannsynligvis cellemotilitet og ressursforbruk begrensninger.
Figur 1. (A) Bilde av CFM. (B) Skjematisk fremstilling av en flyt celle. (C) SEM Bilde av skrivehodet som viser individuelle flowcells. (D) Skjematisk av neddykket utskrift der skrivehode dokker til vev kultur kompatibel overflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Images sammenligne morfologi utsådd versus trykte celler. In (A) 3T3-cellerble microfluidically trykt på BSA og vurdert på 0, 2, 24 og 48 timer. I (B) 3T3-celler ble utsådd i stedet for trykket. Den cellemorfologi er lik om ikke identisk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3. Sammenligning av celletetthet og levedyktighet mellom celle trykking og celle seeding ved forskjellige tidspunkter, inkludert 0, 2, 24 og 48 timer. In (A) celletettheten i celler per mm 2, ble målt. I (B) levedyktighet av cellene ble bestemt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette Figure.
Figur 4. 10x forstørrelse bilde av fire flyt celler i cellemicroarray kontinuerlig flyt microspotter der NIH/3T3 celler ble strømmet gjennom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D microfluidic utskriftsteknologi beskrevet her er unikt i stand til microfluidically utskrift matriser av celler i en væske fylt godt, dvs. en neddykket overflaten. Ved å skrive ut på neddykkede overflater, kan celle mikromatriser fremstilles som opprettholder det fysiologisk relevante cellulære fenotype av celler, så vel som evne til å multiplekse celler i bunnen av en enkelt brønn Figur 4. Resultatene av denne studien viser at microfluidically utskrift celler resulterer i celle vedlegg med sammenlign cellemorfologi og levedyktighet; Men, kan de trykte cellene bli mer tett festet i et definert sted som resulterer i kortere totale studie ganger. Kortere studie ganger kan føre til betydelige kostnadsbesparelser for høy gjennomstrømming narkotika screening 14.
Microfluidics har tidligere vært brukt i mobilnettet mikromatriser og høy gjennomstrømming narkotika screening. Dusinvis av studier har beskrevet hvordan flyten baserte analysereliminere statisk flow problemer; dessverre, disse studiene bruker 2D MicroFluidics (må ikke forveksles med 2D og 3D vevskulturer), som begrenser tettheten, multipleksing, og mikroskop integrering for svært parallelle analyser 15 - 19. Digitale MicroFluidics og dråpebaserte MicroFluidics har vært foreslått for disse typer applikasjoner og kan operere i svært parallell, multipleksede konfigurasjoner 15,17,18, men de er begrenset til én eller små cellegrupper og miste alle 3-D, multi- celletype vev struktur under tillagingen. Høy gjennomstrømming flowcytometri har blitt utnyttet for hurtig batteri screening; imidlertid strømningscytometri krever celler til å forbli i suspensjon, som ikke er ideelt for screening adherente cellelinjer som, in vivo, blir tjoret til ekstracellulær matriks 20. Co-kulturer også lider av mangel på ekte vev representasjon 19. I kontrast, 3D MFCA teknologien muliggjør helautomatisk destilling av biomolekyler og levering av reagens til celle flekker eller intakte vev skiver i en tettpakket array. Det foreslåtte systemet vil ikke bare være i stand til å generere matriser, men vil gjøre det i en "flyter" miljø som gir mulighet for studier av skjærspenninger, levering av ulike forbindelser, og vekstvilkår på disse arrays og vil føre til mer forutsigbar in vitro narkotika screening verktøy. En rekke programmer kan være så for seg slik at innovasjon for å fortsette på ubestemt tid. Et slikt verktøy kan roman cellular medisiner og cytotoxicological analyser i en rekke kritiske forskningsfelt som kreft, diabetes, betennelser, infeksjoner, og hjerte-og karsykdommer.
Mens MFCA er den foretrukne metode for å levere celler til en neddykket flate, forblir det en utfordring å feste cellen til overflaten, spesielt for ikke-adherente cellelinjer. Fremtidige retninger for denne teknologien vil fokusere på metoder for celle vedlegg foroverflaten. Teknikker for celle mønster på kunstige overflater i dag finnes, og inkluderer: blekkutskrifter, microextrusion eller filament plotting, DNA hybridisering, og laser fremover transfer 21. Av disse teknikkene, festingen av celler ved hjelp av DNA-hybridisering teknologien innehar flere unike og viktige funksjoner. For det første er metoden for cellefesting ikke avhengig av reseptorer som er besatt av de enkelte celler slik at både adherente og ikke-adherente celler er i stand til å bli mønstret ved hjelp av denne metode 22. Deretter lar DNA cellulære mønster fremgangsmåte for generering av komplekse cellulære matriser som omfatter mange celletyper ved bruk av flere flatebundne DNA-sekvenser 23. Fremtidige søknader eller retninger vil fokusere på å bruke DNA hybridisering teknologi for cellebinding 19,24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er ansatt og aksjonærer i Wasatch Microfluidics som produserer reagenser og / eller instrumenter som brukes i dette manuskriptet.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Chris Morrow for teknisk assistanse. Finansieringen ble gitt av NIH SBIR (R43) gir 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous flow microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | Base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | Cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | Cell media additive |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | Cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | Stain cell sfor counting |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | Cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | Rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | Used to remove cells from surface |
References
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. , Springer. (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
