Introduction
Ilaç endüstrisinde son gelişmeler, ilaç tarama ve cytotoxicological analiz 1,2,3 için ilaç keşfi sürecinde hücresel mikrodiziler kullanarak artan ilgi yol açmıştır. Hücre mikrodizileri kullanılarak in vitro yüksek verimli tarama deneyleri ve yöntemlerinin geliştirilmesi, hızlı ve düşük maliyetli bir ilaç adaylarının gelişimi hem de önceden hücrenin 1,4 temel anlayışı kolaylaştıracaktır. Hücreleri ile tarama için geleneksel yaklaşım, geleneksel iyi-plaka platformları kullanır; Ancak bu yaklaşım nedeniyle yüksek maliyet, sınırlı verim ve hücre fonksiyonu 1,5 nicel bilgi için sınırlı yeteneği sınırlıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, hücresel mikroarray teknolojileri araştırma moleküler biyolojik karakterizasyonu, doku mühendisliği ve ilaç tarama 1,6 için gelişen edilir. Hücresel microarrays avantajları küçük bir örnek kullanımı, minimal etkilerini içerirhücresel fenotip heterojenite bilgi maskeleme ve daha yüksek hacimli uygulamalar 1,7,8 için tahliller otomatikleştirmek için en önemlisi yetenek.
Farmasötik sanayi şu anda mikrotiter yuvalı plakalar 9 ilaç taraması için 2B hücre tek-tabakalı kültürler ile yüksek yayılmalı hücre bazlı bir tarama tahlilleri kullanır. Mikrotitre plakalara çoğullama hücreleri özgün deney seçenekleri ile daha yüksek verim için potansiyel sunmaktadır. Bundan başka, hücre mikrodizilerinde mevcut teknolojiler, hücreler, in vivo önemli ölçüde 10,11 gelen hücrelerin fenotipinin değiştirebilir ki kurumaya bırakın. Bu sorunların üstesinden gelmek için, MFCA tasarlanmış ve Şekil 1 'de gösterilmiştir. MFCA 3D akışkansal tasarımı bir banyoya daldırılır ve bir yalıtım oluşturmak için bir yüzeye karşı sıkıştırılmak üzere, Şekil 1' deki baskı kafası ucu sağlar. Kafasının yumuşak silikon ucu gibi davranırConta ve geri dönüşümlü bir mühür oluşturur. MFCA teknolojisi, özellikle, hücre kültürleri, doku dilim sistemler için gerekli olan batık yüzeyleri ile arabirim oluşturmak için uygun, ve diğer yaklaşımlar ile zor veya imkansız olur. Pimleri veya mürekkep püskürtmeli baskı çalışmaz, ve 2D mikroakışkan cihazlar birikimi veya ayrık noktalar büyük diziler ile arabirim için uygun değildir. Bundan başka, deney minyatürleştirme ve lokalize ile - hücresel mikro-dizi - MFCA, yüksek yayılmalı hücre bazlı tarama deneyleri ile ilgili önemli problemlerin üstesinden gelmektedir.
CFM bir yüzey 12,13 mikroskobik nokta yerlerine bisikletle küçük hacimli sıvı örneklerinin 3D kanal ağlarını kullanır. Akış ile baskı ile, biyomoleküller, hücreler ve diğer reaktifler, mevcut hücre baskı teknikleri engellemektedir hava, maruz kalmadan hassas biyomoleküllerin ve hücrelerin baskı sağlayan, baskı işlemi boyunca sıvı bir ortamda muhafaza edilir. Bu dizi yüzeyde bir yakalama mekanizması vardır örneğin, hibridoma süpernatanları ya da sağlanan gibi ham malzeme doğrudan baskı için de mümkündür. Bu yazının amacı, bir yüzey üzerine ayrıntılı olarak, iki hücre tiplerinin batık baskı açıklamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kültür HAZIRLIĞI Hücre
- Kullanıma hazır olana kadar sıvı azot içinde NIH/3T3 hücre stokları saklayın.
- 50 ug / ml streptomisin,% 10 fetal sığır serumu, 10 mM HEPES tampon maddesi, 50 birim / ml penisilin, ve ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanılarak NIH/3T3 hücreleri için tam ortam hazırlayın.
- 37 ° C 'de çalkalayıcı bir su banyosu içinde 2-3 dakika için hücreler Çözülme
- 3 dakika boyunca 1,500 x g de tam ortam ve santrifüj içinde 5 ml içinde süspanse hücreler.
- Hücre topaklarını bozmadan hücre süpernatantı.
- Medya 5 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu ve yerine 10 ul çıkarın.
- Hücre süspansiyonuna Trypan Blue 10 ul ilave edin ve pipet ucu ile karıştırın.
- Pipet bir hemositometre odasına boyanmış hücrelerin 10 ul.
- 10x hemositometrede hücreleri saymakbüyütme.
- 9 büyük kareler 4 için canlı hücreleri (küçük, beyaz top) saymak. Sadece Tripan Mavi leke koyu mavi görünmüyor canlı hücreleri saymak.
- Hücreler orijinal hücre süspansiyon içinde 4 x 10 hücre / ml sayısının sonuçlanan büyük kare başına hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın.
- 1 x10 her bir T25 şişesi içinde, 5 ml toplam 5 hücre / ml bir yoğunlukta tohum hücreleri.
- Başlamadan deneylerden önce,% 70 ve% 80 confluency arasına Kültür hücreleri. Gerektiğinde her 2-3 gün medya Yenile ya.
2.. Baskı Yüzey Hazırlama
- Mark, bir doku kültürü ile muamele edilmiş polistiren (TCTPS) 12 çukurlu levha altındaki işaretleyici ile bir dikdörtgen baskı kafası (19 mm x 7 mm) boyutudur.
- Pipet 50 dikdörtgen alanı içine fetal sığır serumu ul ve ucu ile tüm bölge üzerine yayıldı.
- Petri kabı bırakınSteril bir biyogüvenlik kaput O / N serum nokta tamamen kuruması için. Bu plakalar kullanmak için en fazla 2 gün önce hazırlanmalıdır.
3.. Batık Baskı
- Distile su ile baskı kafasını durulayın.
- Damıtılmış su ile bir 60 mm Petri kabı doldurmak ve yüzey üzerine baskı kafası rıhtım.
- Pnömatik bir pompa kullanılarak 150 ul / dakika ile 2 dakika boyunca çizgilerin her birinden damıtılmış su akış.
- Petri kabı suyu atmak ve temiz su ile doldurun.
- Su yukarı ve aşağı 3 kez baskı kafasını hareket ettirin.
- Önceden hazırlanmış 12 oyuklu bir plaka içerisinde serum kaplı nokta üzerinde baskı kafası merkezi olarak yerleştirir.
- Başbakan önceden ısıtılmış eksiksiz bir medya, kanal başına 300 ul ile baskı kafası.
- Baskı, bir yüzey üzerine 50,000 hücre / ml 'lik konsantrasyon ile 60 ul / dk, kanal başına 100 ul süspansiyon hücreleri.
- Karşı demirledi sol baskı kafasını, yerleştirinyüzey ve bir hücre kültürü inkübatöründe manifold 2 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C olarak ayarlanır.
- 2 saat inkübasyondan sonra, baskı kafası çıkarın ve kültür çanağı üzerindeki kapağı yerleştirin. Yazıcı kafası kaldırıldı hangi süre 0 saat zaman noktası olarak kabul edilir.
4. Standard Hücre Kültürü
- Aşama 2'de hazırlanan serum benekli TCTPS 12 oyuklu plaka birine önceden ısıtılmış ortam 1 ml ilave edilir.
- Bir 12-yuvalı plaka TCTPS tek bir kuyuya pipetle adım 2 ve geri kalan hücre süspansiyonu 1 ml al. Bu tabak içinde 50,000 hücre ihtiva eden bir kültür üretecektir.
- 2 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatör içinde, hücre kültürü plakası yerleştirin.
- 2 saat kuluçka zamanlaması başladıktan sonra; baskılı ve tohum örnekleri arasındaki tutarlılık için, bu 0 hr zaman noktası olarak kabul edilir.
5. Kültür Görselleştirme
- 0, 2, 24, ve iki yöntemlerin her biri 48 saat sonra, germe hücre dStandart bir ters mikroskop kullanılarak, yukarıda ve görüntü TANIMLANMIŞ.
- Propidyum iyodür, sadece ölü hücre çekirdeği içine dahil edilen kırmızı bir floresan boya kullanarak hücreleri Leke.
- Yavaşça kalsiyum ve pislikleri kaldırmak magnezyum (PBS + +) ile fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml ile hücreler 3 kez yıkayın.
- Her bir kültür teknesine, önceden ısıtılmış PBS + + 1 ml ilave edilir.
- Her bir kültür teknesine propidyum iyodür stok çözeltisi (1 mg / ml) 1 ul ekle.
- 10 dakika boyunca 37 ° C 'de propidyum iyodürle boyanan hücreleri inkübe edin.
- Görüntü ters bir 10x ve 40x büyütme mikroskop kullanarak hücreleri.
- Propidyum iyodür, sadece ölü hücre çekirdeği içine dahil edilen kırmızı bir floresan boya kullanarak hücreleri Leke.
- Uygun bir biohazard konteyner hücreleri atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fibroblast hücre hattı NIH/3T3 hücreler, bir dalgıç yüzey üzerine basılı veya ekilmiştir. Hücreler, ml başına 5 x 10 4 hücre yoğunluğuna kadar büyütülmüştür. Hücreler, geleneksel hücre kültürü teknikleri kullanılarak ekilmiştir. Hücreler, geniş ebatlı, kanal proteinleri ve diğer biyomoleküllerin için kullanılan daha CFM (~ 500 um) daha büyük olan on iki akış hücresi baskı kafası kullanılarak basıldı. Hücreler serum kaplı yüzey üzerine basılı veya ekilmiştir. Baskı işlemi Şekil 1 de gösterilmiştir.
Baskı ve Tohumlamadan sonra, hücreler, uygun zaman noktalarında (0, 2, 24 ve 48 saat) de yoğunluğu ve şekil değerlendirmek için görselleştirilmiştir. Bu zaman noktalarında, hücre yoğunluğu ve hücre morfolojisi 10X ve 40X büyütme mikroskopik kullanılarak değerlendirildi. Görüntüler hücreler, her bir zaman noktasında her bir büyütme ve Şekil 2 ile hemen hemen aynı fenotipleri sahip olduğunu göstermektedir. Bu rakamlar, etkisi dayanarakBaskı az olduğu tespit edilmiştir.
Hücre canlılığı, bir PI leke kullanılarak değerlendirildi. Şekil 3'te gösterildiği gibi, baskılı hücre için hücre canlılığı, her bir zaman noktası için tohumlanmış hücrelere göre önemli ölçüde farklı değildi. Yüzeye hücreleri bağlama iki yöntem arasındaki en önemli fark basılı hücrelerin yoğunluğudur. Hücre yoğunluğu numaralı seribaşı ve baskılı hücrelerinde hem de% 50 oranında 2 saat zaman noktasında azalır. Daha fazla çalışma bu düşüşün nedenini belirlemek için garanti edilir; Ancak, genel olarak basılı yoğunluk oranları DİKİMLERDE kıyasla anlamlı olarak daha yüksek kalır. Akış hücresi içindeki baskılı hücre yoğunluğu dikkate hücreleri tohumlama ile aynı yoğunlukta basıldı tohumlanmış hücreleri gibi her bir zaman noktasında yaklaşık olarak on kat daha yoğun ama daha küçük bir alana (bir akış hücre için 0.6 cm 2 bölge, 3.8 cm 2 Bir 24-yuvalı plaka içinde bir kuyu için). Son zaman noktasında hücreler w aynı yoğunlukta olanhich nedeniyle hücre motilitesi ve kaynak tüketimi sınırlamaları muhtemeldir.
CFM Şekil 1. (A) Resim. (B) bir akış hücresi şematik. (C) bireysel flowcells gösteren kafasının SEM görüntüsü. (D) doku kültürü uyumlu yüzeyine kafası rıhtım. Batık baskı şematik tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Basılı hücrelerine karşın tohumlandı morfolojisini karşılaştırılması Şekil 2.. Görüntü. (A) 3T3 hücreleri, Inmicrofluidically BSA üzerine basılmış ve 0, 2, 24 ve 48 saat sonunda ölçüldü. (B) 'de 3T3 hücreleri tohumlanır yerine basıldı. Hücre morfolojisi aynı olmasa bile benzer. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
0, 2, 24, ve 48 saat dahil olmak üzere çeşitli zaman noktalarında baskı hücre ve hücre tohumlama arasında hücre yoğunluğu ve viyabilitede Şekil 3.. Karşılaştırması., (A) olarak 2 mm başına hücrelerinde hücre yoğunluk değerlendirildi. (B) hücrelerin canlılığı tespit edildi. bu figu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızyeniden.
Şekil 4. NIH/3T3 hücreleri akardı edildiği hücre mikrotertip sürekli akış microspotter dört akış hücrelerinin 10x büyütme görüntü. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan 3D mikroakışkan baskı teknolojisi, iyi doldurulmuş bir sıvının içine hücre microfluidically baskı dizilerin benzersiz yeteneğine sahip bir batık yüzeyini yani. Batık yüzeyleri üzerine baskı ile, hücre mikroarray'ler hücrelerin fizyolojik olarak ilgili hücre fenotipi hem de tek bir iyi Şekil 4'ün alt hücreleri multiplex yeteneğini korumak üretilebilir. Microfluidically hücreleri sonuçlar baskı Bu çalışmanın sonuçları, karşılaştırılabilir hücre morfolojisi ve canlılığı ile hücre eki; Bununla birlikte, basılı hücreleri daha yoğun kısa bir toplam çalışma zamanlarda elde edilen belirli bir konumda tutturulabilir. Daha kısa çalışma süreleri 14 tarama yüksek kapasiteli ilaç için önemli maliyet tasarrufu neden olabilir.
Microfluidics önce hücresel mikrodiziler ve yüksek verimli ilaç taraması için kullanılmıştır. Çalışmaların onlarca akış deneyleri tabanlı nasıl ayrıntılı varstatik akış sorunları ortadan kaldırmak; 19 - ne yazık ki, bu çalışmalar yoğunluk, çoğullama ve son derece paralel analizler için 15 mikroskop entegrasyonu sınırlar 2D mikroflüidik (2D ve 3D doku kültürleri ile karıştırılmamalıdır), kullanın. Dijital mikroflüidik ve damlacık tabanlı ve arayüz Bu tür uygulamalar için önerilmiştir ve son derece paralel olarak, çok katlı konfigürasyonlar 15,17,18 olarak çalışabilir, ancak bir ya da küçük hücre grupları ile sınırlı değildir ve tüm kaybeder 3-D, multi- numune hazırlama sırasında hücre tipi doku yapısı. Yüksek üretim akış sitometri hızlı hücre taranması için kullanılmıştır; Bununla birlikte, sitometrisi, in vivo olarak, hücre dışı matriks 20 gergin olan yapışık hücre çizgileri taranması için ideal değildir ki, süspansiyon içinde kalmasını gerektirir hücreleri akar. Co-kültürler de doğru doku temsil 19 eksikliğinden muzdarip. Bunun aksine, 3D MFCA teknoloji tam otomatik DE sağlarbiyomoleküller ve yoğun bir şekilde bir dizi hücre lekeleri veya bozulmamış doku dilimleri reaktifin teslim konumu. Önerilen sistem diziler oluşturmak mümkün olacaktır değil sadece, ama bu diziler üzerinde kayma gerilmeleri, farklı bileşiklerin doğum ve büyüme koşulları çalışmaları için izin verir ve daha akıllı in vitro ilaç yol açacak bir "akan" bir ortamda bunu yapardı araçları tarama. Uygulamaları çeşitli yenilik süresiz devam etmek için izin tasavvur edilebilir. Böyle bir aracı gibi kanser, diyabet, enflamasyon, enfeksiyon, ve kardiyovasküler hastalık gibi kritik araştırma alanlarında çok sayıda yeni hücresel ilaç keşfi ve cytotoxicological deneyleri sağlar.
MFCA bir batırılmış yüzeye hücreleri sunmak için tercih edilen yöntem olsa da, zorluk, özellikle yapışkan olmayan hücre hatları için, yüzeye hücre takmak için devam etmektedir. Bu teknoloji için gelecek tarifi için hücre eki için yöntemler üzerinde durulacakyüzey. Yapay yüzeylerde hücre desenlendirme Teknikleri şu anda mevcut ve şunlardır: mürekkep püskürtmeli baskı, microextrusion veya filament komplo, DNA hibridizasyon ve lazer ileri transferi 21. Bu teknikler arasında, DNA melezleme teknolojisi kullanılarak hücre bağlanma birçok benzersiz ve önemli özelliklere sahiptir. İlk olarak, hücre eklenme yöntemi, her iki yapışkan ve yapışkan olmayan hücreler bu yöntemi kullanarak 22 desenli olma yeteneğine sahip olan tek tek hücreler ile sahip reseptörleri bağımlı değildir. Daha sonra, DNA hücre model verme yöntemi, birden çok yüzey-bağlı DNA sekanslarının 23 kullanımı ile bir çok hücre tipini içeren kompleks hücresel dizilerin üretimi için olanak sağlar. Gelecek uygulamalar veya tarifi hücre eki 19,24 için DNA hibridizasyon teknolojisini kullanarak üzerinde durulacak
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar reaktifler ve / veya bu metinde kullanılan aletleri üreten Wasatch Microfluidics çalışanı ve hissedarları vardır.
Acknowledgments
Yazarlar, teknik yardım için Chris Morrow kabul etmek istiyorum. Finansman NIH SBIR (R43) tarafından sağlanan 1R43GM101859-01 (MPİ) GRANT10940803 vermek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous flow microspotter | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | Base media for cells |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | Cell media additive (control pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | Cell media additive |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | Cell media additive | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | Stain cell sfor counting |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | Cell chamber to count cells |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | Used to check on cells | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | Used for collecting images | |
| Phosphate buffered saline (with calcium and magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | Rinsing cells before passaging and before staining with PI |
| TrypLE Express | Invitrogen | A12177-01 | Used to remove cells from surface |
References
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
- Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
- Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
- Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
- Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
- Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
- Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. , Springer. (2008).
- Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
- Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
- Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
- Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107 (1993).
- Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
- Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
- Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
- Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).
