Summary
يوضح هذا الفيديو طريقة، وذلك باستخدام الماسح الضوئي السريرية 3 T، مقابل تعزيز النقيض MR التصوير من الفأرة البصرية والسذاجة الإسقاط لفي الدراسات المجراة المتكررة والطولي للانحطاط العصبية البصرية المرتبطة الحادة إصابة العصب البصري سحق والمزمنة الضمور في العصب البصري الفئران خروج المغلوب (P50 KO).
Abstract
النظام البصري القوارض يشمل خلايا الشبكية العقدة والمحاور العصبية الخاصة التي تشكل العصب البصري لدخول مراكز مهادي والدماغ المتوسط، والتوقعات بعد المشبكي إلى القشرة البصرية. بناء على بنيتها التشريحية متميزة ومريحة للمعاقين، فقد أصبح الهيكل المفضل للدراسات على بقاء الخلايا العصبية، وتجديد محور عصبي، واللدونة متشابك. وقد مكنت التطورات الأخيرة في MR التصوير والتصور في الجسم الحي من الجزء retino سقفي هذا الإسقاط باستخدام المنغنيز بوساطة تعزيز النقيض (ميمري). هنا، نقدم بروتوكول اورده من أجل التوضيح من الإسقاط البصرية في الفئران، الذي لا يمكن أن يتحقق قرارات (200 ميكرون) 3 3 المشتركة باستخدام الماسحات الضوئية تسلا. ونحن لشرح كيفية حقن intravitreal من جرعة واحدة من 15 نانومول MnCl 2 يؤدي إلى تعزيز المشبعة من الإسقاط سليمة في غضون 24 ساعة. مع استثناء من شبكية العين، وindepen التغيرات في كثافة إشارةدنت من التحفيز البصري وتزامن أو الشيخوخة الفسيولوجية. نحن مزيد من تطبيق هذه التقنية لرصد طوليا تنكس محور عصبي ردا على الحادة إصابة العصب البصري، وهو النموذج الذي المنغنيز 2 + النقل الاعتقالات تماما في موقع الآفة. على العكس، ونشط المنغنيز 2 + النقل يتناسب كميا لبقاء، العدد، والنشاط الكهربائي من الألياف محور عصبي. لمثل هذا التحليل، ونحن مثالا المنغنيز 2 + حركية النقل على طول المسار البصري في نموذج الفأر وراثيا (NF-P50 كيلوبايت KO) عرض ضمور عفوية من الحسية، بما في ذلك المرئية والتوقعات. في هذه الفئران، اورده يشير إلى انخفاض ولكن لا تتأخر المنغنيز 2 + النقل بالمقارنة مع الفئران نوع البرية، وبذلك تكشف علامات ضعف الهيكلية و / أو وظيفية عن طريق الطفرات NF كيلوبايت.
باختصار، اورده الجسور مريح في الجسم الحي المقايسات والأنسجة بعد الوفاة لcharacterizatiعلى النزاهة الألياف العصبية والنشاط. ومن المفيد للغاية لدراسات طولية على تنكس محور عصبي والتجديد، والتحقيقات في فئرانا معدلة وراثيا لالظواهر حقيقية أو محرض.
Introduction
على أساس هيكلها العصبية التشريحية مواتية النظام البصري القوارض يقدم إمكانيات فريدة من نوعها لتقييم المركبات الدوائية وقدرتها على التوسط العصبية 1 أو الآثار المؤيدة لل2،3 التجدد. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح دراسات عن الخصائص الوظيفية والعصبية التشريحية للالمسوخ الماوس، كما يتضح في الآونة الأخيرة لالفئران التي تفتقر إلى البروتين السقالات قبل المشبكي الباسون 4. علاوة على ذلك، مجموعة واسعة من الأدوات التكميلية يتيح إضافية يضم من الشبكية العقدة الخلية (RGC) وأرقام محوار RGC وكذلك النشاط RGC، على سبيل المثال، من خلال تخطيط كهربية الشبكية والاختبارات السلوكية، وتحديد إعادة ترتيب القشرية عن طريق التصوير الضوئي الإشارات الجوهرية. أحدث التطورات التقنية في الفحص المجهري ليزر تمكين التصور الموضع من RGC التجديد في الأنسجة العميقة عن طريق التصوير مضان في عينات جبل بأكمله من العصب البصري (ON) والدماغ. في هذا histologنهج كال، رباعي هيدرو الفوران أساس المقاصة الأنسجة في تركيبة مع ضوء مضان المجهري ورقة يسمح القرار من الألياف واحد أن إعادة إدخال في ON deafferented والجهاز البصري 5. بينما مثل هذه التقنيات قد تكون متفوقة في القرار وتحديد أنماط النمو، فإنها لا تمكن التحليلات المتكررة وطولية من الأحداث نمو الفرد، والتي يتم المطلوب وخاصة لتقييم عملية التجديد على المدى الطويل.
واستخدمت تعزيز التباين التصوير بالرنين المغناطيسي لتصور الغازية الحد الأدنى من إسقاط retino سقفي في الفئران والجرذان 6،7. ويمكن تحقيق هذا عن طريق التسليم المباشر العين أيونات ممغطس (على سبيل المثال، المنغنيز 2 +) إلى خلايا الشبكية. كما التناظرية الكالسيوم، وهو مدرج المنغنيز 2 + في RGC somata عبر قنوات الكالسيوم الجهد بوابات ونقلها بنشاط على طول محور عصبي الهيكل الخلوي للON سليمة والجهاز البصري. في حين أنه يتراكم في الدماغ نوىمن الإسقاط المرئي، أي في النواة الركبية الجانبية (LGN) وأكيمة متفوقة (SC)، ونشر عبر التشابك في القشرة البصرية الأولية تظهر ضئيلة 8،9، على الرغم من أنه قد تحدث 10،11. تحت MR التسلسل، ممغطس المنغنيز 2 + تقوي MR النقيض أساسا بتقصير T-1 تدور شعرية وقت الاسترخاء 12. مثل المنغنيز 2 + تعزيز التصوير بالرنين المغناطيسي (ميمري) قد تم تطبيقها بنجاح في مختلف الدراسات العصبية التشريحية والوظيفية من الفئران، بما في ذلك تقييم تجدد المحاور والضمور بعد الإصابة ON 13،14، ورسم الخرائط التشريحية الدقيقة لإسقاط 15 retino سقفي ، فضلا عن تحديد خصائص النقل محور عصبي بعد العلاج الدوائي 16. قمنا بمد التحسينات الأخيرة في الجرعة والسمية، وحركية العصبية المنغنيز 2 + امتصاص والنقل، فضلا عن تحسين بروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي تطبيقه على الدراسات المتعلقة المعدلة وراثيا9 الفئران باستخدام الماسحات الضوئية 3 تسلا التي يشيع استخدامها في الممارسة السريرية 17.
هنا، نقدم بروتوكول اورده مناسبة للطولية في الجسم الحي التصوير من إسقاط retino سقفي الماوس وتجسد تطبيقه من خلال تقييم المنغنيز 2 + تعتمد تعزيز إشارة في ظل ظروف تنكس عصبي السذاجة ومختلف. يضع بروتوكول لدينا التركيز بوجه خاص على الحصول على البيانات MR في 3 T المجال المغناطيسي المعتدلة التي هي عموما أكثر سهولة من الماسحات الضوئية الحيوان مخصص. في الفئران السذاجة، نحن لتوضيح كيف يمكن أن يكون المسالك محددة كثافة إشارة كبيرة وبتكاثر تصبح زادت بعد intravitreal (ivit) المنغنيز 2 + التطبيق. كميا، المنغنيز 2 + الانتشار على طول الإسقاط المرئي يحدث بشكل مستقل عن عملية الشيخوخة الطبيعية (قياس بين الفئران 3 و 26 شهرا من العمر) وزيادة غير الحرارية إلى التحفيز البصري والتكيف مع الظلام. في المقابل، المنغنيز
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تنفيذ جميع التدخلات الحيوانية وفقا للاتفاقية الأوروبية لرعاية الحيوان واستخدام الحيوانات المختبرية وبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة الأخلاق المحلية. يوصف الإجراء الإصابة على الفئران في مكان آخر 9.
1. Intravitreal المنغنيز حقن
- أداء ساعة المنغنيز 2 + حقن 24 قبل MR مسح بمساعدة مساعد. تخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5٪ محلول الكلورال هيدرات (420-450 ملغ / كغ من وزن الجسم في برنامج تلفزيوني العقيمة). للتخدير الموضعي إضافية، وتطبيق قطرة واحدة من conjuncain السائل (0.4٪ oxybuprocaine هيدروكلوريد) إلى القرنية قبل ثقب العين. لحقن 15 نانومول المنغنيز 2 + في العين يعد 7.5 ملي MnCl 2 الحل، على سبيل المثال، عن طريق تمييع 1 لتر من 1 M MnCl حل 2 الأسهم في 132 LH 2 </ الفرعية> O. تحميل 5 ميكرولتر من الحل النهائي في حقنة 5 ميكرولتر هاميلتون متصلة G 34 مركزا الصغيرة القابلة للإزالة إبرة (إبرة RN).
- عندما بدءا من العين اليمنى، ضع الماوس جانب اليسار تحت المجهر مجهر ومفتوحة بلطف وإصلاح العين اليمنى بين الإبهام والسبابة من يدك اليسرى. التقط حقنة بيدك اليمنى واتخاذ اجراء من الإبرة على مقربة من الحافة. للثقب ارضحي لمبة العين، إدراج بعناية الإبرة في الجسم الزجاجي في محيط-infero الزمنية البعيدة حوالي 1 ملم إلى حوف، وبالتالي تجنيب السفن الصلبة.
- المقبل، مساعد ينطبق ببطء الحجم الكلي لل2 ميكرولتر في حين تسيطر على حجم حقنة هاميلتون. خلال هذا الإجراء، ومراقبة موضع إبرة تحت المجهر الأمثل وتجنب ثقب العدسة أو إراقة السائل. الحفاظ على إبرة تدخل بشكل ثابت لمدة 30 ثانية إضافية، ثم سحبها ببطء لتقليل السائلالتسرب من موقع الحقن.
- في جميع أنحاء الداخلي، ينبغي إيلاء عناية خاصة لتجنب الضغط على العين. وبالمثل، وتجنب محاولات عديدة لقاسية أو ثقب لمبة العين. منذ المنغنيز 2 + امتصاص في RGCs والنقل على طول ON مشبعة بالفعل في 15 نانومول MnCl 2، وهذا يقلل من الاختلافات إشارة من كميات الحقن غير دقيقة قليلا. لتعزيز إشارة الثنائية من الإسقاط المرئي، كرر إجراء الحقن للعين اليسرى.
- تنطبق-أوفلوكساسين تحتوي على (3 ملغ / مل) قطرات العين والتي تحتوي على مرهم بانثينول مرة واحدة بعد العملية لمنع التهابات العين وجفاف العين. العودة الفئران لأقفاصها تحت ظروف السكن العادي حتى بداية الفحص MR.
2. إعداد الحيوان للتصوير بالرنين المغناطيسي
- تخدير الماوس عن طريق الإدارة من خليط الغاز isoflurane و/ الأكسجين 2٪ / 98٪. جبل الماوس على حامل الماوس في موقف مبرومة أفقي تقريبا. الإضافيةERT عليه في لفائف MR، والتي يتم بعد ذلك تعديل داخل الماسح الضوئي MR. مراقبة التنفس ومعدل ضربات القلب من خلال النظم الملائمة. لمزيد من التفاصيل التقنية، انظر هيرمان وآخرون 20.
- خلال التصوير بالرنين المغناطيسي، التخدير إمدادات الطاقة عن طريق نفخ المستمر من البداية 1.5٪ / 98.5٪ خليط الغاز isoflurane و/ الأكسجين عن طريق جهاز تبخير متصلا صاحب الرأس الماوس عن طريق أنبوب المتكاملة. أثناء الفحص، وضبط عمق التخدير وفقا لمعلمات الحيوية المسجلة (أي تهدف لمعدل التنفس مستقرة من حوالي 40 نفسا في الدقيقة). باستخدام جهاز التدفئة حفاظ على درجة حرارة سطح الجسم مستقرة بين 35 و 37 درجة مئوية، كما تم قياسها عن طريق جهاز استشعار الحراري وضعه في موقع البطن من الفأرة. لمزيد من التفاصيل التقنية، انظر هيرمان وآخرون 17.
- بعد الفحص، وتحرير الماوس من حامل وتوريد مع الأكسجين النقي لتسريع الشفاء من التخدير. بالإضافة إلى ذلك، والحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة باستخداممصدر التدفئة الضوء الأحمر.
3. بروتوكول التصوير بالرنين المغناطيسي
- يتم التحقق من صحة بروتوكول ل3 تسلا الماسح الضوئي مجهزة، SNR كفاءة، لفائف حيوان صغير مخصص (الاستقطاب خطيا يتز لفائف) مع حقل فعالة نظر 35 مم × 38 مم. تعمل لفائف في وضع الإرسال والاستقبال.
- مع الحيوان في موقفها النهائي، وضبط اللحن ومباراة لفائف مع المعونة من محلل تردد. ضبط يدويا الارسال إشارة الجهد والتيارات الرقائق لتحسين تجانس الصورة وجودتها.
- اكتساب T 1 المرجحة الصور 2D بورصة طوكيو مع قرار من 0.5 مم × 0.5 مم × 2 مم في ضوء السهمي ومستعرضة للتخطيط. باستخدام التخطيط بمسح MR، الحصول على الصور MEMR في اتجاه وقياس الاكليلية، استدارة لتكون موازية لرأس الحيوان مع ترميز المرحلة على طول اتجاه بين اليسار واليمين. لتقليل اكتساب الوقت، استخدم حقل مستطيل نظر تعديلها لأبعاد الرئيس الفعلي. توظيف مدلل تسلسل FLASH 3D (VIBE 3D) باستخدام المعلمات التالية: قاعدة المصفوفة 256، مجال الرؤية 54 مم × 50.65 مم × 14.08 مم، وذلك باستخدام الحقل مستطيلة 93.8٪ من رأي في المرحلة ترميز الاتجاه، و 128 شرائح من 0.11 ملم شريحة سمك لقرار تعيين شريحة إلى 61٪.
- تفعيل الاستيفاء في الطائرة لخلق صور النهائي مع 512 × 480 × 128، وتوفير حل فعال من 0.21 ملم × 0.21 ملم × 0.18 ملم (0.1 ملم × 0.1 ملم × 0.09 ملم محرف)، والوقت صدى تي E = 6.51 ميللي ثانية، الوقت التكرار T R = 16 ميللي ثانية، عرض النطاق الترددي = 160 هرتز / بكسل، وزاوية الوجه = 22 درجة. تطبيق متوسطين وثلاثة التكرار لتحقيق ما مجموعه اكتساب الوقت (T A) ما يقرب من 30 دقيقة.
4. تحليل البيانات التصوير بالرنين المغناطيسي
- تحليل البيانات باستخدام برنامج برنامج برنامج syngo. لتعزيز إشارة الكمي، حدد مناطق محددة سالفائدة و 2D في مستو تسجيلات التصوير بالرنين المغناطيسي وتحديد شدة إشارة (SI) لهيكل محسن (SI ميمري)، والخلفية الأنسجة (SI backgr)، والانحراف المعياري للضوضاء (SD N). حيثما كان ذلك ضروريا، واستخدام الماوس أطلس الدماغ لتسهيل التوجه العصبية التشريحية للLGN والهياكل SC. حساب نسبة التباين إلى الضوضاء (CNR) باستخدام الصيغة:
- لجنة المصالحة الوطنية = (SI اورده - SI backgr) / SD N
- تحديد ثلاث صور متتالية لحساب متوسط لجنة المصالحة الوطنية لكل عينة. في الحيوانات حقن ثنائيا، وتحليل كل نصف الكرة بشكل مستقل.
- لتصوير الصور الأفقية، الاكليلية والسهمي، وحساب إعادة البناء من multiplanar الأصلي مجموعة البيانات 3D التصوير بالرنين المغناطيسي. لا ينصح هذه الصور المجهزة للتحليل الكمي. إعادة البناء لخلق 3D الرسوم المتحركة (إسقاطات كثافة الأقصى، خطط تنفيذ البعثات) من retino-سقفي الإسقاط، استخدم وظيفة تجهيز وحدة تصوير الأوعية البرمجيات.
5. المنغنيز 2 + Autometallography (TIMM تلطيخ)
- لTIMM تلطيخ من المنغنيز 2 هياكل الدماغ + تتبع التالية ميمري، وضخ جرعة من 15-150 نانومول المنغنيز 2 + ivit 24 ساعة قبل التصوير.
- بعد تفحص MR، يروي الحيوانات مع 30 مل من الجليد الباردة 0.325٪ نا 2 S في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). تشريح الشبكية وتجميد العينات المجمدة في القسم.
- قطع، أقسام الاستوائية متتابعة من 15 ميكرون سمك على مبضع بردي.
- أداء TIMM تلطيخ 21 في غياب تثبيتي، وفقا لcryoprotection Angenstein وآخرون 22.
6. التحليل الإحصائي
أداء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب للمقارنات واحدة، تليها آخر مخصص ANOVA. يتم عرض البيانات كما يعني ± الخطأ القياسي. أرقام N الفرديةنظرا منفصل لكل تجربة. وتعتبر النتائج التوصل P ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية (P ≤ 0.05، *؛ P ≤ 0.01، **؛ P ≤ 0.001، ***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قدرة هذه التقنية التصوير لتقييم دقيق حيوية وظيفة الإسقاط المرئي يعتمد على التطبيق الدقيق لغير سام المنغنيز 2 + الجرعة إلى الجسم الزجاجي وامتصاص من قبل RGCs. يتم اختبار هذا الافتراض الرئيسي في الشكل 1، حيث أظهرت طبقة معينة المنغنيز 2 + امتصاص autometallography (TIMM تلطيخ) 21. وقد تم تحليل أقسام شبكية العين في 24 ساعة بعد تطبيق ivit إما 15 أو 150 نانومول نانومول المنجنيز 2 +، أو برنامج تلفزيوني عن السيطرة. عند هذه النقطة الزمن، تظهر المنغنيز 2 + حقن الشبكية أقصى تعزيز إشارة في T 1 المرجحة التصوير بالرنين المغناطيسي (N = 3؛ الخطوط المنقطة)، في حين حقن PBS لم يتم تعزيز شبكية العين في إشارة (N = 3؛ خط منقط) (الشكل 1 غادر لوحة). لاحظ تعزيز إشارة hyperintensive في 150 نانومول حقن العين. في المقابل، مناطق الدماغ nonenhanced (النجمة) تظهر مشابهة شدة إشارة الخلفية لجميع المشاركينnditions (اللون الأخضر). Ivit المنغنيز الزيادات 2 + التطبيق الشامل تلطيخ TIMM ولا سيما في طبقة RGC وطبقة الألياف العصبية (NFL) (الشكل 1، إدراجات تضخيم في لوحة المتوسطة)، والتي أكدتها التحقيقات الفردية RGC somata التالية H & E شارك في وضع العلامات (اللوحة اليمنى).
لفي الجسم الحي التصوير من إسقاط retino سقفي الماوس، فمن الأهمية بمكان لتحديد ماوس خاص بروتوكول اورده حيث المعلمات التشغيلية جنبا إلى جنب مع المعدات، كما هو موضح في الشكل 2، ويتم تكييفها لتحليل الفئران في حقل T 3. تطبيق مثل هذا الإعداد الماسح الضوئي، وكشفت في وقت سابق أن عملنا لCNS دقة وضوح الصورة لفائف الرأس الفئران متفوقة على ماوس مخصصة كلها لفائف الجسم 17. لإصلاح الرأس والفئران لضبط بشكل صحيح وضعه داخل لفائف الفئران، ونحن نستخدم مهد وأنبوب مخروطي مع شريط لدغة مصنوعة من البلاستيك، وكلاهما يضيق نطاق لتلبية أبعاد الهيكلمن الفئران (أرقام 2A، B). عندما يتم الحصول على الصور على مستعرضة T 1 مصفوفة المرجح تنفيذ 3D التدرج تسلسل الصدى، يمكن أن يتوقع توليد صور عالية الدقة من (200 ميكرون) 3 في غضون 35 دقيقة من اكتساب الوقت. ونحن نوصي بشدة رصد مستمر من الوظائف الحيوية أثناء الفحص. تعديل التخدير مع الأوكسجين postimaging والتحكم في درجة الحرارة الجسم يسرع كثيرا من الوقت الانتعاش ويضمن معدلات البقاء على قيد الحياة من حوالي 100٪. هذه الاحتياطات الفنية ضرورية للتأكد من أن الفوج كله سوف تعمل على مساندة التصوير بالرنين المغناطيسي طولية والمتكررة.
في أي دراسة، فقط غير سام المنغنيز 2 + جرعة من 15 نانومول ينبغي أن تستخدم لتطبيق ivit 9، وهو ما يكفي لتعزيز بارز يزار في شبكية العين، ON، والجهاز البصري يصل إلى LGN داخل المخ قبل المشبكي وSC. وأفضل حساب القيم CNR من 200 ميكرون سميكة مستعرضةشرائح الحصول عليها من مجموعات البيانات الأصلية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي reslicing الأصلي حجم 3D الخواص. ويبين الشكل 3A مثالا للدقة تقرير لجنة المصالحة الوطنية لتعزيز LGN، حيث يتم اختيار ثلاث مناطق من الاهتمام في كل صورة ل(1) منطقة محسنة إشارة (SI اورده )، (2) الأنسجة غير أفيني الدماغ (SI backgr)، و (3) من الضوضاء في الخلفية (SD N). يتم تقديم متوقعة تعزيز إشارة المكانية كميا على طول مجمل إسقاط بصرية واحدة في الشكل 3B. لاحظ زيادة تدريجية قوية من تعزيز إشارة في أقسام الشبكية طول الطائرة ظهري بطني، التي تصل ذروتها في رأس العصب البصري. بالإضافة إلى ذلك، لاحظ عدم وجود المنغنيز عبر التشابك 2 + الانتشار ذات الصلة في الطبقات القشرية تحت ظروف تجريبية تطبيق (انخفاض إشارة في القشرة البصرية). خطط تنفيذ البعثات توضيحية للغاية لتصور وتحديد المواقع 3D من إسقاط retino سقفي جملة وتفصيلا (فيلم 1). Aيتم تحديد ccumulation من المنغنيز 2 + طول الإسقاط المرئي من قبل حركية امتصاص الخلايا في RGCs من خلال الجهد تعتمد كا 2 + قنوات والنقل في محور عصبي سريع، فضلا عن إزالة منخفضة نسبيا من النسيج المستهدف 13. وفقا لدراساتنا الحركية السابقة، ويمكن الكشف عن المنغنيز 2 + تعتمد تعزيز إشارة في وقت مبكر 6 ساعة بعد الحقن. أكثر من ذلك قمم في 24 ساعة وتنخفض إلى مستويات خط الأساس خلال 120 ساعة بعد الحقن 9. وبالتالي، لتحقيق أفضل النتائج، يجب أن يتم تنفيذ اورده 24 ساعة بعد الحقن، وهو ما يمثل نصف الوقت المطلوب لتعزيز الفئران 13.
بعد أن أوجز المبدأ لتعزيز النقيض من الإسقاط المرئي من قبل ميمري، ونحن مزيد من التواصل تأثيرات معلمتين - حالة الضوء والحيوان سن - التي قد تؤثر على القياسات الكمية:
(1) لاختبار وأو تراكم تعتمد على التحفيز من المنغنيز 2 + في مراكز الدماغ المتوسط، بقيت الفئران إما تحت ظروف الإضاءة حفز من قبل التعرض المصباح من وتيرة محددة (5 هرتز) وشدة الضوء (3 W LED) التي تحققت أو في الظلام الدامس قبل الفحص وخلال 24 ساعة من المنغنيز 2 + التعرض. التحليل الكمي للساعة 24 لجنة المصالحة الوطنية بعد ivit المنغنيز 2 + التطبيق يكشف عن زيادة كبيرة في قوة إشارة الشبكية تكييفها داكنة بالمقارنة مع ظروف حفز الخفيف (66.29 ± 3.07 مقابل 54.56 ± 3.08، P ≤ 0.05، N = 7 / 8؛ الشكل 3C). بالنظر إلى التدرج في تعزيز الإشارات بين الشبكية الطرفية ورأس العصب البصري (انظر الشكل 3B)، ونحن على ثقة لتحليل دائما أقسام الشبكية المقابلة في جميع المجموعات التجريبية. تحليل الصور على طول الطائرة بطني ظهراني كشفت، كما هو متوقع، أن القيم المطلقة لجنة المصالحة الوطنية تتراجع في كل الظروف. الأهم من ذلك أن يختلطالفرق إشارة سالبة بين الظلام والضوء الشبكية تكييفها لا يزال مستمر (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، وتعزيز إشارة في مناطق الإسقاط من LGN (26.97 ± 1.78 مقابل 26.58 ± 1.05، P = 0.9، N = 7-2) وSC (25.09 ± 1.24 مقابل 26.81 ± 1.55، P = 0.4، N = 7 / 8) لا يمكن تمييزه بين البيئات تكييف الضوء والظلام (الشكل 3C). يوضح هذا الاختبار أن امتصاص المنغنيز 2 + في طبقات الشبكية حساسة للالتعرض للضوء، في حين لا يتأثر انتشارها على طول إسقاط retino سقفي وتراكمها في المناطق المستهدفة من خلال التحفيز البصري تتزامن. بدلا من ذلك، قد تكون حساسية إشارة من 3 T الماسح الضوئي دون عتبة الكشف عن التباين في إشارة LGN أو SC.
(2) استكشاف الآثار المترتبة على سن الحيوان على تعزيز إشارة اورده ذات الصلة من الإسقاط المرئي، قمنا بتحليل الفئران بين 3 و 26 شهرا سعمر و. القيم لجنة المصالحة الوطنية في LGN من الفئران 3 أشهر من العمر (23.49 ± 1.36، N = 12) لا تختلف عن كثافة إشارة يقاس في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 7 أشهر (23.90 ± 0.81، P = 0.79، N = 16)، و 13 شهرا (23.35 ± 1.29، P = 0.94، N = 10) أو 26 شهرا (25.10 ± 2.29، P = 0.53، N = 6؛ الشكل 3D). وبالمثل، فإن كثافة إشارة في SC هو دون تغيير بين 3 أشهر (19.01 ± 1.20) و 26 شهرا من العمر (16.92 ± 2.18، P = 0.37؛ الشكل 3D). على الرغم من زيادة طفيفة هو واضح في القيم CNR من الشبكية 26 شهرا (38.49 ± 3.25)، فإن هذه الزيادة لا تصل أهميتها عند مقارنتها في جميع المجموعات (P> 0.05). هذه التجارب تشير إلى أن تعزيز إشارة في المناطق المستهدفة الدماغي من الإسقاط المرئي لا يتأثر التحفيز البصري والشيخوخة الفسيولوجية.
المقبل، ونحن لشرح حساسية اورده للكشف عن التغييرات الهيكلية سو الإسقاط البصري الناجم عن axonopathy الحادة والمزمنة. لاستكشاف هذا، وهذا نموذج من انحطاط ولري الناجم عن الصدمة ON إصابة 18 وكذلك نموذج حيواني عرض المبكر، تنكس عفوية من التوقعات الحسية بما في ذلك مسار بصرية 19 كانوا يعملون:
(1) axonopathy الصدمة الناجمة عن الإصابة ON سحق يتسبب في كسر axona كراسات. وبالتالي، فإن النقل retino سقفي من المنغنيز 2 + على طول محور عصبي الهيكل الخلوي تكون سدت تماما وعلى نحو مستدام، كما تصور من قبل فقدان كامل للالمنغنيز 2 + تعزيز إشارة في LGN وتحليلها SC يوم واحد (لا يظهر)، أسبوع واحد (الشكل 4A ، الخطوط المنقطة)، و 4 أسابيع (لا يظهر) إضافة الاصابة. للتدليل بوضوح ملامح MR تشريحي عصبي ومتتالية من الإصابة وعلى لتشريح لهم من الدولة السذاجة، وقد ألحقت الآفة من جانب واحد فقط. هذه النتائج في دون تغيير المنغنيز 2 + النقل على رعليه السيطرة على الجانب خلافا لانقطاع التتبع على جانب التدخل. تحليل القيم لجنة المصالحة الوطنية في مجالات deafferented يؤكد غياب كامل من تعزيز إشارة (لا يظهر). يوضح هذه التجربة أيضا أن ميمري هي حساسة للغاية في الكشف عن مكان وشدة موقع الآفة من خلال التقييم الطولي للكثافة إشارة على طول الإسقاط قبل وبعد الإصابة (الشكل 4B). في حين أن كثافة إشارة على طول ON قبل الإصابة يبقى باستمرار فوق إشارة الخلفية، هناك انخفاض-الصدغي المكانية في كثافة إشارة إلى اليوم مستوى خلفية واحدة بعد الإصابة ON.
(2) أظهرت عملنا في وقت سابق أن المنغنيز 2 + تعزيز إشارة تعتمد في LGN هو انخفاض في 10 شهرا من العمر الفئران التي تفتقر إلى الوحيدات P50 NF كيلوبايت عند قياسها 24 ساعة بعد الحقن 9. كشف هذا مع الاحقية عالية، ونحن يفترض وجود ضعف العام في retino-سقفي المنغنيز 2 + العابرةالميناء، ربما بسبب انخفاض عدد RGCs وذات الصلة على الاعتلال العصبي في الشيخوخة P50 الفئران KO 19. بدلا من ذلك، قد تكون مرتبطة انخفاض تعزيز إشارة مع امتصاص الخلايا العصبية المتأخرة ونشر المنغنيز 2 + من الجسم الزجاجي وعلى طول الإسقاط المرضية. إمكانية هذا الأخير يمكن استكشافها عن طريق إجراء المسح الضوئي MR المتكررة بعد طلب واحد من 15 نانومول المنغنيز 2 + ودراسة حركية تعزيز إشارة في شبكية العين وLGN في وقت مبكر (8 و 24 ساعة) وأواخر (48 و 72 ساعة) وقت نقطة. في النوع البري وP50 الفئران KO، الشبكية قمم تعزيز إشارة في 8 ساعات في معدلات متطابقة تقريبا تعزيز (43.52 ± 3.24 و 40.72 ± 2.79، P = 0.6، N = 3-6؛ الشكل 4C، يسار). في حين لا يزال تعزيز إشارة عالية في أنواع البرية في 24 ساعة حقن آخر، فإنه ينخفض في P50 الفئران KO (43.38 ± 2.18 مقابل 32.89 ± 1.54، P ≤ 0.01، N = 5-8). خلال مراحل لاحقة (48 و 72 ساعة)، والنقصان تعزيز إشارة في كلا المجموعتين (مع انخفاض القيم باستمرار لجنة المصالحة الوطنية في الفئران خروج المغلوب)، وبالتالي استبعاد الشبكية المنغنيز تأخير 2 + امتصاص وانتشار الفئران في P50 KO. المقابلة النتائج في LGN من P50 الفئران KO تأكيد هذه الفكرة. على الرغم من أن لجنة المصالحة الوطنية هو أقل من ذلك بكثير بين 8 و 48 ساعة بعد الحقن (P ≤ 0.05، N = 5-9)، حركية توهين الإشارة في P50 الفئران KO يقابل ذلك في البرية من نوع الفئران (الشكل 4C، يمين). وبالتالي، ويرجع ذلك إلى انخفاض أعداد محوار منشؤها من السكان RGC محدودة بدلا من حركية النقل ضعف انخفاض-الصدغي المكاني تعزيز إشارة لإسقاط retino سقفي. نقترح اورده أن يكون أداة قيمة للكشف المسوخ الماوس الوراثية للعاهات projectional في الجهاز العصبي المركزي.
المحتويات "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 1. تلطيخ TIMM من المنغنيز 2 + امتصاص في RGCs. الممثل الصور الحرارية خريطة T 1 المرجحة التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI T 1) تظهر زيادة إشارة من العدسة والشبكية محيط كله (الخط المنقط) 24 ساعة بعد تطبيق ivit من 15 نانومول، وكثيفة فرط تعزيز إشارة بعد تطبيق 150 نانومول المنغنيز 2 + (يسار). تمثل الألوان الدافئة القيم إشارة أعلى من الألوان الباردة. شريط النطاق: 1 مم. الوسط / اليمين: المنغنيز 2 + امتصاص RGCs بعد الحقن ivit من MnCl 2 كما الكشف عنها بواسطة هطول الفضة باستخدام تلطيخ TIMM (اللون الأسود). إثبات السيطرة أقسام الشبكية PBS المعاملة ضعيفة إلى حد تلطيخ والتمايز منتشر طبقة RGC (RGC) (أعلى؛ N = 3). عالية التكبير لا يسمح د. iscrimination من الخلايا الفردية (إدراجات تضخيم) Ivit MnCl 2 التطبيق يزيد تفاضلي تلطيخ الفضة الشاملة عبر طبقات الشبكية، مع هطول الفضة بارزة بشكل خاص في طبقة الألياف العصبية (NFL)، وطبقة RGC، والطبقة النووية الداخلية (INL؛ الوسط والقاع ، إدراجات تضخيم؛ N = 3). Colabeling من TIMM مع H & E تلطيخ مزيد يؤكد طبقة معينة مثل المنغنيز 2 + تراكم (اللوحة اليمنى). شريط النطاق، لمحة عامة: 50 ميكرون، التكبير: 25 ميكرون. IPL، طبقة ضفيري الداخلية؛ اوبل، طبقة ضفيري الخارجي؛ ONL، طبقة النووي الخارجي؛ RPE، الشبكية الظهارة الصبغية.
الشكل 2. التصوير بالرنين المغناطيسي تبين المعدات خصيصا لالماوس MEMR الحصول على الصور على الماسح الضوئي 3T السريرية. A) يظهر مهد الماوس حسب الطلب مع بالفنار الرأس شريط التثبيت وأجهزة الاستشعار لرصد الجهاز التنفسي (لوحة بيضاء، أنبوب الأزرق). ب) يبين وضع الماوس وثابتة في المهد. أنابيب لتوريد الغاز مخدر اليسرى. C) تجسد وضعية الرأس ومهد الماوس داخل لفائف يتز الاستقطاب خطيا العاملة في الإرسال وتلقي الوضع. D) يدل على منصة لفائف أمام أنبوب التدريع والسريرية 3 T الماسح الضوئي. يوفر أنبوب النحاس المطلي التدريع إضافية من الضوضاء وكتل إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي من مقرها حصيرة تسخين المياه الساخنة (التفاف سوداء حول أنبوب). E) يتصور مجموعة كاملة المتابعة من لفائف الحيوان داخل المسام من 3 T الماسح الضوئي فقط قبل تحديد المواقع رأس حيوان على وجه التحديد في مركز التساوي داخل الماسح الضوئي.
الرقم 3. اورده من إسقاط retino سقفي السذاجة تحت ضوء مختلف الظروف والعمر. أ) توضيحات من المنطقة ذات الاهتمام (ROI) رسم الخرائط في تعزيز LGN والأنسجة الخلفية على التصوير بالرنين المغناطيسي مستعرضة تسجيل (يسار). ويتضح LGN تعزيز إشارة محددة بالخريطة الحرارة العرض (يمين). 1 و 1 '، اليسار واليمين LGN؛ 2 و 2 '، الأنسجة الخلفية؛ 3، والضوضاء؛ P، الخلفي؛ R، أليس كذلك. شريط مقياس: 100 ميكرون B) رسم الخرائط المكانية لتعزيز إشارة على طول إسقاط retino سقفي واحد كما هو محدد من المكتسبة أصلا شرائح مستعرضة صورة MR بواسطة اورده. الساحات مملوءة، المنغنيز 2 + تعتمد تعزيز إشارة؛ مثلثات مفتوحة، إشارة الخلفية. R، الشبكية؛ ON، العصب البصري؛ OT والجهاز البصري؛ LGN، النواة الركبية الجانبية؛ SC، أكيمة متفوقة؛ VC، القشرة البصرية. شريحة سمك، 200 ميكرون. C) التحفيز لايت يقلل بشكل ملحوظ تعزيز إشارة الشبكية. Enhancement في LGN وSC مستقلة من التحفيز البصري. الدوائر شغلها، داكنة التكيف؛ الدوائر المفتوحة، والتكيف مع الضوء. د) تعزيز إشارة مستقلة عن زيادة العمر بين 3 و 26 شهرا.
الشكل 4. اورده من إسقاط retino سقفي في ظل ظروف الاعصاب. أ) تنفيذ اورده من الفئران حقن ثنائيا ivit أسبوع واحد بعد إصابة سحق من جانب واحد حق ON. إعادة البناء Multiplanar وجهات النظر الأفقي، الاكليلية، والجانبية تصور غياب كامل للإشارة في تعزيز LGN وSC لنصف الكرة جرح (الخطوط المنقطة). ج، نصف الكرة الأرضية المقابل؛ ط، نصف الكرة المماثل. شريط النطاق: 1 مم B) الصور برنامج التأمين الصحي وتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي الطولي للتعزيز إشارة المكانية على طول ON قبل ويوم واحد بعد الإصابة. R، الشبكية؛ ON، العصب البصري؛ سهم، موقع الآفة. لا يتأثر 0.5 ملم C) حركية تعزيز إشارة تحت تنكس عصبي مزمن في إسقاط البصرية في P50 الفئران KO المبكر (8 ساعات) امتصاص المنغنيز 2 + في خلايا شبكية العين، ولكن يتم تقليل بالفعل في LGN من P50: شريط مقياس. الفئران KO. التصوير المتكرر MR في 24، 48، و(فقط لشبكية العين) في 72 ساعة يبين الحد إشارة مستمرة، ولكن حركية مماثلة من المنجنيز 2 + النقل وتراكم في شبكية العين وLGN من P50 الفئران KO.
الفيلم 1: صور متحركة، 3D حرارة الخريطة عرض الموضع إسقاط retino سقفي محسنة في المقابل تم إجراء MR التصوير 24 ساعة بعد الحقن ivit الثنائية من 15 نانومول MnCl 2. يتم عرض البيانات في وضع برنامج التأمين الصحي. شريحة سمك، 200 ميكرون. <وأ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" الهدف = "_blank"> الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اورده من النظام البصري يمتد تقنيات العصبية الحيوية التقليدية لتقييم الأداء الوظيفي في ظل ظروف السذاجة والمرضية. وبصرف النظر عن تقديم نظرة فريدة من نوعها في سلامة معزولة CNS الألياف المسالك، اورده يمكن استكمال بسهولة مع اختبارات سلوكية، على سبيل المثال، البصريات والمهام المياه القائمة بصريا، للتحقيق في الآثار المباشرة لنموذج معين للإدراك البصري. كما يربط الكهربية والتحقيقات النسيجي مع توصيف وظيفي البصرية في الجسم الحي. والتقنية هي موثوق بها للغاية وقابلة للتكرار مع وجود فروق طفيفة بين الأفراد ضمن مجموعات متطابقة (انظر أشرطة الخطأ في أرقام 3، 4). يثير الاهتمام والفضول، في جرعة من 15 نانومول، المنغنيز 2 + امتصاص ونقل محور عصبي المشبعة العمليات، بحيث تعزيز إشارة تصل إلى الهضبة التي لا يمكن أن تكون مرتفعة عن طريق إضافية المنغنيز 2 + العرض 9. من الناحية العملية منعرض ومثل هذه الاستجابة الجرعة يقلل مميزة، على الأقل إلى حد ما، حقن المرتبطة الاختلافات في تعزيز إشارة. ومن الجدير بالذكر أن البيانات المعروضة على الجرعة وحركية المنغنيز 2 + تعزيز إشارة محددة بالنسبة للفئران ومتميزة عن مثيلاتها في الفئران، والتي تتطلب حوالي 10-20x وأعلى المنغنيز 2 + الجرعة وزيادة الكمون (36 ساعة) لتحقيق تعزيز النقيض الأمثل 13،23. بالإضافة إلى ذلك، وتعزيز طول الإسقاط المرئي يظل منسجما بين سن الحيوان من 3 و 26 شهرا. هذا الاستنتاج يتماشى مع التجارب التي أجريت على الفئران البصرية الشيخوخة، وحقيقة أن الفئران C57/B6 حفاظ على النشاط العادي البصرية لتصل إلى 2 سنة من العمر 24. على الرغم من أننا لم نحلل الفئران الفردية طوليا في دراسة الشيخوخة، والنتائج السابقة تبين بوضوح سلامة تدار بشكل متكرر المنغنيز 2 + جرعات من 15 نانومول للصيانة 9 البصرية، والتي يمكن أن المطلوب في الدراسات الطولية الشيخوخة.
وفقا لفكرة أن المنغنيز 2 + وهو مدرج في RGCs، وتبين لنا المنغنيز 2 + امتصاص في somata من خلال تلطيخ TIMM التي تعتمد على هطول الفضة من ايونات المعادن الحرة، والتي تطبقها Angenstein وآخرون. لداخل المخ المنغنيز 2 + الكشف التالية تطبيقه النظامية 22. سابقا، تم الكشف داخل المخ المنغنيز 2 + التوزيع من قبل تصوير الإشعاع الذاتي من 54 المنجنيز 2 + النظائر لتحديد الدوائر العصبية من الفئران CNS 25، ولكن ليس على المستوى الخلوي. هنا، TIMM تلطيخ يسمح إسناد المنغنيز 2 + لامتصاص السكان خلية متميزة داخل شبكية العين المكشوفة، حيث نجد البارزين الفضة هطول الأمطار في RGC وطبقات الألياف العصبية. تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول يبين تطبيقها تحسين الكشف عن طريق تلطيخ TIMM بعد تطبيق جرعة من 150 نانومول مقارنة ب 15 نانومول المنغنيز 2 +. على الرغم من المنغنيز 2 + امتصاص ومحور عصبي العابرة لمشبعة بالفعل في الميناء 15 نانومول، وبالتالي، منح أي زيادة إضافية لجنة المصالحة الوطنية على طول إسقاط retino سقفي في جرعات أعلى، مكملات المفرطة قد تزيد من توافر الحرة والبروتين غير منضم المنجنيز 2 +، وبالتالي جعلها في متناول هطول الفضة. سوف التحسينات المستقبلية في حساسية تلطيخ تسمح للارتباط القيم لجنة المصالحة الوطنية القائمة على اورده من التوقعات المحددة CNS مع موقع الخلوية من المنغنيز 2 + تخصيب داخل المنطقة النسيجية محددة. قد تكون هذه القدرة مفيدة أيضا لتوصيف وتقدير من المنغنيز 2 + التوزيع في المناطق الأخرى خارج الجهاز العصبي المركزي الإسقاط المرئي. وبالمثل، فقد استخدمت المنغنيز 2 + في نموذج سمية kainate لتصور انحطاط والتجدد من الألياف المطحلب الحصين 26.
2 مليون + يتم تناولها من قبل قنوات الكالسيوم تعتمد الجهد ويتم توزيعها داخل الخلية عن طريق النقل محور عصبي النشطة، والتي كاليفورنيان يكون قد تم حظره من قبل العلاج الكولشيسين 25،27. وقد كشفت التجارب البصرية التحفيز على الفئران تلقي جرعة داخل الصفاق من MnCl 2 زيادة تعزيز إشارة في الداخلية، وبوجه خاص، شبكية العين الخارجي 28. وبالتالي، يثير مزيدا من التكيف مع الظلام شدة إشارة في طبقات الشبكية الخارجي مقارنة مع الفئران المعرضة لظروف الإضاءة غرفة فقط، مما يدل على حساسية شبكية العين المنغنيز 2 + لامتصاص التحفيز البصري 28. وبالمثل، نجد تعزيز كثافة إشارة في شبكية الفئران تكيفت مظلمة بالمقارنة مع الفئران المعرضة إلى التحفيز البصري بعد ivit المنغنيز 2 + التطبيق. قد تكون ذات صلة إلى هذه الخصائص الكهربية محددة من الشبكية وتوليد تيار الظلام المستمر في خلايا مستقبلة للضوء. منذ كا 2 + تدفق إلى قطاعات الخارجي من المستقبلات الضوئية يساهم بشكل كبير في دستور الحالي الظلام، قد تكون مصحوبة جيلهمبواسطة تعزيز التعاون امتصاص المنغنيز 2 + في طبقة الخلايا المستقبلة للضوء تحت جنح الظلام. في المقابل، التحفيز ضوء يقلل من الظلام الحالي ويسبب فرط الاستقطاب من خلايا مستقبلة للضوء 29. وبالتالي، عموما المنغنيز 2 + امتصاص قد تضاءلت في ظل ظروف الإضاءة.
لاستخدام موثوق بها من ميمري، فمن المهم توضيح ما إذا كان أكثر وضوحا المنغنيز 2 + امتصاص في شبكية العين تتكيف داكنة يغير تعزيز إشارة على طول أجزاء أخرى من الإسقاط المرئي أو حتى توسعه بأكمله. وقد أظهرت التغييرات التي تعتمد على التحفيز في اورده قوة إشارة الشبكات الدماغية لنظام الصوتية بعد داخل الصفاق المنغنيز 2 + التطبيق 30. في هذه الدراسة من قبل يو وآخرون، تعرضت الفئران لترددات الضوضاء متغير قبل التحقيق التفحص MR T 1 وتعزيز إشارة المرجح لأكيمات السفلي في وقت لاحق. تم العثور على التحفيز الصوتية لsignificanTLY زيادة شدة إشارة اورده في التمثيل التوضع النغمي، وبالتالي تجسد شخصية مثل الرنين المغناطيسي الوظيفي التي تعتمد على النشاط المنغنيز 2 + تراكم 30. في المقابل، في مجموعة التجريبية لدينا ما يصل المنغنيز 2 + تراكم في LGN وSC يظهر مستقلة من التحفيز البصري. ومع ذلك، قد تنشأ مثل هذه الاختلافات في رسم خرائط الدماغ الحسية محاولات من الحقل المغناطيسي وانخفاض عتبة محدود من الكشف لدينا 3 T الماسح الضوئي بالمقارنة مع ارتفاع الحقل 7 T الماسح الضوئي المستخدم من قبل يو وآخرون 30.
حتى الآن، لا يعرف أن ما يؤثر على مدى المعلمات الفيزيائية الحيوية النقل محور عصبي تقدمي من المنغنيز 2 + وكيف ميمري قد تكون بمثابة مؤشر للنشاط الكهربائي. ومع ذلك، يبدو أن المنغنيز 2 + انتقال المرض من خلال RGCs يحدث، على الأقل جزئيا، بشكل مستقل من التحفيز محددة الخفيفة والمدخلات الكهربائية الواردة من خلايا القطبين. بدلا من ذلك، فإن التأثير الصافي لالكهربائيةctivity داخل إسقاط retino سقفي قد يكون نتيجة التحفيز الكهربائي للداكنة استجابة "OFF-RGCs 'وخفيفة استجابة' ON-RGCs '. ويدعم هذا التفسير من قبل الاكتشاف الذي المنغنيز 2 + النقل على طول إسقاط retino سقفي وغير منخفضة القيمة في سلالات الفأر مع ضعف البصر، مثل الفئران CBA التي تحمل طفرة RD1 من الجين Pde6b تسبب تنكس الشبكية 11. في دراسة الحركية على النوع البري الفئران النظر وCBA، لوحظت معدلات النقل مماثلة خلال المرحلة الأولي تدفق (بواقع 2.5 ساعة بعد الحقن) وتعزيز إشارة النهائي (في 24 ساعة) في LGN وSC 11.
أخذت معا، هذه الملاحظات تدعم فكرة أن ميمري، على سبيل المثال، من النظام البصري كما يتضح هنا، يمثل مقياسا لقيمة السلامة الهيكلية والاستقرار بدلا من التمثيل الغذائي للنشاط الكهربائي. عمليا، وعلى ما يبدو ليالياستقلال جدول تعزيز إشارة في LGN الدماغي وSC من التعرض للضوء يسمح للمناولة قوية والإسكان الحيوانات دون رعاية خاصة فيما يتعلق الإضاءة. من ناحية أخرى، للدراسات اورده التي تركز على تعزيز إشارة الشبكية، فمن الضروري للحفاظ على الحيوانات تحت ظروف الإضاءة رقابة مشددة قبل الفحص.
بين المعلمات الفسيولوجية التي تؤثر على المنغنيز 2 + أسعار النقل محور عصبي واللاحقة اورده تعزيز إشارة، استقرار درجة حرارة الجسم قد تكون ذات أهمية خاصة. ويدل على ذلك الدراسات على الأنف المنغنيز 2 + لتعزيز أهداف الإسقاط الشمية الأولية في الدماغ، حيث تم العثور على تخصيب اليورانيوم لتتضاءل إلى حد كبير في تخفيض مؤقت في درجة حرارة الجسم إلى 30 درجة مئوية مقارنة للإشارة إلى تعزيز تحت درجة حرارة الجسم العادية 27. لذلك، ينبغي رصد درجة حرارة الجسم وتعديلها قبل وأثناء MR بمسح ليس فقط لعrotect صحة الحيوانات، ولكن أيضا لتطبيع المعلمات الفسيولوجية للالمنغنيز 2 + الانتشار.
منذ التعديلات المرضية في جسم المريض وضعف التمثيل الغذائي يؤثر على فعالية نقل محور عصبي من المنغنيز 2 +، وتعزيز إشارة في مراكز الإسقاط، على سبيل المثال، LGN وSC، يمكن أن تكون بمثابة مقياس لسلامة الهيكلية والنشاط وظيفية من هذا المسار. هنا، نقدم اثنين من ظروف مختلفة من انحطاط وعلى توضيح أن المنغنيز 2 + نشر وتخصيب في مراكز مهادي والدماغ المتوسط يختلف بوصفها وظيفة من سلامة محور عصبي. وينعكس الحاد على نتائج الإصابة في فقدان إشارة إجمالية مباشرة بعد الإصابة، التي لا يتعافى في غضون 4 أسابيع بسبب عدم وجود تجدد المحاور ذات الصلة، في حين بطيئة تنكس محور عصبي في P50 KO متحولة عن طريق خفض قيم لجنة المصالحة الوطنية في LGN. نظرا لإمكانية التصوير الطولي، قد يكون هذا التطبيق من ميمري و قيمةأو رصد ردود النمو postlesional من ON والسماح للتحقيق في التدخلات الدوائية الجينية أو proregenerative لRGCs.
بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم اورده كوسيلة حساسة للغاية للكشف عن ضعف تدريجي في تعزيز إشارة التي ترتبط مع عمليات تنكس محور عصبي مزمن. وتشارك عامل النسخ NF كيلوبايت في صيانة الخلايا العصبية والفئران مع حذف الوحيدات P50 من NF كيلوبايت العرض التي تعتمد على سن فقدان الخلية العصبية ومحور عصبي تنكس داخل منظومة بصرية 19. بالإضافة إلى النسيجي وتحليل الإلكترون المجهري، اورده من إسقاط retino سقفي قادرة على تحديد التغيرات المظهرية في هذه الفئران. عن طريق الاستحواذ مسلسل T 1 صور الرنين المغناطيسي المرجح التالية ivit المنغنيز 2 + التطبيق، ونحن ميز الكلي انخفض من تأخر ببساطة المنغنيز 2 + النقل على طول الممر البصري في هذه P50الفئران KO. وبالتالي، الحصول على البيانات المتكررة من قبل اورده بعد واحد المنغنيز 2 + تطبيق يتيح تعريف حركية النقل محور عصبي والتعديلات العصبية في حوض السباحة لا تقدر بثمن من الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة. حاليا، العديد من التعديلات من ميمري هي قيد التحقيق تهدف إلى جعل هذه التقنية آمنة لتطبيقات التشخيص في البشر. وثمة نهج واعدة ذات الصلة السريرية العالية، والتي يشكل بديلا للivit الحقن، هو تسليم المنغنيز 2 + كما قطرات العين. وبالتالي، والإدارة موضعي من 1 M MnCl 2 أسفرت عن تعزيز إشارة كبيرة بنسبة 20٪ في SC عندما تم الحصول على الصور على 4.7 T الماسح الضوئي الحيوان 31. كانت قادرة على الكشف عن طريقة واسعة ON تنكس الشبكية التالية نقص التروية 31، وتركيز تطبيقها ثبت آمنة عندما يطبق بشكل متكرر في فترات شهرية 32. نظرا لسمية عصبية عالية نسبيا من المنغنيز 2 +
باختصار، يوضح دراستنا أن اورده هو المنهج التجريبي قوية لدراسة circuitries retino-سقفي في الفئران، وبالتالي تمديد المهام البصرية لتقييم وظائف النظام البصري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
ويدعم حزب العدالة والتنمية من قبل مؤسسة أوبنهايم وRH معتمد من قبل مؤسسة VELUX. نشكر أولا Krumbein لBuder التقنية وK. لدعم النسيجي، وJ. غولدشميت (معهد لايبنتز لبيولوجيا الأعصاب، ماغديبورغ، ألمانيا) للحصول على المشورة التقنية بشأن TIMM تلطيخ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Manganese (II) chloride solution 1 M | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI contrast reagent |
| Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% oxybuprocaine hydrochloride |
| Floxal eye drops | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml ofloxacin |
| Ointment panthenol | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420-450 mg/kg body weight |
| Hamilton syringe | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, no NDL |
| 34 G needle (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4 |
| Binocular Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| 3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
| Rat head coil | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
| Mouse holder | custom made | ||
| Red light lamp | |||
| Frozen section medium NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | tissue embedding for cryo-sections |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | for sulfide perfusion |
| Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
| Gum arabic | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | for TIMM staining |
| Hydroquinone (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
| Citric acid (C6H8O7) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
| Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 |
References
- Kretz, A., et al. Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo. Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).
- Lima, S., et al. Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice. Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).
- Lima, S., et al. Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).
- Goetze, B., et al. Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons. Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).
- Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
- Pautler, R. G., et al. In vivo neuronal tract tracing using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Magn Reson Med. 40, 740-748 (1998).
- Watanabe, T., et al. Mapping of retinal projections in the living rat using high-resolution 3D gradient-echo MRI with Mn2+-induced contrast. Magn Reson Med. 46, 424-429 (2001).
- Pautler, R. G. In vivo, trans-synaptic tract-tracing utilizing manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). NMR biomed. 17, 595-601 (2004).
- Haenold, R., et al. Magnetic resonance imaging of the mouse visual pathway for in vivo studies of degeneration and regeneration in the CNS. Neuroimage. 59, 363-376 (2012).
- Lindsey, J. D., et al. Magnetic resonance imaging of the visual system in vivo: transsynaptic illumination of V1 and V2 visual cortex. Neuroimage. 34, 1619-1626 (2007).
- Bearer, E. L., et al. Role of neuronal activity and kinesin on tract tracing by manganese-enhanced MRI (MEMRI). Neuroimage. 37, Suppl 1. S37-S46 (2007).
- Mendonca-Dias, M. H., et al. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Semin Nucl Med. 13, 364-376 (1983).
- Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the optic visual pathway and optic nerve injury in adult rats. J Magn Reson Imaging. 22, 492-500 (2005).
- Sandvig, I., et al. In vivo MRI of olfactory ensheathing cell grafts and regenerating axons in transplant mediated repair of the adult rat optic nerve. NMR biomed. 25, 620-631 (2012).
- Chan, K. C., et al. In vivo retinotopic mapping of superior colliculus using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Neuroimage. 54, 389-395 (2011).
- Chan, K. C., et al. In vivo chromium-enhanced MRI of the retina. Magn Reson Med. 68, 1202-1210 (2012).
- Herrmann, K. H., et al. Possibilities and limitations for high resolution small animal MRI on a clinical whole-body 3T scanner. Magma. 25, 233-244 (2012).
- Villegas-Perez, M. P., et al. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
- Takahashi, Y., et al. Development of spontaneous optic neuropathy in NF-κΒ50-deficient mice: requirement for NF-κΒp50 in ganglion cell survival. Neuropathol Appl Neurobiol. 33, 692-705 (2007).
- Herrmann, K. H. P., et al. MRI compatible small animal monitoring and triggering system for whole body scanners. Z Med Phys. 24, 55-64 (2013).
- Danscher, G., Zimmer, J. An improved Timm sulphide silver method for light and electron microscopic localization of heavy metals in biological tissues. Histochemistry. 55, 27-40 (1978).
- Angenstein, F., et al. Manganese-enhanced MRI reveals structural and functional changes in the cortex of Bassoon mutant mice. Cereb cortex. 17, 28-36 (2007).
- Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the rat visual pathway: acute neural toxicity, contrast enhancement, axon resolution, axonal transport, and clearance of Mn(2). J Magn Reson Imaging. 28, 855-865 (2008).
- Lehmann, K., et al. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restor Neurol Neurosci. 30, 161-178 (2012).
- Takeda, A., et al. Manganese transport in the neural circuit of rat CNS. Brain Res Bull. 45, 149-152 (1998).
- Nairismagi, J., et al. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging of mossy fiber plasticity in vivo. Neuroimage. 30, 130-135 (2006).
- Smith, K. D., et al. In vivo axonal transport rates decrease in a mouse model of Alzheimer's disease. Neuroimage. 35, 1401-1408 (2007).
- Berkowitz, B. A., et al. Noninvasive and simultaneous imaging of layer-specific retinal functional adaptation by manganese-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2668-2674 (2006).
- Schnapf, J. L. B. D. A. How photoreceptor cells respond to light. Sci. Am. 256 (8), (1987).
- Yu, X., et al. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat Neurosci. 8, 961-968 (2005).
- Sun, S. W., et al. Noninvasive topical loading for manganese-enhanced MRI of the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3914-3920 (2011).
- Sun, S. W., et al. Impact of repeated topical-loaded manganese-enhanced MRI on the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4699-4709 (2012).
