В естественных изображений зрительного нерва волокна целостность контрастным усилением МРТ у мышей

Summary

Это видео иллюстрирует способ, с помощью клинического 3 T сканера, для контрастированием МР томографии наивным мыши визуальной проекции и для повторяющихся и продольных естественных условиях исследования в зрительного нерва дегенерации, связанных с острым повреждением зрительного нерва на раздавливание и хронической дегенерации зрительного нерва в нокаут-мышей (р50 ^КО).

Abstract

Грызун визуальная система охватывает ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов, которые формируют зрительный нерв, чтобы войти таламическое и среднего мозга центры и постсинаптические прогнозы на зрительной коре. На основе своего специфического анатомического строения и удобной доступности, он стал излюбленным структура исследований по выживаемости нейронов, регенерации аксонов и синаптической пластичности. Последние достижения в области МРТ позволили визуализации в естественных условиях ретинобластому tectal части этой проекции с использованием марганца опосредованной повышение контрастности (MEMRI). Здесь мы приводим протокол MEMRI для иллюстрации визуальной проекции у мышей, которым резолюции (200 мкм) ³ может быть достигнуто с помощью обычных 3 Tesla сканеры. Мы показываем, как инъекция из одного дозировке 15 нмоль MnCl ₂ приводит к насыщенному повышения неповрежденной проекции в 24 час. За исключением сетчатки, изменения в интенсивности сигнала не зависятвмятина от совпадали визуальной стимуляции или физиологического старения. Кроме того, мы применить эту технику для продольно контролировать дегенерацию аксонов в ответ на острый зрительного повреждения нерва, парадигма, по которому Mn ^{2 +} транспорт полностью аресты на месте повреждения. С другой стороны, активное Mn ^{2 +} транспорт количественно пропорциональна жизнеспособности, числа и электрической активности аксонов волокон. Для такого анализа мы примером Mn ^{2 +} транспортные кинетики вдоль зрительной пути в трансгенных мышах (NF-kB р50 ^KO), где отображаются спонтанное атрофию сенсорные, в том числе визуальных, прогнозов. У этих мышей MEMRI указывает снижается, но не задерживается Mn ^{2 +} транспорт по сравнению с мышами дикого типа, обнаруживая таким образом признаки структурных и / или функциональных нарушений на NF-kB мутаций.

Таким образом, MEMRI удобно соединяет в естественных условиях анализов и послеубойную гистологии для characterizatiна целостности нервных волокон и деятельности. Это очень полезно для продольных исследований по дегенерации аксонов и регенерации, и исследований мутантных мышей для подлинных или индуцибельных фенотипов.

Introduction

На основе его благоприятного нервно-анатомические структуры грызун визуальная система предоставляет уникальные возможности для оценки фармакологических соединений и их способность быть посредником нейропротекцию ¹ или про-регенеративный эффект ^2,3. Кроме того, она позволяет исследования по функциональной и нейро-анатомических характеристик мутантных мышей, как это недавно примера для мышей, лишенных пресинаптического строительных лесов белок Фагот ^4. Кроме того, широкий спектр дополнительных инструментов дает дополнительные показывая сетчатки ганглиозных клеток (РГК) и РГК чисел аксонов, а также РГК деятельности, например, путем электроретинографии и поведенческих тестов и определения корковых перестроек оптическим визуализации внутренних сигналов. Новейшие технические разработки в лазерной микроскопии позволяют на месте визуализации регенерации РГК глубокой ткани флуоресцентной визуализации в целых монтирования образцов зрительного нерва (ON) и мозга. В этом histologческих подход, тетрагидрофуран основе ткани очистка в сочетании с легкой листовой флуоресцентной микроскопии позволяет решить одиночных волокон, что повторного ввода в деафферентированной ON и зрительного тракта ^5. В то время как такие методы могли бы быть выше в разрешении и определения моделей роста, они не позволяют повторяющиеся и продольные анализ отдельных событий роста, которые особенно желательных оценить процесс долгосрочного регенерации.

С контрастным усилением МРТ был использован для минимально инвазивной визуализации проекции ретино-tectal у мышей и крыс ^6,7. Это может быть достигнуто путем непосредственного внутриглазной доставке парамагнитных ионов (например, Mn ^{2 +)} к клеток сетчатки. В аналоговых кальция, Mn ^{2 +} включен в РГК somata через напряжения закрытого кальциевых каналов и активно транспортируется вдоль аксонов цитоскелета неповрежденной ON и зрительного тракта. В то время как он накапливается в ядрах мозгавизуального проектирования, т.е. латерального коленчатого тела (LGN) и верхний бугорок (SC), transsynaptic распространения в первичной зрительной коре появляется незначительным ^8,9, хотя это может произойти ^10,11. Под MR последовательности, парамагнитного Mn ^{2 +} увеличивает MR контраст в основном за счет сокращения T ₁ спин-решеточной релаксации ^12. Такое Mn ^{2 +} МРТ с (MEMRI) успешно применяется в различных нервно-анатомических и функциональных исследований крыс, в том числе оценки регенерации аксонов и дегенерации после ON травмы ^13,14, точное анатомическое отображение ретино-tectal выступа ¹⁵ , а также определения аксонов транспортных характеристик после медикаментозного лечения ^16. Последние уточнения в лекарственных, токсичности и кинетики нейронных Mn ^{2 +} поглощение и транспорт, а также усовершенствованных протоколов МРТ расширили свое применение в исследованиях по трансгенныхмышей ⁹ с использованием 3 Tesla сканеры, обычно используемые в клинической практике ^17.

Здесь мы представляем MEMRI протокол, подходящий для продольное естественных изображений мыши ретино-tectal проекции и примером его применения на основе оценки Mn ^{2 +} в зависимости усиление сигнала в наивных и различных условиях нейродегенерацию. Наш протокол ставит конкретную акцент на сбор данных MR в умеренном 3 T магнитного поля, что, как правило, более доступны, чем выделенных сканеров животных. В наивных мышей, мы проиллюстрируем, как интенсивность сигнала тракта конкретных может быть существенно и воспроизводимо стать увеличилось после стекловидное тело (ivit) Mn ^{2 +} приложения. Количественно, Mn ^{2 +} распространения вдоль зрительной проекции происходит независимо от нормального процесса старения (измеряется от 3 ​​до 26-месячным мышам) и приумножение не поддается визуальной стимуляции и адаптации к темноте. В противоположность этому, Mn 18, а также в nfkb1 нокаут-мышей (р50 ^KO) страдает от спонтанного апоптоза РГК смерти и ПО дегенерации ^19. Таким образом, в расширении к обычной гистологического анализа, продольный MEMRI анализ отдельных животных позволяет профилирование уникальных кинетики нейродегенеративных процессов. Это должно оказаться полезным для исследований по нейропротекции и регенерации аксонов, связанных с фармакологическими или генетических вмешательств.

Protocol

Все вмешательства животных проводятся в соответствии с Европейской конвенцией по уходу за животными и использованию лабораторных животных и Заявление о ARVO для использовании животных в офтальмологической и Vision Research. Все эксперименты одобрено местным комитетом по этике. Порядок НА травмы у мышей описан в другом месте ^9.

1. Интравитреальных Марганец впрыска

1. Выполните Mn ^{2 +} инъекции через 24 часа перед МР сканирование с помощью ассистента. Обезболить животных путем внутрибрюшинной инъекции 5% раствора хлоралгидрата (420-450 мг / кг массы тела в стерильном PBS). Для получения дополнительной местной анестезии, применить одну каплю жидкого conjuncain (гидрохлорид оксибупрокаина 0,4%) к роговице до глаз прокол. Чтобы придать 15 нмоль Mn ^{2 +} в глазу подготовить мМ MnCl решение в 7,5 _2, например, путем разбавления 1 л 1 М MnCl ₂ маточного раствора в 132 LH _{2 <}/ Суб> О. Нагрузка 5 мкл окончательного решения в шприц 5 мкл Hamilton, подключенного к 34 G небольшой ступицы съемной иглой (РН иглы).
2. При запуске с правого глаза, поместите курсор левосторонней под бинокулярным микроскопом и осторожно открытия и исправления правый глаз между большим и указательным пальцами левой руки. Возьмите шприц в правой руке и завладеть иглы недалеко от чаевых. Для атравматичной прокола глаза лампой, осторожно вставьте иглу в стекловидное тело в InFero-временной окружности около 1 мм дистальнее лимба, избавив склеры сосуды.
3. Далее, заместитель медленно относится общий объем 2 мкл, контролируя при этом масштаб шприца Гамильтона. Во время этой процедуры, следить за оптимальное размещение иглы под микроскопом и избежать пункцию объектив или разлив жидкости. Хранить иглу статически, вставленный в течение дополнительных 30 секунд, а затем вывести его медленно, чтобы минимизировать жидкостиутечки из места инъекции.
4. Во время процедуры, особое внимание следует уделить, чтобы избежать давления на глаза. Кроме того, избегать резких или многочисленные попытки проколоть глаз лампу. С Mn ^{2 +} поглощение в РГК и транспорта вдоль ON уже насыщен на 15 нмоль MnCl _2, это сводит к минимуму изменения сигнала на несколько неточных объемов закачки. Для двустороннего усиления сигнала визуального проектирования, повторите процедуру инъекции для левого глаза.
5. Применение офлоксацин, содержащих (3 мг / мл) и глазные капли, содержащие пантенол мазь один раз после процедуры, чтобы предотвратить глазные инфекции и сушку глаза. Возвращаемое мышей в их клетки в нормальных жилищных условий до начала MR сканирования.

2. Животное Подготовка к МРТ

1. Обезболить мышь администрацией 2% / 98% газовой смеси в изофлюран / кислорода. Установите курсор на держателе мыши в почти горизонтальном, раскрученного положении. InsERT она в МР катушку, которая затем доводили внутри МР-томографа. Монитор дыхания и частоты сердечных сокращений по соответствующих систем. Технические подробности см. Херрманн и др. ^20.
2. Во время МРТ, поставка анестезии путем непрерывного вдувания первоначально 1,5% / 98,5% смеси изофлуран / кислород газа через испаритель, подключенного к держателю головной мыши с помощью интегрированного трубки. Во время сканирования, настроить глубину анестезии в соответствии с записанными жизненно важных параметров (то есть стремиться к стабильной частоты дыхания около 40 вдохов в минуту). Использование нагревательного устройства поддерживать температуру поверхности тела стабильную между 35 и 37 ° С, как измерено датчиком температуры, расположенным в брюшной сайта мыши. Технические подробности см. Херрманн и др. ^17.
3. После сканирования, освободить мышь из держателя и поставить с чистым кислородом, чтобы ускорить восстановление после анестезии. Кроме того, поддерживать температуру тела стабильным с помощьюкрасный свет источник нагрева.

3. МРТ протокол

1. Протокол проверяется для Tesla сканера 3, оснащенной специальной, SNR-эффективной, небольшой катушкой животных (линейно поляризованным Литцендрат катушки) с эффективным поле зрения 35 мм × 38 мм в диаметре. Используйте катушку в приемопередающей режиме.
2. С животного в конечное положение, отрегулировать настройки и матч катушки с помощью частотного анализатора. Ручная регулировка опорного напряжения передатчика и прокладка токи для оптимизации однородности и качества изображения.
3. Приобретать T _1, взвешенных изображений 2D TSE с разрешением 0,5 мм × 0,5 мм × 2 мм в сагиттальной и поперечной зрения планирования. Используя планирования МР сканирование, приобрести изображения МЭМР в корональной направлении измерения, поворачивается, чтобы быть параллельным головы животного с фазовым кодированием вдоль влево-вправо. Чтобы свести к минимуму время приема, использовать прямоугольную поле зрения доводят дофактические размеры головы. Применять испорченный последовательность 3D FLASH (VIBE 3D), используя следующие параметры: базовой матрицы 256, поле зрения 54 мм × 50,65 мм × 14,08 мм, с использованием 93,8% прямоугольную поле зрения в фазовом направлении кодирования, и 128 ломтики 0,11-мм толщина среза с разрешением среза установлен в 61%.
4. Активируйте интерполяции в плоскости для создания окончательного изображения с 512 × 480 × 128, обеспечивая эффективное разрешение 0,21 мм × 0,21 мм × 0,18 мм (0,1 мм × 0,1 мм × 0,09 мм с интерполяцией), эхо времени T _E = 6,51 мс, время повторения Т _R = 16 мс, пропускная способность = 160 Гц / PX, флип угол = 22 °. Нанесите два средних и три повторения для достижения общего времени приобретения (Т _A) около 30 мин.

4. МРТ Анализ данных

1. Анализ данных с помощью программного обеспечения Syngo fastView. Для количественного усиления сигнала, выберите определенные регионы ое интерес к 2D плоских МРТ записей и определения интенсивности сигнала (SI) из расширенной структуры (СИ _MEMRI), ткани фоне (СИ _{предпосылка)} и стандартное отклонение шума (SD _N). В случае необходимости, использовать мышь мозга атлас для облегчения нервно-анатомические ориентацию для LGN и SC структур. Рассчитать отношение контраст-шум (CNR), используя формулу:
2. CNR = (СИ _MEMRI - С.И. _{предпосылка)} / SD _N
3. Количественная три последовательных изображений для среднего расчета CNR для каждого образца. В двустороннем порядке вводили животных, анализировать каждое полушарие самостоятельно.
4. Для изображением горизонтальных, фронтальной и сагиттальной изображений, рассчитать многоплоскостной реконструкции из исходного набора данных 3D МРТ. Эти обработанные изображения не рекомендуются для количественного анализа. Для создания анимированных 3D реконструкции (максимальные прогнозы интенсивности, MIPS) на Retino-Tectal проекция, использовать пост-обработки программный модуль ангиографии.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM Окрашивание)

1. Для Тимм окрашивания Mn ^{2 +} прослеживается структур мозга следующей MEMRI, придать дозировку 15-150 нмоль Mn ^{2 +} ivit 24 часа в сутки до визуализации.
2. После того, как MR сканирования, заливать животных с 30 мл ледяной 0,325% Na ₂ S в PBS (рН 7,4). Проанализируйте сетчатки и образцы заморозить в ледяной разделе.
3. Вырезать последовательные, экваториальные участки 15 толщиной мкм на замораживающий микротом.
4. Выполните Тимм окрашивание ²¹ при отсутствии фиксатора и криозащиты согласно Angenstein др. ^22.

6. Статистический анализ

Выполните статистический анализ с использованием Т-теста Стьюдента для отдельных сравнений, а затем постфактум ANOVA. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Отдельные номера N являютсядаются отдельно для каждого эксперимента. Результаты идущие P ≤ 0,05 считаются статистически значимыми (р ≤ 0,05, *, р ≤ 0,01, **, р ≤ 0,001, ***).

Representative Results

Способность этого метода воображения, чтобы точно оценить жизнеспособность и функциональность визуального проектирования опирается на точного применения нетоксичной Mn ^{2 +} дозировке в стекловидное тело и его поглощением РГК. Этот крупный предположение проверяется на рисунке 1, где слой конкретных Mn ^{2 +} поглощение чем свидетельствует autometallography (окрашивания TIMM) ^21. Retina разделы были проанализированы в 24 часов после ivit применения либо 15 нмоль или 150 нмоль Mn ^{2 +,} или PBS в качестве контроля. В этот момент времени, то Mn ^{2 +} инъекционные сетчатки проявлять максимальную усиление сигнала в _Т1 взвешенных МРТ (N = 3; пунктирные линии), в то время как PBS вводили сетчатка не усиливается в сигнал (N = 3; пунктирная линия) (рис. 1 , левая панель). Обратите внимание на гиперинтенсивный усиление сигнала в 150 нмоль введенного глазом. В противоположность этому, nonenhanced области мозга (звездочки) показывают, что аналогичные интенсивности фонового сигнала при всех соnditions (зеленый цвет). Ivit Mn увеличивается ^{2 +} приложений в целом окрашивание TIMM особенно в слое РГК и слоя нервных волокон (NFL) (рис. 1, увеличенные вставками в средней панели), которые подтверждаются расследования индивидуального РГК somata следующее H & E со-маркировка (правая панель).

Для в естественных изображений мыши ретино-tectal проекции, очень важно, чтобы выбрать специальный MEMRI протокол обмена с мышью, где эксплуатационные параметры вместе с оборудованием, как показано на рисунке 2, приспособлены для анализа мышей в поле 3 Т. Применяя такую ​​установку сканера, наши предыдущие показали, что для разрешения изображения ЦНС крыса глава катушки превосходит выделенной мыши всей катушки тела ^17. Чтобы исправить мышиный голову и правильно настроить его положение в крыс катушки, мы используем колыбель и коническую трубку с укуса бар, сделанный из пластика, оба из которых разукрупненных для удовлетворения размеры кузовамышей (фиг. 2A, B). Когда изображения приобретаются на поперечном Т ₁ взвешенной матрицы, реализующего 3D эхо последовательности градиента, генерация изображений с высоким разрешением (200 мкм) ³ в 35 мин времени приобретения можно ожидать. Мы настоятельно рекомендуем постоянный мониторинг жизненно важных функций во время сканирования. Регулировка анестезии вместе с postimaging оксигенации и контроля температуры тела значительно ускоряет время восстановления и гарантирует выживаемость около 100%. Такие технические меры предосторожности необходимы для того, чтобы целая когорта выдержит продольную и повторяющиеся МРТ.

В любом исследовании, только нетоксичными Mn ^{2 +} дозировка 15 нмоль должны использоваться для применения ivit ^9, которая является достаточной для заметно повысить СНРС в сетчатке, ON, и оптический тракт до пресинаптической внутримозгового LGN и SC. Значения CNR лучше рассчитывается из толстого поперечных 200 мкмломтики, полученные из исходных наборов данных МРТ по reslicing исходный объем изотропную 3D. Фиг.3А показывает пример точного определения CNR для повышения LGN, где три области, представляющие интерес, выбранного в каждом изображении для (1) области сигнала с повышенной (SI _MEMRI ), (2) не-аффинное мозговой ткани (СИ _{предпосылка)} и (3) фоновый шум (SD _N). Ожидаемо пространственное усиление сигнала количественно по полноте единого визуального проектирования представлена ​​на рисунке 3В. Обратите внимание на сильный постепенное увеличение усиления сигнала в сетчатке секций вдоль дорсовентральной плоскости, пик которого в головке зрительного нерва. Кроме того, обратите внимание на отсутствие соответствующего transsynaptic Mn ^{2 +} распространения в слоях коры под действием приложенного экспериментальных условиях (снижение сигнала в зрительной коре). ПОМ очень иллюстративный визуализировать 3D позиционирование проекции ретино-tectal в целом (Movie 1).ccumulation из Mn ^{2 +} вдоль зрительной проекции определяется кинетики внутриклеточного поглощения в РГК через напряжения зависимых Са ^{2 +-каналы} и его быстро аксонального транспорта, а также по относительно низкой оформления от ткани-мишени ^13. По нашим предыдущих кинетических исследований, Mn ^{2 +} зависит усиление сигнала могут быть обнаружены уже в 6 часов после инъекции. Он также пики при 24 ч и уменьшается обратно к исходному уровню в течение 120 часов после инъекции ^9. Таким образом, для достижения оптимальных результатов, MEMRI должна быть выполнена через 24 часа после инъекции, которая представляет половину времени, необходимого для повышения крыс ^13.

Изложив принцип для контрастного усиления визуального проектирования по MEMRI, мы далее общаться влияния двух параметров - светлое состояние и животных возраст - которые могут повлиять на количественные измерения:

(1) Для проверки пили стимул-зависимое накопление Mn ^{2 +} в среднем мозге центров, Мышей содержали либо под светло-стимулированных условиях, достигнутых фонарик воздействия определенной частоты (5 Гц) и интенсивности света (3 Вт LED) или в полной темноте до сканирования и во время 24 часов в Mn ^{2 +} экспозиции. Количественный анализ CNR 24 часов после ivit Mn ^{2 +} приложение показывает значительное увеличение интенсивности сигнала от приспособленности к темноте сетчатки по сравнению с условиями освещения стимулированной (66.29 ± 3,07 против 54,56 ± 3,08, р ≤ 0,05, N = 7 / 8; Фигура 3С). Учитывая градиент усиления сигнала между периферийной сетчатки и диска зрительного нерва (см. рисунок 3B), мы уверены, чтобы всегда анализировать соответствующие сетчатки разделы во всех экспериментальных группах. Анализ изображений вдоль в направлении от живота к спине плоскости показал, как и ожидалось, что абсолютные значения CNR идут вниз в обоих условиях. Важно отметить, что относительнаяРазница Ative сигнала между темной и светлой адаптированной сетчатки остается постоянным (данные не представлены). Тем не менее, усиление сигнала в проекционных областях LGN (26.97 ± 1.78 против 26.58 ± 1.05, P = 0,9, N = 7-2) и SC (25.09 ± 1.24 против 26.81 ± 1.55, P = 0,4, N = 7 / 8) неотличима между светлыми и темными условиях кондиционирования (рис. 3C). Этот анализ показывает, что поглощение Mn ^{2 +} в слоях сетчатки чувствительна к освещенности, в то время как его распространение вдоль проекции ретино-tectal и накопления в целевых районах не зависит от совпадающих визуальной стимуляции. Кроме того, чувствительность сигнала 3 T сканера может быть ниже порога обнаружения для изменения сигнала в LGN или SC.

(2) изучить последствия возраста животного на связанных MEMRI усиления сигнала визуального проектирования, мы проанализировали мышей от 3 до 26 месяцев Oе возраст. Значения CNR в LGN из 3 месяца мышей (23.49 ± 1.36, N = 12) не отличаются от интенсивности сигнала, измеренного у мышей в возрасте 7 месяцев (23,90 ± 0,81, р = 0,79, N = 16), 13 месяцев (23,35 ± 1,29, р = 0,94, N = 10) или 26 месяцев (25,10 ± 2,29, р = 0,53, N = 6; Рисунок 3D). Кроме того, интенсивность сигнала в СК не меняется от 3 ​​месяцев (19.01 ± 1.20) и 26-месячного возраста (16,92 ± 2,18, р = 0,37; Рисунок 3D). Хотя небольшое увеличение проявляется в значениях CNR из 26-месячным сетчатки (38.49 ± 3.25), этот рост не достигает значения по сравнению протяжении всех групп (р> 0,05). Эти эксперименты показали, что усиление сигнала в мозговых целевых областях визуального проектирования не зависит от визуальной стимуляции и физиологического старения.

Далее, мы продемонстрировать чувствительность MEMRI обнаружить структурные изменения ое визуальная проекция вызвано острой и хронической аксонопатии. Чтобы исследовать это, модель валлеровский дегенерации индуцируется травматического НА травмы ^18, а также на животных моделях, где отображаются преждевременное, спонтанное перерождение сенсорных проекций в том числе зрительного пути ¹⁹ были заняты:

(1) Травматический аксонопатия индуцируется НА раздавить травмы вызывает поломку Axona пучков. Следовательно, ретинобластому tectal транспорт Mn ^{2 +} вдоль аксонов цитоскелета будет полностью блокирован и устойчиво, как визуализировали путем полной потере Mn ^{2 +} повышенной сигнала в LGN и SC проанализированы один день (не показан), через неделю (фиг. 4А , пунктирные линии), а также 4 недели (не показаны) после травмы. Чтобы ясно продемонстрировать нейроанатомическом и последовательных особенности МР не на травмы и препарировать их от наивного государства, поражение было нанесено только в одностороннем порядке. Это приводит к неизменном Mn ^{2 +} транспорта на тон контрольной стороне в отличие от прерывания индикаторного на стороне вмешательства. Анализ значений CNR в деафферентированной областей подтверждает полное отсутствие усиления сигнала (не показан). Этот эксперимент еще раз демонстрирует, что MEMRI очень чувствительна в обнаружении расположение и тяжесть поражения сайте по продольной оценки интенсивности сигнала вдоль проекции до и после травмы (рис. 4б). В то время как интенсивность сигнала вдоль ON до травмы постоянно остается выше фонового сигнала, есть височно-пространственная падение интенсивности сигнала к фоновому уровню одного дня после ON травмы.

(2) Наша ранние работы показали, что Mn ^{2 +} зависит усиление сигнала в LGN уменьшается в 10 месяцев старые мыши, лишенные субъединицы p50 NF-kB при измерении через 24 часа после инъекции ^9. Обнаружение этого с высокой консистенции, мы предположили, общее ухудшение в ретино-tectal Mn ^{2 +} транспорт, возможно, вызвано уменьшенными РГК и связанных НА нейропатии в старения p50 ^КО мышей ^19. С другой стороны, уменьшить усиление сигнала может быть связано с замедленным нейронов поглощение и распространение Mn ^{2 +} из стекловидного тела и вдоль патологического проекции. Последняя возможность может быть составлен с выполнении повторяющихся МР сканирование после однократного применения 15 нмоль Mn ^{2 +} и изучения кинетики усиления сигнала в сетчатке и LGN в начале (8 и 24 часа в сутки) и поздний (48 и 72 ч) времени пунктов. В дикого типа и p50 ^KO мышей, сетчатки пики повышения сигнала на 8 ч при почти одинаковых ставки повышения (43,52 ± 3,24 и 40,72 ± 2,79, р = 0,6, N = 3-6; Рисунок 4C, слева). В то время как усиление сигнала остается высоким в диких видов в 24 час после инъекции, он отказывается в p50 ^KO мышей (43.38 ± 2.18 против 32,89 ± 1,54, P ≤ 0,01, N = 5-8). Во время более поздних этапах (48 и 72 ч), усиление сигнала уменьшается в обеих группах (с последовательно более низких значениях CNR в нокаут-мышей), таким образом, исключая отложенный сетчатки Mn ^{2 +} поглощения и распространения в p50 ^KO мышей. Соответствующие результаты в LGN р50 ^KO мышей подтверждают это предположение. Несмотря на то, CNR значительно ниже, между 8 и 48 ч после инъекции (P ≤ 0,05, N = 5-9), кинетика затухания сигнала в р50 ^KO мышей соответствует что у мышей дикого типа (фиг. 4C, справа). Таким образом, снижается височно-пространственное улучшение сигнал ретино-tectal проекции в связи с сокращением численности аксонов, происходящих из ограниченного населения РГК, а не обесцененным транспортных кинетики. Мы предлагаем MEMRI, чтобы быть ценным инструментом для скрининга генетических мутантов мыши для проекционных нарушениями ЦНС.

Содержание "FO: держать-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 1. TIMM окрашивание Mn ^{2 +} поглощение в РГК. Представительства тепловой карте образы T ₁ взвешенный МРТ (МРТ Т ₁₎ показывают, усиление сигнала объектива и весь сетчатки окружности (пунктирная линия) 24 часа в сутки после ivit применения 15 нмоль, и гипер-интенсивное усиление сигнала после применения 150 нмоль Mn ^{2 +} (слева). Теплые цвета представляют более высокие значения сигнала, чем холодных цветов. Шкала бар: 1 мм. Ближний / вправо: Mn ^{2 +} поглощение РГК после ivit инъекции MnCl ₂ как обнаруженного серебра осадков помощью Тимм окрашивание (черный цвет). PBS-обработанные участки сетчатки управления демонстрируют весьма слабое окрашивание и диффузного дифференциацию слоя RGC (RGC) (последняя, ​​N = 3). Высокое увеличение не позволяет д. iscrimination отдельных клеток (увеличенные вставками) Ivit MnCl ₂ приложений дифференциально повышает общую окрашивание серебряную через слоев сетчатки, с видным осадков серебра особенно в слоя нервных волокон (НФЛ), РГК слоя и внутреннего ядерного слоя (INL; средней и нижней , увеличенные вставки, N = 3). Colabeling из Тимм с H & E окрашивания еще раз подтверждает такой слой конкретных Mn ^{2 +} накопления (правая панель). Шкала бар, обзор: 50 мкм, увеличение: 25 мкм. IPL, внутренний слой плексиформные; OPL, внешний сетчатый слой; ОНЛ, наружный ядерный слой; НПП, пигментный эпителий сетчатки.

Рисунок 2. Фотографии, показывающие оборудование МРТ специально для мыши МЭМР получения изображений на клинической сканера 3Т. А) показывает на заказ колыбель мыши с бITE фиксация бар голова и датчик для дыхательной мониторинга (белый площадки, синий трубки). B) показывает, расположенную и фиксированную мышь в колыбели. Трубки в левой питания анестезирующий газ. C) является примером позиционирование головы мыши и колыбели внутри линейно поляризованного Litz катушки, работающей в передачи и приема режим. D) показывает катушки платформу в передней части защитного трубки и клиническая 3 Т сканер. Трубка с покрытием меди обеспечивает дополнительную защиту от шума и блоков сигнала МРТ от основанного на нагревательный мат горячей воды (черный оберточной вокруг трубы). Е) визуализирует полную настройку животного катушки внутри поры 3 T сканера просто до позиционирования головки животных именно в изоцентре внутри сканера.

Рисунок 3. MEMRI из наивного ретино-tectal проекции в различных условиях освещенности и возрастных.) Иллюстрация области интереса (ROI) отображения в расширенной LGN и фона ткани на поперечном МРТ записи (слева). ЛГН конкретных усиление сигнала иллюстрируется тепла карте презентации (справа). 1 и 1 ', слева и справа ЛГН; 2 и 2 ', фон ткани; 3, шум; Р, задняя; R правой. Шкала бар:. 100 мкм Б) Пространственное отображение усиления сигнала вдоль одной ретино-tectal проекции как определяется из первоначально приобретенных поперечная МР ломтиками изображения на MEMRI. Заполненные квадраты, Mn ^{2 +} зависит усиление сигнала; открытые треугольники, фоновый сигнал. R, сетчатки; О, зрительного нерва; ОТ, зрительный тракт; ЛГН, латерального коленчатого тела; SC, верхний бугорок; VC, зрительная кора. Толщина среза, 200 мкм. C) Легкий стимуляция значительно снижает сетчатки усиление сигнала. Enhancement в LGN и SC не зависит от визуальной стимуляции. Заполненные кружки, темно-адаптация; белые кружки, свет адаптации. D) усиление сигнала не зависит от увеличения возраста от 3 ​​до 26 месяцев.

Рисунок 4. MEMRI из ретино-tectal проекции под нейродегенеративных состояний. А) MEMRI в двустороннем ivit вводили мышам выполняется через неделю после одностороннего раздавить травмы правого ON. Многоплоскостной реконструкции горизонтальных, корональных и боковым видом изображать полное отсутствие усиления сигнала в LGN и SC для потерпевшего полушарии (пунктирные линии). с, контралатерального полушария; я, ипсилатеральная полушарие. Шкала бар: 1 мм. B) MIP изображения и продольный анализ МРТ пространственного усиления сигнала вдоль ON до ив один прекрасный день после травмы. R, сетчатки; О, зрительного нерва; стрелка, поражения сайт. Шкала бар:.. 0,5 мм C) Кинетика усиления сигнала при хронической нейродегенерации визуального проектирования в p50 ^KO мышей Рано (8 ч) поглощение Mn ^{2 +} в клетках сетчатки не влияет, но уже снижается в LGN р50 мышей ^KO. Повторные МРТ на 24, 48, и (только для сетчатки) в 72 часов показывает устойчивое сокращение сигнала, но подобные кинетика Mn ^{2 +} переноса и накопления в сетчатке и LGN р50 ^KO мышей.

Фильм 1: Анимированные, 3D тепло карту презентация на месте контрастным усилением ретино-tectal проекции МРТ была выполнена через 24 часа после двусторонней ivit инъекции 15 нмоль MnCl _2.. Данные представлены в режиме MIP. Толщина среза, 200 мкм. <Нет созданных плейлистов: = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.

Discussion

MEMRI зрительной системы распространяется обычные нейробиологические методики для оценки функциональности под наивных и патологических состояний. Помимо предоставления уникальную возможность заглянуть в целостности изолированной ЦНС волокна тракта, MEMRI может быть легко дополнен поведенческих тестов, например, оптометрии и задач воды визуально основе, для расследования непосредственных последствий данной парадигмы для зрительного восприятия. Он также связывает электрофизиологических и гистологических исследований с функциональной визуальной характеристики в естественных условиях. Методика высоко надежные и воспроизводимые с небольшими отклонениями в пределах межличностных идентичных групп (см. планки погрешностей на рисунках 3, 4). Интересно, что при дозе 15 нмоль, Mn ^{2 +} поглощение и аксонального транспорта насыщены процессов, так что усиление сигнала достигает плато, которое не может быть повышен за счет дополнительного источника ^{9 +} Mn ^2. С практической точкисмотреть, такой ответ доза характерные минимизирует, по крайней мере, в некоторой степени, инъекций, связанных изменений в усиления сигнала. Следует отметить, что представленные данные по дозировке и кинетики Mn ^{2 +} усиления сигнала специфичны для мышей и отличаются от тех, у крыс, которые требуют примерно 10-20x высокий Mn ^{2 +} дозировку и увеличение задержки (36 ч) для достижения оптимального повышение контрастности ^13,23. Кроме того, повышение вдоль зрительной проекции остается последовательной между животной возрасте от 3 до 26 месяцев. Этот вывод согласуется с визуальными испытаний, выполненных на стареющих мышей и тот факт, что мыши C57/B6 поддержания нормального визуального деятельность до 2 лет ^24. Хотя мы не анализировать отдельные мышей продольно в старения исследования, предыдущие результаты ясно демонстрируют безопасность повторно вводимых Mn ^{2 +} дозах 15 нмоль для визуального обслуживания ^9, которые могли бы быть нужной в продольных исследованиях старения.

В соответствии с понятием, что Mn ^{2 +,} включенного в РГК, мы покажем Mn ^{2 +} поглощение в их somata по Тимм окрашивания которая опирается на серебряной осаждения свободных ионов металлов, применяемым Angenstein соавт. Для внутримозгового Mn ^{2 +} обнаружения следующих его системное приложение ^22. Ранее внутримозговое Mn ^{2 +} распределение было обнаружено с помощью авторадиографии ⁵⁴ Mn ^{2 +} изотопа, чтобы очертить нейронных цепей крысы ЦНС ^25, но не на клеточном уровне. Здесь, окрашивание TIMM позволяет приписывание Mn ^{2 +} поглощение в различных клеточных популяций в пределах открытой сетчатки, где мы находим заметную серебряную осадков в РГК и слоев нервных волокон. Следует отметить, что протокол прикладной демонстрирует улучшенную обнаружение окрашиванием Тимм после применения дозе 150 нмоль сравнению с 15 нмоль Mn ^{2 +.} Хотя Mn ^{2 +} поглощение и его аксонов трансПорт уже насыщены при 15 нмоль, таким образом, не присвоении никакого дополнительного увеличения CNR вдоль ретино-tectal проекции при более высоких дозах, чрезмерное добавки могут повысить доступность бесплатной белка несвязанных Mn ^{2 +} и таким образом сделать его доступным для серебра осадков. Будущие уточнения в окрашивания чувствительности позволит корреляцию значений CNR MEMRI основе конкретных прогнозов ЦНС с сотовой расположения Mn ^{2 +} обогащения в пределах определенной гистологической регионе. Такая возможность может быть полезно для характеристики и количественного определения Mn ^{2 +} распространения в других регионах ЦНС за пределами визуальной проекции. Кроме того, Mn ^{2 +} был использован в модели каинатного токсичности визуализировать дегенерации и регенерации гиппокампа замшелых волокон ^26.

Mn ^{2 +} занимают напряжения каналов зависит кальция и внутриклеточно распространяется активного аксонов транспорта, окн быть заблокирован колхицином ^25,27. Визуальные эксперименты стимуляции на крыс, получавших внутрибрюшинно дозу MnCl _2, показали повышенное усиление сигнала во внутреннем и, в частности, наружной сетчатки ^28. Таким образом, темно-адаптация далее поднимает интенсивности сигнала в наружных слоях сетчатки по сравнению с крыс, подвергавшихся воздействию условий комната свет только, что свидетельствует о чувствительности сетчатки Mn ^{2 +} поглощение в визуальной стимуляции ^28. Аналогично находим повышенную интенсивность сигнала в сетчатке темных адаптированных мышей по сравнению с мышами, подверженных визуальной стимуляции после ivit Mn ^{2 +} приложения. Это может быть связано с конкретным электрофизиологических свойств сетчатки и генерации непрерывного темнового тока в фоторецепторных клеток. С Са ^{2 +} приток в наружных сегментов фоторецепторов вносит значительный вклад в конституции темнового тока, их поколение может сопровождатьсяна более тесное поглощение Mn ^{2 +} в фоторецепторов клеток слоя под темноте. В отличие от этого, световая стимуляция снижает темновой ток и вызывает гиперполяризацию клетки фоторецепторов ^29. Таким образом, в целом Mn ^{2 +} поглощение может быть уменьшена в соответствии с условиями освещения.

Для надежного использования MEMRI, важно уточнить, является ли более выраженным Mn ^{2 +} поглощение в приспособленности к темноте сетчатки изменяет усиление сигнала вдоль других частях зрительной проекции или даже всем своем объеме. Стимуляция зависит от изменения интенсивности MEMRI сигнала головного мозга сетей были продемонстрированы для акустической системы после внутрибрюшинного Mn ^{2 +} приложения ^30. В этом исследовании Ю. и соавт., Крысы подвергались воздействию переменных шумовых частот до того, MR сканирует и Т ₁ взвешенное усиление сигнала из нижней двухолмия впоследствии была исследована. Акустическая стимуляция было обнаружено ЗнаменательныеTLY увеличить интенсивности сигнала MEMRI в tonotopic представления, таким образом, иллюстрирующих МРТ-как характер деятельности зависит от Mn ^{2 +} накопления ^30. В противоположность этому, в наше Экспериментальная установка Mn ^{2 +} накопление в LGN и SC появляется независимо от визуальной стимуляции. Однако такие различия в сенсорных попыток картирования мозга может возникнуть от нижнего магнитного поля и ограниченной порога обнаружения нашего 3-T сканера по сравнению с высоким поле 7 Т сканера, используемого Yu и др. ^30.

На сегодняшний день не известно, в какой степени биофизические параметры влияют антероградную аксонов транспорт Mn ^{2 +} и как MEMRI может служить индикатором для электрической активности. Тем не менее, оказалось, что Mn ^{2 +} передача по РСК происходит, по крайней мере частично, независимо от светло-специфической стимуляции и электрической материалов, полученных от биполярных клеток. Кроме того, чистый эффект электрической аctivity в ретино-tectal проекции может быть результатом электрической стимуляции темной проблематику "OFF-РГК" и светло-отзывчивым "ON-РГК". Такое толкование подтверждается тем фактом, что Mn ^{2 +} транспорт вдоль ретино-tectal проекции не нарушается в линиях мышей с плохим зрением, таких как ЦБ мышей, которые несут RD1 мутации гена PDE6B вызывает дегенерацию сетчатки ^11. В исследовании кинетики на зрячих и СВА мышей дикого типа, наблюдались на начальном этапе приток (в 2,5 часа после инъекции) и для окончательного усиления сигнала (в 24 часов) в LGN и SC ¹¹ сопоставимые ставки транспортные.

Взятые вместе, эти наблюдения подтверждают мнение, что MEMRI, например, зрительной системы в качестве примера здесь, представляет собой ценный меру для структурной целостности и метаболической стабильности, а не для электрической активности. Практически, казалось бы, сТаблица независимость усиления сигнала в коре головного LGN и СК от освещенности позволяет для надежной обработки и содержания животных без специального ухода, насчет освещения. С другой стороны, для MEMRI исследований, которые сосредоточены на сетчатки усиления сигнала, необходимо держать животных под жестким контролем условий освещенности до начала сканирования.

Среди физиологических параметров, которые влияют на Mn ^{2 +} аксональные цены транспортировки и последующего MEMRI усиление сигнала, стабильность температуры тела может иметь особое значение. Об этом свидетельствуют исследования по интраназального Mn ^{2 +} для повышения первичных обонятельных целей проекционных в мозге, где обогащение было установлено, что значительно ослабевает, в то временного снижения температуры тела до 30 ° С по сравнению с сигналом усиления при нормальной температуре тела ^27. Таким образом, температура тела должна контролироваться и регулироваться до и во время МР сканирует не только рrotect здоровье животных, но и нормализовать физиологические параметры Mn ^{2 +} распространения.

Поскольку патофизиологические изменения и метаболические нарушения влияют на аксонов транспортной эффективности Mn ^{2 +,} усиления сигнала в проекционных центров, например, ЛГН и SC, может служить мерой для структурной целостности и функциональной активности этого пути. Здесь мы представляем два разных условия О вырождении и показать, что Mn ^{2 +} размножение и обогащение таламуса и среднего мозга центров варьируется в зависимости от аксонов целостности. Острая По итогам травмы в полной потере сигнала сразу после травмы, которая не восстанавливается в течение 4 недель в связи с отсутствием соответствующей регенерации аксонов, в то время как медленное дегенерации аксонов в р50 ^KO мутанта отражается пониженных значений CNR в LGN. Учитывая возможность продольной томографии, это применение MEMRI может быть ценным еили мониторинга postlesional ответов роста в ON и позволяют для исследования proregenerative генетических или фармакологических вмешательств в РГК.

Кроме того, мы представляем MEMRI как высокочувствительного метода выявления постепенные ухудшения в усиления сигнала, которые связаны с хроническими аксонов процессов дегенерации. Фактор транскрипции NF-kB участвует в нейронной обслуживания и мышей с делецией р50 субъединицы NF-kB дисплея возраст-зависимой гибели нейронов клеток и дегенерации аксонов в зрительной системы ^19. В дополнение к гистологических и в электронном микроскопе анализов, MEMRI из ретинобластому tectal проекции способен идентифицировать фенотипические изменения у этих мышей. По приобретению серийный _Т-1 взвешенных МРТ следующих ivit Mn ^{2 +} приложение, мы выделили в целом уменьшается с просто задержки Mn ^{2 +} перевозок по зрительного пути в этих р50Мышей KO. Таким образом, повторяющиеся сбора данных по MEMRI после однократного Mn ^{2 +} приложения позволяет определение аксонов транспортных кинетики и нейрофизиологических изменений в неоценимой пула доступных генетически модифицированных мышей. В настоящее время несколько модификаций MEMRI находятся под следствием с целью, чтобы сделать этот метод безопасен для диагностических целей у человека. Перспективным подходом большое клиническое значение, что составляет альтернативу ivit инъекции, является поставка Mn ^{2 +} в виде глазных капель. Таким образом, местное применение 1М MnCl ₂ дали значительное усиление сигнала на 20% в СК, когда изображения были приобретены на 4,7 T животных сканера ^31. Метод был в состоянии обнаружить обширный НА дегенерации следующие ишемии сетчатки ^31, а концентрация применяется доказано в безопасности, когда многократно применяться в месячными интервалами ^32. Учитывая относительно высокий нейротоксичность Mn ^{2 +} например, для диагностики рассеянного склероза и других невропатии.

Таким образом, наше исследование показывает, что MEMRI является мощным экспериментальный подход к изучению ретинобластому tectal электрических схем у мышей, таким образом, расширяя оптометрические задач для оценки функциональных возможностей зрительной системы.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908