Dans l'imagerie in vivo de Optic Nerve Fiber intégrité par IRM de contraste amélioré chez la souris

Summary

Cette vidéo illustre un procédé, en utilisant un T scanner clinique 3, pour l'imagerie RM de renforcement du contraste de la projection visuelle de la souris naïve et pour des études répétitives et longitudinaux in vivo de la dégénérescence du nerf optique associés à une lésion du nerf optique à l'écrasement aiguë et de la dégénérescence du nerf optique chronique dans souris knock-out ^(KO p50).

Abstract

Le système visuel de rongeur englobe les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones qui forment le nerf optique pour entrer centres thalamiques et du mésencéphale et projections post-synaptiques dans le cortex visuel. Sur la base de sa structure anatomique distinct et l'accessibilité pratique, il est devenu la structure privilégiée pour les études sur la survie neuronale, la régénération axonale et la plasticité synaptique. Les récents progrès dans l'IRM ont permis la visualisation in vivo de la partie rétino-tectale de cette projection à l'aide de manganèse médiation amélioration du contraste (MEMRI). Ici, nous présentons un protocole MEMRI pour illustration de la projection visuelle chez la souris, que les résolutions de (200 um) ³ peuvent être obtenus en utilisant communes à 3 Tesla. Nous montrons comment l'injection intravitréenne d'une dose unique de 15 nmol _MnCI2 conduit à une amélioration saturé de la projection intact dans les 24 heures. A l'exception de la rétine, des changements dans l'intensité du signal sont indédent de la stimulation visuelle coïncidé ou vieillissement physiologique. Nous appliquons en outre cette technique pour suivre longitudinalement dégénérescence axonale suite à une lésion du nerf optique aiguë, un paradigme qui Mn ^{2 +} transport complètement arrestations sur le site de la lésion. Inversement, Mn ^{2 +} transport actif est quantitativement proportionnelle à la viabilité, le nombre et l'activité électrique des fibres axonales. Pour cette analyse, nous illustrons Mn ^{2 +} cinétique de transport le long du trajet optique dans un modèle de souris transgénique (NF-kB p50 ^KO) l'affichage de l'atrophie spontanée sensorielle, notamment visuelle, des projections. Chez ces souris, MEMRI indique réduite mais non retardé Mn ^{2 +} transport par rapport aux souris de type sauvage, révélant ainsi des signes de dégradations structurales et / ou fonctionnelles des mutations par NF-kB.

En résumé, MEMRI comble bien des essais in vivo et post mortem histologie pour la characterizatisur l'intégrité et l'activité des fibres nerveuses. Il est très utile pour les études longitudinales sur la dégénérescence et la régénération axonale, et les enquêtes de souris mutantes pour phénotypes authentiques ou inductibles.

Introduction

Sur la base de sa structure neuro-anatomique favorable du système visuel rongeur offre des possibilités uniques pour évaluer les composés pharmacologiques et leur capacité à servir de médiateur neuroprotection ¹ ou effets pro-régénératives ^2,3. En outre, il permet des études sur les caractéristiques fonctionnelles et neuro-anatomique de mutants de souris, comme l'a récemment illustré pour les souris dépourvues de la protéine d'échafaudage présynaptique Basson ^4. En outre, un large éventail d'outils complémentaires offre supplémentaire comportant des cellules rétiniennes ganglionnaires (GRC) et le nombre d'axones RGC ainsi que l'activité RGC, par exemple, par électrorétinographie et des tests de comportement, et la détermination des réarrangements corticales par imagerie optique des signaux intrinsèques. Les derniers développements techniques de microscopie laser permettent la visualisation in situ de RGC régénération de tissu profond imagerie de fluorescence dans des spécimens entiers de montage de nerf optique (ON) et le cerveau. Dans ce histologapproche ical, tétrahydrofuranne base compensation des tissus en combinaison avec la lumière microscopie à fluorescence de la feuille permet la résolution des fibres simples qui ré-entrer dans le ON déafférenté et des voies optiques ^5. Bien que de telles techniques pourrait être supérieure à la résolution et la détermination de profils de croissance, ils ne permettent pas d'analyses répétitives et longitudinaux des événements de croissance individuels, qui sont particulièrement souhaités pour évaluer le processus de régénération à long terme.

Contraste l'IRM a été utilisée pour la visualisation invasive de la projection rétino-tectale chez la souris et le rat ^6,7. Ceci peut être réalisé par dépôt intra-oculaire directe des ions paramagnétiques (par exemple, Mn ^{2 +)} à des cellules de la rétine. Comme un analogue de calcium, Mn ^{2 +} est incorporé dans RGC soma via des canaux calciques voltage-dépendants et transporté activement le long du cytosquelette axonal de l'ON intacte et des voies optiques. Bien qu'il s'accumule dans les noyaux du cerveaude la projection visuelle, c'est à dire le corps genouillé latéral (CGL) et colliculus supérieur (SC), propagation transsynaptique dans le cortex visuel primaire semble négligeable ^8,9, mais il peut se produire ^10,11. Sous séquençage MR, paramagnétique Mn ^{2 +} augmente M. contraste principalement en raccourcissant T ₁ spin-réseau temps de relaxation ^12. Cette Mn ^{2 +} amélioré IRM (MEMRI) a été appliquée avec succès dans diverses études neuro-anatomiques et fonctionnelles des rats, y compris l'évaluation de la régénération axonale et la dégénérescence après ON blessures ^13,14, la cartographie anatomique précise de la projection ¹⁵ rétino-tectale , ainsi que la détermination des caractéristiques de transport axonal après le traitement pharmacologique ^16. Améliorations récentes dans les doses, la toxicité, et la cinétique des protocoles IRM neuronales Mn ^{2 +} absorption et le transport, ainsi que l'amélioration ont étendu son application à des études sur transgénique⁹ souris en utilisant 3 Tesla, couramment utilisés dans la pratique clinique ^17.

Ici, nous présentons un protocole approprié pour MEMRI longitudinal imagerie in vivo de la projection rétino-tectale souris et illustrons son applicabilité en évaluant Mn ^{2 +} amélioration du signal dépend des conditions de neurodégénérescence naïfs et divers. Notre protocole met l'accent spécifique sur l'acquisition de données MR dans un champ magnétique modéré 3 T qui est généralement plus accessibles que les scanners pour animaux dédiés. Chez les souris naïves, nous illustrons comment intensité de signal spécifique à l'appareil peut être sensiblement et de façon reproductible devenir augmenté après intravitréenne (ivit) Mn ^{2 +} application. Quantitativement, Mn ^{2 +} propagation le long de la projection visuelle se produit indépendamment du processus normal de vieillissement (mesurée entre les souris de 3 et 26 mois) et l'augmentation est réfractaire à une stimulation visuelle et de l'adaptation à l'obscurité. En revanche, Mn 18 ainsi que dans les souris knock-out NFKB1 (p50 ^KO) souffre de la mort spontanée RGC apoptotique et sur ​​la dégénérescence ^19. Ainsi, l'expansion à l'analyse histologique conventionnelle, analyse MEMRI longitudinal de chaque animal permet le profilage de la cinétique uniques de processus neurodégénératifs. Cela devrait s'avérer utile pour des études sur la neuroprotection et la régénération axonale associés aux interventions pharmacologiques ou génétiques.

Protocol

Toutes les interventions sur les animaux sont effectuées en conformité avec la Convention européenne pour la protection des animaux et l'utilisation des animaux de laboratoire et de la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research. Toutes les expériences sont approuvés par le comité d'éthique local. La procédure de ON blessures chez les souris est décrit ailleurs ^9.

Une. Injection intravitréenne de manganèse

1. Effectuer le Mn ^{2 +} injection 24 heures avant le MR scanner à l'aide d'un assistant. Anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale d'une solution d'hydrate de chloral à 5% (420 à 450 mg / kg de poids corporel dans du PBS stérile). Pour une anesthésie topique supplémentaire, appliquer une goutte de liquide conjuncain (0,4% de chlorhydrate de oxybuprocaïne) de la cornée avant ponction œil. Pour injecter 15 nmol Mn ^{2 +} par oeil préparer une mM MnCl solution 7,5 _2, par exemple, en diluant 1 L de 1 M _MnCI2 solution stock dans 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Charge 5 ul de la solution finale dans une seringue de Hamilton de 5 ul relié à un petit moyeu amovible aiguille 34 G (aiguille RN).
2. Lors du démarrage de l'œil droit, placez la souris du côté gauche sous un microscope binoculaire et ouvrez-le délicatement et fixer l'œil droit entre le pouce et l'index de votre main gauche. Prenez la seringue avec votre main droite et s'emparer de l'aiguille près de la pointe. Pour ponction atraumatique de l'ampoule d'oeil, insérer délicatement l'aiguille dans le corps vitré à la circonférence de inféro-temporal environ 1 mm distale du limbe, épargnant ainsi les navires scléral.
3. Ensuite, l'assistant applique lentement le volume total de 2 pi tout en contrôlant l'échelle de la seringue Hamilton. Au cours de cette procédure, surveiller le placement optimal de l'aiguille sous le microscope et d'éviter la perforation de la lentille ou de déversement du liquide. Gardez l'aiguille insérée statiquement pour un supplément de 30 secondes, puis retirer lentement pour minimiser liquidedes fuites provenant du site d'injection.
4. Tout au long de la procédure, une attention particulière doit être prise pour éviter la pression de l'œil. De même, éviter les tentatives difficiles ou nombreuses à percer l'ampoule d'oeil. Depuis Mn ^{2 +} absorption dans les CGR et le transport le long de la ON est déjà saturé à 15 nmol _MnCI2, ce qui minimise les variations de signal par des volumes d'injection légèrement imprécises. Pour le signal amélioration bilatérale de la projection visuelle, répétez la procédure d'injection pour l'oeil gauche.
5. Appliquer ofloxacine contenant (3 mg / ml) collyre et pommade contenant du panthénol-fois après la procédure de prévenir les infections oculaires et le séchage de l'œil. Remettre les souris dans leurs cages, dans des conditions normales de logement jusqu'à ce que le début de l'examen IRM.

2. Préparation des animaux pour l'IRM

1. Anesthésier les souris par administration d'un mélange à 2% / 98% d'isoflurane gaz / oxygène. Montez la souris sur un support de la souris dans une position presque horizontale sans torsion. Insert-la dans la bobine de MR, qui est ensuite ajustée à l'intérieur de l'appareil d'IRM. Surveillance de la respiration et du rythme cardiaque par des systèmes appropriés. Pour plus de détails techniques, voir Herrmann et al ^20.
2. Au cours de l'IRM, l'anesthésie par insufflation d'alimentation en continu d'un mélange gazeux initialement 1,5% / 98,5% d'isoflurane / oxygène par l'intermédiaire d'un évaporateur relié au support de la tête de la souris par un tube intégré. Lors de l'analyse, ajuster la profondeur de l'anesthésie en fonction des paramètres vitaux enregistrés (c. viser un taux de respiration stable d'environ 40 respirations par minute). L'utilisation d'un dispositif de chauffage à maintenir la température de surface du corps stable entre 35 et 37 ° C, telle que mesurée par un capteur thermique placé à l'emplacement de l'abdomen de la souris. Pour plus de détails techniques, voir Herrmann et al ^17.
3. Après le scan, libérer la souris de son support et fournir de l'oxygène pur à accélérer la reprise de l'anesthésie. En outre, maintenir la température corporelle stable en utilisantune source de chauffage de la lumière rouge.

3. Protocole IRM

1. Le protocole est validé pour une Tesla scanner 3 équipé d'une bobine dédié, SNR efficace petit animal (bobine Litz polarisée linéairement) avec un champ de vue effectif de 35 mm × 38 mm de diamètre. Actionner la bobine en mode d'émission-réception.
2. Avec l'animal dans sa position finale, ajuster la mise au point et la partie de la bobine à l'aide d'un analyseur de fréquence. Ajuster manuellement la tension de référence de l'émetteur et les courants cales afin d'optimiser l'image homogénéité et la qualité.
3. Acquérir T ₁ pondérés images 2D EST avec une résolution de 0,5 mm x 0,5 mm x 2 mm en vue sagittale et transversale de la planification. Utilisation des examens IRM de planification, d'acquérir les images MEMR en direction de mesure coronale, tourné pour être parallèle à la tête de l'animal avec codage de phase dans le sens gauche-droite. Pour réduire le temps d'acquisition, utiliser un champ rectangulaire de vue adaptée à laDimensions de la tête réels. Employer une séquence FLASH 3D gâté (VIBE 3D) en utilisant les paramètres suivants: la matrice de base 256, champ de vision 54 mm x 50.65 mm x 14.08 mm, utilisant un champ rectangulaire de 93,8% de vue en direction de codage de phase, et 128 tranches de 0,11 mm l'épaisseur de la tranche à la résolution de la tranche fixée à 61%.
4. Activer l'interpolation dans le plan pour créer des images finales avec 512 × 480 × 128, offrant une résolution effective de 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm x 0,1 mm x 0,09 mm interpolés), temps d'écho T _E = 6,51 ms, temps de répétition T _R = 16 ms, bande passante = 160 Hz / px, angle de bascule = 22 °. Appliquer deux moyennes et trois répétitions pour obtenir un temps d'acquisition total (T _A) d'environ 30 min.

4. Analyse des données IRM

1. Analyser les données en utilisant le FastView syngo logiciel. Pour l'amélioration quantitative de signal, sélectionnez régions définies ointérêt de f en 2D planaires enregistrements IRM et déterminer l'intensité du signal (SI) de la structure renforcée (SI _MEMRI), fond de tissu (SI _backgr), et l'écart type du bruit (SD _N). Si nécessaire, utiliser un cerveau de souris atlas pour faciliter l'orientation de neuro-anatomique pour LGN et les structures de SC. Calculer le rapport contraste sur bruit (CNR) selon la formule suivante:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _backgr) / SD _N
3. Quantifier trois images consécutives pour le calcul CNR moyenne pour chaque échantillon. Chez les animaux injectés bilatéralement, analyser chaque hémisphère indépendamment.
4. Pour la représentation des images horizontales, frontal et sagittal, calculer reconstructions multiplanaires de l'ensemble original de données IRM 3D. Ces images traitées ne sont pas recommandés pour l'analyse quantitative. Pour créer des reconstructions 3D animés (projections d'intensité maximale, PMI) de la rétinopathie-Tectale projection, utiliser un module logiciel de post-traitement angiographie.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM coloration)

1. Pour TIMM coloration de Mn ² structures cérébrales ⁺ tracées suivant MEMRI, injecter une dose de 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 heures avant l'imagerie.
2. Après numérisation du MR, perfuser les animaux avec 30 ml glacée 0,325% de Na ₂ S dans du PBS (pH 7,4). Disséquer la rétine et des échantillons de gel dans la section congelés.
3. Couper, sections équatoriales séquentielles de 15 um d'épaisseur sur une cryotome.
4. Effectuer TIMM coloration ²¹ en l'absence de fixateur et de cryoprotection selon Angenstein ²² et al.

6. Analyse statistique

Effectuer des analyses statistiques en utilisant le test t de Student pour les comparaisons simples, suivie par la poste ANOVA hoc. Les données sont présentées comme moyenne ± erreur-type. Des numéros individuels N sontséparément pour chaque expérience. Résultats atteignant P ≤ 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

Representative Results

La capacité de cette technique d'imagerie afin d'évaluer avec précision la vitalité et la fonctionnalité de la projection visuelle repose sur une application précise de Mn ^{2 +} posologie non toxique pour le corps vitré et son absorption par les CGR. Cette hypothèse majeure est testée à la figure 1, où la couche spécifique Mn ^{2 +} absorption est démontrée par autometallography (TIMM coloration) ^21. Sections de la rétine ont été analysées à 24 heures après l'application de ivit soit de 15 nmol à 150 nmol ou Mn ^{2 +,} ou du PBS en tant que contrôle. A ce point de temps, les Mn ² rétines ⁺ injectés montrent une amélioration du signal maximal T ₁ IRM pondérée (N = 3; pointillés), alors que le PBS injecté rétine n'est pas améliorée du signal (N = 3, en trait pointillé) (Figure 1 , panneau de gauche). Notez l'amélioration du signal hyperintensive dans l'œil injecté de 150 nmol. En revanche, les zones du cerveau nonenhanced (astérisques) montrent similaires intensités de signal de fond pour tous les conditions (de couleur verte). Ivit Mn ^{2 +} application augmente globalement coloration TIMM en particulier dans la couche RGC et la couche de fibres nerveuses (NFL) (figure 1, encarts agrandies dans le panneau du milieu), qui sont confirmés par l'enquête de personne soma RGC suivante H & E co-marquage (panneau de droite).

Pour l'imagerie in vivo de la projection de la rétino-tectale souris, il est essentiel de choisir un protocole de MEMRI de souris particulier où les paramètres de fonctionnement ainsi que l'équipement, comme illustré sur la figure 2, sont adaptés pour analyser les souris dans un domaine de 3 T. L'application d'une telle installation du scanner, nos travaux antérieurs ont révélé que, pour la résolution d'image du système nerveux central d'une bobine de tête de rat est supérieure à un ensemble de bobine de corps de la souris dédié ^17. Pour fixer la tête murin et à régler correctement sa position dans la bobine de rat, nous utilisons un berceau et un tube conique avec barre de morsure en plastique, qui sont tous deux revus à la baisse pour atteindre les dimensions du corpsde souris (figures 2A, B). Lorsque les images sont acquises sur une matrice pondérée transversale T ₁ la mise en œuvre de gradient séquences écho 3D, la génération d'images à haute résolution de (200 um) ³ dans les 35 min de temps d'acquisition peut être prévu. Nous recommandons fortement la surveillance constante des fonctions vitales pendant le balayage. Ajustement de l'anesthésie avec postimaging oxygénation et de contrôle de la température du corps accélère de manière significative le temps de récupération et garantit des taux d'environ 100% de survie. Ces précautions techniques sont essentielles pour s'assurer que toute la cohorte soutiendra IRM longitudinal et répétitif.

Dans toute étude, seule une Mn ^{2 +} posologie non toxique de 15 nmol doit être utilisé pour l'application de ivit ^9, qui est suffisante pour améliorer CNR en évidence dans la rétine, ON, et des voies optiques jusqu'à la CGL et SC intracérébrale présynaptique. Valeurs CNR sont mieux calculées à partir de 200 um d'épaisseur transversaletranches obtenues à partir d'ensembles de données d'origine IRM par reslicing le volume isotrope 3D d'origine. figure 3A montre un exemple de détermination CNR précise pour le CGL renforcé, où trois régions d'intérêt sont sélectionnés dans chaque image pour (1) zone de signal améliorée (SI _MEMRI ), (2) un tissu non-affine cerveau (SI _backgr), et (3) le bruit de fond _{(SD N).} L'amélioration du signal spatial expectable quantifié le long de la totalité d'une seule saillie visuel est présenté sur la figure 3B. Notez la forte augmentation progressive de l'amélioration du signal dans les sections de la rétine dans le plan dorso-ventral, qui culmine à la tête du nerf optique. En outre, notez l'absence de Mn ^{2 +} propagation transsynaptique pertinente dans les couches corticales dans les conditions expérimentales appliquées (chute de signal dans le cortex visuel). PMI sont très illustratifs de visualiser le positionnement 3D de la projection rétino-tectale in toto (film 1). Accumulation de Mn ^{2 +} le long de la projection visuelle est déterminée par la cinétique de l'absorption intracellulaire dans les CGR à travers tension dépendantes canaux Ca ^{2 +} et de son transport axonal rapide, ainsi que par le relativement faible clairance du tissu cible ^13. D'après nos études cinétiques précédentes, Mn ^{2 +} amélioration du signal dépendant peut être détectée dès 6 heures après l'injection. En outre, elle culmine à 24 h et diminue à des niveaux de référence dans les 120 heures après l'injection ^9. Par conséquent, pour obtenir des résultats optimaux, MEMRI doit être effectuée 24 h après l'injection, ce qui représente la moitié du temps requis pour la mise en valeur de ¹³ rats.

Après avoir exposé le principe de l'amélioration du contraste de la projection visuelle par MEMRI, nous communiquons davantage les influences de deux paramètres - les conditions de lumière et animale âge - qui peuvent affecter les mesures quantitatives:

(1) Pour tester fou l'accumulation de relance dépendante de Mn ^{2 +} dans les centres du mésencéphale, les souris ont été conservés soit dans des conditions stimulées lumière obtenus par l'exposition de la torche d'une fréquence définie (5 Hz) et l'intensité lumineuse (3 W LED) ou dans l'obscurité complète avant la numérisation et pendant 24 heures de Mn ^{2 +} exposition. L'analyse quantitative de la CNR 24 heures après ivit Mn ^{2 +} demande révèle une augmentation significative de l'intensité du signal de la rétine adaptée à l'obscurité par rapport à des conditions de lumière stimulée (66,29 ± 3,07 vs 3,08 ± 54,56, P ≤ 0,05, N = 7 / 8, la figure 3C). Compte tenu de la pente dans l'amélioration du signal entre la rétine périphérique et la tête du nerf optique (voir la figure 3B), nous avons assuré de toujours analyser sections rétiniennes correspondant dans tous les groupes expérimentaux. analyse de l'image le long du plan de ventro-dorsale a révélé, comme prévu, que les valeurs absolues CNR descendent dans les deux conditions. Surtout, le reldifférence de signal de ative entre rétines adapté obscurité et la lumière demeure persistante (données non présentées). Toutefois, le signal amélioration dans les domaines de projection de LGN (26,97 ± 1,78 vs 1,05 ± 26,58, P = 0,9, n = 7-2) et SC (25,09 ± 1,24 vs 1,55 ± 26,81, P = 0,4, N = 7 / 8) ne se distingue pas entre les environnements de conditionnement claires et sombres (figure 3C). Cet essai démontre que l'absorption de Mn ^{2 +} dans les couches rétiniennes est sensible à l'exposition à la lumière, tandis que sa propagation le long de la saillie et de l'accumulation rétino-tectale dans les zones cibles n'est pas influencée par une stimulation visuelle coïncident. En variante, la sensibilité du signal du scanner de 3 T peut être inférieure au seuil de détection de variation de signal dans la CGL ou SC.

(2) Pour explorer les implications de l'âge de l'animal sur l'amélioration du signal MEMRI liés de la projection visuelle, nous avons analysé la souris entre 3 et 26 mois, of âge. Valeurs CNR dans le LGN des souris 3 mois (23,49 ± 1,36, N = 12) ne diffèrent pas de l'intensité du signal mesuré chez la souris âgée de 7 mois (23,90 ± 0,81, p = 0,79, N = 16), 13 mois (23,35 ± 1,29, P = 0,94, N = 10) ou 26 mois (25,10 ± 2,29, P = 0,53, N = 6; figure 3D). De même, l'intensité du signal dans le SC reste inchangée entre 3 mois (19,01 ± 1,20) et 26 mois (16,92 ± 2,18, P = 0,37; figure 3D). Bien qu'une légère augmentation est évidente dans les valeurs CNR de vieux 26 mois rétines (38,49 ± 3,25), cette augmentation ne soit pas significative par rapport à travers tous les groupes (P> 0,05). Ces expériences indiquent que l'amélioration du signal dans les zones cibles cérébrales de la projection visuelle n'est pas affectée par la stimulation visuelle et vieillissement physiologique.

Ensuite, nous démontrons la sensibilité de MEMRI pour détecter des altérations structurelles of la projection visuelle causée par axonopathie aiguë et chronique. Pour explorer cela, un modèle de dégénérescence wallérienne induite par traumatique ON blessures ¹⁸ ainsi que d'un modèle animal affichage précoce, dégénérescence spontanée des projections sensorielles, y compris la voie visuelle ¹⁹ ont été employés:

(1) axonopathie traumatique induite par ON lésion par écrasement provoque la rupture de Axona fascicules. Par conséquent, le transport de rétino-tectale de Mn ^{2 +} le long du cytosquelette axonal sera complètement et durablement bloqué, comme révélé par la perte totale de Mn ² Signal ⁺ renforcée dans le LGN et SC analysé une journée (non représenté), une semaine (figure 4A , des lignes pointillées), et 4 semaines (non représentés) après la lésion. Pour démontrer clairement les caractéristiques de MR neuroanatomiques et consécutifs de ON blessures et de les disséquer de l'état naïf, la lésion a été infligé que de façon unilatérale. Il en résulte inchangé Mn ^{2 +} transport sur ​​til contrôle côté à la différence de traceur interrompu sur le côté de l'intervention. L'analyse des valeurs CNR dans les domaines déafférenté confirme l'absence totale de rehaussement de signal (non représenté). Cette expérience démontre en outre que MEMRI est très sensible à la détection de l'emplacement et de la sévérité d'un site de lésion par évaluation longitudinale de l'intensité du signal le long de la saillie avant et après le traumatisme (Figure 4B). Bien que l'intensité du signal le long de la ON avant blessure reste constamment au-dessus du bruit de fond, il ya une baisse de temporo-spatiale de l'intensité du signal au niveau de fond un jour après ON blessures.

(2) Un travail antérieur a démontré que Mn ^{2 +} dépendant de l'amélioration du signal dans la CGL est réduit en 10 mois Des souris âgées qui n'ont pas la sous-unité p50 de NF-kB quand elle est mesurée 24 h après l'injection ^9. Détecter ce avec une grande consistance, nous avons supposé une dégradation générale dans rétino-tectale Mn ^{2 +} transle port, éventuellement, causée par un nombre réduit de CGR et liés ON neuropathie dans le vieillissement p50 ^KO souris ^19. En variante, l'amplification du signal réduit peut être associée à une capture neuronale retardée et la propagation de Mn ^{2 +} à partir du corps vitré et le long de la projection pathologique. Cette dernière possibilité peut être explorée en effectuant des analyses de MR répétitives après une seule application de 15 nmol Mn ^{2 +} et étude de la cinétique de rehaussement du signal dans la rétine et LGN au début (8 et 24 heures) et la fin (48 et 72 heures) du temps des points. Chez les souris ^KO de type sauvage et p50, la rétine pics d'amélioration du signal à 8 h taux à peu près identiques d'amélioration (43,52 ± 3,24 et 40,72 ± 2,79, p = 0,6, n = 3-6; figure 4C, gauche). Bien que l'amélioration du signal reste élevé chez les types sauvages à injection h post 24, il décline chez les souris ^KO p50 (43,38 ± 2,18 vs 32,89 ± 1,54; P ≤ 0,01, N = 5-8). Au cours des phases ultérieures (48 et 72 h), l'amélioration du signal diminue dans les deux groupes (avec des valeurs systématiquement inférieurs CNR chez les souris knock-out), excluant ainsi une rétine Mn ^{2 +} retardé l'adoption et à la propagation chez les souris ^KO p50. Les résultats correspondants dans le LGN des souris ^KO p50 confirment cette notion. Bien que le CNR est significativement plus faible entre 8 et 48 heures après l'injection (P ≤ 0,05, N = 5-9), la cinétique de l'atténuation du signal en p50 souris ^KO correspond à celle des souris de type sauvage (figure 4C, à droite). Ainsi, la temporo-spatiale signal de mise en valeur réduite de la projection rétino-tectale est en raison du nombre d'axones réduction provenant d'une population limitée RGC plutôt que la cinétique de transport douteux. Nous vous proposons MEMRI être un outil précieux pour cribler des mutants génétiques de souris pour dépréciations projectionnel dans le SNC.

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Figure 1. TIMM coloration de Mn ^{2 +} absorption dans CGR. Représentatifs chaleur des images de cartes de T ₁ IRM pondérée (IRM T ₁₎ présentera un signal amélioration de la lentille et la totalité de la circonférence de la rétine (en pointillés) de 24 heures après l'application de ivit de 15 nmol, et l'amélioration du signal hyper-intense après l'application de 150 nmol Mn ^{2 +} (à gauche). Les couleurs chaudes représentent des valeurs de signal plus élevés que les couleurs froides. Barre d'échelle: 1 mm. Moyen / droite: Mn ^{2 +} absorption par CGR après injection de ivit de _MnCI2 détectée par précipitation argent en utilisant TIMM coloration (couleur noire). Sections de la rétine contrôle PBS traités démontrent plutôt faible coloration et la différenciation diffuse de la couche RGC (RGC) (en haut, N = 3). Fort grossissement ne permet pas d. Discrimination des cellules individuelles (encarts agrandies) Ivit MnCl demande ₂ augmente de façon différentielle coloration globale d'argent à travers les couches de la rétine, avec une précipitation d'argent importante en particulier dans la couche de fibres nerveuses (NFL), la couche RGC, et la couche nucléaire interne (INL; milieu et en bas , encarts agrandies; N = 3). Co-marquage de TIMM avec coloration H & E confirme encore cette couche Mn ^{2 +} accumulation spécifique (panneau de droite). La barre d'échelle, vue d'ensemble: 50 pm, grossissement: 25 pm. IPL, couche plexiforme interne; OPL, la couche plexiforme externe; ONL, couche nucléaire externe; RPE, l'épithélium pigmentaire rétinien.

Figure 2. Photographies montrant des appareils d'IRM spécifiquement pour MEMR acquisition d'image de la souris sur un scanner 3T clinique. A) montre le berceau de la souris sur mesure avec bite fixation de la tête de la barre et le capteur de surveillance respiratoire (tapis blanc, tube bleu). B) montre la souris positionné et fixé dans le berceau. Les tubes à l'alimentation gauche du gaz anesthésique. C) illustre le positionnement de la tête de la souris et le berceau à l'intérieur de la bobine Litz polarisation linéaire fonctionnant en émission et en réception. D) montre la plate-forme de bobines en face du tube de blindage et la clinique trois T scanner. Le tube revêtu de cuivre offre une protection supplémentaire contre le bruit et bloque le signal d'IRM à partir de la nappe d'eau chaude en fonction de chauffage (d'enveloppement noir autour du tube). E) visualise la mise en place complète de la bobine de l'animal à l'intérieur du pore du scanner de 3 T juste avant de positionner la tête de l'animal avec précision à l'isocentre à l'intérieur du scanner.

Figure 3. MEMRI de la projection rétino-tectale naïf dans diverses conditions de lumière et de l'âge. A) Illustration de la région d'intérêt (ROI) dans la cartographie améliorée LGN et le tissu de fond sur une IRM transversale d'enregistrement (à gauche). LGN amélioration du signal spécifique est illustrée par la carte de chaleur présentation (à droite). 1 et 1 ', à gauche et à droite LGN; 2 et 2 ', le tissu de fond; 3, le bruit; P, postérieur; R, à droite. Barre d'échelle:. 100 um B) la cartographie du territoire de l'amélioration du signal le long d'une projection rétino-tectale unique tel que déterminé à partir de l'origine acquis transversale MR images tranches par MEMRI. Carrés pleins, Mn ^{2 +} amélioration du signal dépendant; triangles vides, le signal de fond. R, de la rétine; ON, le nerf optique; OT, des voies optiques; LGN, noyau genouillé latéral; SC, colliculus supérieur; VC, cortex visuel. L'épaisseur des tranches, 200 um. C) la stimulation de lumière réduit de manière significative l'amélioration du signal de la rétine. Enhancement dans le LGN et SC est indépendante de la stimulation visuelle. Les cercles pleins, adaptation à l'obscurité; cercles ouverts, adaptation à la lumière. D) l'amélioration du signal est indépendante de l'âge croissant entre 3 et 26 mois.

Figure 4. MEMRI de la projection rétino-tectale dans des conditions neurodégénératives. A) MEMRI de souris bilatérale ivit injectés effectuée une semaine après une lésion par écrasement unilatérale du droit ON. Reconstructions multiplanaires de vues horizontales, coronales et latéraux représentent absence totale de mise en valeur du signal dans le LGN et SC pour l'hémisphère lésé (lignes en pointillés). c, hémisphère controlatéral; i, hémisphère ipsilatéral. Barre d'échelle: 1. mm B) images MIP et l'analyse de l'IRM longitudinal de la mise en valeur de signal spatial le long de la ON avant etun jour après la lésion. R, de la rétine; ON, le nerf optique; flèche, site de la lésion. Barre d'échelle:.. 0,5 mm C) Cinétique de signal de mise en valeur en vertu de la neurodégénérescence chronique de la projection visuelle chez les souris ^KO p50 tôt (8 h) l'absorption de Mn ^{2 +} dans les cellules de la rétine n'est pas affectée, mais est déjà réduit dans le CGL de p50 souris ^KO. L'imagerie par résonance magnétique répétitive à 24, 48, et (seulement pour la rétine) à 72 h montre la réduction du signal soutenue, mais une cinétique similaire de Mn ^{2 +} de transport et d'accumulation dans la rétine et des LGN souris ^KO de p50.

Film 1: Animation, chaleur carte 3D de la présentation in situ projection rétino-tectale contraste amélioré dans l'IRM a été réalisée 24 heures après l'injection de ivit bilatérale de 15 nmol _MnCI2.. Les données sont présentées en mode MIP. L'épaisseur des tranches, 200 um. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

Discussion

MEMRI du système visuel s'étend techniques classiques neurobiologiques pour évaluer la fonctionnalité dans des conditions pathologiques et naïfs. En plus de fournir un aperçu unique de l'intégrité d'un isolé CNS faisceau de fibres, MEMRI peut être facilement complétée par des tests de comportement, par exemple, l'optométrie et des tâches à base d'eau visuellement, pour enquêter sur les conséquences immédiates d'un paradigme donné pour la perception visuelle. Il relie également électrophysiologiques et histologiques avec la caractérisation visuelle fonctionnelle in vivo. La technique est très fiable et reproductible avec des écarts mineurs interindividuelles au sein des groupes identiques (voir les barres d'erreur dans les figures 3, 4). Curieusement, à une dose de 15 nmol, Mn ^{2 +} absorption et le transport axonal sont les processus saturé, de sorte que l'amélioration du signal atteint un plateau qui ne peut être élevé par additionnelle Mn ^{2 +} alimentation ^9. D'un point de pratiquevoir, une telle réponse de la dose minimise caractéristiques, au moins dans une certaine mesure, l'injection variations associées à la mise en valeur de signal. Notamment, les données présentées sur la posologie et la cinétique de Mn ^{2 +} amélioration du signal sont spécifiques pour les souris et distinctes de celles des rats, qui exigent une participation d'environ 10-20x supérieur Mn ^{2 +} dosage et augmentation de la latence (36 h) pour obtenir l'amélioration de contraste optimal ^13,23. En outre, la mise en valeur le long de la projection visuelle reste cohérente entre un âge de l'animal de 3 et 26 mois. Ce résultat est en ligne avec les tests visuels réalisés sur des souris vieillissantes et le fait que les souris C57/B6 maintenir l'activité visuelle normale jusqu'à 2 ans d'âge ^{de 24} ans. Bien que nous n'ayons pas analysé souris individuelles longitudinalement dans l'étude de vieillissement, les résultats précédents montrent clairement la sécurité de façon répétitive administrés Mn ^{2 +} doses de 15 nmol pour l'entretien visuel ^9, ce qui peut être souhaité dans des études de vieillissement longitudinales.

Conformément à l'idée que Mn ^{2 +} est incorporé dans RGC, nous montrons Mn ^{2 +} absorption dans leur corps cellulaire par TIMM coloration qui repose sur la précipitation d'argent d'ions métalliques libres, tel qu'il est appliqué par Angenstein et al. Pour intracérébrale Mn ^{2 +} suite à la détection son application systémique ^22. Auparavant, intracérébrale Mn ^{2 +} distribution a été détecté par autoradiographie de ⁵⁴ Mn ^{2 +} isotope pour délimiter des circuits neuronaux du système nerveux central de rat ^25, mais pas au niveau cellulaire. Ici, TIMM coloration permet l'attribution de Mn ^{2 +} absorption de populations de cellules distinctes au sein de la rétine exposée, où nous trouvons important précipitation d'argent dans la GRC et des couches de fibres nerveuses. Il convient de noter que le protocole appliqué montre une détection améliorée par TIMM coloration après application d'une dose de 150 nmol par rapport à 15 nmol Mn ^{2 +.} Bien que Mn ^{2 +} absorption et sa transmission axonalele port est déjà saturé à 15 nmol, donc, conférant aucune augmentation CNR supplémentaires le long de la projection rétino-tectale à des doses plus élevées, la supplémentation excessive pourrait augmenter la disponibilité de la liberté, la protéine non liée Mn ^{2 +} et ainsi la rendre accessible pour la précipitation de l'argent. Améliorations futures de la sensibilité coloration permettront la corrélation des valeurs CNR base de MEMRI de projections CNS spécifiques avec la localisation cellulaire de Mn ^{2 +} enrichissement dans une région histologique défini. Une telle capacité peut également être utile pour la caractérisation et la quantification de Mn ^{2 +} distribution dans d'autres régions du système nerveux central en dehors de la projection visuelle. De même, Mn ^{2 +} a été utilisé dans un modèle de toxicité kaïnate pour visualiser la dégénérescence et de régénération des fibres moussues de l'hippocampe ^26.

Mn ^{2 +} est occupée par les canaux calciques dépendant de la tension et est distribué de manière intracellulaire par transport axonal active, qui can être bloqué par traitement à la colchicine ^25,27. Expériences de stimulation visuelle sur des rats recevant une dose intrapéritonéale de _MnCl2 ont révélé une amélioration du signal augmenté dans le, rétine externe et interne, en particulier ^28. De ce fait, adaptation à l'obscurité soulève en outre des intensités de signal dans les couches extérieures par rapport à la rétine des rats exposés à des conditions de lumière ambiante uniquement, ce qui indique la sensibilité de la rétine Mn ^{2 +} absorption à une stimulation visuelle ^28. De même, on constate une meilleure intensité de signal dans la rétine de souris adaptées sombre par rapport à des souris exposées à une stimulation visuelle après ivit Mn ^{2 +} application. Ceci pourrait être lié aux propriétés électrophysiologiques spécifiques de la rétine et la génération d'un courant d'obscurité en continu dans les cellules photoréceptrices. Depuis influx de ^{Ca2 +} dans les segments externes de photorécepteurs contribue de manière significative à la constitution du courant d'obscurité, leur génération peut être accompagnérenforcée par la co-absorption de Mn ^{2 +} dans la couche des cellules photoréceptrices sous l'obscurité. En revanche, la stimulation lumineuse réduit le courant d'obscurité et entraîne une hyperpolarisation des cellules photoréceptrices ^29. Ainsi, dans l'ensemble Mn ^{2 +} absorption pourrait être diminuée dans des conditions de lumière.

Pour une utilisation fiable de MEMRI, il est important de préciser si le Mn ^{2 +} plus prononcée absorption dans la rétine adaptée à l'obscurité modifie l'amélioration du signal le long d'autres parties de la projection visuelle ou même la totalité de son extension. changements de stimulation dépendant de l'intensité du signal MEMRI des réseaux cérébraux ont été démontrées pour le système acoustique après intrapéritonéale Mn ^{2 +} application ^30. Dans cette étude, par Yu et al., Les rats ont été exposés à des fréquences de bruit variables devant les scans IRM et T ₁ signal pondéré en valeur du colliculus inférieur a ensuite été étudié. Stimulation acoustique a été trouvé à SignificanTLY augmenter MEMRI intensités de signal dans une représentation tonotopique, illustrant ainsi le caractère IRMf comme dépendant de l'activité de Mn ^{2 +} accumulation ^30. En revanche, dans la mise en place expérimentale Mn ^{2 +} accumulation dans la CGL et SC semble indépendant de stimulation visuelle. Toutefois, ces différences dans sensorielles tentatives de cartographie du cerveau pourraient surgir dans le champ magnétique inférieur et le seuil limité de détection de notre scanner 3 T par rapport à la zone 7 T scanner haute utilisée par Yu et al ^30.

A ce jour, on ne sait pas dans quelle mesure les paramètres biophysiques affectent le transport axonal antérograde de Mn ^{2 +} et comment MEMRI peut servir d'indicateur de l'activité électrique. Néanmoins, il apparaît que Mn ^{2 +} transmission par CGR se produit, au moins en partie, indépendamment de la stimulation spécifique de lumière et entrée électrique reçu à partir de cellules bipolaires. Sinon, l'effet net d'une électriquectivité dans la projection rétino-tectale pourrait être le résultat de la stimulation électrique de dark-sensible 'OFF-CGR »et sensible à la lumière" ON-CGR. Une telle interprétation est étayée par le fait que le Mn ^{2 +} transport le long de la projection rétino-tectale ne soit pas compromise dans des souches de souris avec une mauvaise vision, comme les souris CBA qui portent la mutation du gène RD1 PDE6B provoquant la dégénérescence rétinienne ^11. Dans une étude cinétique sur des souris voyants et ABC de type sauvage, les tarifs de transport comparables ont été observés au cours de la phase de l'afflux initial (à 2,5 heures après l'injection) et pour l'amélioration du signal final (à 24 h) dans le LGN et SC ^11.

Pris ensemble, ces observations confirment l'idée selon laquelle MEMRI, par exemple, du système visuel comme exemplifié ici, représente une mesure utile à l'intégrité structurelle et la stabilité métabolique, plutôt que pour l'activité électrique. Pratiquement, ce qui semble sTable indépendance de l'amélioration du signal en LGN cérébrale et SC de l'exposition de lumière permet une gestion robuste et le logement des animaux sans soin particulier concernant l'éclairage. D'autre part, pour les études de MEMRI qui se concentrent sur l'amélioration du signal de la rétine, il est nécessaire de garder les animaux dans des conditions de lumière étroitement contrôlés avant l'analyse.

Parmi les paramètres physiologiques qui affectent Mn ^{2 +} taux de transport axonal et ultérieure amélioration du signal MEMRI, la stabilité de la température du corps peut être d'une importance particulière. Ceci est indiqué par des études sur intranasale Mn ^{2 +} pour la mise en valeur des objectifs de projection olfactifs primaires dans le cerveau, où l'enrichissement a été trouvé à être diminuée de façon significative à une réduction temporaire de la température corporelle à 30 ° C par rapport au signal amélioration des conditions de température normale du corps ^27. Par conséquent, la température du corps doit être contrôlée et ajustée avant et pendant le MR balaye pas seulement à la protéger la santé des animaux, mais aussi de normaliser les paramètres physiologiques du Mn ^{2 +} propagation.

Etant donné que des modifications physiopathologiques et les déficiences métaboliques affectent l'efficacité du transport axonal de Mn ^{2 +,} l'amélioration du signal dans les centres de projection, par exemple, LGN et SC, peuvent servir de mesure de l'intégrité de la structure et l'activité fonctionnelle de cette voie. Ici, nous présentons deux conditions différentes de la dégénérescence et illustrons que Mn ^{2 +} propagation et d'enrichissement dans les centres thalamiques et du mésencéphale varie en fonction de l'intégrité axonale. Aiguë sur les résultats des blessures à une perte totale du signal immédiatement après la blessure, qui ne récupère pas dans les 4 semaines en raison de l'absence de la régénération axonale pertinentes, tout en lente dégénérescence axonale dans la p50 mutante ^KO se traduit par des valeurs CNR réduits dans le CGL. Compte tenu de la possibilité de l'imagerie longitudinale, cette application de MEMRI pourrait être utile fou le suivi des réponses de croissance postlesional de l'ON et de permettre à l'enquête d'interventions génétiques ou pharmacologiques pro-régénérateur à CGR.

En outre, nous présentons MEMRI comme une méthode très sensible pour détecter des déficiences progressives dans l'amélioration du signal qui sont associées avec les processus de dégénérescence axonale chronique. Le facteur de transcription NF-kB est impliquée dans le maintien des neurones et des souris avec deletion de la sous-unité p50 de NF-kB affichage perte de cellules neuronales dépendant de l'âge et la dégénérescence axonale à l'intérieur du système visuel ^19. En plus de l'analyse histologique et microscopique électronique, MEMRI de la saillie de rétino-tectale est capable d'identifier un changement phénotypique chez ces souris. Par l'acquisition de T de série ₁ pondérés images IRM suivants ivit Mn ^{2 +} application, nous distinguons un ensemble réduit d'un Mn ^{2 +} transport tout simplement retardé le long de la voie visuelle dans ces p50Souris KO. Ainsi, l'acquisition de données répétitives par MEMRI après une seule demande ⁺ Mn ² permet la définition de la cinétique de transport axonal et altérations neurophysiologiques dans la piscine précieuse de souris génétiquement modifiées disponibles. Actuellement, plusieurs modifications de MEMRI sont sous enquête visant à faire de cette technique en toute sécurité pour les applications de diagnostic chez l'homme. Une approche prometteuse de grande importance clinique, qui constitue une alternative à ivit injection, est la livraison de Mn ^{2 +} sous forme de gouttes oculaires. Ainsi, l'administration topique de 1 M _MnCI2 a donné une amélioration du signal significatif de 20% dans le SC lorsque les images ont été acquises sur un T scanner 4.7 animale ^31. La méthode a permis de détecter une vaste ON dégénérescence suite à une ischémie rétinienne ^31, et la concentration appliquée prouvé sûr quand répétitive appliquée dans les mois ^32. Compte tenu de la relativement forte neurotoxicité du Mn ^{2 +} par exemple, pour le diagnostic de la sclérose en plaques et d'autres neuropathies.

En résumé, notre étude démontre que MEMRI est une approche expérimentale puissant pour étudier circuiteries rétino-tectales chez la souris, prolongeant ainsi les tâches d'optométrie pour évaluer la fonctionnalité du système visuel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908