Imagem in vivo da fibra óptica Nerve Integrity por ressonância magnética com contraste em Ratos

Summary

Este vídeo ilustra um método, usando um scanner T clínica 3, por MR com contraste de imagem da projeção visual ingênuo do mouse, para estudos in vivo repetitivos e longitudinais de degeneração do nervo óptico associados com lesão por esmagamento do nervo óptico aguda e degeneração do nervo óptico crônica em camundongos knock-out ^(KO p50).

Abstract

O sistema visual de roedores engloba células ganglionares da retina e seus axônios que formam o nervo óptico para entrar centros tálamo e mesencéfalo, e projeções pós-sinápticos para o córtex visual. Com base na sua estrutura anatómica distinta e acessibilidade conveniente, tornou-se a estrutura preferida para estudos sobre a sobrevivência neuronal, regeneração axonal, e plasticidade sináptica. Os recentes avanços na ressonância magnética permitiram a visualização in vivo da parte retino-tectal dessa projeção usando manganês mediada realce de contraste (MEMRI). Aqui, apresentamos um protocolo MEMRI para ilustração da projeção visual em camundongos, pelo qual resoluções de (200 mm) ³ pode ser conseguido usando scanners comuns 3 Tesla. Demonstramos como injecção intravítrea de uma única dose de 15 nmol de _MnCl2 conduz a um acessório saturada de projecção intacto dentro de 24 horas. Com exceção da retina, alterações na intensidade do sinal são indedente de estimulação visual coincidiu ou envelhecimento fisiológico. Aplicamos ainda mais essa técnica para monitorar longitudinalmente degeneração axonal em resposta à lesão do nervo óptico aguda, um paradigma pelo qual Mn ^{2 +} transporte completamente prisões no local da lesão. Por outro lado, Mn ^{2 +} transporte ativo é quantitativamente proporcional à viabilidade, número e atividade elétrica das fibras de axônio. Para tal análise, exemplificamos Mn ^{2 +} cinética de transporte ao longo do caminho visual em um modelo de camundongo transgênico (NF-kB p50 ^KO) exibindo atrofia espontânea de sensorial, incluindo visuais, projeções. Nestes ratos, MEMRI indica reduzida mas não retardada de Mn ^{2 +} transporte, em comparação com ratinhos de tipo selvagem, revelando sinais de deficiências estruturais e / ou funcionais, por mutações de NF-kB.

Em resumo, MEMRI convenientemente pontes ensaios in vivo e post mortem histologia para o characterizatina de integridade e atividade de fibras nervosas. É muito útil para estudos longitudinais sobre degeneração e regeneração axonal e investigações de ratos mutantes para fenótipos genuínos ou induzidas.

Introduction

Com base na sua estrutura neuro-anatômica favorável do sistema visual de roedores oferece possibilidades únicas para avaliar compostos farmacológicos e sua capacidade de mediar neuroproteção ¹ ou efeitos pró-regenerativas ^2,3. Além disso, ele permite que os estudos sobre as características funcionais e neuro-anatômica de mutantes do rato, como recentemente exemplificado para camundongos sem a proteína andaimes pré-sináptico Fagote ^4. Além disso, um amplo espectro de ferramentas complementares proporciona adicional que caracteriza de células da retina gânglio (RGC) e os números de axónios RGC, bem como a actividade das CGR, por exemplo, por electrorretinografia e testes comportamentais, e a determinação de rearranjos corticais por imagiologia óptica de sinais intrínsecos. Os últimos desenvolvimentos técnicos em microscopia a laser permitem a visualização em situ de RGC regeneração por tecidos profundos imagens de fluorescência em amostras inteiras de montagem de nervo óptico (ON) e cérebro. Neste histológicoabordagem iCal, tetra baseado compensação tecido em combinação com a microscopia de fluorescência de luz folha permite a resolução de fibras individuais que re-entrar no ON desaferentada e trato óptico ^5. Enquanto tais técnicas pode ser superior na resolução e determinação de padrões de crescimento, eles não permitem análises repetitivas e longitudinais de acontecimentos individuais de crescimento, as quais são particularmente desejados para avaliar o processo de regeneração a longo prazo.

RM contrastada tem sido empregada para a visualização minimamente invasiva da projeção retino-tectal em camundongos e ratos ^6,7. Isto pode ser conseguido por entrega intra-ocular directa de iões paramagnéticos (por exemplo, Mn ^{2 +)} para as células da retina. Como um análogo de cálcio, Mn ^{2 +} é incorporada RGC somata através de canais de cálcio dependentes da voltagem e ativamente transportado ao longo do citoesqueleto axonal do ON intacta e trato óptico. Enquanto se acumula nos núcleos do cérebroda projecção visual, isto é, o núcleo geniculado lateral (LGN) e colículo superior (SC), a propagação transsináptica no córtex visual primário parece insignificante ^8,9, embora possa ocorrer ^10,11. Sob MR seqüenciamento, paramagnética Mn ^{2 +} aumenta MR contraste principalmente pelo encurtamento _T1 spin-rede tempo de relaxamento ^12. Tal Mn ^{2 +} reforçada MRI (MEMRI) tem sido aplicado com sucesso em vários estudos neuro-anatômicas e funcionais de ratos, incluindo a avaliação da regeneração axonal e degeneração após ON lesão ^13,14, o mapeamento anatômico preciso da ¹⁵ projeção retino-tectal , bem como a determinação das características de transporte axonal após o tratamento farmacológico ^16. Refinamentos recentes na dosagem, toxicidade e cinética de protocolos de ressonância magnética neuronais Mn ^{2 +} absorção e transporte, bem como melhorados têm estendido a sua aplicação aos estudos sobre transgênicosratinhos ⁹ utilizando 3 scanners Tesla vulgarmente utilizados na prática clínica ^17.

Aqui, apresentamos um protocolo adequado para MEMRI longitudinal in vivo de imagens da projeção retino-tectal rato e exemplificar sua aplicabilidade avaliando Mn ^{2 +} aumento do sinal dependente em condições neurodegeneração ingênuos e vários. Nosso protocolo coloca especial ênfase para a aquisição de dados em um MR 3 T campo magnético moderado que geralmente é mais acessível do que os scanners de animais dedicados. Em camundongos ingênuos, que ilustram como a intensidade do sinal específico do trato pode ser substancialmente e reproduzível tornar aumentou após intravítrea (ivit) Mn ^{2 +} aplicação. Quantitativamente, Mn ^{2 +} propagação ao longo da projeção visual ocorre independentemente do processo de envelhecimento normal (medido entre os ratos 3 e 26 meses de idade) e de aumento é refratário a estimulação visual e adaptação à escuridão. Em contraste, Mn 18, bem como em NFKB1 camundongos knock-out ^(KO p50) que sofrem de morte espontânea RGC apoptose e na degeneração ^19. Assim, em expansão para análise histológica convencional, análise MEMRI longitudinal de animais individuais permite perfis de cinética únicas de processos neurodegenerativos. Isso deve ser útil para estudos sobre a neuroproteção e regeneração axonal associados com intervenções farmacológicas ou genéticas.

Protocol

Todas as intervenções animais são realizados em conformidade com a Convenção Europeia para a Animal Care e Uso de Animais de Laboratório ea Demonstração ARVO para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética local. O procedimento de lesão ON em ratos é descrito em outra parte ^9.

1. Intravítrea Manganês Injeção

1. Realize o Mn ^{2 +} injeção 24 horas antes do MR varredura com a ajuda de um assistente. Anestesiar os animais, por injecção intraperitoneal de uma solução de hidrato de cloral a 5% (420-450 mg / kg de peso corporal em PBS estéril). Para anestesia tópica adicional, aplicar uma gota de conjuncain líquido (0,4% de cloridrato de oxibuprocaína) à córnea antes da punção olho. Para injectar 15 nmol de Mn ^{2 +} por olho preparar uma mM _de MnCl2 solução 7,5, por exemplo, por diluição de 1 L de uma solução ₂ M de MnCl estoque em 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Carga 5 ul da solução final numa seringa de 5 mL de Hamilton ligada a um 34 L pequeno cubo de agulha amovível (agulha RN).
2. Ao iniciar com o olho direito, posicione o mouse-esquerda lado sob um microscópio binocular e gentilmente aberta e fixar o olho direito entre o polegar eo dedo indicador de sua mão esquerda. Pegar a seringa com a mão direita e segure a agulha perto da ponta. Por punção atraumática da lâmpada olho, inserir cuidadosamente a agulha para dentro do corpo vítreo a circunferência ínfero-temporal aproximadamente, 1 mm distal do limbo, poupando assim os vasos da esclera.
3. Em seguida, o assistente aplica-se lentamente o volume total de 2 mL, enquanto controla a escala da seringa Hamilton. Durante este procedimento, monitorizar a colocação da agulha óptima sob o microscópio e evitar a perfuração da lente ou o derramamento do líquido. Mantenha a agulha inserida estaticamente para um adicional de 30 segundos, em seguida, retirá-la lentamente para minimizar líquidoperda no local da injeção.
4. Durante todo o processo, deve ser tomado cuidado especial para evitar a pressão no olho. Da mesma forma, evitar tentativas hostis ou numerosas para perfurar o bulbo ocular. Desde Mn ^{2 +} captação no CGR e transporte ao longo da ON já está saturado em 15 nmol _MnCl2, isso minimiza as variações de sinal por volumes de injeção um pouco imprecisas. Para o aumento do sinal bilateral da projeção visual, repita o procedimento de injeção para o olho esquerdo.
5. Aplicar ofloxacina contendo (3 mg / ml), as gotas oculares e pomadas contendo pantenol uma vez após o procedimento para evitar infecções oculares e secagem do olho. Retorne os ratos para suas gaiolas em condições normais de habitação até o início da digitalização MR.

2. Preparação Animal para MRI

1. Anestesiar o rato pela administração de uma mistura de gás isoflurano / oxigênio 2% / 98%. Monte o mouse sobre um suporte de rato em, uma posição quase horizontal sem torção. Insert-o na bobina de MR, que é ajustado, em seguida, no interior do scanner de MR. Monitore a respiração ea frequência cardíaca em sistemas apropriados. Para obter detalhes técnicos, consulte Herrmann et al ^20.
2. Durante MRI, anestesia oferta por insuflação contínua de um 1,5% / 98,5% mistura de gás inicialmente isoflurano / oxigênio através de um evaporador ligado ao suporte da cabeça do rato por um tubo integrado. Durante a verificação, ajustar a profundidade da anestesia de acordo com os parâmetros vitais gravados (ou seja, apontar para uma taxa de respiração estável de cerca de 40 respirações por minuto). Usando um dispositivo de aquecimento de manter a temperatura da superfície do corpo estável entre 35 e 37 ° C, como medido por um sensor de temperatura posicionado no local abdominal do rato. Para obter detalhes técnicos, consulte Herrmann et al ^17.
3. Após a verificação, libertar o rato do suporte e abastecer com oxigênio puro para acelerar a recuperação da anestesia. Para além disso, manter a temperatura do corpo estável usandouma fonte de aquecimento da luz vermelha.

3. Protocolo de MRI

1. O protocolo é validado por um scanner de 3 Tesla equipado com um, SNR-eficiente, pequena bobina animais dedicada (polarizada linearmente bobina Litz) com um campo de visão efetivo de 35 mm x 38 mm de diâmetro. Operar a bobina no modo de transmissão-recepção.
2. Com o animal na sua posição final, ajustar o tom e fósforo da bobina com o auxílio de um analisador de frequência. Ajustar manualmente a tensão de referência do transmissor e as correntes de calços para otimizar a homogeneidade ea qualidade da imagem.
3. Adquirir T ₁ ponderados imagens 2D TSE com uma resolução de 0,5 mm x 0,5 mm x 2 mm de vista longitudinal e transversal para o planejamento. Usando os exames de RM de planejamento, adquirir as imagens MEMR em direção medição coronal, girada para ser paralela à cabeça do animal com a codificação de fase ao longo da direção esquerda-direita. Para minimizar o tempo de aquisição, use um campo retangular de vista ajustado aodimensões da cabeça reais. Empregar uma seqüência FLASH 3D mimada (VIBE 3D), utilizando os seguintes parâmetros: matriz de base 256, campo de visão 54 milímetros × 50,65 milímetros × 14,08 milímetros, utilizando 93,8% de campo de visão retangular na direção de codificação de fase, e 128 fatias de 0,11 mm espessura de corte com a resolução definida fatia para 61%.
4. Ative a interpolação no plano para criar imagens finais com 512 × 480 × 128, proporcionando uma resolução efetiva de 0,21 mm x 0,21 milímetros × 0,18 milímetros (0.1 mm x 0,1 mm x 0,09 milímetros interpolado), tempo de eco T _E = 6,51 ms, tempo de repetição T _R = 16 ms, largura de banda = 160 Hz / px, ângulo de inclinação = 22 °. Aplicar duas médias e três repetições para obter um tempo de aquisição total (T _A) de cerca de 30 min.

4. RM Análise de Dados

1. Analisar os dados usando o software fastView syngo. Para o aumento do sinal quantitativa, selecione regiões definidas of interesse em gravações de ressonância magnética planares 2D e determinar a intensidade do sinal (SI) da estrutura de reforço da (SI _MEMRI), o fundo do tecido _(Fundo SI), e o desvio padrão do ruído (SD _N). Quando necessário, use um atlas do cérebro do rato para facilitar a orientação neuro-anatômica para LGN e estruturas SC. Calcula-se a razão de contraste-ruído (CNR) usando a fórmula:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _Fundo) / SD _N
3. Quantificar três imagens consecutivas para o cálculo CNR média para cada amostra. Em animais injectados bilateralmente, analisar cada hemisfério independentemente.
4. Para representação de imagens horizontais, coronal e sagital, calcule reconstruções multiplanares do conjunto original de dados de MRI 3D. Estas imagens processadas não são recomendados para análise quantitativa. Para criar reconstruções 3D animadas (projeções de intensidade máxima, MIPS) da retinoProjeção tectal, use um módulo de software de pós-processamento de angiografia.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM Coloração)

1. Para TIMM coloração de Mn ^{2 +} estruturas cerebrais traçadas seguinte MEMRI, injetar uma dose de 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 horas antes da imagem.
2. Depois do MR varredura, perfuse os animais com 30 ml gelada 0,325% Na ₂ S em PBS (pH 7,4). Dissecar retina e amostras congeladas na seção de congelados.
3. Corte seqüenciais, seções equatoriais da espessura 15 mM em um cryotome.
4. Realização da coloração TIMM ^21, na ausência de agente fixador e crioprotecção de acordo com ANGENSTEIN et al ^22.

6. Statistical Analysis

Realizar análises estatísticas usando o teste t de Student para comparações individuais, seguido pelo post hoc ANOVA. Os dados são apresentados como média ± erro padrão. Números individuais de N sãodeterminado separadamente para cada experimento. Resultados atingindo P ≤ 0,05 são considerados estatisticamente significativa (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

Representative Results

A capacidade desta técnica de imagem para avaliar com precisão a vitalidade ea funcionalidade da projeção visual depende a aplicação precisa de um atóxico Mn ^{2 +} dosagem para o corpo vítreo e sua absorção pelas CGR. Este pressuposto importante é testado na Figura 1, onde específica Mn ^{2 +} absorção camada é demonstrada por autometallography (coloração TIMM) ^21. Secções da retina foram analisados ​​às 24 h após a aplicação de ivit ou 15 nmol ou 150 nmol de Mn ^{2 +,} ou PBS como controlo. Neste ponto de tempo, as Mn ^{2 +} retinas injetadas mostram um aumento máximo de sinal em T ₁ ponderado MRI (n = 3; linhas ponteadas), ao passo que o PBS injectados retina não é reforçada em sinal (N = 3, a linha pontilhada) (Figura 1 , painel esquerdo). Note-se a melhoria de sinal na 150 nmol olho injetado. Em contraste, as áreas do cérebro nonenhanced (asteriscos) mostram intensidades de sinal de fundo semelhante para todos os conditions (cor verde). Ivit Mn ^{2 +} aplicação aumenta a coloração geral TIMM particularmente na camada RGC e camada de fibras nervosas (NFL) (Figura 1, inserir engrandecido no painel do meio), que são confirmados pela investigação de somata RGC indivíduo seguinte H & E co-rotulagem (painel direito).

Para imagiologia in vivo da projecção retino-tectal rato, que é crítico para seleccionar um protocolo MEMRI rato especial onde os parâmetros operacionais, bem como o equipamento, tal como ilustrado na Figura 2, estão adaptados para analisar os ratos num campo de 3 t. A aplicação de uma tal configuração do scanner, o nosso trabalho anterior revelou que a resolução da imagem CNS uma bobina de cabeça de rato é superior a um rato inteiro dedicado bobina de corpo ^17. Para corrigir o cabeça murino e ajustar adequadamente a sua posição dentro da bobina de rato, usamos um berço e um tubo cônico com bar mordida de plástico, sendo que ambos estão downscaled para atender as dimensões do corpode murganhos (Figuras 2A, B). Quando as imagens são adquiridas em uma matriz transversal T ₁ ponderada implementação gradiente seqüências de eco 3D, a geração de imagens de alta resolução de (200 mm) ³ dentro de 35 min de tempo de aquisição pode ser esperado. Recomendamos fortemente o monitoramento constante das funções vitais durante a varredura. Ajuste de anestesia em conjunto com a oxigenação postimaging e controle de temperatura do corpo acelera significativamente o tempo de recuperação e garante taxas de sobrevivência de cerca de 100%. Tais precauções técnicas são essenciais para garantir que toda a coorte vai sustentar MRI longitudinal e repetitivo.

Em todo o estudo, só um de Mn ^{2 +} de dosagem não tóxico de 15 nmol deve ser utilizado para a aplicação ivit ^9, o que é suficiente para aumentar de forma proeminente RNC na retina, ON, e trato óptico até a LGN intracerebral pré-sináptico e SC. Valores CNR são melhor calculadas a partir de 200 mM transversal de espessuracortes obtidos a partir de conjuntos de dados originais de ressonância magnética por reslicing do volume original 3D isotrópica. Figura 3A mostra um exemplo de determinação CNR preciso para a LGN reforçada, onde três regiões de interesse são seleccionados em cada imagem (1) a área aumentada do sinal (SI _MEMRI ), (2) de tecido não afim cérebro (SI _Fundo), e (3) o ruído de fundo (SD _N). O aumento do sinal espacial expectável quantificados ao longo da totalidade de uma única projecção visual é apresentado na Figura 3B. Observe o forte aumento gradual de aumento do sinal nas seções da retina ao longo do plano dorsoventral, que picos na cabeça do nervo óptico. Além disso, observe a falta de um transsináptica Mn ^{2 +} propagação relevante em camadas corticais, nas condições experimentais aplicadas (queda de sinal no córtex visual). MIPs são altamente ilustrativo de visualizar o posicionamento 3D da projeção retino-tectal in toto (Filme 1). Accumulation de Mn ^{2 +} ao longo da projecção visual é determinado pela cinética da captação intracelular em CGRs por meio de tensão dependente de Ca ^{2 +} e canais e o seu rápido transporte axonal, bem como pela relativamente baixa eliminação a partir do tecido alvo ^13. De acordo com os nossos estudos cinéticos anteriores, Mn ^{2 +} aumento do sinal dependente pode ser detectado tão cedo como 6 horas após a injecção. É mais picos em 24 horas e diminui de volta aos níveis basais dentro de 120 horas pós-injeção ^9. Portanto, para obter os melhores resultados, MEMRI deve ser realizada 24 horas após a injecção, o que representa metade do tempo necessário para os ratos reforço ^13.

Tendo esboçado o princípio para o realce de contraste da projeção visual por MEMRI, comunicamos ainda mais as influências de dois parâmetros - a condição de luz e animal idade - que podem afetar as medições quantitativas:

(1) Para testar fou acumulação dependente de estímulo de Mn ^{2 +} em centros de mesencéfalo, os ratos foram conservados em condições estimulados luz alcançados pela exposição lanterna de uma freqüência definida (5 Hz) e intensidade de luz (LED 3 W) ou em completa escuridão antes do exame e durante 24 horas de exposição de Mn ^{2 +.} A análise quantitativa da CNR 24 horas após ivit Mn ^{2 +} aplicação mostra um aumento significativo da intensidade de sinal de retinas de adaptação ao escuro em comparação com as condições de luz-estimulada (66,29 ± 3,07 vs 54,56 ± 3,08, P ≤ 0,05, N = 7 / 8 A Figura 3C). Dado o gradiente de aumento do sinal entre a retina periférica e a cabeça do nervo óptico (ver Figura 3B), que assegurou a analisar sempre correspondentes secções da retina dentro de todos os grupos experimentais. A análise de imagens ao longo do plano ventrodorsal revelado, como esperado, que os valores absolutos CNR estão indo para baixo em ambas as condições. É importante ressaltar que o reldiferença entre o sinal operatória retina adaptado escuro e luz permanece persistente (dados não mostrados). No entanto, o aumento do sinal em áreas de projecção de LGN (26,97 ± 1,78 vs 26,58 ± 1,05, P = 0,9, N = 7-2) e SC (25,09 ± 1,24 vs 26,81 ± 1,55, P = 0,4, N = 7 / 8) é indistinguível entre ambientes condicionado claras e escuras (Figura 3C). Este ensaio demonstra que a absorção de Mn ^{2 +} em camadas da retina é sensível à exposição à luz, enquanto que a sua propagação ao longo da projecção retino-tectal e acumulação nas áreas de destino não é influenciada por estimulação visual coincidente. Alternativamente, a sensibilidade do sinal do scanner 3 T pode ser inferior ao limite de detecção para a variação do sinal na LGN ou SC.

(2) Para explorar implicações da idade do animal no aumento do sinal MEMRI relacionados da projeção visual, analisamos camundongos entre 3 e 26 meses Sf idade. Valores CNR na LGN de ratos 3 meses de idade (23,49 ± 1,36, N = 12) não diferem a partir da intensidade do sinal medido em camundongos com idade entre 7 meses (23,90 ± 0,81, p = 0,79, N = 16), 13 meses (23,35 ± 1,29, P = 0,94, N = 10) ou 26 meses (25,10 ± 2,29, P = 0,53, N = 6; figura 3D). Da mesma forma, a intensidade do sinal no SC está inalterada entre 3 meses (19,01 ± 1,20) e 26 meses de idade (16,92 ± 2,18, P = 0,37; figura 3D). Apesar de um ligeiro aumento é evidente nos valores de CNR retinae 26 meses de idade (38,49 ± 3,25), este aumento não atingiu significância quando comparado ao longo de todos os grupos (P> 0,05). Estas experiências indicam que o aumento do sinal em áreas-alvo cerebrais do projeção visual não é afetado pela estimulação visual e envelhecimento fisiológico.

Em seguida, vamos demonstrar a sensibilidade do MEMRI para detectar alterações estruturais of a projeção visual causada por axonopatia aguda e crônica. Para explorar isto, um modelo de degeneração Walleriana induzida por lesão traumática ON ^18, bem como um modelo animal exibindo degeneração precoce e espontâneo das projeções sensoriais, incluindo a via visual ¹⁹ foram empregados:

(1) axonopatia traumática induzida por ON lesão por esmagamento provoca a quebra de Axona fascículos. Por conseguinte, o transporte retino-tectal de Mn ^{2 +,} juntamente citoesqueleto axonal será completamente bloqueado e sustentável, como visualizado pela perda completa de Mn ^{2 +} sinal reforçada no LGN e SC analisados ​​num dia (não mostrado), uma semana (Figura 4A , linhas pontilhadas) e 4 semanas (não mostrados) após a lesão. Para demonstrar claramente as características de RM neuroanatômicos e consecutivas de lesão ON e dissecá-los a partir do estado ingênuo, a lesão foi infligida apenas unilateralmente. Isso resulta em inalterado Mn ^{2 +} transporte em tele controlar lado, em contraste com a interrupção de marcador no lado da intervenção. A análise dos valores CNR nas áreas desaferentada confirma a ausência completa de aumento do sinal (não mostrado). Esta experiência demonstra ainda que MEMRI é altamente sensível para detectar a localização e gravidade de um local da lesão por avaliação longitudinal da intensidade do sinal ao longo da projecção, antes e após a lesão (Figura 4B). Embora a intensidade de sinal ao longo do NO antes da lesão permanece constantemente acima do sinal de fundo, existe uma queda de tempo-espacial da intensidade do sinal para o nível de fundo um dia após a lesão EM.

(2) O nosso trabalho anterior demonstrou que a Mn ^{2 +} aumento do sinal dependente do LGN é reduzida em 10 meses ratos velhos que faltam a subunidade p50 de NF-kB quando medidos 24 horas após a injecção ^9. Detectando isso com uma alta consistência, assumimos uma deterioração geral em retino-tectal Mn ^{2 +} transporto, possivelmente causada por redução do número de CGR e relacionados ON neuropatia no envelhecimento p50 ^KO camundongos ^19. Alternativamente, o aumento do sinal reduzido pode ser associada com uma absorção neuronal retardada e propagação de Mn ^{2 +} a partir do corpo vítreo e ao longo da projecção patológica. A última possibilidade pode ser explorada através da realização de exames de RM repetitivos após uma única aplicação de 15 nmol Mn ^{2 +} e estudar a cinética de aumento do sinal na retina e LGN no início (8 e 24 horas) e tarde (48 e 72 horas) Tempo pontos. Em tipo selvagem e p50 ^KO, os picos de melhoria de sinal da retina em 8 horas taxas em quase idênticos realce (43,52 ± 3,24 e 40,72 ± 2,79, p = 0,6, N = 3-6; Figura 4C, à esquerda). Enquanto o aumento do sinal permanece elevada em tipos selvagens em 24 horas pós injeção, ele declina em p50 ^KO (43,38 ± 2,18 vs 32,89 ± 1,54, P ≤ 0,01, N = 5-8). Durante as fases posteriores (48 e 72 horas), o aumento do sinal diminui em ambos os grupos (com valores sempre inferiores para CNR em camundongos knock-out), excluindo, assim, um atraso de retina Mn ^{2 +} absorção e propagação em p50 ^KO. Correspondentes resultados no LGN de p50 ^KO confirmar esta noção. Embora o CNR é significativamente inferior entre 8 e 48 horas pós-injecção (P ≤ 0,05, N = 5-9), a cinética de atenuação do sinal em ratinhos ^KO p50 corresponde ao que em ratinhos de tipo selvagem (Figura 4C, à direita). Assim, o reduzido aumento do sinal temporo-espacial da projeção retino-tectal é devido ao número reduzido de axônios provenientes de uma população RGC limitada ao invés de cinética de transporte de deficiência. Propomos MEMRI para ser uma ferramenta valiosa para a tela mutantes genéticos do rato para deficiências projectional no SNC.

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Coloração Figura 1. TIMM de Mn ^{2 +} captação de CGRs. Imagens de mapa de calor representativos de T ₁ ponderado MRI (ressonância magnética T ₁₎ mostram o aumento do sinal da lente e de toda a circunferência da retina (linha pontilhada) 24 horas após a aplicação de 15 ivit nmol, e aumento do sinal hiper-intensivo após a aplicação de 150 nmol Mn ^{2 +} (esquerda). As cores quentes representam valores de sinal mais elevadas do que as cores frias. Bar escala: 1 mm. Médio / direita: Mn ^{2 +} absorção pelas CGR após a injeção ivit de _MnCl2 como detectado por precipitação de prata utilizando a coloração TIMM (cor preta). Secções de retina de controlo tratados com PBS demonstram a coloração bastante fraca e diferenciação difusa da camada de RGC (RGC) (em cima, N = 3). Alta ampliação não permite d. aplicação iscrimination de células individuais (inserir ampliadas) Ivit _MnCl2 diferencialmente aumenta coloração com prata global entre as camadas da retina, com uma precipitação de prata particularmente proeminente na camada de fibras nervosas (NFL), a camada de RGC, e a camada nuclear interna (INL, meio e fundo , inserções ampliados, N = 3). Colabeling de TIMM com H & E coloração mais confirma tal camada de Mn ^{2 +} acumulação específico (painel direito). Barra de escala, visão geral: 50 mm, ampliação: 25 m. IPL, camada plexiforme interna; OPL, camada plexiforme externa; ONL, camada nuclear exterior; RPE, epitélio pigmentar da retina.

Figura 2. Fotografias mostrando equipamentos de ressonância magnética especificamente para rato MEMR aquisição de imagem em um scanner 3T clínica. A) mostra o berço do rato feito sob medida com bite fixação cabeça bar eo sensor de monitorização respiratória (pad branco, azul tubo). B) mostra o mouse posicionado e fixado no berço. Os tubos para a esquerda o fornecimento de gás anestésico. C) exemplifica o posicionamento da cabeça de rato e um suporte no interior da bobina de Litz linearmente polarizada a operar em modo de transmissão e de recepção. D) mostra a plataforma de bobina em frente do tubo de blindagem e o 3 clínico digitalizador t. O tubo revestido de cobre fornece proteção adicional contra ruídos e bloqueia o sinal de ressonância magnética da esteira de aquecimento de água quente com base (embalagem preta ao redor do tubo). E) visualiza a configuração completa da bobina de animais dentro do poro do scanner 3 T apenas antes de posicionar o animal cabeça precisamente no isocentro dentro do scanner.

Figura 3. MEMRI da projeção retino-tectal ingênuo sob diferentes condições de luz e idade. A) Ilustração da região de interesse (ROI) de mapeamento em maior LGN e tecido plano em um MRI transversal gravação (esquerda). LGN aumento do sinal específico é ilustrado pelo mapa de calor apresentação (direita). 1 e 1 ', para a esquerda e LGN direita; 2 e 2 ', o tecido de base; 3, o ruído; P, posterior; R, direita. Barra de escala:. 100 mm B) mapeamento espacial da melhoria do sinal ao longo de uma única projeção retino-tectal determinado a partir de fatias de imagem de RM transversal originalmente adquiridos por MEMRI. Quadrados preenchidos, Mn ^{2 +} aumento do sinal dependente; triângulos abertos, sinal de fundo. R, a retina; ON, nervo óptico; OT, trato óptico; LGN, núcleo geniculado lateral; SC, coliculo superior; VC, córtex visual. A espessura de corte, 200 m. C) estimulação de luz reduz significativamente o aumento do sinal da retina. Enhancement no LGN e SC é independente da estimulação visual. Círculos preenchidos, escuro-adaptação; melhoria de sinal círculos abertos, adaptação de luz. D) é independente do aumento da idade entre 3 e 26 meses.

Figura 4. MEMRI da projeção retino-tectal em condições neurodegenerativas. A) MEMRI de camundongos injetados bilateralmente ivit realizada uma semana após lesão por esmagamento unilateral do direito ON. Reconstruções multiplanares de pontos de vista horizontal, coronal, e laterais retratam completa ausência de aumento do sinal na LGN e SC para o hemisfério lesado (linhas pontilhadas). c, hemisfério contralateral; i, hemisfério ipsilateral. Barra de escala:. 1 milímetro B) imagens MIP e análise de ressonância magnética longitudinal do aumento do sinal espacial ao longo do ON antes eum dia após a lesão. R, a retina; ON, nervo óptico; seta, local da lesão. Barra de escala:.. Cedo (8 horas) absorção de 0,5 milímetros C) Cinética de aumento do sinal em neurodegeneração crônica da projeção visual em p50 ^KO de Mn ^{2 +} em células da retina não é afetado, mas já é reduzida na LGN de p50 ^KO. Imaging repetitivo MR 24, 48, e (apenas para retina) a 72 hr mostra redução sinal sustentado, mas cinética semelhantes de Mn ^{2 +} transporte e acumulação na retina e LGN de p50 ^KO.

Filme 1: Animated, heat map 3D apresentação da na projeção retino-tectal situ com contraste ressonância magnética foi realizada 24 horas após a injeção ivit bilateral de 15 nmol _MnCl2.. Os dados são apresentados no modo de MIP. A espessura de corte, 200 mM. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" target = "_blank"> Clique aqui para ver este vídeo.

Discussion

MEMRI do sistema visual estende técnicas neurobiológicas convencionais para avaliar a funcionalidade em condições ingênuos e patológicos. Além de oferecer uma perspectiva única sobre a integridade de um isolado CNS trato fibra, MEMRI pode ser facilmente complementada com testes comportamentais, por exemplo, optometria e tarefas de água com base visualmente, para investigar as conseqüências imediatas de um determinado paradigma para a percepção visual. Ela também liga eletrofisiológico e investigações histológicas com caracterização visual funcional in vivo. A técnica é altamente confiável e reprodutível com variações interindividuais menores dentro de grupos idênticos (ver barras de erro nas figuras 3, 4). Curiosamente, a dose de 15 nmol, Mn ^{2 +} captação e transporte axonal são processos saturado, de modo que o aumento do sinal atinge um patamar, que não pode ser elevado por Mn ^{2 +} fornecimento adicional ^9. Em termos práticos dever, uma resposta à dose minimiza tais características, pelo menos até certo ponto, de injeção de variações associadas na melhoria do sinal. Notavelmente, os dados apresentados sobre dosagem e cinética de Mn ^{2 +} melhoria de sinal são específicos para os ratos e distintos daqueles em ratos, que exigem um 10-20x maior Mn ^{2 +} dosagem aproximadamente e aumento da latência (36 hr) para conseguir aumento de contraste ideal ^13,23. Além disso, a valorização ao longo da projeção visual permanece consistente entre uma idade do animal, de 3 e 26 meses. Este resultado está em linha com testes visuais realizados em ratos envelhecimento eo fato de que os ratos C57/B6 manter a atividade visual normal até 2 anos de idade ^24. Embora nós não analisar ratinhos individuais longitudinalmente no estudo de envelhecimento, os resultados anteriores demonstram claramente a segurança dos administrados repetidamente Mn ^{2 +} doses de 15 nmol para a manutenção gravura ^9, o qual pode ser desejado em estudos de envelhecimento longitudinais.

De acordo com a noção de que a Mn ^{2 +} é incorporada CGRs, mostramos Mn ^{2 +} captação no seu somata por coloração TIMM que se baseia na precipitação de prata de iões metálicos livres, tal como aplicado por ANGENSTEIN et al. Intracerebral de Mn ^{2 +} detecção de sequência sua aplicação sistémica ^22. Anteriormente, intracerebral Mn ^{2 +} distribuição foi detectada por autoradiografia de ⁵⁴ Mn ^{2 +} isótopo para delinear os circuitos neuronais do sistema nervoso central de rato ^25, mas não ao nível celular. Aqui, coloração TIMM permite a atribuição de Mn ^{2 +} captação de populações de células distintas dentro da retina exposta, onde encontramos a precipitação de prata destaque no RGC e camadas de fibras nervosas. Deve notar-se que o protocolo aplicado mostra a detecção melhorada de coloração TIMM após a aplicação de uma dose de 150 nmol em comparação com 15 nmol de Mn ^{2 +.} Apesar de Mn ^{2 +} captação axonal e sua transporta já está saturado a 15 nmol, assim, conferindo nenhum aumento CNR adicional ao longo da projeção retino-tectal em doses mais elevadas, a suplementação excessiva pode aumentar a disponibilidade de livre, a proteína não ligada Mn ^{2 +} e, assim, torná-lo acessível para a precipitação de prata. Refinamentos futuros na sensibilidade coloração vai permitir a correlação de valores de projeções específicas do sistema nervoso central com a localização celular de Mn ^{2 +} enriquecimento dentro de uma região definida histológica CNR baseados em MEMRI. Tal capacidade pode também ser útil para a caracterização e quantificação de Mn ^{2 +} distribuição em outras regiões do SNC fora da projecção visual. Da mesma forma, Mn ^{2 +} foi utilizado em um modelo de toxicidade cainato para visualizar a degeneração e de regeneração das fibras musgosas do hipocampo ^26.

Mn ^{2 +} é ocupado por canais de cálcio dependentes de voltagem e é distribuído por meio intracelular transporte axonal ativo, que can ser bloqueada por tratamento com colchicina ^25,27. Experiências visuais de estimulação em ratos que receberam uma dose intraperitoneal de _MnCl2 revelaram um aumento do realce do sinal na retina interna e, em particular, exterior ^28. Desse modo, adaptação ao escuro aumenta ainda mais intensidade do sinal nas camadas da retina externa em comparação com ratos expostos a apenas condições de luz ambiente, indicando assim a sensibilidade da retina Mn ^{2 +} captação de estimulação visual ^28. De igual modo, encontramos aumentada a intensidade do sinal na retina de ratos adaptados escuro em comparação com os ratos expostos a um estímulo visual após ivit Mn ^{2 +} aplicação. Isto pode estar relacionado com as propriedades electrofisiológicas específicas da retina e a geração de uma corrente escura contínua em células fotorreceptoras. Desde influxo de ^{Ca2 +} em segmentos externos de fotorreceptores contribui significativamente para a constituição do atual escuro, sua geração pode ser acompanhadapelo reforço da co-absorção de Mn ^{2 +} na camada de células fotorreceptoras na escuridão. Em contraste, a estimulação pela luz reduz a corrente escura e faz com que a hiperpolarização das células fotorreceptoras ^29. Assim, em geral Mn ^{2 +} absorção pode ser diminuída sob condições de luz.

Para o uso adequado do MEMRI, é importante esclarecer se o mais pronunciado Mn ^{2 +} captação no retina adaptado ao escuro altera o aumento do sinal ao longo de outras partes da projeção visual ou mesmo toda a sua extensão. Alterações dependentes de estimulação em MEMRI intensidade do sinal de redes cerebrais foram demonstradas para o sistema acústico após intraperitoneal Mn ^{2 +} aplicação ^30. Neste estudo realizado por Yu et al., Os ratos foram expostos a ruído freqüências variáveis ​​antes dos exames de RM e T ₁ o aumento do sinal ponderada do colículo inferior foi posteriormente investigado. Estimulação acústica foi encontrado para significantly aumentará a intensidade de sinal Memri em uma representação tonotópico, exemplificando assim o caráter fMRI-like de Mn ^{2 +} acumulação dependente de atividade ^30. Em contraste, na nossa montagem experimental acumulação de Mn ^{2 +} no LGN e SC parece independente da estimulação visual. No entanto, essas diferenças sensoriais em tentativas de mapeamento do cérebro pode surgir a partir do campo magnético inferior e limitado de limiar de detecção do nosso scanner 3 T, em comparação com o scanner T campo 7 alta utilizada por Yu et al ^30.

Até o momento, não se sabe até que ponto parâmetros biofísicos afectar o transporte axonal anterógrado de Mn ^{2 +} e como MEMRI pode servir como um indicador para a atividade elétrica. No entanto, verifica-se que Mn ^{2 +} transmissão por CGRs ocorre, pelo menos em parte, de forma independente da estimulação específica e entrada de luz eléctrica recebida a partir de células bipolares. Alternativamente, o efeito líquido de um elétricoctivity na projeção retino-tectal pode ser resultado de uma estimulação elétrica sensíveis ao escuro 'OFF-CGR' e leve-responsive 'ON-CGR. Tal interpretação é apoiada pela constatação de que Mn ^{2 +} transporte ao longo da projeção retino-tectal não é prejudicada em linhagens de camundongos com baixa visão, como camundongos CBA que carregam a mutação do gene RD1 Pde6b causando degeneração da retina ^11. Em um estudo cinético em camundongos selvagens avistados e CBA, foram observadas taxas de transporte comparáveis ​​durante a fase de fluxo inicial (em 2,5 horas pós-injeção) e para o aumento do sinal final (às 24 horas), no LGN e SC ^11.

Tomados em conjunto, estas observações apoiam a noção de que MEMRI, por exemplo, do sistema visual, tal como exemplificado aqui, representa uma medida útil para a integridade estrutural e estabilidade metabólica do que para a actividade eléctrica. Na prática, o aparentemente sindependência mesa de aumento do sinal em LGN cerebral e SC da exposição à luz permite a manipulação e alojamento de animais robusto sem um cuidado especial sobre iluminação. Por outro lado, para estudos Memri que incidem sobre o aumento do sinal da retina, é necessário para manter os animais em condições de luz altamente controlados antes do exame.

Entre os parâmetros fisiológicos que afetam Mn ^{2 +} taxas de transporte axonal e posterior aumento do sinal MEMRI, a estabilidade da temperatura do corpo pode ser de particular importância. Isso é indicado por estudos sobre intranasal Mn ^{2 +} para o aprimoramento das metas de projeção olfativas primárias no cérebro, onde o enriquecimento foi encontrado para ser significativamente diminuída em uma redução temporária da temperatura corporal a 30 ° C em relação a sinalizar aumento sob a temperatura normal do corpo ^27. Portanto, a temperatura do corpo deve ser monitorizada e ajustada, antes e durante o MR verifica não apenas para protect a saúde dos animais, mas também para normalizar os parâmetros fisiológicos de Mn ^{2 +} propagação.

Uma vez que as alterações patofisiológicas e deficiências metabólicas afectar a eficácia do transporte axonal de Mn ^{2 +,} o aumento do sinal em centros de projecção, por exemplo, LGN e SC, pode servir como uma medida para a integridade estrutural e a actividade funcional deste caminho. Aqui, apresentamos duas condições diferentes de ON degeneração e ilustrar que Mn ^{2 +} propagação e enriquecimento em centros tálamo e mesencéfalo varia em função da integridade axonal. Agudos sobre provoca lesões em uma perda sinal total imediatamente após a lesão, o que não se recuperar dentro de 4 semanas, devido à falta de regeneração axonal relevante, enquanto a degeneração axonal lento no p50 mutante ^KO é refletida por valores reduzidos CNR no LGN. Dada a possibilidade de imagiologia longitudinal, esta aplicação de MEMRI pode ser valiosa fou monitorar respostas de crescimento postlesional do ON e permitir a investigação de intervenções genéticas ou farmacológicas proregenerative a CGR.

Além disso, apresentamos MEMRI como um método altamente sensível para detectar deficiências graduais na melhoria do sinal que estão associados com os processos de degeneração axonal crônica. O factor de transcrição NF-kB está envolvida na manutenção neuronal e ratinhos com supressão da subunidade p50 de NF-kB visor perda celular neuronal dependente da idade e degeneração axonal no sistema visual ^19. Em adição à avaliação histológica e microscópica de electrões analisa, MEMRI da projecção retino-tectal é capaz de identificar alterações fenotípicas nestes ratinhos. Por aquisição da T série ₁ imagens ponderadas MR seguintes ivit Mn ^{2 +} aplicação, distinguiu um total reduziu-se de um Mn ^{2 +} transporte simplesmente adiada ao longo da via visual nestes p50KO. Desse modo, a aquisição de dados repetitivos por MEMRI após uma única Mn ^{2 +} aplicação permite a definição da cinética de transporte axonal e alterações neurofisiológicas na piscina inestimável de camundongos geneticamente modificados disponíveis. Atualmente, várias modificações de MEMRI estão sob investigação com o objetivo de tornar esta técnica segura para aplicações de diagnóstico em seres humanos. Uma abordagem promissora de alta relevância clínica, o que constitui uma alternativa à ivit injecção, é o fornecimento de Mn ^{2 +,} como gotas oculares. Dessa forma, a administração tópica de 1 M _MnCl2 rendeu um aumento do sinal significativo de 20% na SC quando as imagens foram adquiridas em um scanner de animais 4.7 T ^31. O método foi capaz de detectar extensa ON degeneração após isquemia da retina ^31, ea concentração aplicada se mostrado segura quando repetidamente aplicado em intervalos mensais ^32. Dada a relativamente alta neurotoxicidade de Mn ^{2 +} por exemplo, para o diagnóstico de esclerose múltipla e outras neuropatias.

Em resumo, nosso estudo demonstra que MEMRI é uma abordagem experimental poderosa para estudar circuitos retino-tectal em camundongos, alargando assim as tarefas de optometria para avaliar a funcionalidade do sistema visual.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908