In vivo avbildning av Optic Nerve Fiber Integrity genom Contrast-Enhanced MRI hos möss

Summary

Denna video visar en metod, med hjälp av en klinisk 3 T scanner, för kontrastförstärkt MR-avbildning av naiva musen visuell projektion och för repetitiva och longitudinella in vivo-studier av synnerven degeneration i samband med akut synnerven krosskada och kronisk synnerven degeneration i knock-out-möss (p50 ^KO).

Abstract

Den gnagare visuella systemet omfattar näthinneganglieceller och deras axoner som bildar synnerven ange talamiska och mitthjärnan center och postsynaptiska prognoser till syncentrum. Utifrån sin distinkta anatomiska struktur och bekväm tillgänglighet, har det blivit gynnad struktur för studier av neuronal överlevnad, axonal regeneration, och synaptisk plasticitet. Nya framsteg inom MR har möjliggjort visualisering av Retino-tectal del av denna projektion med hjälp av mangan medierad kontrastförbättring (MEMRI) in vivo. Här presenterar vi en MEMRI protokoll för illustration av visuell projektion i möss, genom vilka resolutioner (200 nm) ³ kan åstadkommas med hjälp av vanliga 3 Tesla skannrar. Vi visar hur intravitreal injektion av en enda dos av 15 nmol _MnCl2 leder till en mättad förbättring av den intakta projektion inom 24 timmar. Med undantag av näthinnan, är förändringar i signalintensitet oberoende av sammanföll visuell stimulans eller fysiologiska åldrande. Vi tillämpar vidare denna teknik för att på längden övervaka axonal degeneration till följd av akut optisk nervskada, ett paradigm av vilken Mn ^{2 +} transport helt gripanden vid skadestället. Omvänt är aktiv Mn ^{2 +} transport kvantitativt proportion till lönsamhet, antal, och elektriska aktivitet axon fibrer. För en sådan analys, vi exemplifiera Mn ^{2 +} transport kinetik längs den visuella vägen i en transgen musmodell (NF-kB p50 ^KO) visar spontan atrofi av sensoriska, inklusive visuella, projektioner. I dessa möss, visar MEMRI minskat, men inte försenas Mn ^{2 +} transporter jämfört med vildtyp möss, vilket visar tecken på strukturella och / eller funktionsnedsättningar av NF-kB-mutationer.

Sammanfattningsvis MEMRI överbryggar lämpligen in vivo och efter slakt histologi för characterizatiden av nervfiber integritet och aktivitet. Det är mycket användbart för longitudinella studier på axonal degeneration och regeneration, och undersökningar av muterade möss för äkta eller inducerbara fenotyper.

Introduction

Utifrån sin gynnsamma neuro-anatomiska struktur gnagare visuella systemet erbjuder unika möjligheter att utvärdera farmakologiska föreningar och deras förmåga att fungera som neuroprotektion ¹ eller pro-regenerativa effekter ^2,3. Dessutom tillåter det studier om de funktionella och neuro-anatomiska egenskaper mutanter mus, som nyligen exemplifieras för möss som saknar den presynaptiska byggnadsställningar proteinet Fagott ^4. Dessutom ett brett spektrum av kompletterande verktyg ger ytterligare med av retinal ganglion celler (RGC) och RGC axon nummer samt RGC aktivitet, t.ex. genom elektroretinografi och beteendetester, och fastställandet av kortikala omdisponeringar av optisk avbildning av inre signaler. Den senaste tekniska utvecklingen inom laser mikroskopi möjliggör in situ-visualisering av RGC förnyelse av djup vävnad fluorescens avbildning i hela montera exemplar av synnerven (ON) och hjärna. I detta histological tillvägagångssätt, tetrahydrofuran baserad vävnad clearing i kombination med ljus plåt fluorescensmikroskopi tillåter upplösning av enstaka fibrer som återinträda i deafferenterad ON och optisk kanalen ^5. Även om sådana metoder kan vara överlägsen i upplösning och bestämning av tillväxtmönster, gör de det inte möjligt för repetitiva och longitudinella analyser av enskilda tillväxt händelser, som är särskilt önskvärda för att bedöma processen för långsiktig förnyelse.

Kontrastförstärkt MRT har varit anställd för minimal invasiv visualisering av Retino-tectal projektion på möss och råttor ^6,7. Detta kan uppnås genom direkt intraokulär avgivning av paramagnetiska joner (t.ex. ^{Mn2 +)} till retinala celler. Som en kalcium analog, Mn ^{2 +} inkorporeras i RGC somata via spänningsstyrda kalciumkanaler och aktivt transporteras längs axonal cytoskelettet av den intakta ON och optisk vägarna. Även om det ackumuleras i hjärnkärnorav den visuella projektion, dvs sido geniculate kärnan (LGN) och överlägsen colliculi (SC), transsynaptisk utbredning i den primära syncentrum förefaller försumbar ^8,9, även om det kan förekomma ^10,11. Under MR-sekvensering, paramagnetiska Mn ^{2 +} förstärker MR kontrast främst genom att förkorta T ₁ spin-lattice relaxationstiden ^12. Sådana Mn ^{2 +} förstärkt MRT (MEMRI) har med framgång tillämpats inom olika neuro-anatomiska och funktionella studier av råttor, däribland uppskattning av axonal regeneration och degeneration efter ON skada ^13,14, exakt anatomisk kartläggning av Retino-tectal projektion ¹⁵ samt fastställande av axonal egenskaper transport efter farmakologisk behandling ^16. Nya förbättringar i doserings, toxicitet och kinetik neuronala Mn ^{2 +} upptag och transport, samt förbättrade MRI-protokoll har utökat sin ansökan till studier på transgenamöss ⁹ med användning av 3 Tesla scanners som vanligen används i klinisk praxis ^17.

Här presenterar vi en MEMRI protokoll som lämpar sig för längs in vivo avbildning av musen Retino-tectal projektion och exemplifiera dess tillämplighet genom att bedöma Mn ^{2 +} beroende signalförstärkning i naiva och olika neurodegeneration förhållanden. Vår protokoll lägger särskild vikt vid MR datainsamling i en måttlig 3 T magnetfält som är generellt mer tillgängliga än hängivna djur skannrar. I naiva möss, vi visar hur tarmspecifik signalstyrkan kan vara väsentligt och reproducerbart bli ökade efter intravitreal (ivit) Mn ^{2 +} ansökan. Kvantitativt, Mn ^{2 +} utbredning längs den visuella projektionen sker oberoende av det normala åldrandet (mätt mellan 3 och 26 månader gamla möss) och förstärkning är refraktär för visuell stimulans och anpassning till mörker. I kontrast, Mn 18 liksom i nfkb1 knock-out-möss (p50 ^KO) som lider av spontan apoptotisk RGC-död och ON degeneration ^19. Således, i expansionen till konventionella histologiska analys, längs MEMRI analys av enskilda djur möjliggör profilering av unika kinetik neurodegenerativa processer. Detta skulle visa sig användbart för studier om neuroprotektion och axonal regeneration förknippade med farmakologiska eller genetiska ingrepp.

Protocol

Alla animaliska ingrepp utförs i enlighet med den europeiska konventionen om Animal Care och användning av försöksdjur och ARVO uttalande för användning av djur i ögon och Vision Research. Alla experiment har godkänts av den lokala etiska kommittén. Proceduren i ON skada i möss beskrivs på annan plats ^9.

1. Intravitreala Mangan Injection

1. Utför Mn ^{2 +} injektion 24 timmar före MR skanning med hjälp av en assistent. Bedöva djuren genom intraperitoneal injektion av en 5% kloralhydrat lösning (420-450 mg / kg kroppsvikt i steril PBS). För ytterligare lokal anestesi, applicera en droppe vätska conjuncain (0,4% oxibuprokain hydroklorid) på hornhinnan innan ögon punktering. För att injicera 15 nmol Mn ^{2 +} per öga förbereda en 7,5 mM _MnCl2 lösning, t ex genom att späda 1 L av 1 M _MnCl2 stamlösning i 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Belastning 5 pl av den slutliga lösningen i en 5 | il Hamilton-spruta ansluten till en 34 G litet nav borttagbar nål (RN nål).
2. Vid start med höger öga, placera musen vänster-sidig under ett binokulärt mikroskop och försiktigt öppna och fixa det högra ögat mellan tummen och pekfingret på vänster hand. Plocka upp sprutan med din högra hand och ta tag i nålen nära spetsen. För atraumatisk punktion i ögat glödlampa, försiktigt in nålen i glaskroppen vid infero-temporala omkrets ca 1 mm distalt om limbus, och därmed skona sklerala fartyg.
3. Härnäst assistenten applicerar långsamt den totala volymen av 2 | il under reglering av omfattningen av Hamilton-spruta. Under denna procedur, övervaka optimal nål placering under mikroskop och undvika punktion av linsen eller spill av vätskan. Håll nålen statiskt insatt i ytterligare 30 sekunder, sedan dra tillbaka det sakta för att minimera vätskeläckage från injektionsstället.
4. Under hela förfarandet, bör särskild försiktighet iakttas för att undvika tryck mot ögat. Likaså undvika hårda eller flera försök att punktera ögat glödlampa. Eftersom Mn ^{2 +} upptag i RGC: er och transporter längs ON redan är mättad vid 15 nmol _MnCl2, minimerar denna signalvariationer genom injektion något oprecisa volymer. För bilateral signalförstärkning av den visuella projektionen, upprepa injektionsproceduren för vänster öga.
5. Applicera ofloxacin-innehållande (3 mg / ml) ögondroppar och pantenol innehållande salva en gång efter det att förfarandet för att förhindra ögoninfektioner och torkning av ögat. Återgå mössen till sina burar under normala bostadsförhållanden fram till början av MR-skanning.

2. Animal Förberedelse för MR

1. Bedöva musen genom administrering av en isofluran / syre gasblandning 2% / 98%. Montera musen på en mus hållare i ett nästan horisontellt, utan snodd läge. InsERT den i MR-spole, som sedan justeras inne i MR-scannern. Övervaka andning och puls med lämpliga system. För tekniska detaljer, se Herrmann et al ^20.
2. Under MRI, leverans anestesi genom kontinuerlig inblåsning av en initialt 1,5% / 98,5% isofluran / syre gasblandning via en förångare som är ansluten till musen huvudet innehavaren av ett integrerat rör. Under avsökningen, justera djupet på anestesi enligt de inspelade vitala parametrar (dvs. sträva efter en stabil andningsfrekvens av ca 40 andetag per minut). Med hjälp av en uppvärmningsanordning hålla kroppen yttemperaturen stabil mellan 35 och 37 ° C, mätt med en termisk sensor placerad i den abdominala stället i mus. För tekniska detaljer, se Herrmann et al ^17.
3. Efter genomsökningen, befria musen från hållaren och leverera med rent syre för att påskynda återhämtning från anestesi. Dessutom håller kroppstemperaturen stabil genom att användarött ljus värmekälla.

3. MRT protokoll

1. Protokollet är validerad för en 3 Tesla scanner utrustad med en dedikerad, SNR snåla, små djur spole (linjärt polariserat Litz spole) med ett effektivt synfält på 35 mm × 38 mm diameter. Manövrera spole i sändar-mottagningsläget.
2. Med djuret i sitt slutläge, justera melodi och matchen i spolen med hjälp av en frekvens analysator. Justera manuellt sändarreferensspänning och shims strömmarna för att optimera bild homogenitet och kvalitet.
3. Förvärva T ₁ viktade 2D TSE bilder med en upplösning på 0,5 mm x 0,5 mm x 2 mm i sagittal-och tvärgående vy för planering. Med hjälp av planering MR, förvärva MEMR bilder i coronal mätning riktning, roteras för att vara parallell med djurets huvud med fas-kodning längs vänster-höger riktning. För att minimera förvärvs tid, använder en rektangulär synfält anpassas tillverkliga huvuddimensioner. Anställa en bortskämd 3D FLASH sekvens (VIBE 3D) med hjälp av följande parametrar: basmatris 256, synfält 54 mm × 50.65 mm x 14.08 mm, med 93,8% rektangulär synfält i fas koda riktning, och 128 skivor 0,11-mm snittjocklek med slice upplösning inställd på 61%.
4. Aktivera i-planet interpolation för att skapa slutliga bilderna med 512 × 480 × 128, vilket ger en effektiv upplösning på 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm × 0,1 mm × 0,09 mm interpoleras), eko tid T _E = 6,51 msek, repetitionstiden T _R = 16 ms, bandbredd = 160 Hz / px, flip vinkel = 22 °. Applicera två medelvärden och tre upprepningar för att uppnå en total förvärvstiden (T _A) på cirka 30 minuter.

4. MRI Data Analysis

1. Analysera data med hjälp av programmet syngo fastView. För kvantitativ signalförstärkare, väljer definierade områden of intresse 2D plana MRI inspelningar och bestämma signalintensiteterna (SI) av den förstärkta strukturen (SI _MEMRI), vävnads bakgrund (SI _backgr) och standardavvikelsen för bruset (SD _N). Vid behov kan du använda en mus hjärna atlas för att underlätta neuro-anatomiska orienteringen för LGN och SC strukturer. Beräkna kontrast-till-brus-förhållande (CNR) med hjälp av formeln:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _backgr) / _SD-N
3. Kvantifiera tre på varandra följande bilder för medelberäkning CNR för varje prov. I bilateralt injicerade djur, analysera varje hemisfär självständigt.
4. För skildring av horisontella, koronalt och sagittal bilder, beräknar flerplans rekonstruktioner från den ursprungliga 3D MRI datamängd. Dessa bearbetade bilder rekommenderas inte för kvantitativ analys. För att skapa animerade 3D-rekonstruktioner (maximal intensitet projektioner, MIPs) i Retino-Tectal projektion, använd en angiografi efterbearbetning programmodul.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM Färgning)

1. För TIMM färgning av Mn ^{2 +} spåras hjärnstrukturer efter MEMRI, injicera en dos av 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 timmar före avbildning.
2. Efter MR skanning, BEGJUTA djuren med 30 ml iskall 0,325% Na ₂ S i PBS (pH 7,4). Dissekera retinae och frysa proverna i Frozen avsnitt.
3. Skär sekventiella, Ekvatorial sektioner av 15 ìm tjocklek på en cryotome.
4. Utför TIMM färgning ²¹ i avsaknad av fixativ och kryoskydd enligt Angenstein et al ^22.

6. Statistisk analys

Utföra statistiska analyser med hjälp av Students t-test för enstaka jämförelser, följt av post hoc ANOVA. Data presenteras som medelvärde ± standardfel. Individuella N siffror ärangivna separat för varje experiment. Resultat når P ≤ 0,05 anses vara statistiskt signifikant (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

Representative Results

Förmågan av denna bildteknik för att exakt bedöma vitalitet och funktionaliteten av den visuella projektions beroende av exakt applicering av ett giftfritt Mn ^{2 +} dosering till glaskroppen och dess upptag av RGC: er. Denna stora antagande testas i figur 1, där lager specifik Mn ^{2 +} upptag demonstreras av autometallography (TIMM färgning) ^21. Retina avsnitt analyserades vid 24 timmar efter ivit tillämpning av antingen 15 nmol eller 150 nmol Mn ^{2 +,} eller PBS som kontroll. Vid denna tidpunkt, den Mn ^{2 +} injicerade retinae visar maximal signalförstärkning i _T1 viktade MRI (N = 3, streckade linjer), medan PBS injicerade näthinnan har inte ökat i signalen (N = 3, streckad linje) (Figur 1 , till vänster). Notera den hyperintensive signalförstärkning på 150 nmol injicerade ögat. Däremot nonenhanced hjärnområden (asterisker) visar liknande bakgrund signalintensiteter för allt samarbetenditions (grön färg). Ivit Mn ^{2 +} applikations ökar övergripande TIMM färgning särskilt i RGC lagret och nervfiberlager (NFL) (Figur 1, förstorade inläggningar i mittpanelen), vilket bekräftas av undersökningar av enskilda RGC somata efter H & E co-märkning (högra panelen).

För in vivo-avbildning av musen retino-tectal projektion, är det viktigt att välja en speciell mus MEMRI protokoll där driftsparametrarna tillsammans med utrustning, såsom visas i fig 2, är avpassade för att analysera möss i en 3 T fält. Tillämpa sådan scanner setup, visade vårt tidigare arbete som för CNS-bildupplösning ett råtthuvud pole är överlägsen en dedikerad mus hela kroppen pole ^17. För att fixa det murina huvudet och att korrekt justera sin position inom råttpolen, använder vi en vagga och ett koniskt rör med bett bar av plast, som båda är nedskalad att möta karosstorlekav möss (fig. 2A, B). När bilder förvärvas på en tvärgående _T1 viktade matris genomföra 3D gradienteko sekvenser, kan förväntas att generera högupplösta bilder av (200 nm) ³ inom 35 min av anskaffningstiden. Vi rekommenderar starkt för löpande övervakning av vitala funktioner under genomsökningen. Justering av anestesi tillsammans med postimaging syresättning och kroppstemperatur kontroll accelererar kraftigt återhämtningstid och garanterar överlevnaden på cirka 100%. Sådana tekniska skyddsåtgärder är viktigt att se till att hela kohorten kommer att upprätthålla longitudinell och repetitiva MRI.

I varje studie, bör endast ett icke-toxiskt ^{Mn2 +} dos av 15 nmol användas för ivit applikation ^9, som är tillräcklig för att tydligt förbättra CNRS i näthinnan, ON, och optiken vägarna upp till det presynaptiska intracerebral LGN och SC. CNR värden bäst beräknat från 200 um tjock tvärskivor som erhållits från original MRI datamängder genom reslicing den ursprungliga isotrop 3D-volymen. Figur 3A visar ett exempel på exakt CNR beslutsamhet för den förbättrade LGN, där tre regioner av intresse väljs ut i varje bild (1) signal-förstärkt område (SI _MEMRI ), (2) icke-affine hjärnvävnad (SI _backgr), och (3) bakgrundsljud (SD _N). Den expect rumslig ekosignaler kvantifierades längs helheten av en enda visuell projektion visas i fig 3B. Notera den starka gradvis ökning av signalförstärkning i retinal sektioner längs dorsoventral planet, som toppar på papillen. Dessutom, notera att det saknas en relevant transsynaptisk Mn ^{2 +} utbredning i kortikala skikt inom de tillämpade experimentella förhållanden (signal droppe i syncentrum). MIPs är mycket belysande att visualisera 3D-positionering av Retino-tectal projektion i sin helhet (film 1). ETTccumulation av Mn ^{2 +} längs sikt projektionen bestäms av kinetiken av intracellulärt upptag i RGC genom spänningsberoende ^{Ca2 +-kanaler} och dess snabba axonal transport, samt av den relativt låga avslut från målvävnaden ^13. Enligt våra tidigare kinetiska studier, kan Mn ^{2 +} beroende signalförstärkning upptäckas så tidigt som 6 timmar efter injektion. Det nya toppar vid 24 timmar och minskar tillbaka till basnivån inom 120 timmar efter injektion ^9. Därför, för att uppnå optimala resultat, MEMRI bör utföras 24 timmar efter injektion, vilket utgör hälften av den förbättring tid som krävs för råttor ^13.

Efter att ha beskrivit principen för kontrastförstärkning av den visuella projektionen av MEMRI, vi ytterligare kommunicera influenser av två parametrar - ljusförhållanden och djurens ålder - som kan påverka kvantitativa mätningar:

(1) För att testa feller påverkan beroende ackumulering av Mn ^{2 +} i mitthjärnan centra möss hålls antingen under ljus-stimulerade villkor uppnås genom ficklampa exponering av en bestämd frekvens (5 Hz) och ljusintensitet (3 W LED) eller i totalt mörker innan skann och under 24 h av Mn ^{2 +} exponering. Kvantitativ analys av CNR 24 timmar efter ivit Mn ^{2 +} programmet konstateras en väsentlig ökning av signalintensiteten av mörk-anpassad retinae jämfört med ljusstimulerade förhållanden (66,29 ± 3,07 vs 54.56 ± 3.08, P ≤ 0,05, N = 7 / 8, fig. 3C). Med tanke på lutningen i signalförstärkning mellan den perifera näthinnan och synnerven huvudet (se figur 3B), försäkrade vi att alltid analysera motsvarande retinala sektioner inom alla experimentella grupper. Bildanalys längs ventrodorsal planet visade, som väntat, att absoluta CNR värdena går ner i båda villkoren. Huvudsakligen reltiva signal skillnaden mellan ljus och mörker anpassad retinae förblir ihållande (data visas ej). Men signalförstärkning i framtidsområden LGN (26.97 ± 1,78 vs 26.58 ± 1,05, P = 0,9, N = 7-2) och SC (25,09 ± 1,24 vs 26.81 ± 1,55, P = 0,4, N = 7 / 8) är omöjlig att skilja mellan ljusa och mörka miljöer konditione (figur 3C). Denna analys visar att upptaget av Mn ^{2 +} i näthinnans skikt är känsligt för ljus, medan dess utbredning längs Retino-tectal projektion och ackumulering i målområden som inte påverkas av sammanfallande visuell stimulans. Alternativt kan signalkänslighet av 3 T scannern vara under tröskeldetektering för signal variation i LGN eller SC.

(2) För att undersöka konsekvenserna av djurets ålder på MEMRI relaterade signalförstärkning av den visuella projektionen, analyserade vi möss mellan 3 och 26 månader of ålder. CNR värden i LGN 3 månader gamla möss (23.49 ± 1,36, N = 12) inte skiljer sig från signalstyrkan mäts i möss i åldern 7 månader (23,90 ± 0,81, p = 0,79, N = 16), 13 månader (23.35 ± 1,29, P = 0,94, N = 10) eller 26 månader (25,10 ± 2,29, P = 0,53, N = 6, Figur 3D). Likaså är signalintensiteten i SC oförändrad mellan 3 månader (19.01 ± 1.20) och 26 månaders ålder (16,92 ± 2,18, P = 0,37; Figur 3D). Även om en liten ökning är tydlig i CNR värden av 26 månader gamla retinae (38.49 ± 3,25), denna ökning inte når signifikans i jämförelse i alla grupperna (P> 0,05). Dessa experiment visar att signalförstärkning i cerebrala målområden i den visuella projektionen är opåverkad av visuell stimulans och fysiologiska åldrande.

Härnäst visar vi hur känslig MEMRI att upptäcka strukturella förändringar of den visuella projektion som orsakas av akut och kronisk axonopathy. För att undersöka detta har en modell av Wallerian degeneration inducerad av traumatisk PÅ skada ¹⁸ samt en djurmodell visar brådmogen, spontana degeneration av sensoriska analyser och huruvida visuella vägen ¹⁹ anställda:

(1) Traumatisk axonopathy inducerad av ON krosskada orsakar brott på Axona fascicles. Följaktligen kommer retino-tectal transport av Mn ^{2 +} längs axonal cytoskelettet vara fullständigt och varaktigt blockerad, såsom visualiseras genom fullständig förlust av Mn ^{2 +} förstärkt signal i LGN och SC analyseras en dag (ej visad), en vecka (figur 4A , streckade linjer) och 4 veckor (ej visade) efter skada. För att tydligt visa de neuroanatomiska och konsekutiva MR funktioner i ON skada och att dissekera dem från den naiva tillståndet, var skadan tillfogas bara ensidigt. Detta resulterar i oförändrad Mn ^{2 +} transport på than styr sidan i motsats till spåravbrott på sidan av insatsen. Analys av CNR-värdena i deafferenterad områden bekräftar den fullständiga frånvaron av signalförstärkning (ej visad). Detta experiment visar vidare att MEMRI är mycket känslig för att detektera läget och svårighetsgraden av en skadestället genom longitudinell utvärdering av signalintensiteten längs utsprånget före och efter skadan (Figur 4B). Medan signalintensiteten längs ON innan skada förblir konstant vara högre än bakgrundssignalen, finns det en temporospatiala nedgång i signalintensitet till bakgrundsnivån en dag efter PÅ skada.

(2) Vårt tidigare arbete visade att Mn ^{2 +} beroende signalförstärkning i LGN reduceras i 10 månader gamla möss som saknar NF-kB subenhet p50 vid mätning 24 timmar efter injektion ^9. Upptäcka detta med en hög konsistens, antog vi en allmän försämring Retino-tectal Mn ^{2 +} transport, möjligen orsakad av minskade antalet RGC: er och relaterade PÅ neuropati i åldrande p50 ^KO möss ^19. Alternativt kan den reducerade signalförstärkning vara associerad med en fördröjd neuronal upptagning och förökning av Mn ^{2 +} från glaskroppen och utmed den patologiska projektion. Den senare möjligheten kan utforskas genom att utföra repetitiva MR efter en enda applicering av 15 nmol Mn ^{2 +} och studera kinetiken för signalförstärkning i näthinnan och LGN på tidigt (8 och 24 timmar) och sen (48 och 72 timmar) tid poäng. I vild typ och P50 ^KO möss, retinala signalförbättrings toppar på 8 timmar vid nästan identiska förbättrings priser (43.52 ± 3.24 och 40.72 ± 2,79, p = 0,6, N = 3-6, Figur 4C, vänster). Även signalförstärkning är fortsatt hög i vilda typer vid 24 timmar efter injektion, avtar den i P50 ^KO möss (43.38 ± 2,18 vs 32.89 ± 1,54, P ≤ 0,01, N = 5-8). Under senare faser (48 och 72 h), minskar signalförstärkning i båda grupperna (med genomgående lägre CNR värden i knock-out-möss), vilket utesluter en fördröjd retinal Mn ^{2 +} upptag och utbredning i P50 ^KO möss. Motsvarande resultat i LGN av P50 ^KO möss bekräftar denna uppfattning. Fastän CNR är betydligt lägre mellan 8 och 48 h efter injektion (P ≤ 0,05, N = 5-9), kinetiken för signaldämpning i p50 ^KO möss överensstämmer med den i möss av vildtyp (Figur 4C, höger). Sålunda är det reducerade temporospatiala ekosignaler av retino-tectal projektion beroende på minskade axon tal som härrör från en begränsad RGC befolkningen snarare än osäkra transport kinetik. Vi föreslår MEMRI att bli ett värdefullt verktyg för att sålla genetiska mutanter mus för projectional försämringar i CNS.

innehåll "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 1. TIMM färgning av Mn ^{2 +} upptag i RGC: er. Representativa värmekartbilder av T ₁ viktad MRT (MRT T ₁₎ visar signalförstärkning av linsen och hela näthinnan omkrets (streckad linje) 24 timmar efter ivit tillämpning av 15 nmol, och hyperintensiv signalförstärkning efter applicering av 150 nmol Mn ^{2 +} (vänster). Varma färger representerar högre signalvärden än kalla färger. Skala bar: 1 mm. Middle / höger: Mn ^{2 +} upptag av RGC efter ivit injektion av _MnCl2 som detekteras med silver utfällning med hjälp TIMM färgning (svart färg). PBS-behandlade kontroll näthinnan sektioner uppvisa ganska svag färgning och diffus differentiering av RGC-skiktet (RGC) (överst, N = 3). Hög förstoring tillåter inte d. iscrimination av enskilda celler (förstorade sätter in) Ivit _MnCI2 ansökan differentiellt ökar övergripande silverfärgning över näthinnans skikt, med en framstående silver nederbörden särskilt i nervfiberlagret (NFL), RGC skikt, och inre nukleära lagret (INL, mitten och botten , förstorade infällningar, N = 3). Colabeling av TIMM med H & E färgning bekräftar ytterligare sådant skikt specifik Mn ^{2 +} ackumulation (högra panelen). Skala bar, översikt: 50 pm, förstoring: 25 pm. IPL, inre plexiform lagret; OPL, yttre plexiform lagret; ENDA, yttre kärnlagret; RPE, pigmentepitelet.

Figur 2. Fotografier som visar MR-utrustning specifikt för mus MEMR bildtagning på en klinisk 3T scanner. A) visar skräddarsydda mus vagga med bite bar huvudfixering och sensorn för andningsövervakning (vit dyna, blå slang). B) visar den placerade och fast musen i vaggan. Rören till vänster tillförselanestesigasen. C) exemplifierar positionering av mus huvudet och hållaren inuti linjärt polarise Litz spole arbetar i sändnings-och mottagningsläge. D) visar spolen plattform framför avskärmningsröret och den kliniska 3 T scanner. Koppar belagda röret ger extra skärmning från buller och blockerar MR-signalen från varmvattenbaserade värmematta (svart omslag runt röret). E) visualiserar den fullständiga utformningen av djuret polen i porerna av 3 T skannern bara före positionering av djurhuvud exakt vid isocentret inuti skannern.

Figur 3. MEMRI av den naiva Retino-tectal projektion under olika ljus-och åldersvillkor. A) Illustration av regionen av intresse (ROI) kartläggning i förbättrad LGN och bakgrundsvävnad på en tvärgående MRI inspelning (till vänster). LGN specifik signalförstärkning illustreras av värmekartan presentation (höger). 1 och 1 ', vänster och höger LGN; 2 och 2 ', bakgrund vävnad; 3, buller; P, posteriort; R, höger. Skala bar:. 100 ìm B) Rumslig kartläggning av signalförstärkning längs en ​​enda Retino-tectal projektion som bestäms från ursprungligen förvärvade tvärgående MR-bildskivor av MEMRI. Fyllda kvadrater, Mn ^{2 +} beroende signalförstärkning; öppna trianglar, bakgrundssignalen. R, näthinnan; ON, synnerven; OT, optik-tarmkanalen; LGN, lateral geniculate kärna; SC, överlägsen colliculi; VC, syncentrum. Slice tjocklek, 200 nm. C) Lätt stimulering minskar retinal signalförstärkning avsevärt. Enhancement i LGN och SC är oberoende av visuell stimulering. Fyllda cirklar, mörk-anpassning; öppna cirklar, ljus anpassning. D) Signal förbättring är oberoende av stigande ålder mellan 3 och 26 månader.

Figur 4. MEMRI av retino-tectal projektionen enligt neurodegenerativa tillstånd. A) MEMRI av bilateralt ivit injicerade möss utfördes en vecka efter unilateral krosskada av rätten ON. Flerplans rekonstruktioner av horisontella, koronalt och sidoutsikt visar total avsaknad av signalförstärkning i LGN och SC för den skadade hemisfären (prickade linjer). c, kontralaterala hemisfären; Jag, ipsilaterala halvklotet. Skala bar:. 1 mm B) MIP bilder och längd MRI analys av den rumsliga signalförstärkning längs ON före ochen dag efter skada. R, näthinnan; ON, synnerven; arrow, skadestället. Skala bar:.. 0.5 mm C) Kinetik för signalförstärkning inom kronisk neurodegeneration av den visuella projektionen i P50 ^KO möss Tidig (8 tim) upptag av Mn ^{2 +} i näthinnans celler påverkas inte, men har redan minskat i LGN av p50 ^KO möss. Repetitiva MR vid 24, 48, och (endast för näthinnan) på 72 timmar visar ihållande minskning signal, men liknande kinetik Mn ^{2 +} transport och ackumulation i näthinnan och LGN av P50 ^KO möss.

Film 1: Animerad, 3D-värme-map presentation av in situ kontrastförstärkt Retino-tectal projektion MR utfördes 24 timmar efter bilateral ivit injektion av 15 nmol _MnCI2.. Data presenteras i MIP-läge. Slice tjocklek 200 um. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" target = "_blank"> Klicka här för att se filmen.

Discussion

MEMRI av det visuella systemet sträcker konventionell neurobiologiska tekniker för att bedöma funktionaliteten i naiva och patologiska tillstånd. Förutom att ge en unik inblick i integriteten för en isolerad CNS-fiber-tarmkanalen, kan MEMRI enkelt kompletteras med beteendetester, t.ex. optometri och visuellt baserade vatten uppgifter, för att undersöka de omedelbara konsekvenserna av en viss paradigm för visuell perception. Den länkar också elektrofysiologiska och histologiska undersökningar med funktionell visuell karakterisering in vivo. Tekniken är mycket tillförlitlig och reproducerbar med små interindividuella variationer inom samma grupp (se felstaplar i diagram 3, 4). Intriguingly vid en dos av 15 nmol, Mn ^{2 +} upptag och axonal transport är mättade processer så att ekosignaler når en platå som inte kan höjas genom ytterligare ^{Mn2 +} försörjningen ^9. Ur en praktisk synpunktse, sådan dos respons karakteristiska minimerar, åtminstone till viss del, injektion tillhörande variationer i signalförstärkning. Noterbart är att de presenterade uppgifterna om dosering och kinetik Mn ^{2 +} signalförstärkning är specifika för möss och skiljer sig från de i råttor, som kräver en ca 10-20x högre Mn ^{2 +} dosering och ökad latens (36 tim) för att uppnå optimal kontrastförbättring ^13,23. Dessutom förstärkning längs sikt projektion förblir konsekvent mellan ett djur 3 år och 26 månader. Detta resultat är i linje med visuella tester som utförs på åldrande möss och det faktum att C57/B6 möss upprätthålla normal visuell aktivitet upp till 2 års ålder ^24. Även om vi inte analysera enskilda möss längsgående i den åldrande studien tidigare resultat visar tydligt att säkerheten för repetitivt administrerade Mn ^{2 +} doser av 15 nmol för visuell underhåll ^9, som kan önskas i longitudinella åldringsstudier.

I enlighet med tanken att Mn ^{2 +} inkorporeras i RGC visar vi Mn ^{2 +} upptag in i deras somata av TIMM färgning som förlitar sig på silver utfällning av fria metalljoner, som tillämpas av Angenstein et al. För intracerebral Mn ^{2 +} upptäckt efter dess system tillämpning ^22. Tidigare var intracerebral Mn ^{2 +} fördelning detekteras genom autoradiografi av ⁵⁴ Mn ^{2 +} isotop att avgränsa neuronala kretsar i råttans CNS ^25, men inte på cellnivå. Här låter TIMM färgning tilldelning av Mn ^{2 +} upptag till distinkta cellpopulationer inom utsatt näthinnan, där vi hittar framstående silver nederbörd i RGC och nervfiberlager. Det bör noteras att protokollet tillämpas visar förbättrad detektering genom TIMM färgning efter applicering av en dos av 150 nmol jämfört med 15 nmol Mn ^{2 +.} Även Mn ^{2 +} upptag och dess axonal transport är redan mättad vid 15 nmol, alltså, ger ingen ytterligare CNR ökning längs Retino-tectal projektion vid högre doser, kanske överdriven tillskott öka tillgången till fri, protein obundet Mn ^{2 +} och på så sätt göra den tillgänglig för silver nederbörd. Framtida förbättringar i färgning känslighet gör att korrelationen av MEMRI-baserade CNR värden för specifika CNS prognoser med den cellulära lokaliseringen av Mn ^{2 +} anrikning inom ett definierat histologiska region. En sådan förmåga kan även vara användbara för karakterisering och kvantifiering av Mn ^{2 +} distribution i andra CNS-regioner utanför det visuella projektion. Likaså har Mn ^{2 +} varit anställd i ett toxicitetsmodell kainat att visualisera degeneration och regeneration av hippocampus mossiga fibrer ^26.

Mn ^{2 +} tas upp av spänningsberoende kalciumkanaler och intracellulärt distribueras av aktiv axonal transport, varav can vara blockerad av kolchicin behandling ^25,27. Visuell stimulans experiment på råttor som fick en intraperitoneal dos av _MnCl2 har avslöjat en ökad signalförstärkning i den inre och i synnerhet yttre näthinnan ^28. Därmed mörk anpassning väcker ytterligare signalintensiteter i de yttre retinal lagren jämfört med råttor som utsätts för endast rum ljusförhållanden, vilket visar känslighet retinal Mn ^{2 +} upptag till visuell stimulans ^28. På samma sätt finner vi förbättrat signalintensitet i näthinnan av mörka anpassade möss jämfört med möss som exponerats för visuell stimulans efter ivit Mn ^{2 +} ansökan. Detta kan ställas i relation till de specifika elektrofysiologiska egenskaperna hos näthinnan och alstringen av en kontinuerlig mörk ström i fotoreceptorceller. Eftersom ^{Ca2 +} inflöde i yttre segment av fotoreceptorer väsentligt bidrar till bildandet av den mörka ström, kan deras generation åtföljasgenom ökat samarbete upptag av Mn ^{2 +} in i fotoreceptorcellskiktet i mörker. I motsats härtill minskar ljusstimulering mörkerströmmen och orsakar hyperpolarisering av fotoreceptorceller ^29. Därmed övergripande Mn ^{2 +} upptag kan minskas i ljusförhållanden.

För säker användning av MEMRI, är det viktigt att klargöra om den mer uttalad Mn ^{2 +} upptag i mörkret-anpassad näthinnan förändrar signalförstärkning längs andra delar av visuell projektion eller till och med hela dess utsträckning. Stimulering beroende förändringar i MEMRI signalintensiteten av cerebrala nätverken har visats för det akustiska systemet efter intraperitoneal Mn ^{2 +} program ^30. I denna studie av Yu et al. Exponerades råttor för variabla ljudfrekvenser innan MR och _T1 viktade signalförstärkning av den sämre colliculi senare undersöktes. Akustisk stimulering befanns significantly öka MEMRI signalintensiteter i en tonotopic representation, vilket exemplifierar fMRI-liknande karaktär av verksamhetsberoende Mn ^{2 +} ackumulation ^30. Däremot i vår experimentella inrättat ^{Mn2 +-ackumulering} i LGN och SC visas oberoende av visuell stimulering. Emellertid kan sådana skillnader i sensoriska hjärna kartläggningsförsök uppstå från den lägre magnetiska fältet och begränsad tröskel för detektering av vår 3 T scanner i jämförelse med den höga fält 7 T scanner av Yu et al ^30.

Hittills är det inte känt i vilken utsträckning biofysiska parametrar påverkar antero axonal transport av Mn ^{2 +} och hur MEMRI skulle kunna fungera som en indikator för elektrisk aktivitet. Icke desto mindre framgår det att ^{Mn2 +} överföring av RGC inträffar, åtminstone delvis oberoende av ljus specifik stimulering och elektrisk insignal mottagen från bipolära celler. Alternativt kan nettoeffekten av elektrisk activity inom retino-tectal utsprång skulle kunna vara en följd av elektrisk stimulering av mörk-responsiv "off-RGC" och ljus-känslig "ON-RGC". En sådan tolkning stöds av upptäckten att Mn ^{2 +} transport längs Retino-tectal projektion inte försämras musstammar med dålig syn, liksom CBA-möss som bär RD1 mutation av Pde6b genen orsakar degeneration av retina ^11. Vid en kinetisk studie av vildtyp seende och CBA-möss var jämförbara transportkostnaderna observerats under den initiala tillströmning fasen (vid 2,5 h efter injektion) och för den slutliga signalförstärkning (vid 24 h) i LGN-och ^SC-11.

Sammantaget antyder dessa observationer stödjer idén att MEMRI, t.ex. i det visuella systemet som har exemplifierats här, utgör en värdefull åtgärd för strukturell integritet och metabolisk stabilitet i stället för elektrisk aktivitet. Praktiskt, till synes stabell oberoende av signalförstärkning i cerebral LGN och SC från ljus exponering möjliggör robust hantering och bostäder av djur utan särskild omsorg om belysning. Å andra sidan, för MEMRI studier som fokuserar på näthinnan signalförstärkning, är det nödvändigt att hålla djuren i hårt kontrollerade ljusförhållanden före skanningen.

Bland de fysiologiska parametrar som påverkar Mn ^{2 +} axonal fraktsatser och efterföljande MEMRI signalförstärkning, kan stabiliteten i kroppstemperatur vara av särskild betydelse. Detta indikeras av studier på intranasal Mn ^{2 +} för förbättring av primära luktprojektions mål i hjärnan, där anrikning befanns vara signifikant minskas vid en tillfällig sänkning av kroppstemperaturen till 30 ° C jämfört med signalförstärkning vid normal kroppstemperatur ^27. Därför bör kroppstemperaturen övervakas och justeras före och under MR avsöker inte bara protect djurens hälsa, men också för att normalisera fysiologiska parametrar av Mn ^{2 +} förökning.

Sedan patofysiologiska förändringar och metaboliska försämringar påverkar axonal transport effektiviteten av ^{Mn2 +,} ekosignaler i projektionscentrum, t.ex. LGN och SC, kan tjäna som ett mått för den strukturella integriteten och funktionell aktivitet av denna bana. Här presenterar vi två olika förhållanden PÅ degeneration och illustrera att Mn ^{2 +} förökning och anrikning i talamus och mitthjärnan centra varierar som en funktion av axonal integritet. Akut PÅ skada leder till en total signalförlust omedelbart efter skada, som inte återgår inom 4 veckor på grund av brist på relevant axonal regeneration, medan långsam axonal degeneration i p50 ^KO mutant reflekteras av minskade CNR värden i LGN. Med tanke på möjligheten till longitudinella avbildning, kan denna tillämpning av MEMRI värdefullt feller övervakning postlesional tillväxtsvar på ON och göra det möjligt att utreda proregenerative genetiska eller farmakologiska interventioner till RGC: er.

Dessutom presenterar vi MEMRI som en mycket känslig metod för att upptäcka gradvisa försämringar i signalförstärkning som är förknippade med kroniska axonal degeneration processer. Transkriptionsfaktorn NF-kB är involverad i neuronal underhåll och möss med deletion av p50-subenheten hos NF-KB display åldersberoende neuronal cellförlust och axonal degeneration inom det visuella systemet ^19. Förutom histologiska och elektronmikroskopiska analyser, MEMRI av retino-tectal utsprånget är i stånd att identifiera fenotypiska förändringar i dessa möss. Genom förvärv av serie T ₁ viktade MR-bilder efter ivit Mn ^{2 +} ansökan, utmärkte vi en övergripande minskat från en helt enkelt försenat Mn ^{2 +} transport längs siktvägen i dessa p50KO möss. Därmed repetitiv datainsamling från MEMRI efter en enda Mn ^{2 +} programmet kan definitionen av axonal transport kinetik och neurofysiologiska förändringar i ovärderlig pool av genetiskt modifierade möss. För närvarande flera ändringar av MEMRI är under utredning som syftar till att göra denna teknik säkert för diagnostiska applikationer hos människor. Ett lovande tillvägagångssätt av hög klinisk relevans, som utgör ett alternativ till ivit injektion, är leverans av ^{Mn2 +} såsom ögondroppar. Därigenom lokal administrering av 1 M _MnCl2 gav en signifikant signal förbättring med 20% i SC när bilder förvärvades på en 4,7 T djur scanner ^31. Metoden kunde upptäcka omfattande PÅ degeneration efter retinal ischemi ^31, och den koncentration som används bevisade säkra när upprepade tillämpas i en månads mellanrum ^32. Med tanke på den relativt höga neurotoxicitet av Mn ^{2 +} till exempel, för diagnos av multipel skleros och andra neuropatier.

Sammanfattningsvis visar vår studie att MEMRI är en kraftfull experimentell metod för att studera Retino-tectal circuitries i möss, och därigenom förlänga optometric uppgifter för att bedöma funktionaliteten i det visuella systemet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908