在视神经纤维通过诚信小鼠对比增强MRI 活体成像

Summary

该视频演示了一种方法，利用临床3个T的扫描仪，对天真的鼠标视觉投影对比增强磁共振成像和重复性和纵向体内视神经病变的研究，急性视神经挤压伤和慢性视神经变性相关敲除小鼠（P50 ^KO）。

Abstract

啮齿动物视觉系统包含形成视神经进入丘脑和中脑中心和突触后投射到视觉皮层的视网膜神经节细胞和它们的轴突。基于其独特的解剖结构和便利的交通，它已成为青睐的结构对神经元的存活，轴突再生，突触可塑性研究。在MR成像的最新发展，使体内使用的可视化介导锰对比度增强（MEMRI）这款投影的眼膜，顶盖部分。在这里，我们提出了一个MEMRI协议说明视觉投影在小鼠中，其中（200微米^）3分辨率可以使用常见的3特斯拉的扫描仪来实现的。我们将演示如何玻璃体腔注射15纳摩尔的MnCl ₂单剂量导致24小时内完整投影的饱和增强。与异常的视网膜，改变信号强度都INDEPEN凹痕恰逢视觉刺激或生理老化。我们还应用此技术来监测纵向轴索变性响应急性视神经损伤，范式其中Mn ^{2 +}的运输完全逮捕的病变部位。相反，有源Mn ^{2 +}的传输是定量相称的生存能力，数量和轴突纤维的电活动。对于这样的分析，我们举例说明的Mn ^{2 +}转运动力学以及在转基因小鼠模型（NF-κBp50的^KO）显示的感官自发萎缩，包括视觉，突出视觉路径。在这些小鼠中，MEMRI表示减少，但不会延迟Mn ^{2 +}的传输相比，野生型小鼠，从而通过NF-κB突变揭示的结构和/或功能障碍的迹象。

综上所述，方便MEMRI桥梁体内试验和验尸组织学的characterizati对神经纤维的完整性和活性。它是在轴突变性和再生，突变小鼠真正的或可诱导的表型调查纵向研究是非常有用的。

Introduction

基于其良好的神经解剖结构的啮齿动物视觉系统提供了独特的机会，以评估药物的化合物和它们的能力，调解神经保护¹或促再生作用^2,3。此外，它允许对小鼠突变体的功能及神经解剖特点的研究，如最近列举的缺乏突触前支架蛋白巴松管^4只小鼠。此外，辅助工具的广谱提供了额外的视网膜神经节细胞（RGC）和RGC轴突数量，以及研究资助局的活动， 如为特色，通过电图和行为测试，和皮质重排由内在信号光学成像的决心。在激光显微镜的最新技术发展在视神经（ON）和脑整装标本深部组织荧光成像使在研资局再生原位可视化。在这种histologiCal的方法，基于四氢呋喃组织清算与光片荧光显微镜组合允许单纤维的分辨率，重新进入deafferented ON和视束^5。虽然这种技术可能是决心和意志的增长模式优越，他们不使个人成长活动，这是特别理想，以评估长期再生的过程中重复和纵向分析。

对比增强MRI已用于小鼠和大鼠^6,7的眼膜，顶盖投影的微创可视化。这可以通过直接的眼内递送顺磁离子（ 如 Mn ^{2 +}的）的视网膜细胞来实现。作为钙类似物，Mn ^{2 +}的结合到RGC胞体通过电压门控钙通道，并沿着完整ON和视束的轴突细胞骨架的主动转运。虽然它积聚在脑细胞视觉投影， 即在外侧膝状体（LGN）和上丘（SC），跨突触传播到初级视觉皮层出现^8,9可以忽略不计，虽然它可能会出现^10,11。在MR测序，顺Mn ^{2 +}的增强磁共振造影主要是通过缩短_Ŧ1自旋-晶格弛豫时间^12。该Mn ^{2 +}增强磁共振成像（MEMRI）已在大鼠的各种神经解剖和功能的研究，包括轴突再生和变性受伤^13,14后的评估中得到成功应用，将眼膜-顶盖突起¹⁵的精确解剖标测，以及轴突转运特性的药物治疗¹⁶后的决心。在剂量，毒性和神经元Mn ^{2 +}的吸收和运输，以及改进的MRI方案动力学近期的改进已经扩大其应用到转基因研究⁹小鼠用3特斯拉的扫描仪在临床实践¹⁷常用。

在这里，我们提出了适用于纵向一MEMRI协议在鼠标眼膜-顶盖投影的体内成像和评估天真和各种神经退行性变的条件下Mn ^{2 +}的依赖性信号增强体现了它的适用性。我们的协议的地方特别强调磁共振数据采集在一个温和的3个T磁场通常比动物专用扫描仪更加方便。在天真的小鼠中，我们说明了如何系特有的信号强度可以大大而重复地成为后玻璃体（ivit）Mn ^{2 +}的应用增加。定量，Mn ^{2 +}的传播沿着视觉投影独立地发生正常的老化过程（3和26个月大的小鼠之间测得）和增强是难治的视觉刺激和适应黑暗。与此相反，锰18以及在NFKB1敲除小鼠（P50 ^KO）从自发凋亡RGC的死亡和ON变性¹⁹痛苦。因此，在扩大传统的组织学分析，动物个体的纵向MEMRI分析，可以为神经变性过程的独特的动力学分析。这应该证明与药物或基因干预相关的神经保护和轴突再生的研究很有用。

Protocol

所有动物的干预按照欧洲公约动物保护实验动物和使用以及ARVO声明在眼科和视觉研究用动物进行的。所有的实验都是由当地伦理委员会批准。对损伤的小鼠中的程序是在别处⁹所述。

1，玻璃体内注射锰

1. 执行中Mn ^{2 +}注射24小时的MR扫描与助手的帮助之前。腹腔注射5％水合氯醛溶液（420-450毫克/千克体重在无菌PBS中）麻醉动物。有关其他局部麻醉，应用一滴液体conjuncain（0.4％奥布卡因盐酸盐）来之前，眼睛穿刺角膜。注入15纳摩尔Mn ^{2 +}的每只眼睛准备一个7.5毫米的MnCl ₂溶液， 例如 ，通过稀释1升1米的MnCl ₂原液在132 LH _{2 <}/ SUB> O。负载5微升的最终解决方案到5微升汉密尔顿注射器连接到34 g小枢纽可拆卸针（RN针）的。
2. 当与右眼开始，请将鼠标左键双面双目显微镜下，轻轻打开并修复你的左手的拇指和食指之间的右眼。拿起注射器用你的右手，并采取针靠近尖端的保持。为眼部灯泡无创伤穿刺，小心将针刺入玻璃体在infero颞周长大约1mm远端的角膜缘，从而不遗余力巩膜血管。
3. 接着，助手慢慢适用的2微升的总体积，同时控制Hamilton注射器的刻度。在此过程中，监测在显微镜下最优的针的位置，并避免液体的透镜或溅出的穿刺。保持静态地插入另外的30秒的针，然后撤回它慢慢地减少液体从注射部位的泄漏。
4. 在整个过程中，特别应注意避免压到眼球。同样，避免恶劣或多次试图刺破眼球灯泡。因为Mn ^{2 +}摄取到视网膜神经节细胞，并沿对运输已经饱和在15纳摩尔的MnCl _2，这稍微不精确的进样量最小化的信号变化。对于视觉投影的双边信号增强，重复注射过程用于左眼。
5. 申请氧氟沙星的含（3毫克/毫升）滴眼液和含有泛醇-软膏后，一旦程序，以防止眼部感染和眼干燥。返回小鼠正常居住条件下它们的笼子，直到MR扫描的开始。

2，动物准备的MRI

1. 由2％/ 98％异氟烷/氧气气体混合物的施用麻醉小鼠。安装鼠标鼠标持有人在一个几乎水平，无捻位置。插件ERT成的MR线圈，然后将其在MR扫描仪内进行调整。监测呼吸和心脏率合适的系统。有关技术详情，请参阅赫尔曼等人 ^20。
2. 在MRI，供给麻醉经由由集成管连接到鼠标头部保持器的蒸发器的最初的1.5％/ 98.5％异氟烷/氧气气体混合物的连续吹入。在扫描过程中，根据记录的重要参数（ 即目标为约每分钟40次呼吸平稳呼吸速率）调整麻醉深度。使用加热装置保持在35和37℃下的体表温度稳定的，如通过定位于小鼠的腹腔内有热传感器测量。有关技术详情，请参阅Herrmann 等^[17]。
3. 扫描之后，从支架释放鼠标和纯氧供应，以加速从麻醉中恢复。另外，通过使用保持体温稳定红灯加热源。

3，MRI协议

1. 该协议被验证为3特斯拉扫描器配备专用的，信噪比高效，小动物线圈（线偏振绞线线圈）与视35毫米×38毫米直径的一个有效字段。操作在发射 - 接收模式线圈。
2. 在其最终位置的动物，调节线圈的同一个频率分析仪的辅助下调谐和匹配。手动调整发射机的基准电压和电流的垫片，以优化图像的均匀性和质量。
3. 收购_Ŧ1加权谢2D图像为0.5毫米，分辨率×0.5㎜×2毫米的规划矢状和横向视图。使用规划MR扫描，获取在冠状测量方向上的MEMR图像，旋转成平行于动物的头沿左右方向的相位编码。为了尽量减少采集时间，使用的视图的矩形区域调整到实际的头部尺寸。基础矩阵256，视场54㎜×50.65毫米×14.08毫米，利用相位编码方向的视图93.8％的矩形区域，和128片0.11毫米：使用以下参数采用一个被宠坏的3D FLASH序列（VIBE 3D）切片厚度与片的分辨率设置为61％。
4. 激活平面内插值到512×480×128创建最终图像，提供0.21㎜×0.21毫米* 0.18毫米的有效分辨率（0.1毫米×011㎜×0.09毫米插值），回波时间T _E = 6.51毫秒，重复时间T _R = 16毫秒，带宽= 160赫兹/像素，翻转角= 22°。应用两个平均值和三个重复，实现约30分钟，总采集时间_（T A）。

4，MRI数据分析

1. 使用该软件的syngo fastView分析数据。对于定量信号增强，选择定义的区域Ø在2D平面的MRI录音f兴趣，并决定加强结构（SI _MEMRI），组织背景（SI _backgr），噪音（SD _N）的标准偏差的信号强度（SI）。如有需要，使用鼠标脑图谱，以促进神经解剖定位为外膝体和SC的结构。计算出的对比度噪声比（CNR），使用下式：
2. CNR =（SI _MEMRI - SI _{backgr）/ SDÑ}
3. 量化连续三个图像的平均CNR计算每个样品。在双边注射的动物，独立分析每个半球。
4. 对于水平，冠状面和矢状面图像的描述，计算从原来的3D MRI数据集多平面重建。这些处理过的图像，不建议进行定量分析。要创建眼膜的动画三维重建（最大强度投影，得到的MIP）- 顶盖投影，使用血管造影后处理软件模块。

5，Mn ^{2 +}的自显影技术（TIMM染色）

1. 对于Mn ^{2 +}的跟踪大脑结构的下列MEMRI TIMM染色，注入的15-150纳摩尔Mn ^{2 +}的ivit 24小时前成像剂量。
2. 后的MR扫描，灌注动物用30ml冰冷的0.325％的Na ₂ S的PBS（pH 7.4）中。视网膜解剖，冷冻样品中冰冻切片。
3. 剪下的cryotome 15微米厚的顺序，赤道部分。
4. 根据Angenstein 等^[22]在没有固定剂和冷冻保护的执行TIMM染色^21。

6，统计分析

使用Student-t检验进行单比较，接着事后方差分析进行统计分析。数据以平均值±标准误差。各个N个数字分别为每个实验给出。结果到达压力 ≤0.05顷认为有统计学显著性（P≤0.05，*，P≤0.01，**，P≤0.001，***）。

Representative Results

这种成像技术的准确评估视觉投影的活力和功能的能力依赖于一个无毒的Mn ^{2 +}的用量精准应用的玻璃体，其吸收的视网膜神经节细胞。这主要假设在图1中，其中层具体Mn ^{2 +}的摄取证明了自显影技术（TIMM染色^）21进行测试。视网膜节，在24小时后，无论是15纳摩尔或150纳摩尔的Mn ^{2 +，}或PBS作为对照的ivit的应用进行了分析。在该时间点时，Mn ^{2 +}的注入视网膜表现出最大的信号增强T中₁加权成像（N = 3;虚线），而PBS注射的视网膜中没有信号（N = 3;虚线）增强（ 图1 ，左图）。请注意，在150纳摩尔注入眼高强信号信号增强。相比之下，平扫脑区（星号）显示出类似的背景信号强度为所有合作制条件（绿色）。Ivit Mn ^{2 +}的应用程序增加整体TIMM染色特别是在RGC层和神经纤维层（NFL）（ 图1，在中间面板放大的插图），这是由个别研资局胞体的调查证实之后H＆ Ë共同的标签（右图）。

为鼠标眼膜-顶盖投影的体内成像，重要的是选择其中的操作参数与设备一起，如示于图2，适合于分析的小鼠中有3 T字段特殊鼠标MEMRI协议。应用这样的扫描仪设置，我们早期的工作表明，中枢神经系统图像分辨率鼠头线圈优于专用鼠标全身线圈^17。这两者要解决的鼠头和适当调整其对大鼠线圈中的位置，我们使用一个支架和一个锥形管咬棒塑料制成的，是按比例缩小，以满足机体尺寸小鼠（ 图2A，B）。当图像在横向_Ŧ1加权矩阵实现3D梯度回波序列获得的，为（200微米^）3内的采集时间35分钟的高清晰度图像的产生可以预期的。在扫描过程中，我们强烈建议不断监测的重要职能。麻醉postimaging氧合和体温控制在一起的调整显著加快恢复时间，并保证约100％的存活率。这样的技术防范措施是必要的，以确保整个队列将保持纵向和重复MRI检查。

在任何研究中，应只用于无毒的Mn ^{2 +}的剂量为15纳摩尔为ivit应用^9，其足以显着提高的CNR在视网膜ON，并视束到突触前脑LGN和SC。 CNR值最好在200微米厚的横向计算通过切片重组原各向同性的三维体积由原来的MRI数据集获得的切片。 图3A显示的精确测定CNR为增强外膝体，其中三个需要关注的区域中的每个图像都选择（1）信号增强区（SI _MEMRI一个例子），（2）非仿射脑组织（SI _backgr），和（3）的背景噪声（SD _N）。沿单一视觉投影的全部量化可预期的空间信号的增强是在图3B中 。注意在视网膜切片沿着背腹平面，其峰值在视神经乳头的强渐进信号增强的上升。此外，请注意缺乏相关的跨突触Mn ^{2 +}的传播进入皮质层应用的实验条件（在视觉皮层的信号压降）下。精神上是高度说明形象化全盘 （ 电影1）的眼膜，顶盖投影的3D定位。一Mn ^{2 +}的沿视觉投影ccumulation是由细胞内摄取的动力学确定成通过电压依赖性视网膜神经节细胞的Ca ^{2 +}通道和它的快速轴突运输，以及通过从所述目标组织^13上的相对低的间隙。根据我们先前的动力学研究，Mn ^{2 +}的依赖性信号增强可早在注射后6小时进行检测。它在24小时进一步的山峰和减少回内120小时后注射⁹基线水平。因此，为了达到最佳效果，MEMRI应进行24小时，在注射后，它代表一半所需的大鼠¹³的提升时间。

在概述了视觉投影由MEMRI的​​对比度增强的原则，我们进一步沟通的两个参数的影响 - 光照条件和动物的年龄 - 这可能会影响定量测量：

（1）尝试f或Mn ^{2 +}在脑中心刺激相关的积淀，老鼠被安放在任何一个定义的频率手电筒曝光（5 Hz）和光照强度（3 W LED）实现的光刺激条件下或在完全黑暗扫描前，而在Mn ^{2 +}的暴露24小时。中国北车24小时的定量分析ivit后的Mn ^{2 +}应用程序^中显示相比，光刺激的条件下（66.29±3.07 与54.56±3.08，P≤0.05，N = 7 /显著增加暗适应视网膜的信号强度8， 图3C）。考虑到周边视网膜和视神经头（ 见图3B）之间的信号增强的梯度，我们放心经常分析各实验组中相应的视网膜切片。沿ventrodorsal平面图像分析发现，正如所料，那绝对CNR值在这两个条件下去。重要的是，REL黑暗与光明适应视网膜之间ative信号差保持持久的（数据未显示）。然而，信号在LGN的投射区的增强（26.97±1.78 与26.58±1.05，P = 0.9，N = 7-2）和SC（25.09±1.24 与26.81±1.55，P = 0.4，N = 7 / 8）是没有区别亮和暗的环境中调理（ 图3C）之间。这个实验表明，摄取Mn ^{2 +}的成视网膜层对光线照射敏感，而其沿眼膜，顶盖投影和积累在目标地区的传播不受重合视觉刺激的影响。备选地，3个T扫描器的信号灵敏度可能低于检测阈值在LGN或SC信号的变化。

（2）探讨动物的年龄对视觉投影MEMRI相关的信号增强的影响，我们分析3及26个月澳的老鼠女年龄。 （P = 0.79，N = 16 23.90±0.81），13个月（23.35在3个月大的小鼠的LGN（23.49±1.36，N = 12）不从年龄7个月的小鼠测得的信号强度不同的CNR值±1.29，P = 0.94，N = 10）或26个月（25.10±2.29，P = 0.53，N = 6， 图3D）。同样，在SC的信号强度是不变的3个月（19.01±1.20）和26个月的年龄（16.92±2.18，P = 0.37; 图3D）。虽然略有增加是显而易见的，26个月大的视网膜（38.49±3.25），中国北车值，当在所有组（P <0.05）相比，这个增长没有达到显着性。这些实验表明，在视觉上投影的脑目标区域的信号增强不受视觉刺激和生理老化。

接下来，我们证明MEMRI的​​灵敏度来检测结构改动ØF中的视觉投影引起的急性和慢性轴索病。为了探究这个，Wallerian变性的创伤性诱导损伤¹⁸以及作为动物模型显示感官预测，包括视觉通路¹⁹的早熟，自发退变模型被雇用：

（1）外伤性轴索病引起的上挤压伤引起axona分册的破损。因此，Mn ^{2 +}的沿轴突细胞骨架眼膜-顶盖传输将是完全和持续阻塞，如在LGN可视化由Mn ^{2 +}的增强的信号的完全损失和SC分析一天（未示出），一个星期（ 图4A中中，虚线），和4周（未示出）后损伤。为了清楚地表明受伤的神经解剖学和连续的MRI表现，并从幼稚状态剖析它们，病灶仅造成单方。这会导致不变的Mn ^{2 +}转运关于t他在对比的干预侧示踪中断控制端。在deafferented领域的CNR值的分析证实完全没有信号增强（未显示）。该实验还表明，MEMRI处于前和伤害后（ 图4B）检测出的病变部位的通过沿突起的信号强度的纵向评估的位置和严重程度高度敏感。而沿受伤之前接通的信号强度不断地保持高于背景信号，存在信号强度的颞空间降低到背景水平一天，在受伤后。

（2）我们以前的工作表明，Mn ^{2 +}的依赖性信号中的LGN增强时^，9注射后测量24小时减至10个月大的小鼠缺乏NF-κB亚基P50。具有很高的一致性检测，我们在眼膜-顶盖Mn ^{2 +}的跨假设整体减值口，可能是由视网膜神经节细胞数量减少，并导致衰老的p50 ^基因敲除小鼠¹⁹相关的开神经病。可替换地，减小信号的增强可能与迟发性神经元摄取和Mn ^{2 +}的传播从玻璃体并沿病理投影相关联。后者的可能性可以通过执行重复性的MR扫描的15纳摩尔Mn ^{2 +}的单个应用程序后，研究视网膜和外膝体信号增强的动力学早期（8至24小时）和晚期（48和72小时）的时间进行探讨点。在野生型和p50 ^敲除小鼠，在8小时的视网膜信号增强的峰在几乎相同的增强率（43.52±3.24和40.72±2.79，P = 0.6，N = 3-6， 图4C所示 ，左图）。而信号增强在24小时后注射居高不下野生型，它的p50 ^基因敲除小鼠下降（43.38±2.18 对比 32.89±1.54，P≤0.01，N = 5-8）。在以后的阶段（48至72小时），信号增强在两组减小（在基因敲除小鼠为低CNR值），从而排除延迟视网膜Mn ^{2 +}的摄取和在p50的^KO小鼠繁殖。相应的结果P50 ^基因敲除小鼠的LGN证实这种说法。虽然CNR为8和48小时后喷射（P≤0.05，N = 5-9）之间的显著较低，在p50的^基因敲除小鼠的信号衰减的动力学对应于在野生型小鼠（ 图4C，右）。因此，该眼膜-顶盖突起的减少颞空间信号的增强是由于从一个有限的RGC人口，而不是受损传输动力学始发减少轴突数量。我们建议MEMRI是一个有价值的工具来筛选基因突变小鼠在中枢神经系统projectional障碍。

内容“FO：保持together.within页=”总是“>
锰²的图1。TIMM染色⁺摄入的视网膜神经节细胞，T ₁为代表热图图像加权成像（MRI _T1）表示镜头的信号增强和整个视网膜围（虚线），24小时后的15 ivit应用应用150纳摩尔后纳摩尔，和超密集信号增强的Mn ^{2 +（}左）。温暖的颜色代表比冷色调更高的信号值。比例尺：1毫米。中/右：ivit注射氯化锰₂银沉淀用TIMM染色（黑色）作为检测后视网膜神经节细胞的Mn ^{2 +}摄入。 PBS处理的对照视网膜节展示出相当弱阳性，研资局层（研资局）的弥漫性差异（顶部，N = 3）。高倍率不允许ð。单个细胞（放大插图）的iscrimination Ivit的MnCl ₂应用程序的差异提高了整体银染整个视网膜层，具有突出的银沉淀尤其是在神经纤维层（NFL），RGC层和内核层（INL，中间和底部，放大的插图，N = 3）。 TIMM的Colabeling用H＆E染色进一步证实该层具体Mn ^{2 +}的积累（右图）。比例尺，概述：50微米，放大倍率：25微米。彩光，内网层; OPL，外丛状层;外核层，外核层; RPE，视网膜色素上皮细胞。

图2。照片显示的MRI设备专门为鼠标MEMR图像采集的临床3T扫描仪。 A）显示了定制鼠标底座用b伊特棒头部固定和传感器对呼吸监测（白色垫，蓝色管），B）示出了定位和固定小鼠中的摇篮。管子向左供给麻醉气体。C）例示了鼠标头和支架的定位线偏振绞线线圈在发送操作内部和接收模式。D）示出了线圈的平台中的屏蔽管的前部和临床3 T成像仪。铜包覆管提供额外的屏蔽从热水基于加热垫（管周围的黑色包装），噪声和块的MRI信号E）可视化的完整的建立了3个T扫描器的细孔内的动物线圈的刚精确定位动物头在扫描仪内的等角点之前。

各种轻，年龄条件下，天真的眼膜，顶盖投影图3。MEMRI A）增强LGN和组织背景插 ​​图感兴趣区（ROI）的映射区域上的横向MRI检查记录（左图）。 LGN特定的信号增强是通过热图显示（右）所示。 1和1'，左，右LGN; 2和2'，背景组织; 3，噪音; P，后路; R，右。比例尺：信号增强的沿MEMRI从最初收购的横向MR图像切片确定一个单一的眼膜，顶盖投影为100微米B）空间的映射。实心方形，Mn ^{2 +}的依赖性信号增强;开放的三角形，背景信号。 R，视网膜;开，视神经; OT，视束; LGN，外侧膝状体;资深大律师，上丘; VC，视觉皮层。切片厚度，200微米。C）光刺激显著降低视网膜信号增强。 ENHAncement在LGN和SC是独立的视觉刺激。实心圆，暗适应;空心圆，光适应D）信号的增强是独立的3和26个月的年龄增加的。

图4。MEMRI神经变性条件下的眼膜，顶盖投影。 A）双边ivit注入小鼠MEMRI权就单方面挤压伤后进行一个星期。的水平，冠状和横向意见多平面重建描绘完全没有信号增强在LGN和SC为受伤半球（虚线）。 C，对侧半球;我，同侧半球。比例尺：1毫米B）MIP图像和沿对空间信号增强的磁共振成像纵向分析前和终有一天伤后。 R，视网膜;开，视神经;箭头，病灶部位。比例尺：根据在p50的^基因敲除小鼠的视觉投影的慢性神经变性的增强信号为0.5mm C）动力学早期（8小时）的摄取的Mn ^{2 +}的成视网膜细胞不受影响，但已缩小的p50的LGN ^KO小鼠。重复磁共振成像在24，48，和（仅适用于视网膜），72小时显示信号的持续减少，但类似的Mn ^{2 +}转运和积累的p50 ^基因敲除小鼠的视网膜和外膝体的动力学。

电影1：动画，三维热图演示原位对比增强眼膜-顶盖投影磁共振成像双边ivit注射15纳摩尔的MnCl ₂后进行24小时。数据列于按揭保险计划模式。切片厚度，200微米。 <A HREF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4”目标=“_blank”>请点击此处观看该视频。

Discussion

视觉系统的MEMRI延伸常规神经生物学技术的幼稚和病理条件下评估功能。除了 ​​提供独特的洞察到一个孤立的中枢神经纤维束的完整性，这种成像方法可以很容易地辅以行为测试， 例如 ，验光和视觉水性任务，调查一个给定的范例视觉感知的直接后果。它还连接电生理和病理调查与体内功能的视觉表征。该技术是高度可靠和可重复使用相同的内群体未成年人的个体差异（参见图3，误差线4）。有趣的是，在15纳摩尔的剂量，Mn ^{2 +}的摄取和轴突运输是饱和的过程，从而使信号增强达到平台不能由附加的Mn ^{2 +}的电源⁹升高。从实际的角度看到，这样的剂量响应特性最小化，至少在一定程度上，注入相关联的信号增强的变化。值得注意的是，关于剂量和Mn ^{2 +}的信号增强的动力学所呈现的数据是特定于小鼠，并从这些大鼠，这需要一个大约10-20X更高的Mn ^{2 +}的剂量和增加的等待时间（36小时），不同的，以获得最佳对比度增强^13,23。此外，增强沿视觉投影仍然是3动物年龄及26个月之间是一致的。这一发现与对衰老小鼠进行视力测试，事实上，C57/B6小鼠维持正常的视觉活动长达2年的²⁴岁行。虽然我们并没有分析个别小鼠在纵向老化研究，以前的结果清楚地表明了重复给药Mn ^{2 +}的剂量为15纳摩尔视觉维修^9，这可能是期望在纵向老化研究的安全性。

按照概念，即Mn ^{2 +}的结合到神经节细胞中，我们显示的Mn ^{2 +}摄入到它们的胞体由TIMM染色依赖于游离的金属离子的银沉淀，如应用于通过Angenstein 等对脑Mn ^{2 +}的检测下列其全身应用^22。此前，脑Mn ^{2 +}的分布由⁵⁴ Mn ^{2 +}的同位素放射自显影检测划定大鼠中枢神经系统²⁵的神经回路，但不是在细胞水平上。在这里，TIMM染色允许的Mn ^{2 +}的归属摄取的暴露的视网膜中不同的细胞群，在那里我们发现突出的银沉淀在研资局和神经纤维层。应当指出，该协议的应用150纳摩尔的剂量后施加的展示改进的检测由TIMM染色相比，15纳摩尔的Mn ^{2 +。}虽然Mn ^{2 +}的吸收和其轴突反端口已经饱和在15纳摩尔，因此，赋予没有额外增加的CNR沿眼膜-顶盖投影在更高的剂量，过量补充可能增加的自由，蛋白质的供应未绑定的Mn ^{2 +，}从而使其对银沉淀访问。在染色的灵敏度未来的改进将允许特定的中枢神经系统预测与Mn ^{2 +}的定义组织区域内富集的细胞定位的MEMRI为基础的CNR值的相关性。这种能力也可能为Mn ^{2 +}的分布在视觉投影以外的其他CNS区域的表征和定量非常有用。同样，Mn ^{2 +}的已受聘于红藻氨酸毒性模型可视化变性海马苔藓纤维²⁶和再生。

Mn ^{2 +}的是采取了由电压依赖性钙通道，并在细胞内分布由主动轴浆运输，其中约n可秋水仙碱治疗^25,27被阻止。对大鼠接收的MnCl ₂的剂量腹膜内的视觉刺激的实验已经揭示了在内圈和，特别是视网膜外层²⁸增加的信号增强。因此，暗适应进一步提高的比较，染毒大鼠仅室内光线条件外层视网膜的信号强度，从而表明视网膜Mn ^{2 +}的敏感性摄取，以视觉刺激^28。同样地，我们发现增强信号强度暗适应小鼠的视网膜相比，后ivit Mn ^{2 +}的应用程序暴露在视觉刺激小鼠。这可能与一个连续的暗电流在感光细胞的视网膜和生成的特定的电生理特性。由于^钙离子涌入光感受器外节显著有助于暗电流的宪法，他们这一代可能伴随通过加强合作摄取Mn ^{2 +}的进入黑暗下的感光细胞层。相比之下，光刺激降低了暗电流，并导致感光细胞²⁹的超极化。因此，整体的Mn ^{2 +}摄取可能会根据光线条件减弱。

为MEMRI的可靠使用，它以澄清更明显的Mn ^{2 +}是否摄取到的暗适应视网膜改变沿所述视觉投影或者甚至它的整个延伸的其它部分的信号增强是很重要的。脑网络的MEMRI信号强度刺激依赖性变化已证明后腹腔Mn ^{2 +}的应用程序³⁰的音响系统。在本研究中通过Yu 等人 ，大鼠前的MR扫描和下丘对T ₁加权信号增强，其后调查暴露于可变噪声频率。声刺激被发现重大TLY增加一个tonotopic表示MEMRI信号强度，从而举例说明活性依赖的Mn ^{2 +}积累³⁰功能磁共振成像样的性格。与此相反，在我们的实验设置的Mn ^{2 +}积累在LGN和SC出现独立视觉刺激。然而，在感觉大脑映射尝试这种差异可能在比较中使用Yu 等人 ³⁰高场7 T扫描仪产生的低磁场和检测我们的3个T的扫描仪的有限的门槛。

到目前为止，它不知道在什么程度的生物物理参数的影响的Mn ^{2 +}的顺行轴突运输和如何MEMRI可能作为电活性的一个指标。然而，似乎Mn ^{2 +}的传输由视网膜神经节细胞发生的独立光特异性刺激和从双极细胞接收电输入端，至少部分地。另外，电一的净影响该眼膜 - 顶盖投影内ctivity可能是暗反应“关视网膜神经节细胞'的电刺激和光响应”ON-视网膜神经节细胞'的结果。这种解释被发现，Mn ^{2 +}的转运沿眼膜-顶盖投影是不是在小鼠品系视力不佳，如CBA小鼠携带PDE6B基因引起视网膜变性¹¹的RD1突变障支持。在野生型近视和CBA小鼠的动力学研究中，在初始阶段流入（在2.5小时后喷射），以及最终的信号增强（24小时）在LGN和SC ¹¹进行观察比较的运输速率。

总而言之，这些观察结果支持了MEMRI， 例如 ，视觉系统的例证这里，代表一个有价值的措施的结构的完整性和代谢稳定性而不是电活动的概念。实际上，看似s在脑外膝体和SC信号增强，从曝光表的独立性使得强大的处理和动物的外壳没有关于照明的特殊照顾。另一方面，对于MEMRI研究，侧重于视网膜的信号增强，有必要使动物在扫描之前，严格控制的光照条件下。

在影响Mn ^{2 +}的轴突运输速率和随后MEMRI信号增强的生理参数，体温的稳定性可能是特别重要的。这是通过为增强在大脑中，其中富集被发现在暂时降低体温的30℃下显著减少初级嗅投影目标对鼻内Mn ^{2 +}的研究表明相比，在正常体温²⁷的信号的增强。因此，体温应该监测和调整之前和在MR扫描过程中，不仅为protect动物的健康，而且也正常化Mn ^{2 +}的传播的生理参数。

因为病理生理改变和代谢障碍的影响的Mn ^{2 +，}在投影中心的信号增强的轴突运输的功效， 例如 ，LGN和SC，可作为结构完整性和该途径的功能性活性的度量。在这里，我们提出关于变性的两种不同的条件，并说明了Mn ^{2 +}的传播和富集在丘脑和中脑中心变化作为轴突完整性的功能。急性受伤导致总的信号损失伤后立即，不因缺乏相关轴突再生的，而在p50的突变^KO慢轴索变性4周内恢复是由LGN降低CNR值反映出来。定的纵向成像的可能性，MEMRI这种应用可能是有价值f或监控对postlesional生长反应，并允许proregenerative遗传或药物干预，以视网膜神经节细胞的研究。

此外，我们提出MEMRI作为一个高度敏感的方法来检测信号逐渐增强的损伤与慢性轴索变性过程有关。转录因子NF-κB参与了神经元的维护和小鼠中缺失了视觉系统¹⁹中的NF-κB显示年龄依赖性神经元细胞损失和轴突变性的P50亚基。除了组织学和电子显微镜分析，该眼膜-顶盖投影MEMRI能够识别在这些小鼠的表型的改变。通过收购以下ivit Mn ^{2 +}的应用程序的串行_Ŧ1加权MR图像中，我们鲜明的整体从简单地推迟Mn ^{2 +}的运输以及在这些p50的视觉通路减少KO小鼠。因此，重复数据收购后MEMRI单Mn ^{2 +}的应用使得在提供转基因小鼠的宝贵池的轴突运输动力学和神经电生理改变的定义。目前，这种成像方法的若干修改正在调查旨在让这项技术安全地用于人类诊断应用。高的临床相关性，这构成一种替代ivit注入一个有前途的方法，为Mn ^{2 +}的交付作为眼药水。从而，为1M的MnCl ₂局部给药在SC产生了显著信号增强了20％时的4.7Ŧ动物扫描仪³¹被获取的图像。该方法能够下列视网膜缺血³¹检测上广泛变性，并应用浓度证明安全的，当在每月的³²间隔重复应用。鉴于Mn ^{2 +}的相对较高的神经毒性例如 ，多发性硬化和其它神经病的诊断。

总之，我们的研究表明，这种成像方法是研究眼膜 - 顶盖设计电路的小鼠，从而延长验光配镜工作评估视觉系统的功能强大的实验方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908