In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

Summary

Dieses Video zeigt ein Verfahren, mit einem klinischen 3 T Scanner, für kontrastverstärkte MR-Bildgebung des naiven Maus visuelle Projektion und für sich wiederholende und Längs in-vivo-Studien der Sehnerv-Degeneration mit akuter Sehnerven Quetschverletzung und chronische Degeneration des Sehnervs an assoziierten Knock-out-Mäusen (p50 ^KO).

Abstract

Das Nagetier visuelle System umfasst retinalen Ganglienzellen und ihre Axone, die den Sehnerv bilden Thalamus und im Mittelhirn Zentren und postsynaptischen Vorsprünge auf den visuellen Kortex ein. Auf der Grundlage seiner ausgeprägten anatomischen Struktur und bequeme Erreichbarkeit, hat es sich die bevorzugte Struktur für Studien über die neuronale Überleben, axonalen Regeneration und synaptische Plastizität. Jüngste Fortschritte in der MR-Bildgebung haben die in vivo Visualisierung des retino-tectalen Teil dieser Projektion mit Mangan-vermittelten Kontrastverbesserung (MEMRI) aktiviert. Hier präsentieren wir eine MEMRI-Protokoll für die Darstellung der visuellen Projektion in Mäusen, durch die Beschlüsse der (200 um) ³ lassen sich mit üblichen 3-Tesla-Scanner erreicht werden. Wir zeigen, wie intravitreale Injektion einer einzelnen Dosis von 15 nmol MnCl ₂ führt zu einer Verbesserung der gesättigten intakt Vorsprung innerhalb von 24 Stunden. Mit Ausnahme der Netzhaut, Änderungen in der Signalstärke sind unabdent von übereinstimm visuelle Stimulation oder physiologische Alterung. Haben wir weiter diese Technik anzuwenden längs überwachen axonalen Degeneration in Reaktion auf akute Verletzung des Sehnervs ein Paradigmen durch die Mn ^{2 +-Transport} vollständig Verhaftungen an der Verletzungsstelle. Umgekehrt ist aktiv Mn ^{2 +-Transport} quantitativ angemessenen Verhältnis zur Rentabilität, Anzahl und elektrische Aktivität der Axon-Fasern. Für eine solche Analyse, veranschaulichen wir Mn ^{2 +-Transport} Kinetik entlang der visuellen Pfad in einem transgenen Mausmodell (NF-kappaB p50 ^KO) Anzeige spontane Atrophie der sensorischen, visuelle, Projektionen. Bei diesen Mäusen zeigt MEMRI reduziert, sondern Mn ^{2 +-Transport} im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nicht verzögert und zeugen somit Anzeichen für strukturelle und / oder funktionelle Beeinträchtigungen durch NF-kB-Mutationen.

Zusammenfassend MEMRI bequem überbrückt in vivo-Tests und Post-mortem-Histologie für die characterizatiauf der Nervenfaserintegrität und Aktivität. Es ist sehr nützlich für Längsschnittstudien zur axonalen Degeneration und Regeneration, und Untersuchungen von mutierten Mäusen für echte oder induzierbare Phänotypen.

Introduction

Aufgrund seiner günstigen neuro-anatomische Struktur das Nagetier visuelle System bietet einzigartige Möglichkeiten, pharmakologische Verbindungen und deren Eignung zur Neuroprotektion ¹ oder pro-regenerative Wirkung ^2,3 vermitteln. Darüber hinaus ermöglicht es Studien über die funktionalen und neuroanatomischen Merkmale von Mausmutanten, wie kürzlich für die Mäuse, denen der präsynaptischen Gerüstprotein Bassoon ⁴ veranschaulicht. Ferner ist ein breites Spektrum von Zusatzwerkzeugen bietet zusätzliche mit der retinalen Ganglienzellen (RGC) und RGC-Axone Nummern RGC-Aktivität, z. B. durch Elektroretinographie und Verhaltenstests und der Bestimmung der kortikalen Umlagerungen durch optische Abbildung der intrinsischen Signalen. Die neuesten technischen Entwicklungen in der Laser-Mikroskopie ermöglicht die in situ-Visualisierung von RGC Regeneration durch tiefe Gewebe Fluoreszenz-Imaging in ganze Berg Exemplare der Sehnerv (ON) und Gehirn. In dieser histologischenschen Ansatz, Tetrahydrofuran basierte Gewebe Clearing in Kombination mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Auflösung von Einzelfasern, die in die deafferentierten ON und Tractus ⁵ erneut eingeben. Während solche Techniken vielleicht überlegen in der Auflösung und Bestimmung von Wachstumsmustern zu sein, haben sie nicht aktivieren wiederholende und Längsschnittanalysen der einzelnen Wachstums Ereignisse, die besonders erwünscht sind, den Prozess der langfristige Regeneration zu beurteilen.

Kontrastmittel-MRT ist für die minimal invasive Visualisierung der retino tectalen-Projektion bei Mäusen und Ratten ^6,7 eingesetzt. Dies kann durch direkte intraokulare Lieferung von paramagnetischen Ionen (z. B. Mn ^{2 +),} um Netzhautzellen erreicht werden. Als Calcium-analog, wird Mn ^{2 +} in RGC Somata über spannungsgesteuerte Calcium-Kanäle eingebaut und entlang der axonalen Zytoskeletts der intakten ON und Tractus aktiv transportiert. Während es in der Hirnkerne sammeltder visuellen Vorsprung, dh die Corpus geniculatum laterale (LGN) und Colliculus superior (SC), transsynaptische Ausbreitung in den primären visuellen Kortex erscheint vernachlässigbar ^8,9, obwohl es ^10,11 auftreten. Unter MR-Sequenzierung, paramagnetische Mn ^{2 +} steigert MR-Kontrast hauptsächlich durch Verkürzen _{T1-Spin-Gitter-Relaxationszeit} ^12. Solche Mn ^{2 +} MRT (MEMRI) ist erfolgreich in verschiedenen neuro-anatomische und funktionelle Untersuchungen von Ratten, wie die Bewertung des axonalen Regeneration und Degeneration nach ON Verletzungen ^13,14 angewendet, die genaue anatomische Zuordnung der retino-tectalen Vorsprung ¹⁵ sowie die Bestimmung des axonalen Transporteigenschaften nach pharmakologischen Behandlung ^16. Letzte Verfeinerungen in der Dosierung, Toxizität, und die Kinetik der neuronalen Mn ^{2 +-Aufnahme} und Transport, sowie verbesserte MRI-Protokolle seiner Anwendung auf Studien an transgenen verlängertMäuse ⁹ mit 3-Tesla-Scanner üblicherweise in der klinischen Praxis ¹⁷ verwendet.

Hier präsentieren wir eine MEMRI-Protokoll eignet sich für Längs-in-vivo-Bildgebung der Maus retino tectalen-Projektion und veranschaulichen ihre Anwendbarkeit durch die Beurteilung Mn ^{2 +-abhängige} Signalverstärkung unter naiv und Neurodegeneration verschiedenen Bedingungen. Unser Protokoll legt besondere Betonung auf der MR-Datenerfassung in einem moderaten 3 T Magnetfeld, die allgemein zugänglicher als engagierten Tier-Scanner. In naiven Mäusen veranschaulichen wir, wie Trakt spezifische Signalintensität erhöht werden, nach intravitrealer (ivit) Mn ^{2 +-Anwendung} deutlich und reproduzierbar zu werden. Quantitativ, Mn ^{2 +} Ausbreitung entlang der visuelle Projektion erfolgt unabhängig von den normalen Alterungsprozess (zwischen 3 und 26 Monate alten Mäusen gemessen) und Vergrößerung ist refraktär visuelle Stimulation und die Anpassung an Dunkelheit. Im Gegensatz dazu, Mn 18 sowie in NFKB1 Knock-out-Mäusen (p50 ^KO) leiden spontane RGC apoptotischen Tod und ON-Degeneration ¹⁹ verringert. So wird in Erweiterung zu herkömmlichen histologischen Analyse Längs MEMRI Analyse der einzelnen Tiere ermöglicht Profilierung der einzigartigen Kinetik von neurodegenerativen Prozessen. Dies sollte nützlich für Studien zur Neuroprotektion und axonalen Regeneration mit pharmakologische oder genetische Eingriffe verbunden beweisen.

Protocol

Alle Tier Eingriffe werden in Übereinstimmung mit der Europäischen Konvention zum Tierpflege und Verwendung von Labortieren und dem ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt. Alle Versuche werden von der lokalen Ethikkommission genehmigt. Das Verfahren von der Schädigung bei Mäusen anderswo ⁹ beschrieben.

1. Intravitreale Injektion Mangan

1. Führen Sie die Mn ^{2 +-Injektion} 24 Stunden vor der MR-Scan mit Hilfe eines Assistenten. Anesthetize die Tiere durch intraperitoneale Injektion einer 5% Chloralhydrat-Lösung (420-450 mg / kg Körpergewicht in sterile PBS). Weitere Lokalanästhesie, einen Tropfen Flüssigkeit conjuncain (0,4% Oxybuprocainhydrochlorid) auf die Hornhaut vor Augen Punktion. Um injizieren 15 nmol Mn ^{2 +} pro Auge bereiten eine 7,5 mM MnCl _2-Lösung, z. B. durch Verdünnen von 1 L 1 M _MnCl2 Stammlösung in 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Last 5 ul der Endlösung in eine 5 ul-Hamilton-Spritze mit einem 34 G kleinen Hub abnehmbare Nadel (RN Nadel) verbunden ist.
2. Beim Start mit dem rechten Auge, positionieren Sie die Maus nach links seitig unter einem Binokular und sanft öffnen und fixieren das rechte Auge zwischen Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Nehmen Sie die Spritze mit der rechten Hand und fassen Sie die Nadel in der Nähe der Spitze. Atraumatische Punktion des Augapfels, die Nadel vorsichtig in den Glaskörpereinsatz am infero-zeitlichen Umfang von etwa 1 mm distal des Limbus, dadurch Schonung skleralen Gefäße.
3. Als nächstes wendet der Assistent langsam das Gesamtvolumen von 2 ul, während die Skala des Hamilton-Spritze. Während dieses Vorgangs überwachen die optimale Platzierung der Nadel unter dem Mikroskop und Punktion der Linse oder Verschütten der Flüssigkeit zu vermeiden. Halten Sie die Nadel statisch für weitere 30 Sekunden eingefügt, dann langsam zurückziehen, um Flüssigkeit zu minimierenLeckage aus der Injektionsstelle.
4. Während des gesamten Verfahrens, sollte besondere Sorgfalt darauf verwendet werden, um Druck auf das Auge zu vermeiden. Ebenso vermeiden harsche oder zahlreiche Versuche, um das Auge Glühbirne durchstechen. Da Mn ^{2 +-Aufnahme} in RGZ und Transport entlang der ON ist bereits bei 15 nmol _MnCl2 gesättigten minimiert diese Signalschwankungen um etwas ungenau Injektionsvolumina. Für bilaterale Signalverstärkung der visuellen Projektion, wiederholen Sie den Einspritzvorgang für das linke Auge.
5. Gelten Ofloxacin enthaltenden (3 mg / ml) Augentropfen und Panthenol haltige Salbe einmal nach dem Verfahren, Augeninfektionen und Trocknen des Auges zu verhindern. Liefert die Mäuse in ihre Käfige unter normalen Wohnbedingungen bis zum Beginn der MR-Scan.

2. Vorbereitung der Tiere für die MRT

1. Betäuben die Maus durch die Verabreichung von 2% / 98% Isofluran / Sauerstoff-Gasgemisch. Montieren Sie die Maus auf eine Maushalterung in einem fast horizontal, aufgedreht Position. Insert es in den MR-Spule, die dann innerhalb des MR-Scanners angepasst. Überwachung der Atmung und der Herzfrequenz durch geeignete Systeme. Für technische Details siehe Herrmann et al ^20.
2. Während der MRT-, Liefer-Anästhesie durch kontinuierliche Insufflation einer zunächst 1,5% / 98,5% Isofluran / Sauerstoff-Gasgemisch über einen Verdampfer zur Maus Kopfhalter durch eine integrierte Rohr verbunden. Während der Abtastung nach der aufgezeichneten Vitalparameter (dh Ziel für eine stabile Atmungsrate von etwa 40 Atemzüge pro Minute) Einstellen der Tiefe der Anästhesie. Verwendung einer Heizvorrichtung halten den Körper Oberflächentemperatur stabil zwischen 35 und 37 ° C, wie durch einen Temperatursensor an der Bauchfalte des Maus positioniert gemessen. Für technische Details siehe Herrmann et al ^17.
3. Nach dem Scan, befreien Sie die Maus aus der Halterung und mit reinem Sauerstoff zu versorgen, um aus der Narkose zu beschleunigen. Darüber hinaus stabil zu halten, die Körpertemperatur durch die Verwendungein rotes Licht Wärmequelle.

3. MRT-Protokoll

1. Das Protokoll für ein 3-Tesla-Scanner mit einer dedizierten, SNR-effiziente, Kleintier Spule (linear polarisierten Litz Spule) ausgestattet mit einer effektiven Sichtfeld von 35 mm × 38 mm Durchmesser geprüft. Betreiben Sie die Spule in Sende-Empfangs-Modus.
2. Mit dem Tier in seiner endgültigen Position, stellen Sie die Melodie und Spiel der Spule mit Hilfe einer Frequenzanalyse. Manuelle Einstellung der Sender Referenzspannung und die Shimströme zu Bildhomogenität und Qualität zu optimieren.
3. Erwerben T ₁ gewichtet 2D-TSE-Bilder mit einer Auflösung von 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm in sagittaler und transversaler Ansicht für die Planung. Mit Hilfe der Planung MR-Scans, die MEMR Bilder in koronalen Messrichtung zu erwerben, gedreht parallel zum Kopf des Tieres mit Phasenkodierung entlang der Links-Rechts-Richtung sein. Um Erfassungszeit zu minimieren, verwenden eine rechteckige Sichtfeld, um die eingestelltetatsächlichen Kopfabmessungen. Verwenden Sie ein verwöhntes 3D FLASH-Sequenz (VIBE 3D) mit folgenden Parametern: Grundmatrix 256, Sichtfeld 54 mm x 50,65 mm x 14,08 mm, mit 93,8% rechteckigen Sichtfeld in Phasencodierrichtung und 128 Scheiben von 0,11-mm- Schichtdicke mit Scheibe Auflösung auf 61% festgelegt.
4. Aktivieren Sie die in-plane-Interpolation, um die endgültigen Bilder mit 512 × 480 × 128 schaffen, bietet eine effektive Auflösung von 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm x 0,1 mm x 0,09 mm interpoliert), Echozeit T _E = 6,51 ms, Wiederholungszeit T _R = 16 ms, Bandbreite = 160 Hz / Pixel, Flip-Winkel = 22 °. Tragen Sie zwei Durchschnitte und drei Wiederholungen, um eine Gesamtaufnahmezeit (T _A) von ca. 30 min zu erreichen.

4. MRI Data Analysis

1. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der Software syngo Fastview. Für die quantitative Signalverstärkung, wählen definierten Regionen of Interesse planaren 2D-MRT-Aufnahmen und Signalintensitäten zu bestimmen (SI) der verstärkten Struktur (SI _MEMRI), Gewebehintergrund (SI _backgr) und der Standardabweichung des Rauschens (SD _N). Falls erforderlich, verwenden Sie eine Maus Hirnatlas zu neuro-anatomische Orientierung für LGN und SC Strukturen erleichtern. Berechnet den Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) nach der Formel:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _backgr) / _SD-N
3. Quantifizieren drei aufeinander folgenden Bilder für mittlere CNR Berechnung für jede Probe. In bilateral injizierten Tieren, analysieren jede Hemisphäre unabhängig.
4. Für Darstellung von horizontal, koronale und sagittale Bilder, berechnen multiplanare Rekonstruktionen aus dem Original-3D-MRI-Datensatzes. Diese bearbeiteten Bilder werden nicht für die quantitative Analyse empfohlen. Um animierte 3D-Rekonstruktionen (Maximum Intensity Projektionen, MIPs) der retino erstellenTectalen-Projektion, verwenden Sie eine Angiographie Post-Processing-Software-Modul.

5. Mn ^{2 +} Autometallographie (TIMM Färbung)

1. Timm Färbung von Mn ^{2 +} zurückzuführen Hirnstrukturen folgende MEMRI injizieren eine Dosis von 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 Stunden vor der Bilderzeugung.
2. Nach der MR-Scan, durchströmen die Tiere mit 30 ml eiskaltem 0,325% Na ₂ S in PBS (pH 7,4). Präparieren Sie retinae und gefrier Proben in Gefrierschnitt.
3. Schneiden sequentiell, Äquatorial Abschnitte von 15 um Dicke auf einer Kryotom.
4. Führen TIMM Färbung ²¹ in Abwesenheit von Fixiermittel und nach Kryokonservierung Angenstein et al ^22.

6. Statistische Analyse

Führen Sie statistische Analysen unter Verwendung des Student-t-Test für Einzelvergleiche, gefolgt von Post-hoc-ANOVA. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Individuelle N Zahlenfür jedes Experiment angegeben. Ergebnisse Erreichen P ≤ 0,05 werden als statistisch signifikant (p ≤ 0,05, *: P ≤ 0,01, **: P ≤ 0,001, ***).

Representative Results

Die Fähigkeit dieser Abbildungstechnik, genau zu beurteilen, die Vitalität und Funktionalität des Bildprojektions beruht auf präzise Anwendung eines nicht-toxischen Dosierungs Mn ^{2 +} in den Glaskörper und seine Aufnahme durch RGCs. Diese wichtige Voraussetzung wird in Fig. 1, wobei die Schicht bestimmte Mn ^{2 +-Aufnahme} durch Autometallographie (TIMM Färbung) ²¹ gezeigt, getestet. Netzhautschnitte wurden bei 24 h nach ivit Anwendung von entweder 15 oder 150 nmol nmol Mn ^{2 +,} oder PBS als Kontrolle analysiert. Zu diesem Zeitpunkt werden die Mn ^{2 +} Netzhaut injiziert zeigen maximale Signalverstärkung in T ₁ gewichteten MRT (N = 3; gestrichelte Linien), während die PBS injiziert Netzhaut ist nicht im Signal (N = 3; gepunktete Linie) erweitert (Abbildung 1 , links). Beachten Sie die hyperintensive Signalverstärkung in der 150 nmol injiziert Auge. Im Gegensatz dazu Nativ Hirnareale (Sternchen) zeigen ähnliche Hintergrundsignalintensitäten für alle Cobedingu n gen (grüne Farbe). Ivit Mn ^{2 +-Anwendung} erhöht Gesamt TIMM Färbung besonders in der RGC Schicht und Nervenfaserschicht (NFL) (Abbildung 1, vergrößert Einsätze in Mitteltafel), die durch die Untersuchung einzelner RGC Somata folgenden bestätigt werden H & E Co-Kennzeichnung (rechts).

Für in vivo-Abbildung von der Maus Retino-tectalen Vorsprung, ist es wichtig, einen speziellen Maus MEMRI Protokoll, bei dem die Betriebsparameter zusammen mit der Ausrüstung, wie in Fig. 2 dargestellt ist, angepasst sind, um Mäuse in einem 3 T-Feld zu analysieren auszuwählen. Anwenden wie ein Scanner-Setup, unseren früheren Arbeiten gezeigt, dass für CNS Bildauflösung eine Ratte Kopfspule ist einem engagierten Maus Ganzkörperspule ^17. Um die Maus-Kopf zu fixieren und seine Position innerhalb der Ratte Spule richtig einzustellen, verwenden wir ein Kinderbett und einen konischen Rohr mit Biss Leiste aus Kunststoff, die beide heruntergerechnet, um die Körpermaße zu erfüllenvon Mäusen (Fig. 2A, B). Wenn Bilder auf einer Quer T ₁ gewichtete Matrix Umsetzung 3D Gradienten-Echo-Sequenzen erworben, kann die Erzeugung von Bildern mit hoher Auflösung von (200 um) ³ innerhalb von 35 min Aufnahmezeit erwartet werden. Wir empfehlen dringend die ständige Überwachung der Vitalfunktionen während des Scans. Anpassung der Anästhesie zusammen mit postimaging Sauerstoffversorgung und Kontrolle der Körpertemperatur deutlich beschleunigt Recovery-Zeit und garantiert die Überlebensrate von ca. 100%. Solche technischen Schutzmaßnahmen sind unerlässlich, um sicherzustellen, dass die ganze Kohorte werden Längs-und wiederholenden MRT zu erhalten.

In jedem Studien, sollte nur ein nicht-toxisches Mn ^{2 +-Dosis} von 15 nmol für ivit ⁹ Anwendung verwendet werden, die ausreicht, um prominent zu verbessern CNR in der Netzhaut, eingeschaltet ist, und Sehbahn bis zum präsynaptischen intrazerebrale LGN und SC. CNR-Werte werden am besten von 200 um dicken Quer berechnetScheiben von Original MRI Datensätze durch Reslice die ursprüngliche isotrope 3D-Volumen erhalten. 3A zeigt ein Beispiel für eine präzise Bestimmung der CNR verbessert LGN, bei dem drei Bereiche von Interesse in jedem Bild für (1)-Signal vergrößerte Bereich (SI _MEMRI ausgewählten ), (2) nicht-affine Hirngewebe (SI _backgr) und (3) Hintergrundrauschen (SD _N). Die zu erwartenden räumlichen Signalverbesserung entlang der gesamten einem einzigen visuelle Projektion quantifiziert ist in 3B dargestellt. Beachten Sie die starke schrittweise Erhöhung der Signalverstärkung in der Netzhautschnitte entlang der dorsoventralen Ebene, die am Sehnervenkopf Gipfel. Zusätzlich ist zu beachten das Fehlen einer entsprechenden transsynaptische Mn ^{2 +-Ausbreitung} in kortikalen Schichten unter den angewandten experimentellen Bedingungen (Signalabfall im visuellen Kortex). MIPs sind sehr illustrativ, die 3D-Positionierung des retino tectalen-Projektion in toto (Movie 1) visualisieren. Accumulation von Mn ^{2 +} entlang der Sichtprojektion durch die Kinetik der intrazelluläre Aufnahme in RGCs durch spannungsabhängige Ca ^{2 +-Kanäle} und ihrer schnellen axonalen Transport, sowie der relativ geringen Abstand von dem Zielgewebe ¹³ bestimmt. Nach unseren früheren kinetischen Untersuchungen kann Mn ^{2 +-abhängige} Signalverstärkung bereits 6 Stunden nach der Injektion festgestellt werden. Es weiteren Peaks bei 24 Stunden und nimmt wieder auf das Ausgangsniveau innerhalb von 120 Stunden nach der Injektion ^9. Deshalb, um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollte MEMRI 24 Stunden nach der Injektion durchgeführt werden, die die Hälfte der Anreicherungszeit für Ratten ¹³ erforderlich darstellt.

Nachdem skizziert das Prinzip zur Kontrastverstärkung der visuellen Projektion von MEMRI, wir weiter kommunizieren die Einflüsse der beiden Parameter - Licht Zustand und Alter der Tiere -, die quantitative Messungen beeinflussen können:

(1) F-Testoder Stimulus-abhängige Akkumulation von Mn ^{2 +-Zentren} in Mittelhirn, wurden die Mäuse entweder unter Taschenlampe durch Belichtung einer definierten Frequenz (5 Hz) und Lichtstärke (3-W-LED) erreicht lichtstimulierten Bedingungen oder in völliger Dunkelheit vor dem Scan gehalten und während 24 Stunden von Mn ^{2 +-Exposition.} Quantitative Analyse der CNR 24 Stunden nach ivit Mn ^{2 +-Anwendung} zeigt eine signifikante Erhöhung der Signalintensität der dunkeladaptierten Netzhaut im Vergleich zu lichtstimulierten Bedingungen (66,29 ± 3,07 vs 3,08 ± 54,56, P ≤ 0,05, N = 7 / 8, Fig. 3C). Angesichts der Gradient in Signalverstärkung zwischen der peripheren Netzhaut und des Sehnervenkopfes (siehe Abbildung 3B), versichert, dass wir immer zu analysieren entsprechenden Netzhautschnitte in allen Versuchsgruppen. Bildanalyse entlang der ventrodorsal Ebene zeigte, wie erwartet, dass die absolute CNR-Werte werden hinunter in beiden Bedingungen. Wichtiger ist, die reltive Signaldifferenz zwischen dunklen und hellen angepasst retinae bleibt persistent (Daten nicht gezeigt). Allerdings Signalverstärkung in den Projektionsgebieten der LGN (26,97 ± 1,78 vs 1,05 ± 26,58, P = 0,9, N = 7-2) und SC (25,09 ± 1,24 vs 1,55 ± 26,81, P = 0,4, N = 7 / 8) nicht zu unterscheiden ist zwischen hellen und dunklen Umgebungen Anlage (3C). Dieser Test zeigt, dass die Aufnahme von Mn ^{2 +} in Netzhautschichten ist lichtempfindlich, während seine Ausbreitung entlang der retino tectalen-Projektion und Akkumulation in den Zielgebieten wird nicht durch übereinstimm visuelle Stimulation beeinflusst. Alternativ könnte die Signalempfindlichkeit des Scanners 3 T unterhalb der Nachweisschwelle für die Signaländerung in der LGN oder SC sein.

(2) Zur Bedeutung des Alters der Tiere auf MEMRI bezogenen Signalverstärkung des visuellen Projektion zu erforschen, untersuchten wir Mäuse zwischen 3 bzw. 26 Monaten of Alter. CNR Werte in der LGN 3 Monate alten Mäusen (23,49 ± 1,36, N = 12) nicht aus der Signalintensität bei Mäusen gemessen im Alter von 7 Monate unterscheiden (23,90 ± 0,81, p = 0,79, N = 16), 13 Monate (23,35 ± 1,29, P = 0,94, N = 10) oder 26 Monate (25,10 ± 2,29, P = 0,53, n = 6, Fig. 3D). Ebenso wird die Signalintensität in der SC unverändert zwischen 3 Monaten (19,01 ± 1,20) und 26 Monaten (16,92 ± 2,18, P = 0,37, Fig. 3D). Obwohl ein leichter Anstieg in den CNR-Werte von 26 Monate alten Netzhaut (38.49 ± 3.25) ersichtlich ist, ist dieser Anstieg nicht erreichen Bedeutung, wenn durch alle Gruppen (p> 0,05) verglichen. Diese Experimente zeigen, dass die Signalverstärkung in der zerebralen Zielbereiche der visuellen Projektion wird nicht durch visuelle Stimulation und physiologische Alterung.

Die Empfindlichkeit der MEMRI, um strukturelle Veränderungen zu erkennen o Weiter zeigen wir,f die visuelle Projektion von akuten und chronischen Axonopathie verursacht. Um dies zu untersuchen, wurden ein Modell der Waller-Degeneration durch traumatische Verletzungen ON ¹⁸ sowie einem Tiermodell die Anzeige frühreif, spontanen Degeneration der sensorischen Projektionen einschließlich der Sehbahn ¹⁹ induziert beschäftigt:

(1) Traumatische Axonopathie von ON Quetschverletzung induzierte bewirkt, dass der Bruch der Axona Faszikel. Folglich wird Retino-tectalen Transport von Mn ^{2 +} entlang der axonalen Zytoskeletts vollständig und dauerhaft blockiert werden, wie durch vollständigen Verlust der Mn ^{2 +-verstärkten} Signals in der LGN visualisiert und SC analysiert einem Tag (nicht dargestellt), einer Woche (4A gestrichelte Linien), und 4 Wochen (nicht gezeigt) nach der Verletzung. Um die neuroanatomischen und aufeinanderfolgende MR-Funktionen von ON Verletzungen zeigen deutlich, und sie von der naiven Zustand sezieren, wurde die Läsion nur einseitig zugefügt. Dies führt unverändert Mn ^{2 +-Transport} auf ter seitlich im Gegensatz zu Tracer-Unterbrechung auf der Seite des Eingriffs zu steuern. Analyse der CNR-Werte in den Bereichen deafferentierten bestätigt die vollständige Abwesenheit von Signalverstärkung (nicht dargestellt). Dieser Versuch zeigt weiter, daß MEMRI ist bei der Erfassung der Lage und Schwere einer Läsion durch Längs Bewertung der Signalintensität entlang der Projektion vor und nach der Verletzung (4B) sehr empfindlich. Während die Signalintensität entlang der ON vor Verletzungen bleibt ständig über dem Hintergrundsignal, gibt es eine zeitlich-räumliche Abfall der Signalintensität der Hintergrundebene einen Tag nach der Schädigung.

(2) Unsere früheren Arbeiten gezeigt, dass Mn ^{2 +-abhängige} Signalverstärkung in der LGN wird in 10 Monaten alten Mäusen fehlt das NF-kB p50-Untereinheit reduziert, gemessen 24 Stunden nach der Injektion ^9. Erkennen Sie diese mit einem hohen Konsistenz, nahmen wir eine allgemeine Verschlechterung retino-tectalen Mn ^{2 +} transPort, möglicherweise durch eine geringere Anzahl von RGZ verursacht und ON Neuropathie bei Alterung p50 ^{KO-Mäusen 19} zusammen. Alternativ könnte das reduzierte Signalverstärkung mit einer verzögerten neuronalen Aufnahme und Ausbreitung von Mn ^{2 +} aus dem Glaskörper und entlang der pathologischen Vorsprung verbunden sein. Die letztere Möglichkeit kann nach einmaliger Applikation von 15 nmol Mn ^{2 +} wiederholende MR-Scans und die Untersuchung der Kinetik der Signalverstärkung in der Netzhaut und am frühen LGN (8 und 24 h) und späten (48 und 72 Stunden) Zeit erforscht werden Punkten. In Wildtyp-und ^{p50-KO-Mäuse,} Netzhautsignalverstärkung Peaks bei 8 h bei fast identisch Verbesserung Raten (43,52 ± 3,24 und 40,72 ± 2,79, p = 0,6, N = 3-6; 4C, links). Während Signalverstärkung bleibt in Wildtypen hoch bei 24 Stunden nach der Injektion, lehnt es in p50 ^KO-Mäusen (43,38 ± 2,18 vs 32,89 ± 1,54, P ≤ 0,01, N = 5-8). In späteren Phasen (48 und 72 Std.), verringert sich die Signalverstärkung in beiden Gruppen (mit durchweg niedriger CNR-Werte in Knock-out-Mäuse), nicht jedoch eine verzögerte Netzhaut Mn ^{2 +-Aufnahme} und Vermehrung in p50 ^KO-Mäusen. Entsprechende Ergebnisse in der LGN von p50 ^KO-Mäusen bestätigen diese Annahme. Obwohl die CNR ist deutlich niedriger zwischen 8 und 48 Stunden nach der Injektion (p ≤ 0,05, N = 5-9), die Kinetik der Signaldämpfung in p50 ^KO-Mäusen entspricht der in Wildtyp-Mäusen (4C, rechts). Somit ist die zeitlich-räumliche reduzierten Signalverstärkung des Retino-tectalen Vorsprung aufgrund der reduzierten Anzahl von Axonen eine begrenzte RGC Bevölkerung nicht beeinträchtigte Transportkinetik Ursprung. Wir schlagen vor, MEMRI, um ein wertvolles Werkzeug, um genetische Mausmutanten für Projektionsdensitometriesystem Beeinträchtigungen im ZNS zu screenen.

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Abbildung 1. TIMM Färbung von Mn ^{2 +-Aufnahme} in RGZ. Vertreter Wärme-Kartenbilder von T ₁ gewichteten MRT (MRT T ₁₎ zeigen die Signalverstärkung der Linse und der Netzhaut den ganzen Umfang (gepunktete Linie) 24 Stunden nach der Anwendung von 15 ivit nmol und hyper-intensiven Signalverstärkung nach der Applikation von 150 nmol Mn ^{2 +} (links). Warme Farben eine höhere Signalwerte als kalte Farben. Maßstab: 1 mm. Mitte / rechts: Mn ^{2 +-Aufnahme} durch RGZ nach ivit Injektion von MnCl _2, wie durch Fällung mit Silber TIMM-Färbung (schwarze Farbe) festgestellt. PBS-behandelten Kontrollnetzhaut Abschnitte zeigen, eher schwache diffuse Färbung und Differenzierung des RGC-Schicht (RGC) (oben, N = 3). Hohe Vergrößerung nicht erlauben d. iscrimination einzelner Zellen (vergrößert Einschübe) Ivit _MnCl2 Anwendung differentiell erhöht die Gesamtsilberfärbung über Netzhautschichten, mit einem prominenten Silberniederschlag insbesondere in der Nervenfaserschicht (NFL), RGC-Schicht und inneren Körnerschicht (INL, Mitte und unten , vergrößert Einsätze, N = 3). Colabeling von TIMM mit H & E-Färbung bestätigt weiterhin solche Schicht spezifische Mn ^{2 +-Akkumulation} (rechts). Maßstabsbalken, Übersicht: 50 um, Vergrößerung: 25 um. IPL, inneren plexiformen Schicht; OPL, plexiformen Schicht; ONL, äußeren Körnerschicht; RPE, retinale Pigmentepithel.

Abbildung 2. Fotografien zeigt MRT-Geräte speziell für Maus MEMR Bildaufnahme auf einem klinischen 3T-Scanner. A) zeigt die maßgeschneiderte Maus Wiege mit bite bar Kopf-Fixierung und der Sensor zur Überwachung der Atmung (weißes Pad, blau Röhre). B) zeigt die Maus positioniert und fixiert in der Wiege. Die Rohre auf der linken Seite der Anästhesiegaszufuhr. C) veranschaulicht die Positionierung der Kopf-und Maus Station innerhalb des linear polarisierten Litz Spule, die in Sende-und Empfangsmodus. D) zeigt die Spule Plattform vor dem Schirmrohr und dem klinischen 3 T-Scanner. Das Kupfer beschichtete Rohr bietet zusätzliche Abschirmung von Lärm und Blöcke der MRT-Signal aus dem Warmwasserheizungsmatte (schwarz Verpackung um das Rohr). E) visualisiert das komplette Set-up des Tieres Spule innerhalb der Pore des 3 T Scanner nur vor, um das Tier Kopf genau im Isozentrum im Scanner positioniert.

Abbildung 3. MEMRI der naiven retino tectalen-Projektion unter verschiedenen Licht-und Altersbedingungen. A) Abbildung der Region of Interest (ROI) im erweiterten Mapping-LGN-und Hintergrundgewebe auf einer transversalen MRT-Aufnahme (links). LGN spezifische Signalverstärkung durch Wärme Kartendarstellung (rechts) veranschaulicht. 1 und 1 ', linken und rechten LGN; 2 und 2 ', Hintergrundgewebe; 3, Lärm; P, posterior; R, rechts. Maßstab:. 100 um B) Räumliche Abbildung der Signalverstärkung entlang einer einzigen retino-tectalen Projektion von ursprünglich erworbenen Quer MR Bildscheiben von MEMRI bestimmt. Gefüllte Quadrate, Mn ^{2 +-abhängige} Signalverstärkung; offene Dreiecke, Hintergrundsignal. R, der Netzhaut; ON, Sehnerv; OT, Tractus; LGN, seitliche Kniehöcker; SC, Colliculus superior; VC, visuellen Kortex. Schichtdicke, 200 um. C) Lichtstimulation reduziert retinalen Signalverstärkung. Enhancement in der LGN und SC ist unabhängig von der visuellen Stimulation. Gefüllte Kreise, dunkel-Anpassung; offene Kreise, leichte Anpassung. D) Signalverstärkung ist unabhängig von zunehmendem Alter zwischen 3 und 26 Monate.

Abbildung 4. MEMRI der retino tectalen-Projektion unter neurodegenerativen Erkrankungen. A) MEMRI bilateral ivit injizierten Mäusen durchgeführt, eine Woche nach der einseitigen Quetschverletzung der rechten ON. Multiplanare Rekonstruktionen von horizontalen, koronalen und Seitenansichten zeigen völlige Fehlen von Signalverstärkung in der LGN und SC für den verletzten Hemisphäre (gestrichelte Linien). c, kontralateralen Hemisphäre; i, ipsilateralen Hemisphäre. Maßstab:. 1 mm B) MIP-Bildern und Längs MRI Analyse der räumlichen Signalverstärkung entlang der vor und dereinen Tag nach der Verletzung. R, der Netzhaut; ON, Sehnerv; Pfeil, Läsion. Maßstab:.. Früh (8 h) Aufnahme von Mn ^{2 +} in Netzhautzellen 0,5 mm C) Kinetik der Signalverstärkung unter chronischen Neurodegeneration der visuellen Projektion in p50 ^KO-Mäusen nicht beeinträchtigt wird, ist aber bereits in der LGN von p50 reduziert ^KO-Mäusen. Wiederholende MR 24, 48, und (nur für Netzhaut) bei 72 h zeigt verzögerter Signalreduktion, aber ähnliche Kinetik der Mn ^{2 +-Transport} und Akkumulation in der Retina und der LGN p50 ^KO-Mäusen.

Film 1: Animierte 3D-Wärme-Kartendarstellung des in situ kontrastverstärkten retino-tectalen Projektion MR-Bildgebung wurde 24 Stunden nach der bilateralen ivit Injektion von 15 nmol MnCl ₂ durchgeführt.. Die Daten werden in der MIP-Modus vorgestellt. Schichtdicke, 200 um. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.

Discussion

MEMRI des visuellen Systems erstreckt herkömmlichen neurobiologische Techniken zur Beurteilung der Funktionalität unter naiven und pathologischen Bedingungen. Neben der einzigartigen Einblick in die Integrität eines isolierten ZNS-Fasertraktes, können MEMRI leicht mit Verhaltenstests, z. B., Optometrie und visuell basierte Wasser Aufgaben ergänzt werden, um die unmittelbaren Folgen eines bestimmten Paradigma für die visuelle Wahrnehmung zu untersuchen. Es verbindet auch elektrophysiologische und histologische Untersuchungen mit funktionellen visuellen Charakterisierung in vivo. Die Technik ist sehr zuverlässig und reproduzierbar mit geringfügigen Abweichungen innerhalb inter identische Gruppen (siehe Fehlerbalken in den Abbildungen 3, 4). Interessanterweise bei einer Dosis von 15 nmol, Mn ^{2 +-Aufnahme} und axonalen Transport gesättigte Prozesse, so dass die Signalverstärkung ein Plateau, das nicht durch zusätzliche Mn ^{2 +} Versorgung ⁹ angehoben werden kann, erreicht. Von einem praktischen Standpunkt auszu sehen, wie eine Dosis-Wirkungs-Kenn minimiert, zumindest bis zu einem gewissen Grad, Injektion verbundenen Schwankungen der Signalverstärkung. Bemerkenswert ist, spezifisch für Mäuse und die sich von denen in Ratten, die einen etwa 10-20fach höhere Mn ^{2 +} Dosierung und erhöhte Latenz (36 Std.) erfordern, um eine optimale Kontrastverstärkung zu erreichen sind die vorliegenden Daten über die Dosierung und die Kinetik der Mn ^{2 +-Signalverstärkung 13,23.} Darüber hinaus bleibt Erweiterung entlang der visuelle Projektion konsistent zwischen einem Tier Alter von 3 und 26 Monate. Dieser Befund steht im Einklang mit visuellen Tests an Mäusen durchgeführt Alterung und der Tatsache, dass C57/B6 Mäuse, normale visuelle Aktivität bis zu 2 Jahren ^24. Obwohl wir nicht einzelne Mäuse in Längsrichtung zu analysieren im Alterungsstudie vorherigen Ergebnisse zeigen deutlich die Sicherheit wiederholt verabreicht Mn ^{2 +} Dosierungen von 15 nmol für visuelle Wartung ^9, die in Längsalterungsstudien gewünscht sein könnte.

In Übereinstimmung mit der Vorstellung, dass Mn ^{2 +} wird in RGZ aufgenommen, zeigen wir Mn ^{2 +-Aufnahme} in ihre Somata von TIMM-Färbung, die auf Silber Fällung von freien Metallionen beruht, wie von Angenstein et al angewendet. Für intrazerebrale Mn ^{2 +-Nachweis} folgenden der systemischen Anwendung ^22. Bisher wurde intrazerebrale Mn ^{2 +} Verteilung durch Autoradiographie von ⁵⁴ Mn ^{2 +} Isotop detektiert neuronalen ZNS der Ratte ²⁵ abzugrenzen, aber nicht auf der Zellebene. Hier erlaubt TIMM Färbung der Zuschreibung von Mn ^{2 +-Aufnahme} zu unterschiedlichen Zellpopulationen innerhalb des belichteten Netzhaut, wo wir prominente Silberniederschlag in der RGC-und Nervenfaserschichten. Es sei darauf hingewiesen, dass das Protokoll angewendet zeigt verbesserte Erkennung von Timm Färbung nach Anwendung einer Dosierung von 150 nmol bis 15 nmol Vergleich Mn ^{2 +} ist. Obwohl Mn ^{2 +-Aufnahme} und ihre axonalen TransportPort bereits bei 15 nmol gesättigt ist, so verleiht keine zusätzliche CNR Anstieg entlang der retino tectalen-Projektion bei höheren Dosierungen kann übermäßige Supplementierung die Verfügbarkeit von freien, ungebundenen Proteins zu erhöhen Mn ^{2 +} und so machen es für Silberniederschlag zu erreichen. Zukunft Verfeinerungen Färbung Empfindlichkeit der Korrelation MEMRI-CNR-Werte von bestimmten ZNS-Vorsprünge mit dem zellularen Standort von Mn ^{2 +-Anreicherung} innerhalb einer definierten histologischen Bereich ermöglichen. Eine solche Fähigkeit kann auch nützlich zur Charakterisierung und Quantifizierung von Mn ^{2 +-Verteilung} in anderen ZNS-Regionen außerhalb des Sichtprojektion sein. Ebenso hat Mn ^{2 +} in einer Toxizität Kainat-Modell eingesetzt, um die Degeneration und Regeneration von Hippocampus-Moosfasern ²⁶ visualisieren.

Mn ^{2 +} wird durch spannungsabhängige Kalziumkanäle aufgenommen und intrazellulär durch aktiven axonalen Transport, verteilt, die ca.n durch Colchicin-Behandlung ^25,27 blockiert werden. Visuelle Stimulation Experimente an Ratten, die eine intraperitoneale Dosis von MnCl ₂ haben eine erhöhte Signalverstärkung in der inneren und insbesondere äußeren Netzhaut ²⁸ offenbart. Dabei Dunkeladaptation wirft weitere Signalintensitäten in den äußeren Netzhautschichten im Vergleich zu Ratten, die nur Raumlicht ausgesetzt, was auf die Empfindlichkeit der Netzhaut Mn ^{2 +-Aufnahme} auf visuelle Stimulation ^28. Ebenso finden wir eine verbesserte Signalstärke in der Netzhaut des dunkeladaptierten Mäusen im Vergleich zu Mäusen, die visuelle Stimulation nach ivit Mn ^{2 +-Anwendung} ausgesetzt ist. Dies könnte auf die spezifischen elektrophysiologischen Eigenschaften der Netzhaut und der Erzeugung eines kontinuierlichen Dunkelstrom in Photorezeptorzellen zusammenhängen. Da Ca ^{2 +-Einstrom} in die Außensegmente der Fotorezeptoren wesentlich zum Aufbau der Dunkelstrom beiträgt, könnte ihre Generation begleitet werdendurch eine verstärkte Zusammenarbeit Aufnahme von Mn ^{2 +} in den Photorezeptorzellschicht unter der Finsternis. Im Gegensatz Lichtstimulation reduziert den Dunkelstrom und bewirkt eine Hyperpolarisation der Photorezeptorzellen ^29. Dabei Gesamt Mn ^{2 +-Aufnahme} kann unter Lichtbedingungen verringert werden.

Für die sichere Nutzung von MEMRI, ist es wichtig zu klären, ob die stärker ausgeprägt Mn ^{2 +-Aufnahme} in den dunkeladaptierten Netzhaut verändert Signalverstärkung an anderen Teilen des visuellen Projektion oder sogar seine gesamte Erweiterung. Stimulation abhängigen Änderungen MEMRI Signalintensität der zerebralen Netzwerke für das akustische System nach intraperitonealer Mn ^{2 +-Anwendung 30} gezeigt. In dieser Studie von Yu et al. Wurden die Ratten mit variabler Rauschfrequenzen, bevor die MR-Scans und T ₁ gewichteten Signalverstärkung des Colliculus inferior wurde anschließend untersucht ausgesetzt. Akustische Stimulation wurde festgestellt, WESENTLICHtly erhöhen MEMRI Signalintensitäten in einem tonotopen Darstellung, so beispielhaft für die fMRI-Charakter der aktivitätsabhängigen Mn ^{2 +-Akkumulation 30.} Im Gegensatz dazu ist in unserer experimentellen bis Mn ^{2 +-Akkumulation} gesetzt in der LGN und SC scheint unabhängig von visuellen Stimulation. Jedoch können solche Unterschiede in der sensorischen Brain Mapping Versuche aus dem unteren magnetischen Feld und begrenzte Erfassungsschwelle der 3 T Scanner im Vergleich zu der hohen Feld 7 T Scanner von Yu et al ergeben ³⁰ verwendet.

Bis heute ist es nicht, in welchem ​​Umfang biophysikalischen Parameter beeinflussen anterograden axonalen Transport von Mn ^{2 +} und wie MEMRI könnte als Indikator für die elektrische Aktivität dienen bekannt. Trotzdem scheint es, dass Mn ^{2 +} Übertragung von RGCs auftritt, zumindest teilweise unabhängig von spezifischen Lichtstimulation und elektrischen Eingang von bipolaren Zellen übermittelt. Alternativ kann der Nettoeffekt eine elektrischectivity im retino-tectalen Projektion könnte ein Ergebnis der elektrischen Stimulation von dunklen ansprechende 'OFF-RGZ' und auf Licht reagieren "ON-RGZ" werden. Diese Auslegung wird durch die Feststellung, dass Mn ^{2 +-Transport} entlang der retino-tectalen Projektion nicht in Mausstämme mit schlechter Sicht, wie CBA Mäusen, die das rd1 Mutation des Gens verursacht PDE6B Netzhautdegeneration ¹¹ tragen beeinträchtigt unterstützt. In einer kinetischen Studie über Wildtyp-Mäuse gesichtet und CBA wurden vergleichbare Transportraten in der Anfangsphase Zustrom (bei ​​2,5 Stunden nach der Injektion) und für die endgültige Signalverstärkung (bei ​​24 Stunden) in der LGN-und ^SC-11 beobachtet.

Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen unterstützen die Vorstellung, dass MEMRI, z. B. des visuellen Systems wie hier veranschaulicht, stellt ein wertvolles Maß für die strukturelle Integrität und die metabolische Stabilität als für elektrische Aktivität. Praktisch ist die scheinbar sTabelle Unabhängigkeit der Signalverstärkung in der zerebralen LGN und SC von Belichtung ermöglicht eine robuste Handhabung und Unterbringung von Tieren ohne besondere Sorgfalt hinsichtlich Beleuchtung. Auf der anderen Seite, für MEMRI Studien, die auf der Netzhaut Signalverstärkung zu konzentrieren, ist es notwendig, Tiere unter streng kontrollierten Lichtbedingungen vor dem Abtastvorgang zu halten.

Unter den physiologischen Parametern, Mn ^{2 +} axonalen Transportraten und die anschließende MEMRI Signalverstärkung auswirken, könnte die Stabilität der Körpertemperatur von besonderer Bedeutung sein. Dies wird durch Untersuchungen über intranasale Mn ^{2 +} für die Verbesserung der primären Geruchsprojektionsziele im Gehirn, wo die Anreicherung wurde, signifikant eine vorübergehende Senkung der Körpertemperatur um 30 ° C verringert werden, um eine Verbesserung im Vergleich angegeben unter der normalen Körpertemperatur ²⁷ signalisieren. Daher sollte die Körpertemperatur überwacht und eingestellt werden, bevor und während der MR-Scans nicht nur pchützen die Gesundheit der Tiere, sondern auch physiologische Parameter von Mn ^{2 +} Ausbreitungs normalisieren.

Da pathophysiologischen Veränderungen und Stoffwechselstörungen auf die axonalen Transport Wirksamkeit von Mn ^{2 +,} Signalverbesserung in Projektionszentren, z. B. LGN und SC, kann als Maß für die strukturelle Integrität und die funktionelle Aktivität dieses Weges dienen. Hier stellen wir zwei verschiedenen Bedingungen von ON-Degeneration und zeigen, dass Mn ^{2 +} Vermehrung und Anreicherung in Thalamus und im Mittelhirn Stellen sich als Funktion der axonalen Integrität. Akute Verletzungen ON ergibt sich eine Gesamtsignalverlust unmittelbar nach der Verletzung, die nicht innerhalb von 4 Wochen durch das Fehlen von relevanten axonalen Regeneration, während langsam axonalen Degeneration in der ^KO-Mutante p50 wieder tut, ist durch reduzierte CNR Werte in der LGN wider. Angesichts der Möglichkeit von Längs Bildgebung, könnte diese Anwendung von MEMRI wertvolle foder Überwachungs postläsionalen Wachstumsreaktionen des ON und ermöglichen die Untersuchung von genetischen oder pharmakologischen proregenerative Interventionen zur RGZ.

Zusätzlich stellen wir MEMRI als hochempfindliches Verfahren zum schrittweisen Beeinträchtigungen in Signalverstärkung, die mit chronischer axonale Degeneration Prozessen verbunden sind detektieren. Der Transkriptionsfaktor NF-&kgr; B wird in neuronalen Wartung und Mäusen mit Deletion der p50-Untereinheit von NF-&kgr; B-Anzeigealtersabhängigen neuronalen Zellverlust und axonale Degeneration im Sichtsystem ¹⁹ beteiligt. Neben histologischen und elektronenmikroskopische Analysen, MEMRI der retino tectalen-Projektion ist in der Lage, phänotypische Veränderungen in diesen Mäusen zu identifizieren. Durch die Übernahme von Serien T ₁ gewichtete MR-Bilder folgenden ivit Mn ^{2 +-Anwendung,} eine Gesamt von einem einfach verzögert Mn ^{2 +-Transport} entlang der Sehbahn in diesen p50 reduziert unterscheiden wirKO-Mäusen. Dabei wiederholte Datenerfassung durch MEMRI nach einer einzigen Mn ^{2 +-Anwendung} ermöglicht die Definition von axonalen Transport Kinetik und neurophysiologische Veränderungen in der unschätzbaren Pool der verfügbaren gentechnisch veränderten Mäusen. Derzeit sind mehrere Modifikationen von MEMRI untersucht mit dem Ziel diese Technik sicher für diagnostische Anwendungen in den Menschen zu machen. Ein vielversprechender Ansatz von hoher klinischer Relevanz, die eine Alternative zur Injektion ivit darstellt, ist die Lieferung von Mn ^{2 +} als Augentropfen. Dadurch topische Verabreichung von 1 M MnCl ₂ ergab eine signifikante Signalverstärkung um 20% in der SC wenn Bilder wurden auf einem 4,7 T Tier Scanner ³¹ erfasst. Das Verfahren war in der Lage, ON Degeneration erkennen umfangreiche folgenden Netzhautischämie ^31, und die aufgebrachte Konzentration als sicher, wenn wiederholt in monatlichen Abständen ³² angelegt. Angesichts der relativ hohen Neurotoxizität von Mn ^{2 +} z. B..

Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass MEMRI ist eine leistungsfähige experimentelle Annäherung an retino tectalen-Schaltungen in Mäusen untersucht und erweitert somit optometrischen Aufgaben für die Beurteilung der Funktionalität des visuellen Systems.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908