マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング

Summary

このビデオでは、ナイーブマウス視覚投影の造影MRイメージングのための急性視神経挫滅損傷および慢性視神経変性に関連視神経変性の繰り返しと縦のin vivo試験では、臨床3 Tスキャナを使用して、方法を示しているノックアウトマウス（P50 ^KO）。

Abstract

齧歯類の視覚システムは、視床と中脳の中心を入力する視神経を形成する網膜神経節細胞とその軸索を包含し、視覚野のシナプス後予測。その明確な解剖学的構造、便利なアクセス可能性に基づいて、ニューロンの生存、軸索再生、およびシナプス可塑性の研究のために好ま構造となっています。 MRイメージングにおける最近の進歩は、マンガン媒介コントラスト強調（MEMRI）を使用して、この突起のレチノ-視蓋部分のin vivo可視化を可能にした。ここでは、（200ミクロン^）3の解像度は一般的な3テスラスキャナを用いて達成することが可能なマウスにおける視覚投影、MEMRIを説明するためのプロトコルを提供する。私たちは、15ナノモルのMnCl ₂の単回投与量の硝子体内注射は24時間以内で完全な投影の飽和向上につながる方法を示しています。網膜を除いて、信号強度の変化が独立しているその一致視覚刺激または生理的老化の凹み。私たちは、縦方向に、この手法をさらに適用する軸索急性視神経損傷を受けて変性症はMn ^{2 +}輸送によるパラダイム病変部位で完全に逮捕を監視します。逆に、活性^の Mn ^{2 +}輸送は、生存率、数、および軸索線維の電気的活性に定量的に比例する。このような分析のために、我々は視覚的な突起を含む感覚の自発的な萎縮を表示するトランスジェニックマウスモデル（NF-κB活性P50 ^KO）での視覚的なパスに沿って^の Mn ^{2 +}輸送動態を例示している。これらのマウスでは、MEMRIは減少したが、このようにしてNF-κBの突然変異により、構造および/ ​​または機能障害の徴候を明らかにし、野生型マウスと比較して^の Mn ^{2 +}輸送を遅延しないことを示します。

要約すると、MEMRIは便利in vivoアッセイを橋渡しし、characterizatiための死後の組織学を投稿神経線維の完全性と活動の上。これは、縦方向の軸索変性と再生に関する研究、本物または誘導性表現型変異マウスの調査のために非常に有用である。

Introduction

その有利な神経解剖学的構造に基づいて、げっ歯類の視覚系は、神経保護¹又はプロ再生効果^2,3を媒介するために、薬理学的化合物およびそれらの能力を評価するためにユニークな可能性を提供しています。また、最近では、シナプス前足場タンパク質ファゴット^4を欠損したマウスで例示したように、マウスの突然変異体の機能的および神経解剖学的特性の研究を可能にします。さらに、補助的なツールの広いスペクトルが電図および行動試験、および固有信号の光イメージングによる皮質再配列の決定により、 例えば 、網膜神経節細胞（RGC）とのRGC軸索番号だけでなく、RGC活性の特色に追加与える。レーザー顕微鏡の最新技術開発が視神経（ON）と脳のホールマウント標本の深い組織蛍光イメージングによってRGC再生の現場での可視化を可能にする。このhistolog中iCalのアプローチは、光シート蛍光顕微鏡と組み合わせて、テトラヒドロフランに基づく組織のクリアをONに求心路遮断および視索⁵に再入力する単繊維の解像度を可能にします。このような技術は、解像度と成長パターンの決定に優れているかもしれませんが、彼らは、特に長期的な再生過程を評価することが望まれている個々の成長の節目、の繰り返しと縦の分析を有効にしないでください。

造影MRIは、マウスおよびラット^6,7における網膜視蓋投影の最小侵襲的可視化のために採用されています。これは、網膜細胞の常磁性イオン（ 例えば 、Mnが^{2 +）}の直接眼内送達によって達成することができる。カルシウムアナログとしてはMn ^{2 +が}電位依存性カルシウムチャネルを経由して、RGC細胞体に組み込まれ、積極的に無傷で、ONと視神経管の軸索細胞骨格に沿って搬送。それは脳核内に蓄積しながら、それが^10,11発生することがありますが、視覚的投影、外側膝状核（LGN）と上丘（SC） すなわち 、一次視覚野への経シナプス伝達は、無視できる程度の^8,9が表示されます。 MR配列決定の下、常磁性^の Mn ^{2 +は、T} ₁スピン-格子緩和時間^12を短くすることにより、主にMRコントラストを増強する。例えばMn ^{2 +、MRI（MEMRI）}が正常に傷害^13,14後の軸索再生および変性の評価を含めたラットの様々な神経解剖学的および機能的研究に適用されている強化され、レチノ-視蓋投影¹⁵の正確な解剖学的マッピング薬物治療¹⁶後の軸索輸送特性だけでなく、決定。 ^の Mn ^{2 +の}取り込み及び輸送神経細胞だけでなく、改善されたMRIプロトコルの投与量、毒性、および動力学における近年の改良により、トランスジェニックの研究への適用を拡大してきた一般的に臨床現場で使用される¹⁷ 3テスラスキャナを用いて、マウス^9。

ここでは、マウスの網膜視蓋投影のインビボ画像化に適した長手MEMRIプロトコルを提示し、ナイーブおよび種々の神経変性条件下で^の Mn ^{2 +}依存性のシグナル増強を評価することにより、その適用性を例示する。我々のプロトコルは、一般的に、専用の動物のスキャナよりもアクセスすることが適度な3 Tの磁場でMRデータ収集上の特定の重点を置きます。ナイーブマウスでは、腸管固有の信号強度が、実質的にかつ再現性硝子（ivit） ^の Mn ^{2 +}アプリケーションの後に増加になることができる方法を示しています。定量的には、視覚投影に沿って^の Mn ^{2 +}伝播が（3と26カ月齢のマウスの間で測定される）正常な老化プロセスとは独立して発生し、増加は暗闇に視覚刺激と適応に難治性である。対照的に、マンガン19日苦しんでノックアウトマウス（P50 ^KO）挫滅¹⁸急性だけでなく、NFKB1で以下に減少する。このように、従来の組織学的分析による膨張で、個々の動物の縦MEMRI分析は、神経変性プロセスのユニークな反応速度のプロファイリングを可能にします。これは、薬理学的または遺伝的な介入に関連した神経保護および軸索再生の研究のために有用であることを証明する必要があります。

Protocol

全ての動物介入は実験動物の動物実験のための欧州条約および眼と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われる。全ての実験は、地元の倫理委員会によって承認されています。マウスにおけるON損傷の手順は、他の場所に記載されている^9。

1。硝子体内注射マンガン

1. アシスタントの助けを借りて、スキャン前にMRにマンガン^{2 +}注入24時間後に行う。 （滅菌PBS中で420〜450 mg / kg体重）5％抱水クロラール溶液の腹腔内注射により動物を麻酔。追加の局所麻酔のため、前目の穿刺に角膜に液体conjuncain一滴（0.4％塩酸オキシブプロカイン）を適用。目ごとに15ナノモル^の Mn ^{2 +を}注入するには、132のLH _{2 <}中1MのMnCl ₂ストック溶液1リットルに希釈することによって、 例えば 、7.5のMnCl ₂溶液を調製/サブ> O。 34gの小さなハブリムーバブルニードル（RN針）に接続されている5μLハミルトンシリンジに最終溶液の負荷5μL。
2. 右目で始まる場合には、双眼顕微鏡下で、ゆっくりと開いた左側のマウスを置き、左手の親指と人差し指の間に右目を修正。右手で注射器を手に取り、先端に近い針を手に取る。眼球の非外傷性穿刺については、慎重に、それ​​によって強膜血管を温存、角膜輪部の遠位にinfero時空周り約1ミリメートルで硝子体に針を挿入します。
3. ハミルトンシリンジの規模を制御しながら、次の、アシスタントが徐々に2μLの総容量が適用されます。この手順の間、顕微鏡下での最適な針の配置を監視し、液体のレンズやこぼれの穿刺を避ける。液体を最小限に抑えるため、ゆっくりとそれを撤回して、静的にさらに30秒間挿入された針を保つ注射部位からの漏れ。
4. 手順では、特別なケアは、目に圧力を避けるために注意すべきである。同様に、眼球を穿刺する過酷なまたは多くの試みを避ける。 ^の Mn ^{2 +}をONに沿ってのRGCや輸送への取り込みはすでに15ナノモルのMnCl ₂で飽和しているので、これは少し不正確注入量によって信号の変動を最小限に抑えることができます。視覚投影の二国間の信号増強のために、左眼用の注入手順を繰り返します。
5. 適用さオフロキサシン含有（3 mg / ml）を点眼し、手順は、眼感染症や目の乾燥を防ぐために、一回の後にパンテノール含有軟膏。 MRスキャンを開始するまでの通常の住宅の条件の下でケージにマウスを返します。

MRI用2。動物の準備

1. 2％/ 98％イソフルラン/酸素ガス混合物の投与によりマウスを麻酔。ほぼ水平、ねじられていない位置にマウスのホルダーにマウスをマウントします。インその後、MRスキャナ内部で調整されたMRコイル内へERTこと。適切なシステムによって呼吸と心拍数を監視します。技術的な詳細については、ハーマンら ^20を参照してください。
2. MRI、統合された管によってマウスヘッドホルダに接続された蒸発器を介して、最初に1.5％/ 98.5％イソフルラン/酸素ガス混合物の連続注入による供給麻酔中。スキャン中に、記録された重要なパラメータ（ すなわち 、毎分約40回の呼吸の安定した呼吸数を目標）によると、麻酔の濃さ ​​を調整します。加熱装置を使用すると、マウスの腹部部位に位置する温度センサにより測定される、35〜37°Cの間の安定した体表面温度を維持する。技術的な詳細については、ハーマンら ^17を参照してください。
3. スキャン後、ホルダーからマウスを解放し、麻酔からの回復を加速する純酸素を供給しています。さらに、使用して、安定した体温を保つ赤色光加熱源。

3。のMRIプロトコル

1. プロトコルは、35ミリメートル×38ミリメートル直径の有効視野に専用の、SNR効率、小動物コイル（直線偏光リッツコイル）を装備した3テスラスキャナのために検証されます。送受信モードでコイルを動作させてください。
2. その最終的な位置にある動物と、周波数分析器を用いてコイルの曲との一致を調整します。手動で画像の均一性および品質を最適化するために、送信機基準電圧とシム電流を調整する。
3. 計画のための矢状および横表示で0.5ミリメートル×0.5ミリメートル×2ミリメートルの解像度で、T ₁加重2D東証画像を取得する。計画MRスキャンを使用して、冠状測定方向にMEMR画像を取得、左右方向に沿って位相エンコードを動物の頭部に平行になるように回転される。取得時間を最小限にするために調整ビューの長方形のフィールドを使用実際のヘッドの大きさ。位相エンコード方向の画93.8％長方形のフィールドを使用して、ベースマトリックス256、視野14.08ミリメートル×50.65ミリメートル×54ミリメートル、および0.11 mmの128スライス：次のパラメータを使用して、甘やかされて育った3D点滅シーケンス（VIBE 3D）を採用スライス解像度のスライス厚は61％に設定する。
4. 、0.21ミリメートル×0.21ミリメートル×0.18ミリメートル（補間0.09ミリメートル×0.1ミリメートル×0.1ミリメートル）、エコー時間T _E = 6.51ミリ秒の有効分解能を提供し、512×480×128で、最終的なイメージを作成する面内補間をアクティブにする繰り返し_時間 t r = 16ミリ秒、帯域幅= 160 Hzの/ PX、フリップ角は= 22°。約30分の合計取得時間（T _A）を達成するために2つの平均値と3繰り返しを適用します。

4。のMRIデータ解析

1. ソフトウェアsyngo fastViewを使用してデータを分析します。定量的な信号増強のため、定義された領域Oを選択Fの2次元平面のMRIの録音への関心と強化された構造（SI _MEMRI）、組織のバックグラウンド（のSI _backgr）とノイズ（のSD _N）の標準偏差の信号強度（SI）を決定する。必要に応じて、LGNとSC構造のための神経解剖学的向きを容易にするために、マウス脳アトラスを使用しています。 ：式を用いて、コントラスト対雑音比（CNR）を算出
2. CNR =（SI _MEMRI - SI _backgr）/ SD _N
3. 各サンプルの平均のCNR計算のための3つの連続した​​画像を定量化する。両側性に注入された動物では、独立して各半球を分析。
4. 水平冠状および矢状画像の描写のために、オリジナルの3D MRIデータセットから多断面再構成を計算します。これらの処理された画像は、定量分析にはお勧めできません。レチノの生気に満ちた3D再構成（最大強度の予測、MIPの）を作成するには- 視蓋投影は、血管造影後処理ソフトウェアモジュールを使用しています。

5。 ^の Mn ^{2 +}オートメタログラフィー（TIMM染色）

1. MEMRI以下^の Mn ^{2 +}をトレース脳構造のTIMM染色のために、15〜150ナノモル^の Mn ^{2 +} ivit 24時間前画像への投与量を注入する。
2. MRスキャンした後、PBS中で30ミリリットルの氷冷0.325パーセントのNa ₂ S（pH7.4）で動物を灌流。凍結切片に網膜凍結サンプルを分析。
3. クライオトーム上で15μmの厚さの連続した​​、赤道部分をカット。
4. Angenstein ら ²²によると、固定剤および凍結保護がない状態でTIMM染色^21を実行します。

6。統計解析

事後分散分析に続いて、単一の比較のためのスチューデントのt検定を用いた統計分析を実行。データは平均±標準誤差として提示されている。個々のN番号は各実験ごとに個別に与えられた。 （; P≤0.01、**、P≤0.001、*** P≤0.05、*）0.05≤Pに達した結果は統計的に有意であると考えている。

Representative Results

正確に視覚投影の活力と機能性を評価するために、このイメージング技術の能力は、硝子体とのRGCによるその取り込みに非毒性^の Mn ^{2 +}投与量の正確なアプリケーションに依存している。この主要な仮定は、層の特定^の Mn ^{2 +}取り込みがオートメタログラフィー（TIMM染色^）21によって実証されている図1にテストされています。網膜切片を対照として15ナノモルまたは150ナノモル^の Mn ^{2 +、}またはPBSのいずれかのivit塗布後 24時間で分析した。 PBSは、網膜は、信号で増強されていない注射し、一方、（点線N = 3）、この時点ではMn ^{2 +}網膜は、MRI加重T ₁における最大シグナル増強を示して注入された（N = 3;点線）（ 図1 、）のパネルを残しました。 150ナノモル注入された目の中hyperintensiveシグナル増強に注意してください。対照的に、非拡張脳領域（アスタリスク）は、すべてのコのための類似のバックグラウンド信号強度を示す特にRGC層であって、以下の個別のRGC細胞体の調査によって確認された神経線維層（NFL）（ 図1、中央のパネルで拡大挿入図）、中nditions（緑色）。Ivit ^の Mn ^{2 +}アプリケーションが増加し、全体的なTIMM染色H＆ E同時標識（右パネル）。

マウス網膜視蓋投影のインビボ画像化のためには、機器と一緒に動作パラメータは、 図2に示すように、T 3フィールドにマウスを分析するように適合されている特殊なマウスMEMRIプロトコルを選択することが重要である。そのようなスキャナ設定を適用する、我々の以前の研究は、CNSの画像解像度のために、ラット頭部コイルは、専用のマウス全身コイル¹⁷よりも優れていることが明らかになった。ネズミの頭を修正するには、適切にラットのコイル内での位置を調整するために、我々はプラスチック製の一口バー付きクレードルと円錐管を使用し、どちらも、体の大きさを満たすためにダウンスケールしているマウスの（ 図2A、B）。画像は、3Dグラジエントエコーシーケンスを実施する横T ₁加重マトリックスで取得された場合、取得時刻の35分以内（200ミクロン^）3の高解像度画像の生成が期待できる。私たちは強く、スキャン中の重要な機能の常時監視することをお勧めします。 postimaging酸素と本体温度制御と共に麻酔の調整が有意に回復時間を加速し、約100％の生存率を保証する。このような技術的な予防策は、全体のコホートは、縦方向および反復的なMRI検査を維持することを保証するために不可欠である。

いずれの研究では、15ナノモルの唯一の無毒性^の Mn ^{2 +}の投与量は、ON、目立つように網膜でのCNRを向上させるのに十分であるivitアプリケーション ^9、およびシナプス前脳内LGNとSCまでの視神経管を使用してください。 CNR値は、最高の厚さ200μmの横方向から計算される元の等方性の3Dボリュームをreslicingことにより、元のMRIデータセットから得られたスライスは、 図3Aは、関心のある三つの領域（1）シグナル増強領域（SI _MEMRI各画像において選択され、強化されたLGNのための正確なCNR判定の一例を示している）、（2）非アフィン脳組織（SIの_{backgr）、（3）}バックグラウンドノイズ（SDの_N）。単一の視覚投影の全体に沿って定量化期待空間信号増強が図3Bに示されている。視神経頭でピーク背腹面に沿って網膜切片におけるシグナル増強の強い緩やかな増加に注意してください。さらに、適用される実験条件（視覚野での信号損失）の下で皮質層に関連する経シナプス^の Mn ^{2 +}の伝播がないことに注意してください。 MIPは、TOTO（ 動画1） 内レチノ-視蓋投影の3D配置を視覚化するために、高度に例示するものである。 A視覚投影に沿って^の Mn ^{2 +}のccumulationは、電圧依存性Ca ^{2 +}チャネルとその速い軸索輸送を通じてだけでなく、標的組織¹³からの比較的低いクリアランスのRGCに細胞内取り込みの動力学によって決定されます。我々の以前の動態研究によれば、 ^の Mn ^{2 +}依存性のシグナル増強は、注入後早ければ6時間として検出することができる。それを24時間でさらにピークと120時間後の注射⁹以内にベースラインのレベルに戻って減少します。したがって、最適な結果を達成するために、MEMRIラット¹³に必要な増強時間の半分を表し、注射後24時間後に行われるべきである。

MEMRIによる視覚投影のコントラスト強調のための原理を概説して、私達はさらに2つのパラメータの影響を伝える - 光条件や動物の年齢 - 定量的な測定に影響を与える可能性があること：

（1）Fをテストするにはまたは中脳の中心中のMn ^{2 +}の刺激依存性の蓄積、マウスを前にスキャンするように定義された周波数（5 Hz）での懐中電灯露出と光強度（3 W LED）によって実現光で刺激された条件の下で、または完全な暗闇の中でどちらかに保持したとMn ^{2 +}の曝露の24時間の間に。 CNR 24時間の定量分析ivit ^の Mn ^{2 +}アプリケーションは、光刺激条件と比較し暗順応網膜の信号強度が大幅に増加（66.29±3.07 対54.56±3.08、P≤0.05、N = 7 /明らかにした後8、 図3C）。周辺網膜と視神経乳頭（ 図3（b）参照 ）との間の信号の強化に勾配を考えると、我々は常に、すべての実験群内の網膜切片を、対応分析することを保証。期待どおり腹背両面の平面に沿って画像解析は、絶対、CNR値が両方の条件に下がり続けていることを、明らかにした。重要なことは、REL明るさと暗さに適応網膜の間ative信号差（データは示していない）永続的なままです。 LGNの投影領域内しかしながら、シグナル増強（26.97±1.78 対26.58±1.05、P = 0.9、N = 7-2）とSC（25.09±1.24 対26.81±1.55、P = 0.4、N = 7 / 8）明暗空調環境（ 図3C）との間で区別することはできません。このアッセイは、対象地域のレチノ-視蓋投影および蓄積に沿った伝播が一致視覚刺激の影響を受けないのに対し、網膜層へ^の Mn ^{2 +}の取り込みは、露光に敏感であることを示している。別の方法として、3 Tスキャナの信号感度はLGNまたはSCでの信号変化を検出閾値を下回っている可能性があります。

（2）視覚投影のMEMRI関連シグナル増強に動物の年齢の影響を探るために、我々はO 3と26ヶ月の間でマウスを解析したF時代。 3ヶ月のLGNのマウス（23.49±1.36、N = 12）でのCNR値は7ヶ月齢のマウスで測定された信号強度（23.90±0.81、P = 0.79、N = 16）と異ならない13ヶ月、（23.35 1.29、P = 0.94、N = 10）または26ヶ月±（25.10±2.29、P = 0.53、N = 6; 図3D）。同様に、サウスカロライナ州での信号強度は、3ヶ月（19.01±1.20）と年齢の26ヶ月の間に変更されていません（16.92±2.18、P = 0.37; 図3D）。わずかな増加は、26ヶ月の網膜（38.49±3.25）のCNR値で明らかではあるが、すべてのグループ（P> 0.05）全体と比較した場合、この増加は有意性には達していません。これらの実験は、視覚投影の脳対象地域のシグナル増強が視覚刺激と生理的な老化による影響を受けないことを示している。

次に、我々はoを構造的変化を検出するためのMEMRIの感度を実証する急性および慢性の軸索障害によって引き起こされる視覚投影F。これを調べるために、負傷¹⁸だけでなく、視覚的な経路¹⁹を含む感覚投影の早熟、自発的な変性を表示する動物モデルに外傷によって誘発されるウォーラー変性のモデルが採用されました。

（1）オン挫滅により誘発される外傷性軸索障害はaxona線維束の破損の原因となる。 LGN中のMn ^{2 +}改善された信号が完全に失わにより可視化し、SCは1日に分析した結果、軸索細胞骨格に沿って^の Mn ^{2 +}のレチノ-視蓋輸送は、完全に持続可能な形でブロックされます（図示せず）、1週間（ 図4A 、点線）および4週間（図示せず）が損傷後。明確オン損傷の神経解剖学的連続のMR機能を紹介し、ナイーブな状態からそれらを分析する、病巣のみを一方的に与えた。これは、トンに不変^の Mn ^{2 +}輸送をもたらす彼は、介入の側のトレーサーの中断とは対照的に側面を制御します。求心路遮断の分野でのCNR値の解析は、信号増強（図示せず）が完全に存在しないことを確認します。この実験は、さらにMEMRIが負傷前と後の投影に沿った信号強度（ 図4B）の長手方向の評価によって、病変部位の位置および重症度を検出するのに非常に敏感であることを示している。負傷前に沿った信号強度は、常にバックグラウンド信号の上に留まる一方で、オン損傷後のバックグラウンドレベル1日にシグナル強度の側頭空間低下があります。

（2）私たちの初期の作品は、注射の⁹の24時間後に測定した場合、LGNのMn ^{2 +}依存性シグナル増強は、NF-κBサブユニットP50を欠いた10ヶ月齢のマウスで減少していることを明らかにした。高い一貫性でこれを検出し、我々はレチノ-視蓋^の Mn ^{2 +}トランスに全体的な障害を想定ポート、おそらくRGCの減少した数字によって引き起こされ、老化P50 ^{KOマウス 19}で神経障害上の関連。また、減シグナル増強は、硝子体からの遅延ニューロンへの取り込みとMn ^{2 +}の伝播とし、病理学的投影に沿って関連している可能性があります。後者の可能性は、初期（8〜24時間）と後期（48〜72時間）の時間15ナノモル^の Mn ^{2 +}の単一のアプリケーション後の繰り返しのMRスキャンを実行し、網膜とLGNでシグナル増強の動力学を研究することによって検討することができますポイント。 （P = 0.6、N = 3-6、 図4C、左43.52±3.24および40.72±2.79）野生型およびp50の^KOマウス 、ほぼ同一の強化·レートで8時間目の網膜信号強調ピーク中。シグナル増強が24時間後に注射で野生種で高いままが、P50 ^KOマウスの下落（43.38±2.18 対 32.89±1.54、P≤0.01、N = 5-8）。後のフェーズ（48および72時間）の間に、シグナル増強は、このように遅れて、網膜^の Mn ^{2 +}取り込み及びP50 ^KOマウスにおける伝搬を除く、（ノックアウトマウスでは一貫して低いのCNR値で）両群で減少する。 P50 ^KOマウス^の LGNの対応する結果は、この概念を確認します。 CNRは、8および48時間後噴射（P≤0.05、N = 5-9）との間の有意に低いが、p50の^KOマウスにおける信号減衰の速度論（右図4C）は、野生型マウスのものに対応する。このように、レチノ - 視蓋投影の縮小側頭空間信号の強化は、限られたRGCの人口ではなく、障害のある輸送動態に起因する減少軸索数に起因している。私たちは、CNSにおけるprojectional障害のための遺伝的マウス突然変異体をスクリーニングするための貴重なツールであることがMEMRIを提案する。

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図1。 ^の Mn ^{2 +}のRGCにおける取り込みのTIMM染色。、T ₁強調MRI（MRI _T1）の代表ヒートマップ画像24時間15のivit適用後の信号レンズの向上と全体の網膜周り（点線）を示しているナノモル、150ナノモル^の Mn ^{2 +（}左）を適用した後のハイパー集中的に信号強調。暖色系は寒色系よりも高い信号値を表す。スケールバー：1ミリメートル。右/中央：マンガン^{2 +が} TIMM染色（黒色）を使用して銀の沈殿によって検出されたのMnCl ₂のivit注入後のRGCによる取り込み。 PBS処置対照網膜のセクションでは、（上、N = 3）むしろ弱い染色と、RGC層（RGC）の拡散分化を示しています。高倍率は、Dを許可していません個々の細胞（拡大インセット）のiscrimination IvitのMnCl ₂アプリケーションは、差別的、特に神経線維層（NFL）、RGC層、内顆粒層（INLの著名な銀の析出と、網膜層全体で、全体的な銀染色を増加させ、ミドルとボトム、拡大されたインセット、N = 3）。 H＆Eをさらに確認するような層の特定^の Mn ^{2 +}の蓄積（右パネル）染色によるTIMMのColabeling。スケールバー、概要：50ミクロン、倍率：25ミクロン。 IPL、内網状層; OPL、外網状層; ONL、外顆粒層; RPE、網膜色素上皮。

図2の臨床3Tスキャナ上でマウスMEMR画像取得のために特別にMRI装置を示す写真。 A）Bでカスタムメイドのマウスクレードルを示していますITEバーヘッドの固定と呼吸監視（白パッド、青管）用のセンサ。B）は、クレードルでの位置決め固定マウスを示しています。左供給にチューブ麻酔ガス。C）は 、送信で動作して直線偏光リッツコイルの内側にマウスヘッドとクレードルの位置を例示し、受信モード、D）シールドチューブの前にコイルのプラットフォームを示していますし、臨床3 Tスキャナ。銅コーティングされたチューブは、熱水による加熱マット（チューブの周囲に黒いラッピング）からのノイズやブロックからMRI信号を追加シールドを提供しています。E）にわずか3 Tスキャナの細孔内の動物のコイルの完全なセット·アップを視覚化スキャナ内部のアイソセンターで正確に​​動物の頭を配置する前に。

横方向のMRIで強化されたLGNおよび背景組織における関心領域（ROI）マッピング領域の様々な光や年齢条件の下でナイーブレチノ-視蓋投影図3。MEMRI。A）イラスト（左）を記録。 LGN特定のシグナル増強は、熱マップ提示（右）によって示されている。 1,1 'は、左右のLGN; 2,2 '、背景組織; 3、ノイズ; P、後部; R右。スケールバー：MEMRIが独自に獲得した横方向のMR画像のスライスから決定されたシングルレチノ-視蓋投影に沿って信号増強の100ミクロンB）空間マッピング。黒四角はMn ^{2 +}依存性シグナル増強;白三角、バックグラウンド信号。 R、網膜; ON、視神経; OT、視索; LGN、外側膝状核;サウスカロライナ州、上丘; VC、視覚野。スライス厚、200μmである。C）光刺激が大幅に網膜シグナル増強を低減します。 EnhaLGNとSC内ncementは視覚刺激とは無関係です。黒丸、暗順応;白丸、明順応。D）に信号増強は3と26ヶ月の間で加齢とは無関係です。

神経変性条件下でのレチノ-視蓋投影図4。MEMRI。 A）二国間ivit注射したマウスのMEMRIは、右側の一方的挫滅損傷後1週間に行った。水平冠状、横ビューの多断面再構成は、負傷した半球（点線）のためのLGNとSC内のシグナル増強が完全に存在しないことを示している。 C、対側半球;私、同側半球。スケールバー：1ミリメートルB）MIP画像およびONに沿った空間信号増強の縦のMRI分析前と損傷後1日。 R、網膜; ON、視神経;矢印、病変部位。スケールバー：0.5ミリメートルP50 ^KOマウスにおける視覚投影の慢性神経変性下の信号増強のC）の速度論網膜細胞へ^の Mn ^{2 +}の初期（8時間）の取り込みには影響されませんが、すでにP50のLGN低減される。 ^KOマウス 。繰り返しのMR 24、48の撮像、および（のみ網膜用）72時間では、持続的なシグナルの減少を示していますが、マンガン^{2 +}輸送とP50 ^KOマウスの網膜とLGNにおける蓄積の類似の動態。

映画1：アニメーションの3Dヒートマッププレゼンテーションその場造影レチノ-視蓋投影でのMRイメージングが15ナノモルのMnCl ₂の二国間ivit注入後24時間後に行った。データは、MIPモードで提示される。スライス厚、200μmである。 <HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4"ターゲット= "_blank">この番組をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

視覚系のMEMRIはナイーブおよび病理学的条件下での機能性を評価するための従来の神経生物学の手法を拡張します。離れて孤立した中枢神経系の線維トラクトの整合性にユニークな洞察を提供するから、MEMRIを簡単に視覚に指定されたパラダイムの即時の影響を調査するために、行動試験、 例えば 、検眼、視覚ベースの水作業を補充することができます。また、電気生理学的およびin vivoでの機能的な視覚的特性評価と組織学的調査をリンクします。技術はマイナーな個人間で高い信頼性と再現性がある（ 図3、図4中のエラーバーを参照）、同一グループ内で差異。興味深いことに、15ナノモルの用量ではMn ^{2 +}取り込み及び軸索輸送そのシグナル増強は、追加^の Mn ^{2 +}電源⁹によって上昇することはできませんプラトーに達するように、飽和プロセスです。実用的な観点からビュー、このような用量反応シグナル増強に特徴的な最小化し、少なくともある程度、注入に関連するバリエーション。注目すべきことに、投与量およびMn ^{2 +}シグナル増強の動態に提示されたデータは、最適なコントラスト強調を実現するために、マウスに特異的な約10-20X高^の Mn ^{2 +}投与量および待ち時間の増加（36時間）を必要とラットのものとは異なっている^13,23。さらに、視覚投影に沿って強化は、動物の3歳と26ヶ月の間で一貫性を維持します。この知見は、視覚的な高齢化マウスで実施された試験とC57/B6マウスは歳²⁴の2年間に通常の視覚的な活性を維持するという事実に沿ったものです。我々は高齢化研究で縦方向に個々のマウスを解析しませんでしたが、前回の結果は明らかに縦老化研究に必要なことがあり、視覚的メンテナンス^9、15ナノモルの繰り返し投与^の Mn ^{2 +}の投与量の安全性を実証する。

^の Mn ^{2 +は、RGC}が中に組み込まれるという概念によれば、我々 ^の Mn ^{2 +が} Angenstein らによって適用されるように、遊離金属イオンの銀の沈殿に依存するTIMM染色によってそれらの細胞体への取り込みを示している。脳内^の Mn ^{2 +}を検出するため、以下のその全身アプリケーション^22。以前は、脳内^の Mn ^{2 +}分布はなく、細胞レベルで、ラットCNS ²⁵の神経回路を記述するために^54の Mn ^{2 +}同位体のオートラジオグラフィーによって検出した。ここでは、TIMM染色により、Mn ^{2 +}の帰属は、我々は、RGCおよび神経線維層に著名な銀の析出を見つけるさらさ網膜内の異なる細胞集団に取り込みできます。これは、プロトコルがショー15ナノモル^の Mn ^{2 +}に比べて150ナノモルの投与量を適用した後TIMM染色による検出を改善し適用に留意すべきである。 ^の Mn ^{2 +は}取り込みとその軸索トランスもののポートがすでに15ナノモルで飽和している、したがって、より高い用量で網膜視蓋投影に沿って追加のCNRの増加を付与しない、過度の補給は自由、タンパク質結合していない^の Mn ^{2 +}の可用性を高めるため、銀の析出がアクセスレンダリングされることがあります。染色感度の将来の改良が定義された組織学的領域内^の Mn ^{2 +}濃縮細胞位置との特異的な中枢神経突起MEMRIベースのCNR値の相関が可能になります。このような機能は、Visual投影外の他のCNS ​​領域におけるMn ^{2 +}の分布の特徴付けおよび定量化のための役に立つかもしれません。同様に、Mnが^{2 +は、}海馬苔状繊維²⁶の変性および再生を視覚化するカイニン酸毒性モデルにおいて有効に用いられている。

のMn ^{2 +は、}電圧依存性カルシウムチャネルによって取り込まれ、細胞内で活性な軸索 ​​輸送、約によって分配されるNコルヒチン処理^25,27によってブロックされる。のMnCl ₂の腹腔内投与量を投与したラットでの視覚刺激実験は、内側と、特に、網膜の外側²⁸増加シグナル増強を明らかにした。これにより、更なる暗順応は、このように、網膜^の Mn ^{2 +}視覚刺激²⁸に取り込みの感度を示す、唯一の室内光条件に暴露したラットに比べて外側の網膜層にシグナル強度を上昇させる。同様に、我々はivit ^の Mn ^{2 +}適用後の視覚刺激にさらされたマウスと比較して、暗順応したマウスの網膜に改善された信号の強さを見つける。これは、網膜と視細胞の継続的な暗電流の発生の具体的な電気生理学的性質に関連している可能性があります。光受容体の外節へのCa ^{2 +}流入が大幅に暗電流の構成に寄与するので、彼らの世代が伴う可能性がありますによって暗闇下の光受容細胞層へのMn ^{2 +}の同時取り込み増強。これとは対照的に、光刺激は、暗電流を低減し、光受容体細胞²⁹の過分極を引き起こす。これにより、全体的なマンガン^{2 +}取り込みは、光条件の下で減少している可能性があります。

MEMRIの信頼性の高い使用法のためには、より顕著^の Mn ^{2 +は}視覚投影あるいはその広がり全体の他の部分に沿って信号増強を変更暗順応網膜への取り込みを可能にするかどうかを明確にすることが重要である。脳のネットワークのMEMRI信号強度の刺激に依存した変化は、腹腔内^の Mn ^{2 +}アプリケーション³⁰の後に音響システム用に実証されている。 Yu らによる本研究では、ラットは、MRスキャンと下丘のT ₁重み付けされた信号強調は、その後調査した前に変数ノイズ周波数に曝露した。音響刺激はsignificanことが判明したTLYこうして活動依存^の Mn ^{2 +}の蓄積³⁰のfMRIのような文字を例に、tonotopic表現MEMRIシグナル強度を増加させる。これとは対照的に、我々の実験はLGN中のMn ^{2 +の}蓄積を設定し、中にSCが視覚刺激とは独立して表示されます。しかし、感覚脳マッピングの試みでのこのような違いは、Yu ら ³⁰が使用する高磁場7のTスキャナと比較して低磁場および当社の3のTスキャナの検出の限られたしきい値に起因する可能性があります。

現在までのところ、それは、生物物理学的パラメータは、Mn ^{2 +}の順行性軸索輸送に影響を与え、どのようにMEMRIが電気的活動の指標となる恐れがあり、どの程度に認識されていない。それにもかかわらず、RGCを重量^の Mn ^{2 +}の送信は、独立して、双極細胞から受け取った光の特定の刺激および電気入力から、少なくとも部分的に起こると思われる。代わりに、電気的なAの正味の効果レチノ - 視蓋投影内ctivityは「ON-RGCが「暗反応」オフのRGC」と光応答の電気刺激の結果である可能性があります。このような解釈は、レチノ-視蓋投影に沿って^の Mn ^{2 +}輸送は、網膜変性症^11の原因PDE6B遺伝子のRD1変異を運ぶCBAマウスなどの視力を持つマウス系統、損なわれていないという知見によってサポートされています。野生型晴眼者とCBAマウスに関する動力学的研究では、同程度の輸送率は、LGNとSC ¹¹に（24時間で）（2.5時間後、注射時）の初期の流入フェーズ中に、最終的な信号増強が観察された。

まとめると、これらの観察は、視覚系のMEMRI、 例えば 、ここに例示されるようにするという考えをサポートし、構造的完全性および代謝安定性のためではなく、電気的活動のための貴重な尺度を表す。実際には、一見S露光から脳LGNとSCにおけるシグナル増強のテーブルの独立性は、照明に関する特別な配慮なしに強固なハンドリングと動物の収容を可能にします。一方、網膜のシグナル増強に焦点MEMRIの研究のために、それは前のスキャンにしっかりと制御された光条件下で動物を維持することが必要である。

^の Mn ^{2 +}軸索輸送速度とその後のMEMRIの信号増強に影響を与える生理的パラメータのうち、体温の安定性が特に重要である可能性があります。これは、濃縮は有意に30℃まで体温の一時的な減少で減少することが見出された脳の一次嗅覚投影ターゲットの増強のための鼻腔内^の Mn ^{2 +}の研究によって示されているが、通常の体温²⁷の下増強を通知するために比較した。したがって、体温が前およびMR中に監視され、調整されるべきであるが、pのみならず、スキャンし動物の健康をrotectだけでなく、マンガン^{2 +}伝播の生理的パラメータを正規化する。

病態生理学的変化および代謝障害は、Mn ^{2 +}の軸索輸送効率、投影中心におけるシグナル増強、 例えば 、LGNとSCに影響を与えるので、この経路の構造的完全性および機能的活性の尺度として働くことができる。ここでは、ON変性の2つの異なる状態を提示し、視床および中脳中心のMn ^{2 +}伝搬と濃縮は、軸索の完全性の関数として変化することを示している。 P50 ^{ノックアウト}変異体のゆっくりと軸索変性しながら、関連する軸索再生の欠如に起因する4週間以内に回復しない損傷直後、全信号損失、急性オン傷害の結果はLGNにおける減少したCNR値に反映される。縦イメージングの可能性を考えると、MEMRIのこのアプリケーションは、貴重なFかもしれませんまたはONのpostlesional成長応答を監視したRGCにproregenerative遺伝的または薬理学的介入の研究を可能にします。

さらに、当社は、慢性軸索変性プロセスに関連付けられている信号増強が徐々に障害を検出するための高感度な方法としてMEMRIを提示する。転写因子NF-κBは視覚系¹⁹内のNF-κB表示年齢依存性の神経細胞の喪失と軸索変性のp50サブユニットを欠失した神経細胞の維持及びマウスに関与している。組織学的および電子顕微鏡分析に加えて、網膜視蓋突起のMEMRIは、これらのマウスにおける表現型の変化を同定することができる。 ivit ^の Mn ^{2 +}アプリケーションを、以下のシリアルのT ₁強調MR画像の取得により、当社はこれらのP50で視覚路に沿って単純に遅れ^の Mn ^{2 +}輸送から減少、全体的な区別KOマウス。これにより、シングル^の Mn ^{2 +}適用後のMEMRIによる反復データ収集が可能な遺伝子改変マウスの貴重なプール内の軸索輸送動力学および神経生理学的変化の定義を可能にします。現在、MEMRIのいくつかの変更は、ヒトにおける診断的適用のためにこの技術を安全にすることを目指して研究中である。点眼薬として注射をivitするための代替となる高臨床的関連の有望なアプローチは、Mn ^{2 +}での配信です。画像は、4.7T動物スキャナ³¹で取得されたとき、それによって、1 MのMnCl ₂の局所投与は、SCで20％有意な信号増強を生じた。この方法は、網膜虚血³¹次変性症に関する広範に検出することができた、と繰り返し毎月の間隔³²に適用された場合に適用される濃度は、安全を証明した。 ^の Mn ^{2 +}の比較的高い神経毒性を考える例えば 、臨床的に関連MEMRIアプリケーションをサポートするために有用であろう。

要約すると、我々の研究は、MEMRIは、このように視覚系の機能を評価するための検眼のタスクを拡張したマウスで網膜視蓋回路網を研究するための強力な実験的アプローチであることを示している。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908