In vivo avbildning av Optic Nerve Fiber Integritet av Kontrast-forsterket MR i Mus

Summary

Denne videoen illustrerer en metode, ved hjelp av en klinisk 3 T scanner, for kontrastforsterket MR avbildning av den naive mus visuell projeksjon og for repeterende og langsgående in vivo studier av synsnerven degenerasjon assosiert med akutt synsnerven klemskade og kronisk synsnerven degenerasjon i knock-out mus (p50 ^KO).

Abstract

Den gnager visuelle systemet omfatter retinal ganglion celler og deres axons som danner synsnerven til å gå inn thalamic og midthjernen sentre, og postsynaptiske anslag til den visuelle cortex. Basert på sin distinkte anatomisk struktur og praktisk tilgjengelighet, har det blitt den favoriserte struktur for studier på nevronale overlevelse, aksonal regenerasjon, og synaptisk plastisitet. Nye fremskritt i MR har aktivert in vivo visualisering av retino-tectal del av dette anslaget ved hjelp av mangan mediert kontrastforbedring (MEMRI). Her presenterer vi en MEMRI protokoll for illustrasjon av videogrammer i mus, der oppløsning på (200 mikrometer) ³ kan oppnås ved hjelp av vanlige 3 Tesla skannere. Vi viser hvordan intravitreal injeksjon av en eneste dose på 15 nmol MnCl ₂ fører til et mettet forbedring av intakt projeksjon i 24 timer. Med unntak av netthinnen, er endringer i signalintensitet uavdent av sammenfalt visuell stimulering eller fysiologiske aldring. Vi søker videre denne teknikken til lengde overvåke aksonal degenerasjon i respons til akutt synsnerven skade, et paradigme der Mn ^{2 +} transport helt arrestasjoner på lesjonen nettstedet. Motsatt er aktiv Mn ^{2 +} transport kvantitativt i forhold til levedyktighet, antall, og elektriske aktiviteten i axon fibre. For en slik analyse, eksemplifiserer vi Mn ^{2 +} transportkinetikk langs den visuelle banen i en transgen musemodell (NF-κB p50 ^KO) viser spontan atrofi av sensoriske, inkludert visuelle, projeksjoner. I disse musene, indikerer MEMRI redusert, men ikke forsinket Mn ^{2 +} transport i forhold til villtype mus, og dermed avsløre tegn på strukturelle og / eller funksjonsnedsettelser av NF-κB mutasjoner.

I sammendraget, MEMRI beleilig broer in vivo og post mortem histologi for characterizatipå av nerve fiber integritet og aktivitet. Det er svært nyttig for longitudinelle studier på aksonal degenerasjon og regenerasjon, og undersøkelser av muterte musene for ekte eller induserbare fenotyper.

Introduction

Basert på sin gunstige nevro-anatomiske strukturen gnager visuelle systemet tilbyr unike muligheter for å evaluere farmakologiske forbindelser og deres evne til å megle neurobeskyttelse ^en eller pro-regenerative effekter ^2,3. Videre tillater det studier på de funksjonelle og nevro-anatomiske karakteristikker av mus mutanter, som nylig eksemplifisert for mus mangler den presynaptiske stillas protein Fagott ^fire. Videre gir et bredt spekter av tilleggsverktøy ekstra med av retinal ganglion celle (RGC) og RGC axon tall samt RGC aktivitet, for eksempel ved elektroretinografi og atferdstester, og fastsettelse av kortikale rearrangementer av optisk avbildning av iboende signaler. De nyeste tekniske utviklingen innen lasermikros aktivere in situ visualisering av RGC regenerering av dype vev fluorescens bildebehandling i hele fjellet eksemplarer av synsnerven (ON) og hjerne. I denne histological tilnærming, tetrahydrofuran basert vev clearing i kombinasjon med lys ark fluorescens mikroskopi tillater oppløsning på enkeltfibre som re-gå inn i deafferented ON og optikk kanalen ^fem. Selv om slike teknikker kan være overlegen i oppløsning og bestemmelse av vekstmønster, har de ikke gjør det mulig gjentatte og langsgående analyser av individuelle vekst arrangement, som er spesielt ønskelig for å vurdere prosessen med langvarig regenerering.

Kontrastforsterket MR har vært ansatt for minimal invasiv visualisering av retino-tectal projeksjon i mus og rotter ^6,7. Dette kan oppnås ved direkte intraokulært levering av paramagnetiske ioner (f.eks, Mn ^{2 +)} til netthinnens celler. Som kalsium analog, Mn ^{2 +} er innlemmet i RGC somata via spenningsstyrte kalsiumkanaler og transporteres aktivt langs aksonal cytoskjelettet av intakt PÅ og optisk kanalen. Mens det hoper seg opp i hjernen kjernerav den visuelle fremvisning, dvs. den laterale geniculate kjernen (LGN) og superior colliculus (SC), transsynaptic forplantning inn i den primære visuelle cortex synes ubetydelig ^8,9, selv om det kan forekomme ^10,11. Under MR-sekvensering, paramagnetisk Mn ^{2 +} forsterker MR kontrast hovedsakelig ved å forkorte T _en spin-gitter relaksasjonstiden ^12. Slike Mn ^{2 +} forbedret MR (MEMRI) har blitt brukt i ulike nevro-anatomiske og funksjonelle studier av rotter, inkludert vurderingen av aksonal regenerasjon og degenerasjon etter PÅ skade ^13,14, presis anatomisk kartlegging av retino-tectal projeksjon ¹⁵ , så vel som bestemmelse av aksonal transport-egenskaper etter at den farmakologiske behandlingen ^16.. Nylige forbedringer i dosering, giftighet, og kinetikk av nevronale Mn ^{2 +} opptak og transport, samt forbedret MR protokoller har utvidet sin søknad til studier på transgenemus ⁹ bruker 3 Tesla skannere som vanligvis brukes i klinisk praksis ^17.

Her presenterer vi en MEMRI protokoll egnet for langsgående in vivo avbildning av musen retino-tectal projeksjon og eksemplifisere sin anvendbarhet ved å vurdere Mn ^{2 +} avhengige forbedring av signal i henhold naive og ulike neurodegenerering forhold. Vår protokollen legger spesiell vekt på MR datainnsamling i en moderat 3 T magnetfelt som er generelt mer tilgjengelig enn dedikerte dyre skannere. I naive mus, illustrerer vi hvordan kanalen spesifikke signalintensitet kan være betydelig og reproduserbart bli økt etter intravitreal (ivit) Mn ^{2 +-programmet.} Kvantitativt, Mn ^{2 +} forplantning langs visuell projeksjon oppstår uavhengig av den normale aldringsprosessen (målt mellom 3 og 26 måneder gamle mus) og styrking er ildfast til visuell stimulering og tilpasning til mørket. I kontrast, Mn 18 samt i nfkb1 knock-out mus (p50 ^KO) lider av spontan apoptose RGC død og ON degenerasjon ^19. Således, i ekspansjon på konvensjonell histologisk analyse, langsgående MEMRI analyse av individuelle dyr muliggjør profilering av unike kinetikken av neurodegenerative prosesser. Dette skulle vise seg nyttig for studier på neuroprotection og aksonal regenerasjon forbundet med farmakologiske eller genetiske intervensjoner.

Protocol

Alle dyre intervensjoner blir utført i henhold til den europeiske konvensjonen for Animal Care og bruk av forsøksdyr og Arvo Erklæring for bruk av dyr i Ophthalmic and Vision Research. Alle forsøkene er godkjent av den lokale etikkutvalg. Prosedyren for ON skader hos mus er beskrevet andre steder ^ni.

En. Intravitreale Mangan Injection

1. Utfør Mn ^{2 +} injeksjon 24 timer før MR-undersøkelse med hjelp av en assistent. Bedøve dyrene ved intraperitoneal injeksjon av en 5% kloralhydrat-løsning (420 til 450 mg / kg kroppsvekt i steril PBS). For ytterligere aktuell anestesi, påfør en dråpe væske conjuncain (0,4% oxybuprocaine hydroklorid) til hornhinnen før øyet punktering. Å injisere 15 nmol Mn ^{2 +} per øye forberede en 7,5 mM MnCl ₂ løsning, for eksempel ved å fortynne en L av en M MnCl _to stamløsning i 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Laste 5 pl av sluttløsningen inn i en 5 pl Hamilton sprøyte som er koblet til en 34 G lite knutepunkt uttakbare kanyle (RN nål).
2. Når du starter med høyre øye, plasserer du musen til venstre-sidig under en kikkert mikroskop og forsiktig åpne og fikse det høyre øyet mellom tommelen og pekefingeren på venstre hånd. Ta opp sprøyten med høyre hånd og ta tak i nålen nær spissen. For atraumatisk punktering av øyet pære, forsiktig stikk nålen inn i glasslegemet på infero-temporal omkrets ca 1 mm distalt for limbus, og dermed skåner scleralkar.
3. Deretter anvender assistent langsomt totalvolum på 2 mL mens kontrollere omfanget av Hamilton sprøyte. I løpet av denne prosedyren, overvåke optimal nål plassering under mikroskopet og unngå punktering av linsen eller søl av væske. Hold nålen statisk satt inn for en ytterligere 30 sek, deretter trekke det sakte for å hindre væskelekkasje fra injeksjonsstedet.
4. I løpet av fremgangsmåten, bør man være spesielt forsiktig for å unngå trykk til øyet. Likeledes, unngå harde eller mange forsøk på å punktere øyet pære. Siden Mn ^{2 +} opptak i RGCs og transport langs PÅ er allerede mettet på 15 nmol MnCl _2, minimerer dette signalvariasjoner med litt upresise injeksjonsvolumer. For bilateral signal forbedring av videogrammer, gjentar injeksjonsprosedyren for det venstre øyet.
5. Påfør ofloxacin-inneholdende (3 mg / ml) øyedråper og panthenol-holdig salve en gang etter fremgangsmåten for å forhindre okulære infeksjoner og tørking av øyet. Returner musene til burene under normale boforhold før starten av MR scan.

2. Animal Forberedelse til MR

1. Anesthetize mus ved administrering av en 2% / 98% isofluran / oksygengassblanding. Monter musen på en museholder i en nesten horisontal, snodd posisjon. Insert den i MR pole, som deretter justert inne i MR-skanneren. Overvåk åndedrett og hjertefrekvensen med hensiktsmessige systemer. For tekniske detaljer, se Herrmann et al ^20.
2. Ved MRI, tilførsels anestesi ved kontinuerlig innblåsning av en i utgangspunktet 1,5% / 98,5% isofluran / oksygengassblanding gjennom en fordamper er koblet til mus hodeholder med et integrert rør. Under skanningen, justere deepness av anestesi i henhold til de registrerte vitale parametre (dvs. satse på en stabil respirasjon hastighet på ca 40 pust per minutt). Ved hjelp av en oppvarmingsenhet holde kroppsoverflatetemperaturen stabil mellom 35 og 37 ° C, målt ved en termisk sensor plassert på den abdominale område av musen. For tekniske detaljer, se Herrmann et al ^17.
3. Etter skanningen, frigjøre musen fra holderen og forsyne med rent oksygen for å akselerere utvinning fra anestesi. I tillegg holder kroppstemperaturen stabil ved hjelpet rødt lys oppvarmingskilde.

Tre. MRI-protokoll

1. Protokollen er validert for en 3 Tesla skanner utstyrt med en dedikert, SNR-effektive, små dyr spiral (lineært polarisert Litz coil) med en effektiv synsfelt på 35 mm × 38 mm diameter. Operer spolen i sende-mottaksmodus.
2. Med dyret i sin endelige stilling, justeres tune og match av spolen ved hjelp av en frekvensanalyseapparat. Justeres manuelt senderen referansespenningen, og de avstands strømninger for å optimalisere bilde homogenitet og kvalitet.
3. Acquire T _en vektet 2D TSE bilder med en oppløsning på 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm i sagittal og tversgående syn for planlegging. Bruke planlegging MR, erverve MEMR bilder i koronale måling retning, roteres for å være parallell til dyrets hode med fase koding langs venstre-høyre retning. For å redusere anskaffelses tid, bruker et rektangulært synsfelt justert tilselve hodet dimensjoner. Ansett en bortskjemt 3D FLASH sekvens (VIBE 3D) med følgende parametere: basen matrix 256, synsfelt 54 mm × 50.65 mm × 14.08 mm, bruker 93,8% rektangulært synsfelt i fase kode retning, og 128 skiver av 0,11 mm skivetykkelse med skive-oppløsning satt til 61%.
4. Aktiver in-plane interpole å lage endelige bildene med 512 × 480 × 128, som gir en effektiv oppløsning på 0,21 mm × 0,21 mm × 0,18 mm (0,1 mm × 0,1 mm × 0,09 mm interpolert), ekkotid T _E = 6,51 msek, repetisjon tid T _R = 16 msek, båndbredde = 160 Hz / px, flip vinkel = 22 °. Påfør to gjennomsnitt og tre repetisjoner for å oppnå en total anskaffelses tid (T _A) på ca 30 min.

4. MR Data Analysis

1. Analysere dataene ved hjelp av programvaren syngo fastView. For kvantitativ forbedring av signal, velg definerte regioner of interesse i 2D-MR-opptak og bestemme signalintensitet (SI) av den forsterkede struktur (SI _MEMRI), vev bakgrunn (SI _backgr), og standardavviket av støyen (SD _N). Der det er nødvendig, kan du bruke en mus hjerneatlas for å lette nevro-anatomiske orientering for LGN og SC strukturer. Beregn motsetning-til-støy-forhold (CNR) med formelen:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _backgr) / SD _N
3. Kvantifisere tre etterfølgende bilder for gjennomsnittlig CNR beregning for hver prøve. I bilateralt injiserte dyr, analysere hver halvkule uavhengig.
4. For skildring av horisontale, koronale og sagittal bilder, beregne flere plan rekonstruksjoner fra den opprinnelige 3D MR datasett. Disse behandlede bilder er ikke anbefalt for kvantitativ analyse. Å lage animerte 3D rekonstruksjoner (maks intensitet anslag, MIPS) av retino-Tectal projeksjon, bruke en angiografi etterbehandling programvaremodul.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM Farging)

1. For TIMM farging av Mn ^{2 +} spores strukturer i hjernen etter MEMRI, injisere en dose på 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 timer før bildebehandling.
2. Etter MR skann, perfuse dyrene med 30 ml iskald 0,325% _Na-2-S i PBS (pH 7,4). Dissekere retinae og fryse prøver i Frozen delen.
3. Skjær sekvensielle, ekvatoriale deler av 15 mikrometer tykkelse på en cryotome.
4. Utfør TIMM flekker ²¹ i fravær av bindemiddel og kryobeskyttelse ifølge Angenstein et al ^22..

6. Statistisk analyse

Utføre statistiske analyser ved hjelp av Student t-test for enkelt sammenligninger, etterfulgt av post hoc ANOVA. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard feil. Egne I tallene ergitt separat for hvert eksperiment. Resultater rekk P ≤ 0,05 anses statistisk signifikant (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **; P ≤ 0.001, ***).

Representative Results

Muligheten av denne avbildningsteknikk for å vurdere presist vitalitet og funksjonaliteten til den visuelle fremvisning er avhengig av nøyaktig påføring av et ikke-toksisk Mn ^{2 +} dosering til glasslegemet og dets opptak i RGCs. Denne store antagelsen er testet i figur 1, hvor laget spesifikk Mn ^{2 +-opptak} er demonstrert av autometallography (TIMM farging) ^21. Retina snitt ble analysert ved 24 timer etter at ivit anvendelse av enten 15 eller 150 nmol nmol Mn ^{2 +} eller PBS som kontroll. På dette tidspunkt, er Mn ^{2 +} injisert retinae viser maksimal forbedring av signal i _en T vektet MRI (N = 3; stiplede linjer), mens PBS injisert hinnen ikke er forsterket i signal (N = 3, stiplet linje) (Figur 1 , venstre panel). Legg merke til hyperintensive forbedring av signal i 150 nmol injisert øye. I motsetning til dette nonenhanced hjerneområder (skjult) viser lignende bakgrunnssignalintensitet for alle conditions (grønn farge). Ivit Mn ^{2 +} applikasjon øker samlet TIMM flekker spesielt i RGC lag og nervefiberlaget (NFL) (figur 1, forstørrede innfellinger i midtre panelet), som er bekreftet av undersøkelse av individuelle RGC somata følge H & E co-merking (høyre panel).

For in vivo-avbildning av musen retino-tectal projeksjon, er det avgjørende å velge en spesiell mus MEMRI protokoll, hvor de operative parametre sammen med utstyret, som illustrert i figur 2, er innrettet til å analysere mus i en 3 T felt. Bruk av en slik skanner oppsett, vår tidligere arbeidet avdekket at for CNS bildeoppløsning en rotte hodet spiral er bedre enn en dedikert mus hele kroppen batteri ^17. Å fikse murine hodet og å riktig justere sin posisjon i rotte pole, bruker vi en vugge og en konisk tube med bite bar laget av plast, som begge er nedskalert til møte dimensjonene kroppsmus (figurene 2A, B). Når bildene er kjøpt på en tverrgående T _en vektet matrise implementere 3D gradient ekko sekvenser, kan forventes generering av høyoppløste bilder av (200 mikrometer) ³ innen 35 min av oppkjøpet tid. Vi anbefaler på det sterkeste den konstant overvåking av vitale funksjoner under skanningen. Justering av anestesi sammen med postimaging oksygenering og kroppstemperaturkontroll betydelig akselererer utvinningen tid og garanterer overlevelse på ca 100%. Slike tekniske tiltak er viktig for å sikre at hele kohorten vil opprettholde langsgående og repeterende MR.

I en hvilken som helst undersøkelse, skal bare et ikke-toksisk Mn ^{2 +} dose på 15 nmol benyttes til ivit påføring ^9, som er tilstrekkelig til å fremtredende styrke CNRS i netthinnen, ON, og optikkkanalen inntil den presynaptiske intra LGN og SC. CNR verdier er best beregnet fra 200 mikrometer tykk tverrgåendeskiver oppnådd fra opprinnelige MRI-datasett ved reslicing den opprinnelige isotropisk 3D volumet. Figur 3A viser et eksempel på en presis bestemmelse CNR for det forbedrede LGN, hvor tre regioner av interesse blir valgt i hvert bilde (1) med forbedret signal-område (SI _MEMRI ), (2) ikke-affine hjernevev (SI _backgr), og (3) bakgrunnsstøy (SD _N). Den expectable romlige forbedring av signal kvantifisert langs helheten av en enkelt visuell fremvisning er presentert i figur 3B. Legg merke til den sterke gradvis økning av signalforbedring i netthinnens seksjoner langs dorsoventral flyet, som topper på synsnervehodet. I tillegg oppmerksom på mangelen på en relevant transsynaptic Mn ^{2 +} forplantning i cortical lagene under anvendte eksperimentelle forhold (signal slipp i den visuelle cortex). Minsteprisene er svært illustrerende for å visualisere 3D-posisjonering av retino-tectal projeksjon i toto (Movie 1). Accumulation av Mn ^{2 +} langs den visuelle fremspring er bestemt av kinetikken av intracellulære opptaket i RGCs gjennom spenningsavhengige Ca ^{2 +-kanaler} og den raske aksonal transport, så vel som ved relativt lav klaring fra målvevet ^13.. I henhold til våre tidligere kinetiske studier, kan Mn ^{2 +} avhengig forbedring av signal detekteres så tidlig som 6 timer etter injeksjon. Det ytterligere topper på 24 timer og reduserer tilbake til baseline nivå innen 120 timers post-injeksjon ^ni. Derfor, for å oppnå optimale resultater, MEMRI bør utføres 24 timer etter injeksjon, noe som representerer halvparten av den tid som kreves for forbedring rotter ^13.

Etter å ha skissert prinsippet for kontrastforbedring av det visuelle projeksjon av MEMRI, vi ytterligere kommunisere påvirkninger av to parametre - lysforhold og dyr alder - som kan påvirke kvantitative målinger:

(1) For å teste feller stimulus-avhengig opphopning av Mn ^{2 +} i midthjernen sentre, mus ble holdt enten under lys-stimulerte forhold oppnås ved lommelykt eksponering av en definert frekvens (5 Hz) og lysintensitet (3 W LED) eller i stummende mørke før skanningen og i løpet av 24 timer av Mn ^{2 +} eksponering. Kvantitativ analyse av CNR 24 timer etter ivit Mn ^{2 +} søknaden viser en betydelig økning i signalintensiteten av mørk-tilpasset retinae i forhold til lys-stimulerte betingelser (66,29 ± 3,07 54,56 ± 3,08 vs, P ≤ 0.05, N = 7 / 8, Fig. 3C). Gitt gradient i forbedring av signal mellom den perifere retina og synsnervehodet (se Figur 3B), forsikret vi å alltid analysere tilsvar netthinnens seksjoner innen alle eksperimentelle grupper. Bildeanalyse langs ventrodorsal flyet avslørt, som forventet, at absolutte CNR verdiene går ned i begge forholdene. Viktigere, reltiv signalforskjellen mellom mørke og lyse tilpasset retinae forblir vedvarende (data ikke vist). Men forbedring av signal i prognose områder av LGN (26,97 ± 1,78 vs 26,58 ± 1,05, P = 0,9, N = 7-2) og SC (25,09 ± 1,24 vs 26,81 ± 1,55, P = 0,4, N = 7 / 8) er utvisket mellom lyse og mørke condition miljøer (Figur 3C). Denne analysen viser at opptaket av Mn ^{2 +} i netthinnens lag er følsom for lys eksponering, mens dens utbredelse langs retino-tectal projeksjon og akkumulering i målområdene ikke er påvirket av sammenfallende visuell stimulering. Alternativt kan signalet følsomheten til 3 T scanner være under påvisningsgrensen for signal variasjon i LGN eller SC.

(2) For å utforske implikasjonene av dyrets alder på MEMRI relatert signal forbedring av videogrammer, analyserte vi mus mellom 3 og 26 måneder of alder. CNR verdier i LGN av tre måneder gamle mus (23.49 ± 1.36, N = 12) skiller seg ikke fra den signalintensitet målt i mus i alderen 7 måneder (23,90 ± 0,81, P = 0,79, N = 16), 13 måneder (23.35 ± 1.29, P = 0,94, N = 10) eller 26 måneder (25,10 ± 2,29, P = 0,53, N = 6; Figur 3D). Likeledes er det signalintensitet i SC uendret mellom tre måneder (19,01 ± 1,20) og 26 måneders alder (16,92 ± 2,18, P = 0,37, figur 3D). Selv en liten økning er tydelig i CNR verdier av 26 måneder gamle retinae (38,49 ± 3,25), betyr denne økningen ikke nå betydning sammenlignet gjennom alle gruppene (P> 0,05). Disse forsøkene indikerer at forbedring av signal i cerebrale målområder i visuell projeksjon er upåvirket av visuell stimulering og fysiologiske aldring.

Neste, vi demonstrere følsomheten av MEMRI å oppdage strukturelle endringer of den visuelle fremvisning forårsaket av akutt og kronisk axonopathy. For å undersøke dette ble en modell av Wallerian degenerering indusert av traumatisk skade ON ¹⁸ så vel som en dyremodell som viser tidlig utviklet, spontan degenerering av sensoriske anslag inkludert synsbane ¹⁹ benyttes:

(1) Trauma axonopathy indusert av ON klemskade fører til brudd på axona fascicles. Følgelig vil retino-tectal transport av Mn ^{2 +} langs aksonal cytoskjelettet være fullstendig blokkert og bærekraftig, som visualisert etter fullstendig tap av Mn ^{2 +} forsterket signal i LGN og SC analysert rad (ikke vist), en uke (figur 4A , stiplede linjer), og 4 uker (ikke vist) poste skade. Å tydelig demonstrere nevroanatomi og påfølgende MR funksjonene i ON skade og å dissekere dem fra den naive staten, ble lesjonen påført bare ensidig. Dette resulterer i uforandret Mn ^{2 +} transport på tHan styrer side i motsetning til tracer avbrudd på siden av intervensjonen. Analyse av CNR verdiene i deafferented områder bekrefter fullstendig fravær av signal ekstrautstyr (ikke vist). Dette forsøk viser videre at MEMRI er svært følsom påvisning på stedet og alvorligheten av en lesjon område ved langsgående vurdering av signalintensitet langs fremspringet før og etter skade (figur 4B). Mens signalintensitet langs ON før skaden stadig forblir over bakgrunnssignalet, er det temporo-romlige fall i signalintensitet til bakgrunnsnivået én dag etter ON skade.

(2) Vår tidligere arbeid vist at Mn ^{2 +} avhengige forbedring av signal i LGN er redusert i 10 måneder gamle mus mangler NF-κB subenhet p50 målt 24 timer etter injeksjon ^ni. Oppdager dette med en høy konsistens, antok vi en samlet verdifall i retino-tectal Mn ^{2 +} transport, muligens forårsaket av redusert antall RGCs og relaterte PÅ nevropati i aldring p50 ^KO mus ^19. Alternativt kan den reduserte signalforbedring være forbundet med en forsinket neuronal opptak og forplantning av Mn ^{2 +} fra glasslegemet og langs den patologiske projeksjon. Sistnevnte mulighet kan utforskes ved å utføre repetitive MR etter en enkelt applikasjon av 15 nmol Mn ^{2 +} og studere kinetikken av forbedring av signal i netthinnen og LGN på tidlig (8 og 24 timer) og sent (48 og 72 timer) tid poeng. I vill type og P50 ^KO mus, retinal signal ekstrautstyr topper på 8 timer ved nesten identiske ekstrautstyr priser (43,52 ± 3,24 og 40,72 ± 2,79, P = 0,6, N = 3-6, figur 4C, venstre). Mens signalforbedring er fortsatt høy i vill typer på 24 hr etter injeksjonen, avslår det i P50 ^KO mus (43.38 ± 2.18 g. 32.89 ± 1.54, P ≤ 0,01, N = 5-8). I senere faser (48 og 72-timers), forbedring av signal reduseres i begge gruppene (med gjennomgående lavere CNR verdier i knock-out mus), noe som utelukker en forsinket retinal Mn ^{2 +} opptak og spredning i P50 ^KO mus. Tilsvarende resultater i LGN av p50 ^KO mus bekrefte denne oppfatningen. Selv om CNR er vesentlig lavere mellom 8 og 48 timer etter injeksjonen (P ≤ 0.05, N = 5-9), kinetikken til signaldempning i p50 ^KO mus tilsvarer den i villtype mus (figur 4C, høyre). Således er den reduserte temporo-romlige signal forbedring av retino-tectal projeksjon på grunn av redusert axon tall som stammer fra en begrenset RGC populasjon fremfor nedsatt transportkinetikken. Vi foreslår MEMRI å være et verdifullt verktøy for å screene genetiske muse mutanter for projectional svekkelser i CNS.

innhold "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1. TIMM farging av Mn ^{2 +} opptak i RGCs. Representative varmekartbilder av T _en vektet MRI (MRI T ₁₎ viser signalforbedring av linsen og hele omkretsen retinal (prikket linje) 24 timer etter påføring av 15 ivit nmol, og hyper-intensive forbedring av signal etter påføring av 150 nmol Mn ^{2 +} (til venstre). Varme farger representerer høyere signalverdier enn kalde farger. Målestokk: 1 mm. Midten / høyre: Mn ^{2 +} opptak av RGCs etter ivit injeksjon av MnCl _to som oppdaget av sølv nedbør hjelp TIMM farging (svart farge). PBS-behandlede kontroll retina seksjoner demonstrere heller svak farging og diffus differensiering av RGC lag (RGC) (topp, N = 3). Høy forstørrelse tillater ikke d. iscrimination av enkeltceller (forstørret innfellinger) Ivit MnCl _to program differentially øker den generelle sølv flekker på tvers av netthinnens lag, med en fremtredende sølv nedbør spesielt i nervefiberlaget (NFL), RGC lag, og indre kjernefysiske lag (INL, midten og bunnen , forstørret innfellinger, N = 3). Colabeling av TIMM med H & E flekker ytterligere bekrefter slikt lag spesifikk Mn ^{2 +} akkumulering (høyre panel). Scale bar, oversikt: 50 mikrometer, forstørrelse: 25 mikrometer. IPL, indre plexiform lag; OPL, ytre plexiform lag; Onl, ytre kjernefysiske lag; RPE, retinal pigment epitel.

Figur 2. Fotografier som viser MR utstyr spesielt for mus MEMR image oppkjøpet på en klinisk 3T skanner. A) viser skreddersydd mus vugge med bite bar hodefiksering og sensoren for luftovervåkning (hvit pad, blå tube). B) viser posisjonert og fast mus i vuggen. Rørene til venstre for tilførsel av anestesigass. C) er et eksempel på posisjoneringen av mus med hodet og holderen på innsiden av lineært polarisert Litz pole som opererer i sende-og mottaksmodus. D) viser spolen plattformen foran dekkrøret og den kliniske 3 T-skanner. Den kobber belagte rør gir ekstra skjerming mot støy og blokkerer MR signalet fra varmt vann basert varmematte (sort innpakning rundt røret). E) visualiserer komplett oppsett av dyret polen i poren av tre T-skanner bare før plassere dyret hodet nettopp på isomidtpunktet inne i skanneren.

Figur 3.. MEMRI av den naive retino-tectal projeksjon under ulike lys-og aldersforhold. A) Illustrasjon region av interesse (ROI) kartlegging i forbedret LGN og bakgrunn vev på en tverrgående MR opptak (til venstre). LGN bestemt signal ekstrautstyr er illustrert med varmekartet presentasjon (til høyre). 1 og 1 ', venstre og høyre LGN; 2 og 2 ', bakgrunn vev; 3, støy; P, posterior; R, akkurat. Målestokk:. 100 mikrometer B) Spatial kartlegging av signalforbedring langs en ​​enkelt retino-tectal projeksjon som bestemmes fra opprinnelig ervervet tverrgående MR bilde skiver av MEMRI. Fylt torg, Mn ^{2 +} avhengige signal ekstrautstyr; åpne trekanter, bakgrunnssignal. R, netthinnen; ON, synsnerven; OT, synskanalen; LGN, lateral geniculate nucleus; SC, overlegen colliculus; VC, visuell cortex. Skivetykkelse, 200 mikrometer. C) Svak stimulering reduserer retinal forbedring av signal betydelig. Enhancement i LGN og SC er uavhengig av visuell stimulering. Fylte sirkler, mørk-tilpasning; åpne sirkler, lys tilpasning. D) Signal ekstrautstyr er uavhengig av økende alder mellom 3 og 26 måneder.

Figur 4. MEMRI av retino-tectal projeksjon henhold nevrodegenerative forhold. A) MEMRI av bilateralt ivit injiserte mus utført en uke etter unilateral knusningsskade i høyre ON. Flere plan rekonstruksjoner av horisontale, koronale, og sidevisninger skildre fullstendig fravær av forbedring av signal i LGN og SC for den skadde halvkule (stiplede linjer). c, kontralaterale halvkule; Jeg, ipsilaterale hemisfære. Målestokk:. 1 mm B) MIP-bilder og lengde MR analyse av romlig signalforbedring langs PÅ før ogen dag etter skade. R, netthinnen; ON, synsnerven; arrow, lesjon nettstedet. Målestokk:.. 0,5 mm C) Kinetics av forbedring av signal i henhold kronisk neurodegenerering av visuell projeksjon i P50 ^KO mus Tidlig (8 timers) opptaket av Mn ^{2 +} i netthinnens celler påvirkes ikke, men er allerede redusert i LGN av p50 ^KO mus. Gjentatte MR på 24, 48, og (bare for retina) på 72 timer viser vedvarende signal reduksjon, men lignende kinetikk av Mn ^{2 +} transport og akkumulering i netthinnen og LGN av P50 ^KO mus.

Film 1: Animert, 3D varme-map presentasjon av in situ kontrastforsterket retino-tectal projeksjon MR ble utført 24 timer etter bilateral ivit injeksjon av 15 nmol MnCl _to.. Resultatene er angitt i MIP-modus. Skivetykkelse, 200 mikrometer. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51274/51274_Haenold_Movie1.mp4" target = "_blank"> Klikk her for å se denne videoen.

Discussion

MEMRI av det visuelle systemet utvider vanlige nevrobiologiske teknikker for å vurdere funksjonaliteten i henhold naive og patologiske tilstander. Bortsett fra å gi et unikt innblikk i integriteten av en isolert CNS fiberkanal, kan MEMRI lett bli supplert med atferdstester, f.eks, optometri og visuelt basert vann oppgaver, for å undersøke de umiddelbare konsekvensene av et gitt paradigme for visuell persepsjon. Det knytter også elektrofysiologisk og histologiske undersøkelser med funksjonell visuell karakterisering in vivo. Teknikken er svært pålitelig og reproduserbar med mindre inter variasjoner innenfor identiske grupper (se feilfelt i figurene 3, 4). Intriguingly, i en dose på 15 nmol, Mn ^{2 +} opptak og aksonal transport er mettet prosesser, slik som forbedring av signal når et platå som ikke kan bli forhøyet ved ytterligere Mn ^{2 +} tilførsel ^9.. Fra et praktisk synspunktse, slik en dose respons karakteristiske minimerer, iallfall til en viss grad, injeksjon tilhørende variasjoner i signal ekstrautstyr. Spesielt, de presenterte data på dosering og kinetikken av Mn ^{2 +} signal forsterkning er spesifikk for mus-og forskjellig fra de hos rotter, noe som krever en tilnærmet 10-20x høyere Mn ^{2 +} dosering og økt latens (36 timer) for å oppnå en optimal kontrastforbedring ^13,23. I tillegg er forbedringen langs den visuelle fremvisning forblir uforandret mellom et dyr 3 år og 26 måneder. Dette funnet er i tråd med visuelle tester utført på aldrende mus og det faktum at C57/B6 mus opprettholde normal visuell aktivitet inntil 2 år ^24. Selv om vi ikke analysere individuelle mus i lengderetningen i den aldrende studien tidligere resultater viser klart sikkerheten av gjentagelser administrert Mn ^{2 +} doser på 15 nmol for visuell vedlikehold ^9, som kan være ønsket i langsgående aldring studier.

I samsvar med forestillingen om at Mn ^{2 +} er innlemmet i RGCs, viser vi Mn ^{2 +} opptak i deres somata Timm flekker som er avhengig av sølv utfelling av gratis metallioner, som anvendes av Angenstein et al. For intra Mn ^{2 +} deteksjon følgende systemisk program ^22. Tidligere ble intracerebral Mn ^{2 +} fordeling detektert ved autoradiografi av ⁵⁴ Mn ^{2 +} isotopen å avgrense neuronal kretser av rotte CNS ^25, men ikke på cellenivå. Her kan TIMM farging tilordningen av Mn ^{2 +} opptak til forskjellige cellepopulasjoner innenfor den eksponerte netthinnen, der vi finner fremtredende sølv nedbør i RGC og nerve fiber lag. Det bør bemerkes at protokollen anvendt viser forbedret deteksjon av TIMM farging etter påføring av en dose på 150 nmol sammenlignet med 15 nmol Mn ^{2 +.} Selv Mn ^{2 +} opptak og dens aksonal transport er allerede mettet på 15 nmol, og dermed ikke gir noe ekstra CNR økning langs retino-tectal projeksjon ved høyere doser, kan overdreven tilskudd øke tilgjengeligheten av gratis, protein ubundet Mn ^{2 +,} og dermed gjøre den tilgjengelig for sølv nedbør. Fremtidige forbedringer i farging sensitivitet vil tillate korrelasjon av MEMRI-baserte CNR verdier av spesifikke CNS anslag med mobil plasseringen av Mn ^{2 +} berikelse innenfor et definert histologisk regionen. En slik evne kan også være nyttig for karakterisering og kvantifisering av Mn ^{2 +} fordeling i andre CNS-regioner utenfor den visuelle fremvisning. Likeledes har Mn ^{2 +} vært ansatt i en kainat toksisitet modell for å visualisere degenerasjon og regenerering av hippocampus mosegrodde fibre ^26.

Mn ^{2 +} blir tatt opp av spenningsavhengige kalsiumkanaler og intracellulært distribuert av aktiv aksonal transport, som can bli blokkert av kolkisinbehandlingen ^25,27. Visuell stimulering eksperimenter på rotter som fikk en intraperitoneal dose av MnCl ₂ har avslørt en økt signalforbedring i det indre og spesielt ytre retina ^28. Dermed mørk tilpasning ytterligere øker signalintensitet i de ytre netthinnens lag sammenlignet med rotter eksponert for lysforholdene i rommet bare, og dermed indikerer sensitivitet av retinal Mn ^{2 +} opptak til visuell stimulering ^28. Tilsvarende finner vi forbedret signalintensitet i netthinnen av mørke tilpasset mus sammenlignet med mus eksponert for visuell stimulering etter ivit Mn ^{2 +-programmet.} Dette kan være relatert til de spesifikke elektrofysiologiske egenskaper av netthinnen og generering av en kontinuerlig mørk strøm i fotoreseptoren celler. Siden Ca ^{2 +} tilstrømningen i ytre deler av fotoreseptorer bidrar vesentlig til konstitueringen av den mørkestrøm, kan deres generasjon ledsagesav forbedret co-opptak av Mn ^{2 +} inn i fotoreseptoren celle laget under mørket. I motsetning til dette reduserer lysimpulser den mørke strømmen og forårsaker hyperpolarisering av fotoreseptoren celler ^29. Dermed samlet Mn ^{2 +} opptak kan bli redusert i henhold til lysforholdene.

For pålitelig bruk av MEMRI, er det viktig å klarlegge om mer uttalt Mn ^{2 +} opptak inn i den mørke-tilpasset retina endrer forbedring av signal langs andre deler av den visuelle fremvisning, eller til og med hele sin forlengelse. Stimuleringsavhengige endringer i MEMRI signal intensitet av cerebral nettverk har blitt demonstrert for akustisk system etter intraperitoneal Mn ^{2 +-programmet 30.} I denne studie av Yu et al. Ble rottene eksponert for varierende støyfrekvenser før MR-skanner og T _en veiet signal forbedring av mindreverdig colliculi ble deretter undersøkt. Akustisk stimulering ble funnet å significantly øke MEMRI signalintensitet i en tonotopic representasjon, og dermed eksemplifisering av fMRI-lignende karakter aktivitetsavhengige Mn ^{2 +} opphopning ^30. I kontrast, i vårt eksperimentelle oppstilling Mn ^{2 +} opphopning i LGN og SC vises uavhengig av visuell stimulering. Imidlertid kan slike forskjeller i sensoriske hjernen kartlegging forsøk oppstår fra det nedre magnetiske feltet og begrenset terskel for påvisning av vår 3 T scanner i forhold til det høye felt 7 T scanner som brukes av Yu et al ^30.

Til dags dato er det ikke kjent i hvilken grad biofysiske parametere påvirker antero aksonal transport av Mn ^{2 +} og hvordan MEMRI kan tjene som en indikator for elektrisk aktivitet. Ikke desto mindre viser det seg at Mn ^{2 +} overføring av RGCs oppstår, i det minste delvis uavhengig av lys spesifikk stimulering og elektrisk inngang mottatt fra bipolare celler. Alternativt nettoeffekten av elektrisk enctivity innenfor retino-tectal projeksjon kan være et resultat av elektrisk stimulering av mørk-responsive "OFF-RGCs 'og lys-responsive' ON-RGCs '. En slik tolkning støttes av funn som Mn ^{2 +} transport langs retino-tectal projeksjon ikke er svekket i musestammer med dårlig syn, for eksempel CBA mus som bærer RD1 mutasjon av Pde6b genet forårsaker retinal degenerasjon ^11. I en kinetisk undersøkelse av villtype seende og CBA mus ble sammenlignbare transport priser observert i løpet av den innledende tilstrømningen fase (ved 2,5-timers post-injeksjon), og for den endelige forbedring av signal (ved 24 timer) i LGN og SC ^11.

Samlet utgjør disse observasjonene støtter forestillingen om at MEMRI, f.eks av det visuelle system som eksemplifisert her, representerer et verdifullt tiltak for strukturell integritet og metabolsk stabilitet snarere enn for elektrisk aktivitet. Praktisk talt, den tilsynelatende sTabellen uavhengighet forbedring av signal i cerebral LGN og SC fra lyseksponering tillater robust håndtering og boliger av dyr uten spesiell omsorg om belysning. På den annen side, for MEMRI studier som fokuserer på retinal forbedring av signal, er det nødvendig å holde dyrene i henhold tett kontrollerte lysforhold før skanningen.

Blant de fysiologiske parametere som påvirker Mn ^{2 +} aksonale transportpriser og påfølgende MEMRI signal ekstrautstyr, kan stabiliteten i kroppstemperatur være av særlig betydning. Dette indikeres av studier på intranasal Mn ^{2 +} for forbedring av primær olfactory projeksjons mål i hjernen, hvor anrikning ble funnet å være vesentlig redusert ved en midlertidig reduksjon av kroppstemperaturen til 30 ° C, sammenlignet med signalforbedring ved normal kroppstemperatur ^27. Derfor bør kroppstemperaturen overvåkes og justeres før og under den MR, ikke bare til protect dyrenes helse, men også for å normalisere fysiologiske parametere av Mn ^{2 +} forplantning.

Siden patofysiologiske endringer og metabolske svekkelser påvirke aksonal transport effekten av Mn ^{2 +,} forbedring av signal i projeksjons sentre, f.eks LGN og SC, kan tjene som et mål for den strukturelle integriteten og funksjonell aktivitet av denne veien. Her presenterer vi to ulike forhold av ON degenerasjon og illustrere at Mn ^{2 +} forplantning og berikelse i thalamic og midthjernen sentrene varierer som en funksjon av aksonal integritet. Akutt ON skade resulterer i et totalt tap av signalstyrke umiddelbart etter skade, som ikke bedres innen 4 uker på grunn av mangelen på relevant aksonal regenerasjon, mens langsomme aksonal degenerasjon i p50 ^KO mutant er reflektert av reduserte CNR verdier i LGN. Med mulighet for langsgående avbildning, kan dette anvendelsen av MEMRI være verdifulle feller overvåking postlesional vekst reaksjoner fra ON og gi rom for etterforskningen av proregenerative genetiske eller farmakologiske intervensjoner til RGCs.

I tillegg presenterer vi MEMRI som en svært følsom metode for å detektere gradvise nedskrivninger i forbedring av signal som er forbundet med kroniske aksonale degenerasjon prosesser. Den transkripsjonsfaktor NF-κB er involvert i neuronal vedlikehold og mus med sletting av p50 subenhet av NF-κB skjerm aldersavhengig neuronal celle tap og aksonal degenerasjon i det visuelle systemet ^19.. I tillegg til histologiske og elektronmikroskopi-analyser, MEMRI av retino-tectal fremspring er i stand til å identifisere fenotypiske endringer i disse musene. Ved kjøp av serie T _en vektet MR-bilder følgende ivit Mn ^{2 +-programmet,} utmerker vi en samlet redusert fra en rett og slett forsinket Mn ^{2 +} transport langs den visuelle veien i disse p50KO mus. Dermed repeterende datainnsamling ved MEMRI etter en enkelt Mn ^{2 +-programmet} gjør at definisjonen av aksonale transportkinetikk og nevrofysiologiske endringer i den uvurderlig pool av tilgjengelige genmodifiserte mus. Foreløpig flere modifikasjoner av MEMRI er under etterforskning tar sikte på å gjøre denne teknikken trygt for diagnostika hos mennesker. En lovende tilnærming av høy klinisk relevans, noe som utgjør et alternativ til ivit injeksjon, er levering av Mn ^{2 +} som øyedråper. Dermed lokal administrasjon av en M MnCl ₂ gitt en betydelig forbedring av signal med 20% i SC da bildene ble anskaffet på en 4,7 T dyr scanner ^31. Fremgangsmåten var i stand til å detektere omfattende ON degenerering etter retinal iskemi ^31, og konsentrasjonen anvendt seg å være sikker når gjentagelser anvendt i månedlige intervaller ^32. Med relativt høy neurotoksisitet av Mn ^{2 +} for eksempel, for diagnostisering av multippel sklerose og andre nevropatier.

Oppsummert, viser vår studie at MEMRI er en kraftig eksperimentell tilnærming til å studere retino-tectal kretser i mus, og dermed forlenge optometric oppgaver for å vurdere funksjonaliteten til det visuelle systemet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908