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Immunology and Infection

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG doi: 10.3791/51275 Published: April 15, 2014

Summary

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)ペプチド35-55(MOG 35-55)で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。

Abstract

多発性硬化症は強力な神経変性成分を有する中枢神経系の慢性神経炎症性脱髄疾患である。この疾患の正確な病因はまだ不明であるが、自己反応性Tリンパ球は、その病態生理学において中心的な役割を果たしていると考えられている。 MSの治療は、これまで部分的にしか有効であり、研究努力は、病気の病態生理に関する我々の知識を拡大し、新たな治療戦略の開発を続けています。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、MSが、多くの臨床的および病態生理学的な機能を共有するための最も一般的な動物モデルである。人間、MSの異なる、臨床免疫学的および組織学的な側面を反映して、EAEモデルの幅広い多様性があります。マウスでは、積極的に誘導されるEAEは、堅牢で複製可能な結果を​​最も簡単な誘導可能なモデルです。それは、自己免疫neuroiによって挑戦トラ​​ンスジェニックマウスを用いて、薬物の又は特定の遺伝子の影響を調査するために特に適しているnflammation。したがって、マウスは、CNSホモジネートもしくはミエリンタンパク質のペプチドで免疫化する。によるこれらのペプチドの低免疫原性のために、強力なアジュバントが使用される。 EAE感受性と表現型は、選択された抗原および齧歯類株に依存します。 C57BL / 6マウスは、トランスジェニックマウスの構築のための一般的に使用される菌株であり、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)に特に反応する。免疫原性エピトープのMOG 35〜55は、免疫前および百日咳毒素に完全フロイントアジュバント(CFA)に懸濁されている予防接種の日に適用され、2日後にされている。マウスは、免疫後9月14日日以内に弛緩性麻痺の昇順で "古典的な"自己限定単相性EAEを開発しています。マウスを、25〜50日間の臨床スコアリングシステムを用いて毎日評価する。 EAEを有する動物だけでなく、このモデルの潜在的なアプリケーションと限界のケア取るための特別な考慮が議論されている。

Introduction

多発性硬化症(MS)は、中枢神経系の慢性脱髄性炎症性疾患であることを特徴とする異種および蓄積臨床症状におけるオリゴデンドロサイトおよびニューロンの破壊をもたらす。 MSは、中枢神経系(CNS)の原型の自己免疫疾患と考えられている動物モデルは、その複雑な病因を解明するために開発されている。さらに、現在の治療は、部分的にしか有効であり、神経変性成分が、おそらく将来の治療的アプローチ1,2の大きな課題である間、主に疾患の炎症期を対象としています。

疾患の正確な病因は未だ不明であるが、CNSにおける軸索のミエリン鞘上のエピトープに対する自己免疫反応は、疾患の発症を誘発すると想定されます。免疫系の遺伝的脆弱性と環境要因( 例えば感染症、ビタミンD)の調節不全があると考えられているMSの病態生理学的メカニズムの中心的な側面に影響を与える。

動物モデルの3つの異なるタイプが現在、MSの病理学的なパターンの探索のために確立されています。タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス(TMEV)のようなウイルスのモデル、クプリゾンのような有毒物質により誘発されたモデル、および実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)3の最後に異なる変形、 4。彼らはすべてのMSの機能を模倣するが、彼らは適応免疫系の関与のような基本的な病理学的特徴で途方も異なっている。それは神経炎症経路を調査するために特に有効であり、多くの場合、新たな治療戦略の5,6の有効性のための「証拠の原則」のモデルとして役立つように、EAEは、最も一般的な動物モデルである。 EAEは、多くの異なる動物( 例えばマウス、ラット、ミニブタ、モルモット、ニワトリ、又は霊長類)において誘導することができる。しかし、マウスは、少なくとも部分的に起因する最も広く使用の種となっている洗練されたトランスジェニックやノックアウトマウス7のレパートリーを拡大する。

EAEの病態生理は、脳特異的抗原に対する免疫系の反応に基づいている。この反応は、MS患者において観察されるものと同等の神経学的および病理学的特徴で、その結果、構造体を担持する抗原の炎症および破壊を誘導する。 3つの異なるアプローチに区別することができます。積極的に誘導されるEAE(aEAE;能動免疫)、受動的にEAE(pEAE、免疫動物から脳炎誘発細胞の転写)自己免疫の研究を可能にする、より最近では、自発的なEAEマウスモデル(SEAE)外因性の操作をすることなくメカニズム。最も簡単な誘導可能なモデルは、高速かつ堅牢な結果に得たマウスでaEAEです。このモデルは、フィールド8での多くの研究者によって神経免疫動物モデルの「ゴールドスタンダード」として考えられている。

aEAE誘導のため、動物予防接種の日に百日咳毒素を腹腔内投与に伴う選ばれた抗原および完全フロイントアジュバント(CFA)からなるエマルジョンの皮下注射で免疫し、2日後にされている。その結果、ミエリン特異的Tリンパ球は末梢で活性化され、血液脳関門を横切ってCNS内に移動される。 CNSに入ると、T細胞は、後続の炎症カスケード、単球またはマクロファージ、最終的には、脱髄および軸索細胞死9のような他の細胞の関与が生じる局所浸潤性および抗原提示細胞によって再活性化される。免疫化プロトコールおよびマウス系統との組み合わせに応じて( 例えば、C57BL / 6、SJL / J、Biozzi)および抗原( 例えば、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP))、疾患コー​​スは、急性、慢性進行性または再発寛解型疾​​患経過を取ることができます。

35〜55ペプチド10、病気の最大値を有するC57BL / 6マウスの免疫のためのプロトコルを記述次の10から20日間の。単独MOG 35-55ペプチド免疫原性は、疾患を誘発するのに十分でないように、このようなCFAなどのアジュバントが必要である。これは、CFAの成分は、これらの分子の食作用およびサイトカインの分泌を誘導する単核食細胞を活性化することが想定される。これは抗原の存在およびリンパ系へのこれらのより効率的な輸送の延長をもたらす。 EAE誘導は、特に調節することが示唆されている百日咳毒素(PT)の適用によって促進される血液脳関門および免疫学的応答性自体は11。疾患誘導した後、特別なケアは、病気の症状のためのマウスの日々の評価のために注意する必要があります。

Protocol

マウス実験のために1。一般的なコメント

  1. マウスを用いた実験はすべて、それぞれの制度的動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われるべきである。
  2. 病原体を含まない条件下でマウスを維持し、食物および水を自由にアクセスできるようにすることを可能。注:疾患に対する感受性が、年齢や性別に応じて変動することができますので、それは実験群の年齢と性別をマッチさせたマウスを使用することが重要です。
  3. MOG 35-55ペプチドが抗原またはペプチドなしnonencephalitogenic PBSのいずれかにより置換される選択された実験条件に依存して、偽免疫化対照群と考えることができる。
  4. (下記参照)の前に、実験を開始する方法論的側面を考慮してください。我々は、EAEスコアリングのための1つまたは2つの盲目の観察者が関与することをお勧めします。

MOG 35〜55エマルションの2。準備

  1. MOの1:1の比率の200μLG 35〜55ペプチド溶液と、CFAは、各マウスに注入する必要があります。準備と注入しながら粘性エマルジョンの一部の損失がある。したがって、必要な量の1.5〜2倍を用意。 MOG 35〜55ペプチド溶液とCFAの両方の必要な金額の2によるエマルジ ​​ョン除算の総容量を計算します。
  2. 2 mg / mlの終濃度までのddH 2 O中で凍結乾燥したMOG 35-55を希釈する。私たちは通常、マウスあたり200μgのMOG 35〜55ペプチドを使用しています。この量は、ストック溶液100μlに含まれています。ペプチド溶液は-20℃で保存する必要があります
  3. 乳鉢に乾燥さ結核菌H37RA(100 mg)を1バイアルのコンテンツを配置。
    1. 薄い粉末を得、乳鉢と乳棒で粉砕した。
    2. 4℃で保存することができる10 mg / mlのCFAのストック溶液を得るために不完全フロイントアジュバントを10ml追加
    3. 予防接種の前に、CFAの原液ウィットを希釈2 mg / mlの最終濃度をH IFA。粒子状物質を再懸濁し、実験の準備中の粘性溶液の一部の体積損失を検討するために、各使用前に完全に混合する。
    4. 1ミリグラムの最終濃度個/ mlに達するまで、MOG 35-55ペプチド溶液と1:1で混合する。
      注意:熱殺菌結核菌は、自然免疫応答を刺激する。吸入、経口摂取、皮膚や目への接触を避ける。
  4. 氷上で予冷ソリューションを提供しています。
    1. 2 mg / mlのCFAおよび2 mg / mlの2 2ミリリットル注射器にMOG 35〜55の溶液の1ミリリットルの1ミリリットルを策定。免疫した動物の数に応じて必要な注射器の個数を計算する。
      注意:厳密には肉芽腫を引き起こしたり、自己免疫反応を誘発する可能性があるアジュバントの準備中にステッチを避ける。
    2. MOG 35〜55溶液と、CFAのための20のGカニューレ27のGカニューレを使用してください。気泡を回避し、時に両方の注射器を接続HREEウェイバルブ。
    3. 他に1シリンジからエマルジョンを送信し、優れた乳化は重要なステップであるように、少なくとも10分間完全に混合。乳化をサポートするために、3ウェイバルブを近閉じます。解決策は、相の分離なしに、白い硬い粘性である必要があります。
    4. エマルジョンは、免疫の前に数日間保存することができる。彼らは安定しているかどうかを観察するために乳剤を調製した後、少なくとも30分待ってください。予防接種の前に、2つのシリンジの1に溶液を描き、27 Gのカニューレを接続してください。

百日咳毒素の3。準備

  1. 百日咳毒素の異なる量は、投与経路( 例えば、静脈内または腹腔内)に依存文献に見出すことができる。当研究室では、2日後に免疫の日に腹腔内に200μlのPBSで百日咳毒素400ngのを使用しています。注意:百日咳毒素は、多くの生物学的効果を持っている。吸入、経口摂取、皮膚や目への接触を避ける。
  2. 100μg/ mlの保存溶液を500μlののddH 2 Oに百日咳毒素50μgのを再構成。 4℃で保存する
  3. PBSで1:50に希釈する。 200μlのは今のPBS 400 ngのが含まれています。注射器の必要量を用意し、それぞれの針ハブのための〜100μLの追加の過剰量を考慮してください。

4。動物免疫

  1. 必要な短期的な安楽死のための具体的な基準のための制度的動物管理使用委員会を参照してください。このようなケタミン/キシラジン注射またはhalothanなどの他のプロトコルも可能かもしれないが、我々の研究室では、イソフルランとの短い麻酔後を使用しています。麻酔を待って、麻酔のレベルを評価するために前足つま先のピンチを使用しています。
  2. 予防接種は、動物のためのストレスを最小限に抑えるために、最適な予防接種を確実にするために経験のある方が行っていることを確認してください。
  3. 抗100μlのを注入各後側腹部に2つの異なるサイトにGEN / CFAエマルジョン皮下。皮膚の下の球根質量フォームは実験を通して持続するべきであることを確認してください。
  4. intraperitonelly百日咳毒素の200μLを注入。
  5. 個々のマウスは簡単にテールベースにカラーマーキングするなど 、日々の評価のために識別することができることを確認します。
  6. 免疫後2日目の百日咳毒素の第二の用量を投与する。

5。EAEの監視

  1. 体重および臨床スコアが毎日評価する必要があります。 EAEの発症は、典型的には、疾患活動性の指標として使用することができる体重減少と相関する。制度上の動物の世話を参照して、個々のマウスは実験から取り出さなければならない場合の基準を事前に定義するための委員会を使用してください。体重減少が20初期体重の%以上際に重篤な臨床徴候は(EAE 7または悪化スコア)を超える場合に発生するときに考慮すべきである。再を参照してください許可された最大のスコアのためのそれぞれの制度的動物管理使用委員会のspectiveガイドライン。
  2. マウスがEAEの臨床症状を有する場合には、水ボトルがまだ到達することができ、その食品がケージの床に載置されることを保証することが重要である。
  3. 別のスコアリングの症状を使用することができる。私たちの研究室では、0〜10のスケールが設定される。
グレード 臨床症状 コメント
0 臨床徴候んマウスは尾の基部に保持されていれば定常歩容、尾部が移動して上げることができ、尾部は丸い物体を包み込む
1 部分的にぐったりテール通常の歩行、尾の先端が垂下
2 麻痺テール通常の歩行、尾の垂下
3 後肢の麻痺、非協調運動まとまりのない歩行、尾がリンプ、後肢をつまんへの対応
4 一つの後肢が麻痺 1後肢のドラッグと非協調歩行、尾がリンプ、1後肢ピンチに応答しません
5 両方の後肢が麻痺しドラッグ両方の後肢に非協調歩行、尾がリンプ、両方の後肢のピンチに応答しません。
6 後肢が麻痺し、前肢の弱点前肢と非協調歩行をつまん後に身体、前肢反射を引くのに苦労し、尾はリンプ
7 後肢は1前肢が麻痺し、麻痺しマウスは尾がリンプ、1前肢がつま先のピンチに応答し、移動することはできません
8 後肢の両方前肢が麻痺し、麻痺しマウスは尾がリンプ、両方の前肢はつま先のピンチに反応しない、移動することはできません
9 瀕死の動かない、変更された呼吸
10

表1。臨床スコアリングシステム。

Representative Results

免疫化後、マウス体重の変化および臨床症状について毎日評価されなければならない。疾患の発症は、通常、EAE症状が表示されている1〜2日前に開始可能性があり軽量化と相関している。 EAEの臨床症状は通常、一日9と14免疫後の間で始まる。病変は、主にC57BL / 6マウスにおけるMOG-EAEにおける脊髄に局在化されると、それらは、典型的には、吻側尾側のパターンで主に運動の症状を発症する。 EAE症状(スコア6)で免疫したマウスの代表的な画像が図1Aに示されている。いくつかの非定型EAE症状はまた、 表1に示した古典のEAEスコアの中に反映されていない軸回転可能に転がり、猫背の外観や過敏症などの発生する可能性がある運動症状がこのモデルの主な特徴であるように、このスコアは私たちを与えるん疾患の重症度を示す目安。異なる監視システム( 例えばスコア0 -別の赤字を評価する5または0-6)、より複雑な複合スコアも発表されている。それぞれの制度的動物管理使用委員会によると、実験から取り出されなければならない重篤な症状で、そのマウスに注意してください。マウスは、次の10〜20日以上の症状の一般部分的な回復を示しています。代表的な疾患経過は、 図1Bに示されている。結果パラメータを評価するために重要であるEAEの間の異なる時点がある。頻繁に見つけることができるいくつかの典型的なアッセイは、非常に簡単に説明する。疾患最大で、マウスは、in vitroでの MOG 35-55ペプチド(MOGリコールアッセイ)を用いて単離された免疫細胞の再刺激後のサイトカイン産生または増殖を評価することができる。免疫細胞はまた、EAEの症状を有するマウスからの脳及び脊髄から単離され、さらに処 ​​理され、フローサイトメトリーにより、例えばすることができる。脊髄切片の組織学的分析は、疾患mで行うことができる病変の負荷と脱髄のためaximum、後で神経変性および神経細胞死のためのマーカーを指している間は、対象となる可能性があります。

図1
図1。代表EAE結果。 30日間の免疫後のEAE症状を免疫したC57BL / 6マウスのA.代表画像(EAEが6得点)。B.代表の疾患経過。データは、平均値と平均値の標準誤差として示されている(N = 5)。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

Discussion

能動免疫プロトコルと異なるEAEモデルの多数は、過去数十年にわたって説明してきた。ラットモデルが広く、最近まで使用されてきたが、マウスは現在、EAE研究のための最も人気のあるモデル生物である。この開発は、利用可能なトランスジェニックマウスの広範かつ増え続けるレパートリーにとりわけある。 MOG 35-55ペプチドを用いたC57BL / 6マウスの免疫化は、最も広く分布EAEモデルの一つであり、信頼性の高い複製可能かつ十分に使い動物モデルとして考えることができる。他のEAEモデルは、より具体的な実験の質問のために使用されているが、多くの神経免疫学研究室では、MOG 35〜55誘発性EAEは、選択したモデルとして確立されている。

考慮すべき重要な点は、EAE実験は方法論的に正しいが行われていることを確認するための実験設定を計画しています。内部妥当性については、疾患症状の盲目採点を強くお勧めします。 Experimentalグループがあるべき年齢に、体重、および性別をマッチさせたマウスを無作為に処置群に割り当てる必要があります。実験は、常に動物福祉の規制を遵守して実施されるべきである。 EAEの研究は、多くの場合、パワー不足であると考慮した統計タイプIIのエラーを取るこ​​とはありません。したがって、実験前に、サンプルサイズの計算は行われるべきである。必要なグループサイズは、予想される効果の大きさに依存します。統計分析のための専門家の相談は、EAE実験を開始する前に考慮されるかもしれません。

プロトコルのいくつかの制限を念頭に置いておく必要がある。最も重要なことは、aEAEデータの解釈は、アジュバントおよび免疫学的反応の両方に付加的な影響を有する百日咳毒素を用いて免疫化モードによって損なわれる。また、MOG 35-55 EAEモデルは、CD4 + T細胞は免疫応答を駆動し、主に示すことを考慮すべきである。 CD8 + T細胞およびB細胞がプレーこれらの細胞型に対処する際にあまり顕著な役割や代替プロトコルが考慮されるべきである。予想される疾患経過は、急性単相および自己限定です。あるいは、再発寛解型疾​​患経過は、また別のEAEモデルにおいて達成することができる。プロトコルの追加の重要な制限は、MSの病態生理の免疫学的構成要素に向けて一定のバイアスである。最後の年の間に、MSは、強力な神経変性成分を有していることが次第に明らかになってきた。オリゴデンドロサイトとニューロンの死は神経障害の進行性の蓄積になる。これは、EAEモデルは、自己免疫性炎症の神経変性メカニズムに関する実験質問への回答が、完全に適していないかもしれないことを考慮に入れなければならない。中枢神経系の病理学を中心とした代替動物モデルが考えられるかもしれない-末梢免疫系の関与なしに有毒な脱髄を損なうキュプリゾンモデルEG。

記載されたプロトコルは、基本的な神経免疫実験モデルとして考えること及び他の用途のために修飾することができる。上述の実験手順を容易に、例えば 、治療を評価するために特に適している再発寛解型EAEの疾患経過のためのPLP 139-151ペプチドおよびSJLマウスを使用して(タンパク質のマウス系統または種類および量を変えることによって、他のEAEプロトコルに適用することができる再発への影響)。記載されたプロトコルはまた、養子移入実験(パッシブEAE)のために使用することができる。上述したように、このモデルでは、C57BL / 6マウスを、MOG 35-55ペプチドおよびCFAで免疫化する。対照的に、百日咳毒素は不要である。 7-15日後、脾臓またはリンパ節を単離し、免疫細胞を、MOG 35-55ペプチドおよびC57BL/6seマウスの新しいグループに移す前に、種々のサイトカインを用いてインビトロで再刺激されている。これらのレシピエントマウスは、数日前にCLAS時よりもEAEを開発sical予防接種。 インビトロ条件下で特異的な免疫学的な質問のために変化させることができる( 例えば 、偏光T H 1またはT H 17細胞へ)。

時々、低い疾病の発生または弱い症状が実験的挑戦であるかもしれません。トラブルシューティングのためのいくつかの推奨事項は次のとおりです。

- 疾患の重症度は、ペプチド/マウスの異なる量を変化させることができる。

- 最適なCFAの濃度は1〜5 mg / mlのとは異なる場合があります。実験を確立するときに、CFAの滴定を考えてみましょう。できるだけ多くの規制は2 mg / mlのを超えて、CFAの濃度を禁止許可CFA濃度について、それぞれの施設内動物のケアと使用委員会のそれぞれのガイドラインを参照してください。

- 種々の方法は、エマルジョンを調製するために記載されている。貧しい乳化possibとして考えた場合、例えば、1時間または超音波処理のためのボルテックスのような別の方法が考えられるかもしれないル·エラーソース。

- 年齢、性別、年の季節や動物施設内の環境条件は、EAE感受性に影響を与える重要な要因である。これは、条件が独立した実験間で同等であることを確実にすべきである。

上述したように、上記プロトコルは、養子EAE実験のための出発点として使用することができる。このモデルは、(野生型レシピエントマウスに脳炎ノックアウト細胞を転送することによって)、遺伝的表現型の末梢およびCNS効果を分離するための転写および細胞の表現型などの特定の免疫学的な質問のために特に適している十分に特徴づけることができる。最後の年の間に、EAE研究の最新の開発は、T細胞受容体トランスジェニックマウスである。これらのマウスは、アジュバント接種の問題を回避し、外部の影響を受けることなく自然にEAE症状を開発しています。しかし、このモデルはbreediのために動物を大量に必要とする十分なグループサイズを確保することngの。ノックアウトマウスの評価は前aEAEとは対照的に、EAE実験に交配を必要とします。各マウスが別の日に病気の症状が発展するにつれ、新規物質の評価はかなり複雑になる可能性があります。そのため、神経免疫ための古典aEAEの値は比類のないままになります。

Disclosures

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

Acknowledgments

この作品は、臨床研究のための学際センター(IZKF)ミュンスター(シード3月12日、SB)によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

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References

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ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;)C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)誘発
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Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).More

Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

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