Summary
この記事では、構造化照明顕微鏡（SIM）を使用してインビトロで海馬ニューロンからイメージ樹状突起棘にワーキングプロトコルについて説明します。 SIMを使用して超解像顕微鏡法は、改善されたディテール個体樹状突起棘の画像化を可能にする、有意にすべての3つの空間次元における光の回折限界を超えて画像解像度を提供する。
Abstract
樹状突起棘は、ニューロンの樹状突起から出た突起であり、脳内の興奮性の入力の主要なシナプス後目標を表すものです。技術の進歩は、ニューロンの接続性とシナプス可塑性において重要な要素として、これらの構造を同定した。光学顕微鏡を用いてスパイン形態の定量分析は、光の固有屈折限界に関連する技術的制限による本質的な問題のまま。樹状突起棘は、容易に共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡により同定することができる。長さ以外の脊椎寸法は、通常、200nmの光学顕微鏡法の理論的な解像限界により固定され、従来の光学分解能よりも小さいので、棘の形状及び大きさの微妙な変化を測定することは困難である。
いくつかの最近開発された超解像技術は、樹状突起棘を含む200nmよりも小さい画像の細胞構造に使用されてきた。 Tヘセ技術は、古典的なファーフィールドの動作に基づいており、したがって、既存の試料調製方法の使用を可能にし、試料の表面を越えて画像にしている。ここで説明するには、初代海馬ニューロン培養中の樹状突起棘の画像に超解像構造化照明顕微鏡（SIM）を適用するための作業プロトコルです。 SIMの可能なアプリケーションでは、共焦点顕微鏡のものと重複する。しかし、2つの技術が異なる適用可能性を提示する。共焦点顕微鏡は、物理的なピンホールの使用にフォーカス光のうちの除去を犠牲にして高解像度化を実現しながら、SIMは、より高い実効横方向の解像度を提供しています。このプロトコルでは、一次ニューロンは、DNAプラスミドは、蛍光タンパク質をコードし、SIMを使用して撮像をトランスフェクトした標準プロトコルを使用して、ガラスカバースリップ上で培養される。樹状突起棘の際に、in vitroで 16〜17日後に画像化されているため、ここに記載さ全体プロトコルは、約2週間かかります樹状開発が最適である。プロトコルの完了後に、樹状突起棘は、特殊なソフトウェアを使用してSIM画像スタックの一連の3Dで再構成することができる。
Introduction
樹状突起棘は、ニューロン膜の小さな突起である。この特徴的な構造は、典型的には、単一のシナプスからの入力を受信するように特化され、2つのニューロン間の物理的接触面積を表している。最も機能的に成熟した樹状突起棘は、球状チップで構成されて頭と呼ばれ、樹状シャフトにヘッドを接続している細い首。しかし、棘は静的ではなく、積極的に移動しても、成人の脳2で連続的にその形態を変更してください。時間の2週間の期間内に、後半胚または出生後早期の時間に由来したラット初代海馬ニューロン培養は、背骨状の構造3への早期糸状仮足から進化し、多数の膜突起を持つ複雑な樹状アーバーを開発しています。この動的挙動および他の特性に基づいて、樹状突起棘は、メモリ記憶およびシナプス伝達のために、4,5の解剖学的基質を提供すると考えられている。
目の与えられた樹状突起棘の大きさと形状がシナプス機能で、それは正確に寸法を測定することが重要ですしていることをE重要な役割。棘は、長さが約200〜2000ナノメートルまで変化と容易に共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡により同定することができる。しかし、長さ以外の脊椎の寸法は、理論的には200ナノメートル6周りの回折によって固定され、通常は従来の光学システム「解像度を下回っている。これらの解決の力は、脊椎のネックとヘッドの幅など細かい詳細を画像化するには不十分である。多くの研究は、この問題を解決するために専用されており、多くの比較的新しい超解像顕微鏡技術は、実質的な進歩を提供した。特に、広視野、非共焦点顕微鏡7-10に横方向に構造化照明顕微鏡（SIM）を使用して任意の発光光を廃棄することなく、古典的な限界を超えた分解能を達成することができる。非リネアと組み合わせてこの技術を用いてr個の顕微鏡技術は、無制限の因子11によって光学顕微鏡の方位分解能を向上させることが理論的に可能である。しかし、ほとんどの実験状況で、SIMは2 1倍に解像限界を超えることができます。このような誘導放出の枯渇（STED）顕微鏡12と光活性化局在化顕微鏡法（PALM）12のような他の超解像光学顕微鏡技術は、樹状突起棘の撮像に適用されている。例えば、PALM等の局在に基づく方法は、超解像を達成するために、原画像の非常に多数を必要とするので、速度が制限される。一方、STEDは、高い画像形成速度を達成することができ、比較的低い光子カウントとSIM 13には当てはまらないかもしれない視野の小さな分野、ではあるが。
この記事では目的は、 試験管内で培養したラット初代海馬ニューロンからの画像樹状突起棘に努めプロトコルを提供するものである
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Protocol
動物に関わる全ての実験手順は、動物の苦痛を軽減するために最適化され、動物実験、アムステルダム大学、12月プロトコル番号のDED204とDED250のために委員会によって承認された。
1。カバースリップの準備
- それらは、12ウェルプレートのウェルに収まるように、炭化物又はダイヤモンドスクライブを用い×15mmの15mmの大きさにカバースリップを減らす。
- ドラフト内で作業しながら、完全にガラス容器に濃硝酸溶液（70％重量/重量）中でカバースリップを沈めることによってコーティングカバースリップを開始します。均一な分布のブレを確実にするためには、4時間の最小インキュベートする。約2回濃硝酸溶液を再利用することが可能であるが、露光により色を失うことができる。
- 濃硝酸溶液を除去し、30分間蒸留水中にカバースリップを4回洗浄し、各洗浄後に慎重に振盪。
- 慎重に取り外し水。
注：次の3つのステップは、無菌層流キャビネット内で行われる。 - 96パーセントエタノールでカバースリップを浸す。エタノール溶液からカバースリップを削除し、それらを乾燥させます。
- カバースリップを火炎とガラス容器に入れて。カバースリップ（例えばデュモンスタイル第5号の鉗子）を処理するために、細かい鉗子を使用してください。
- 180℃で12〜16時間のための乾熱オーブンでアルミ箔と焼くと、コンテナをカバーしっかりと覆われた場合は焼いたカバースリップは、最大1ヶ月間室温で保存することができる。
2。カバースリップコーティング
カバースリップコーティング手順は、ガラス表面への付着およびニューロンの樹状樹枝状分岐14を支持する 。
- 無菌層のフードでは、12ウェルプレートの単一ウェル中で個々のカバースリップを配置するために、無菌の小さな鉗子を使用しています。
- ポリ-L-リジン溶液（またはカバースリップを沈めるのに十分な量）を500μlを加える。
- ラップT彼は蒸発を防止し、室温で一晩それを残すためにアルミ箔でプレート。
- 培養を開始する前に、注意深く無菌層流フード内で、ポリ-L-リジン溶液を吸引する。
- 乾かすためにそれらを防止しながら、二回滅菌水1mlで各ウェルを洗ってください。
- 吸引除去水が完全に、メッキ培地1mlを加え、細胞をめっきする準備ができるまで、組織培養インキュベーター中でカバースリップしておきます。それは、24時間以内に細胞をめっきすることをお勧めします。
E16-E19ラット胚からの脳の3。取り外し
- 一晩乾燥滅菌器中で加熱または70％エタノールでそれらを洗浄することにより、手術器具を滅菌する。エタノールを使用する場合は完全に乾燥。
- 1X HBSS緩衝液を用いて数30ミリメートルの料理を準備し、氷の上に保管してください。
- （±0.4ミリリットルの容量で160 mg / kgのEuthasol）Euthasolの腹腔内注射でラットのダムを安楽死させる。
- 反射神経がないことを確認してください。
- 70％エタノールでダムの腹部にスプレー。
- 腹部に沿って切開すると子宮を取り除く。
- 子宮から胚を取り出して、直径100mmのペトリ皿に入れます。
- 大はさみで胚の頭部を取り外し、冷たい1×HBSS緩衝液を含む新しいペトリ皿に頭を置く。
注意：ここでの手順は、層流キャビネット中無菌条件下で行われる7.1に移行する。 - 大きなピンセットで側面に沿ってヘッドを押したままにします。
- 小さなハサミで、頭の上に皮膚中の矢状カットを行い、その後、横方向に大きな鉗子で皮膚を下に引き剥がす。
- 頭蓋骨を除去するためのステップ3.10と同じ方法を使用します。尾方端から始まる矢状切断を行う。穏やかに脳組織を損傷することなく、頭蓋骨を開いた。離れて横方向に脳が露出頭蓋骨の両半分を折る。
- 鈍いスパチュラで、脳をかき出すと新鮮な冷たい1X HBSSに入れてください。 海馬の4。解剖
- 細かいハサミで小脳を除去して廃棄します。
- 線に沿って矢状カットを行うことで、脳の二つの半球を分離する。
- 各半球を取り、新鮮な冷たい1X HBSSを含む新しい30ミリメートル皿に両方を置く。
- 側頭葉を皿の底に対向するように各半球を置きます。
注：ここでのことから、解剖顕微鏡を使用することをお勧めします。 - そっと小さなピンセットを用いて脳を保持し、鉗子の別のペアと中脳を削除します。皮質および海馬を含む完全な半球の残りの部分を残して。
- 海馬は今皿の底を向くように、組織を裏返します。
- そっとPに半球を開催細かいピンセットでレース。別の細かい鉗子を使用して、慎重に、ゆっくりと髄膜を除去します。それは、嗅球から開始する方が簡単です。海馬を損傷しないように十分に注意してください。
- 海馬は今まで直面しているように、組織を向けます。海馬は現在、その特徴的なC字型の構造で見ることができます。
- 微細鉗子を用いて、海馬を解剖する。新鮮な冷たい1X HBSSを含む新しい30ミリメートル皿にそれを収集します。
- 小片にそれらを切断して、海馬の総数をカウントします。
- 3ミリリットル1X HBSSを含む15ミリリットルの遠心管にピースを集める。
- 5分間300×gで遠心分離し、上清を注意深く除去します。
- 海馬あたり6μlのトリプシンを追加します。
- 37℃で最大20分間インキュベートする3分後に渦巻く。
- 新鮮な冷たい1X HBSS 5mlで2回洗浄し、上清を捨てる。
- セコの後ND 37℃に予め温め、中のめっき1.5ミリリットルを加え、洗浄プレーティング培地中の血清はトリプシン活性を不活性化する。
- 組織のすべての部分が均一に単一細胞に分散されるまで、ゆっくりと火造りパスツールピペットで30Xを粉砕する。任意の泡立ちを避けてください。
- 37℃に予め温めメディアメッキの5ミリリットルを追加します。
- トリパンブルー生体染色を用いて細胞を数える。
- セクション2（全体積2ml）中で調製培地めっき1ml中、12ウェルプレートのウェルあたり50,000個の細胞を播種する。
- 優しく均等に細胞を分散させるプレートを揺する。
- 37℃でインキュベートし、5％CO 2。 2-3日後、10μMFUDRを含む培養培地でプレーティング培地の半分（0.5ml）に置き換える。
注：樹状突起棘イメージングは16〜17日、めっき後に実施される（in vitroで 16〜17日間、DIV）。 - GFP及びインキュベーション培地（グルタ100μlの神経基本培地10ml）を発現するプラスミドDNAを準備します。
- 37℃に予熱暖かいインキュベーション培地
- DNA混合物（管A）を準備します。各カバースリップのためにプレーンな神経基本培地100μlに1μgのDNAを追加します。穏やかに混合する。
- リポフェクタミンミックス（チューブB）を準備します。各カバースリップのためにプレーンな神経基本培地100μlで2μLリポフェクタミンを追加。穏やかに混合する。
- DNA混合物に滴下してリポフェクタミンミックスを追加します。
- 室温で30分間、層流フード内でインキュベートする。
- 1をめっきする予め温めインキュベーション培地の1ミリリットルを追加します。
- 37℃、5％CO 2で5分間店舗プレート2。
- 穏やかにDNA /リポフェクトアミンを200μlを各ウェルに混合し、37℃、5％CO 2で45分間インキュベート滴下する。
- 小さな鉗子の使用とcoversliを持ち上げるPSニューロンを含む、新鮮な暖かい神経基本培地を含む3センチメートル皿にそれらを浸漬することにより、それらをすすぎ、2プレートに移動します。
- 48時間37℃、5％CO 2でトランスフェクトされたニューロンをインキュベートする。
- トランスフェクション効率のためのトランスフェクション後24時間を確認してください。
- 4％PFAおよび0.05のMのTBSを準備します。
- 37℃に4％PFA液を温める
- 優しくカバースリップを含むウェルから培地を吸引除去する。
- 樹状突起の損傷を防ぐために慎重に暖かく、4％PFAを500μlを追加します。
- 15分間室温でインキュベートする。
- 1X HBSSで5分間3回洗浄する。
注：この時点で、サンプルを4℃で3週間まで保存することができまたは免疫染色を直ちに開始することができる。 - サンプルが格納されている場合は、5分間、0.05 M TBSで3回洗浄する。
- 室温で30分間TBS-BSA（1％）溶液でブロックする。
- 5分間0.05MのTBSで3回洗浄する。
- インキュベーションミックスで希釈した一次抗体を加える。
- 室温で1時間プレートをインキュベート。
- 穏やかに振盪しながら4℃で一晩、さらに、インキュベートする。
- 一次抗体を除去する。
- 5分間、0.05MのTBS 3Xで洗浄する。
注：この時点から、光から保護してカバースリップを保つ。 - インキュベーションミックスに希釈した二次蛍光標識抗体を加える。
- 2時間室温でインキュベートする。
- 二次抗体を除去する。
- 5分間0.05MのTBSで3回洗浄する。
- 1X結核で5分間2回洗浄する。
- 井戸からカバースリップを削除するには細かいピンセットを使用してください。
- 組織と結核の余分を乾燥させ、COVをマウント封入剤を使用してerslips。
- 封入剤の蒸発を防ぐためにマニキュアで密封する。
- 488 nmのレーザー、水銀ランプ、ステージコントローラ、ピエゾコントローラ、透過光用のハロゲンランプとPCの電源を入れ、「アンドール、N-SIMの "モードでSIMソフトウェアを起動してください。
- 100X TIRFオブジェクトをきれいに95％エタノールで3回IVEは、石油エーテルで必要に応じ。
- 次のフィルタ設定を使用します。520 LP 488ダイクロイッて。
- 客観的にイマージョンオイルの滴を入れてください。油滴には気泡がないことを確認してください。油がサンプルに接触するまで上方向に目標を移動します。
注：周囲の光からサンプルを保護し、可能な限り室内の照明を暗くするためにカバーのステージ上で行わ。 - PSFの最良の対称性を得るために、37℃、200μmの目的の補正環を設定します。正しいカラーの位置、最初の位置に最適な公称位置での目的のリングを設定してから、100 nmのビーズサンプルをチェックするために。最高のPSFの対称性に応じて、若干の公称1の周りの襟の位置を変更する。
- 照明用、3D-SIMの格子（3次元1layer 100X/1.49すべての波長）を使用します。 1で、SIMの照明に格子整合の場所選択した格子ブロックを開始するには00Xの場所で1.49客観。視野（FOV）の分野のために10月15日ビーズを単離することを許可することができます濃度は、メディアに搭載された100 nmのビーズサンプルを使用しています。目的の位置に目的補正環を設定した後、3D-SIMの照明を選択して、ソフトウェア·ガイド付き位置合わせ手順を開始します。それは、X（1方向）×（100 Zプレーン）がビーズでFOVを再構築する元となる画像を、（5段階）を実行します。ピンボケぼやけ光を含む全体のビーズをカバーし、適切な投資収益率を経由して単一のビーズを選択した後、ソフトウェアはフィッティング自動PSFを開始し、それが結果に応じて格子位置を調整します。
- 顕微鏡の性能をチェックするには、ため、テーブルの動きおよび/または温度ドリフトに起因する可能性のずれ、2週間ごとに格子整合を繰り返します。さらに、また、製造者の指示に従って、レーザ強度と安定性を確認してください。
- 95％のETHで試料表面をきれいに3回ジメタノール。
メモ：次の手順は、コントロールパネルとSIMソフトウェア内の正しい設定の概要については図3を参照してください。 - SIMソフトウェアでは、光学構成瞳のFITCを選択して、白色光で目視検査のためにタレット1に空のフィルタ·ブロックを選択します。
- 「ファイン」にフォーカス速度とXYテーブルの移動速度を設定します。
- シャッターを開け、すぐにサンプルに焦点を当てています。
- もう一度シャッターを閉じて、ゼロにZ座標セット。
- 緑のチャネルを使用して目視検査のためにタレット1の緑色のフィルタを選択します。
- 最低の設定に水銀ランプの強度を設定します。
- 目的は、シール材に接触していないことを確認しながら、慎重にサンプルの境界線に移動します。
- シャッターを開け、すぐに可能な限り低い強度を有するサンプルをスキャン。
- 興味のある十分に明るいデンドライトが発生して、対象となるセグメントを中心とした際に視野内、シャッターを閉じます。
- 、EMモードを読み出す1 MHzの16ビットを得る、露光時間100ミリ秒、レーザパワーの5％とEM 200を得るために光学構成3D-SIM 488およびカメラの設定にソフトウェアを設定する。
注：第2刃物台に緑色のフィルタが選択されていることを確認し、タレット1が空であること。 - 格子は「移動」に設定されていることを確認して、レーザ光を、カメラを通してサンプルを表示するには、ライブをクリックします。
- ルックアップテーブルをアクティブにします。
- 必要に応じて、関心のある対象を中央エキストラファインに設定フォーカス速度と焦点を当てています。
NOTE：EMが1MHz 16ビット利得読み出しモードでは、良好なSIM画像に対するターゲット強度は30,000-45,000の間である。 - すぐにEMが1 MHzの16ビットを得る読み出しモードで30,000-45,000の間の強度の値を取得するには、カメラの設定を調整します。最初に使用します。
- レーザーパワー：0％ - 20％（上記のように調製した試料を用いて、5％または2.6ミリワットで十分）
- 露出時間：50ミリ秒、2秒
- 読み出しモード：EMが1 MHzの16ビットを得る
- EMゲイン：0〜300
- 変換利得：1X - 5.1倍
- ライブのための形式：いいえビニング
- キャプチャするためのフォーマット：いいえビニング
注：これらの設定を使用して1.3％の漂白±6.3％が日常的に大幅な画質15に影響を与える可能性が許容できる最大の漂白、10％の限度内で、達成される。
- ライブビューをオフにするには、[停止]をクリックします。
- へのNDシーケンスパネルで3DのZスタックの設定を行います。
- 範囲：2ミクロン
- セット·サイズ：120 nmの
- Z平面
- ホームポジションをクリックします
- ラムダ項に光学構成3D-SIMの488を選択
- N-SIMのパッドでの取得モードとして3D-SIMを選択します。
- NDシーケンスの取得を実行し、生データを保存します。
- 再び光学構成瞳のFITCを選択して、サンプル全体が画像化されるまでのステップ8.15から8.27を繰り返します
- 3D画像再構成：ステップ8.23で取得したデータがどちらかすぐにまたは後で再構築することができる。再構築スライスのデフォルトの再設定や再構築スタックモードでのZスタックを再構築することから始め、必要に応じて調整してください。
注：最良の結果を得るためには、Zスタックが示されたステップサイズでなされるべきであると再構築スタックモードで再構成。常に生データまたは、好ましくは、広視野画像と比較することによって、再構成画像の妥当性を確認する。再構成処理のために調整することができるパラメータは、コントラスト及び高周波数雑音抑圧である。それらの両方は、異なる生画像特性は再構成プロセス中に考慮されている方法に影響を与える。低い変調深度生データの場合には、コントラストパラメータが重要な役割を果たしている。ユーザは、低い信号対雑音比を有するデータセットを有する場合、高周波ノイズ抑制パラメータが再構成品質に影響を与えることができ、それverely。 - 完成し、中央のXYステージでの撮像と全押しその静止位置に目標を移動すると。
- サンプルをアンマウントし、95％エタノールを含むサンプルと客観の両方を清掃してください。
- ソフトウェアとPCをシャットダウンして、他のすべてのデバイスをオフにします。
- NeuronStudioソフトウェアを使用して前に説明したように取得された画像の3次元再構成および脊椎分類は、TIFFファイルに変換した後に行うことができる16（ 図4参照）。
- NeuronStudiosソフトウェアの復興のために次のパラメータを使用します。
- ボリューム：ボクセルの寸法：X：0.03ミクロン; Y：0.03ミクロン; Z：0.120以下である。
- デンドライト検出：比添付：1.3;最小の長さ：5ミクロン;離散比：1;接合部を再編成する：はい。
- 背骨検出：最小の高さ：0.2ミクロン;最大の高さ：5.001ミクロン;最大幅：3ミクロン;最小ずんぐりサイズ：10ボクセル;最小非準スタブサイズ：5 VOXELS。
- 背骨の分類器：首比（頭頸部比）：1.1;薄い比：2.5;キノコサイズ：0.35ミクロン;
- 神経突起の頂点の形状：：レンダリングに使用NeuronStudioパラメータ固体日食。神経突起頂点カラー：タイプ別;神経突起エッジ形状：ライン;神経突起エッジの色：単一色;図形をスパイン：固体日食;背骨の色：タイプ別。
注：3D再構成は、ボリュームレンダリング設定することも可能であるした後。デフォルトのしきい値は、アクティブ 'を再生成ボリュームレンダリング」オプションを使用して20に設定した。不透明度がチェック '自動輝度」で設定された。 「表面のみ」と「使用ポイントプリレンダリング」オプションもアクティブになっていた
これは、切開は、細胞生存率を確実にするために無菌条件下でできるだけ迅速に行われることが非常に重要である。氷の上に冷たいのサンプルを保管してください。
5。細胞解離とめっき
リポフェクタミンを使用して6。ラット海馬初代神経細胞トランスフェクション
ラット海馬初代神経細胞の7。免疫染色および取り付け
トランスフェクトされた細胞の蛍光強度を向上させるために、トランスフェクション後48時間GFPの検出を増強するために免疫染色プロトコルを実行する。
構造照明顕微鏡を用いて8。樹状突起棘イメージング
に比べて解像度が2倍の改善の因子を提供する250nmで、 - 資料に記載SIMシステムを用いて樹状突起棘イメージングは横方向分解能は約85〜110ナノメートルの（XY）の値と200の間の軸方向（Z）解像度値を有する広視野顕微鏡。
注：SIMを使用して、樹状突起棘イメージングは2日ステップ7.22の後に通常行われますが、サンプルは暗闇の中で、および22の制御された温度下で保持している場合は、最大3週間後に行うことができる - 23℃
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Representative Results
ここで説明するには、SIMを使用して、in vitroでラット初代海馬ニューロンからの樹状突起棘を画像化するための標準化された作業用のプロトコルです。プロトコルのワークフローとその重要なステップは、 図1に示されている。全体的に、プロトコルは、培養、開発およびラット初代海馬ニューロン及び免疫組織化学のトランスフェクションを含む、試料調製の第一段階で分離した実験研究の約2週間かかり、および第2の相標本撮像のSIMを使用する。ニューロンは、多数の樹状突起棘の3,5ベアリング複雑な樹状アーバーを開発したとき、ラット初代海馬ニューロンは、2週間培養開始後約固定されている。セクション1-8に詳細に記載されているプロトコルを用いて、超解像で系統的に樹状突起棘に可能である。 16前に記載されている共焦点蛍光顕微鏡を用いた従来の樹状突起棘撮像方法と比較して、17、SIMを使用して、本明細書に記載されているプロトコルは、初期の糸状仮足から背骨のような構造に至るまで神経細胞膜突起の識別と分類を可能に有意に優れ、画像の解像度と3D再構成が用意されています。
図1。スキームは、プロトコルのワークフロー、その手順とタイミングを示しています。
図2共焦点（A）及びSIM顕微鏡（B）を用いて画像化樹状突起と樹状突起棘の代表的な顕微鏡写真。第8章で説明したように、代表のSIM顕微鏡写真を取得した、代表的な共焦点顕微鏡写真をUを買収した30μmのレーザーパワー2.6 MW、アベレージングなし：物理的なピンホールサイズを歌う。収集は16以前説明したようにNeuronStudioソフトウェアを用いた共焦点画像とSIM（C及びDのそれぞれ）から再構成した。このような首の長さ、ネック径と頭部径などの主要なパラメータを調整した後、樹状突起がトレースされ、棘は、ソフトウェアを使用して自動的に分類された。囲み領域は、得られた3次元再構成の分解能と精度の違いを示す、共焦点（A）及びSIM（B）およびそれらの対応するZスタック（CおよびD）からの再構成で画像化つの個別樹状突起棘を示す。 SIMのより高い解像度に応じて、ヘッド（E）と首の両方の定量分析は、（F）の直径は、SIMは、樹状突起棘形態の小さな変化を検出することが可能であることを示す、同じ樹状突起棘のためにSIM小節共焦点顕微鏡法よりもかなり小さい寸法をことを明らかにする。 D EおよびFでアタは、基準共焦点測定値に正規化される。結果は、共焦点顕微鏡とSIMモードの両方で画像化5樹状セグメントから抽出された3樹状突起棘の平均±SDとして提示されている。ネック径のために、共焦点（100.0±4.296正規化された単位）とSIM（50.61±7.642正規化された単位）の間に有意差（** P = 0.0049）があった画像は、学生のt検定（E）でテストされた。ヘッド径のために、共焦点（100.0±6.255正規化された単位）とSIM（58.12±9.451正規化された単位）の間に有意差（* P = 0.0209）があった画像は、学生のt検定でテストした。
図3。スクリーンショットは、このプロトコルの設定を参考にして、ニコンのNISの要素6.14 SIMソフトウェアパッケージから。
図4。デンドライトの代表画像のNeuronStudio 3Dのスクリーンショット復興と脊椎分類ソフトウェア。
試薬の表1。一覧。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、SIMを使用して、in vitroで培養したラット初代海馬ニューロンからの画像樹状突起棘の作業プロトコルが記述されている。初代海馬神経細胞培養法は、Kaechとバンカー18で説明した独自の方法を最適化したものです。主な違いは、をNeurobasal/B27培養アストログリア細胞フィーダー培養の必要性を排除する媒体、およびグリア細胞の増殖を抑制しつつ、ブリューワーら 19によって記載されるように、ニューロンの生存を促進し、3日目、有糸分裂阻害剤FUDRの添加の使用である。
プロトコルには多くの重要なステップがあります。細胞をめっきするために使用されるカバーガラスの厚さは、正確なSIM実験のために重要である。カバースリップの準備と塗布時の無菌性は重要です。ポリ-L-リシンで処理したカバースリップが2.3と2.4の間に乾燥させてはいけない。ステップ5.8で使用される難研磨ピペットの直径が非常に重要です。あまりにも細い先端は後の段階での低細胞の生存率になります。可能な限り迅速に海馬の単離は、高細胞生存性を確保する。インキュベーションのタイミングおよびトリプシン濃度が高い細胞生存率を確保するために重要である。トリプシン酵素活性の損失も細胞生存率に影響を及ぼし得る。最後に、ステップ5.14においてFUDRの追加は、ニューロンの生存を促進し、グリア増殖を抑制することが重要です。
厳密にここに説明されたプロトコルであり、容易にそれらの形態学的特徴に応じた樹状突起棘を分析し、分類するために3Dで再構築することができる超解像画像の取得結果に続いて実行するときのサンプル画像化フェーズは単純です。図2に示すように、SIMモードで取得された画像の品質は、同じ顕微鏡の共焦点モードを用いて取得された全く同じ樹状セグメントおよび個々の棘の画像よりも実質的に良好である。この結果は、股関節を示唆しているTのSIMを使用すると、 図2Eと2Fに定量化さ樹状突起スパイン形態の微妙な変化、より多くの画像をする絶好の機会を提供することができます。
これまでのところ、ほとんどが（蛍光）広視野顕微鏡法は、その低毒性のために、生きた細胞の画像に使用されている。同様に、その低光毒性効果と従来の（遺伝）fluophoresとの良好な組み合わせに、SIMが可能と生細胞イメージングと超解像で発現細胞の低fluophoreにおける樹状突起棘の同定。このようなSTEDやPalmなどの他の超解像顕微鏡法と比較して、SIMは、in vitroでラット初代海馬ニューロンからの樹状突起棘のイメージングのための迅速かつ手頃な方法を提供する。実際には、SIMのみを従来の共焦点顕微鏡に比べて2倍の解像度を増大させるが。
SIMの制限の一例は、蛍光に依存していることであるいくつかの実験的なセットアップは、適用が困難であることができる。このために、例えば電子顕微鏡などの蛍光に依存しない顕微鏡技術は、可能な解決策を提供することができる。それにもかかわらず、特に電子顕微鏡法は面倒で高価で遅い方法である。また、電子顕微鏡法は、固定したサンプルで行うことができる。したがって、SIMは、生細胞の超解像画像化に適している。蛍光タンパク質をコードするプラスミドトランスフェクションを適用するための理論的根拠は、異なる細胞からの樹状突起の重なりおよび個々の樹状突起棘の識別を防止する、単離された細胞の希少、まだ再現可能な細胞標識化をもたらすことである。免疫染色を用いたトランスフェクションの組み合わせは、蛍光17を増強することが以前に示されている。それにもかかわらず、他の蛍光技術もSIMと樹状突起棘の撮像に適用可能とすることができ、例えば、十分な蛍光染色は最近、脱を用いて取得することができる手順を守っアクチン結合プローブ20。
最近の技術の発展は、高速構造化照明顕微鏡は11ヘルツ13は、本明細書に記載されたプロトコルの非常に論理的な将来のアプリケーションまでのフレームレートで100 nmの解像度が可能であることを実証する、動的セルイメージングSIMの適用を可能にしたので、タイムラプスライブラット初代海馬ニューロンのSIMと樹状突起棘形態の速いダイナミックな変化の分析への応用可能性があります。このアプリケーションの次の課題は、ライブ顕微鏡の長い時間間隔に関連する見積累積光毒性である可能性があります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、CPFに科学研究費オランダ機構（NWO）からビディ承認番号H64.09.016によって賄われた。 CPFは、最終原稿の彼女の批判的コメントと修正のための博士SilvinaさんA. Fratantoniに感謝です。 GMRDL / EMMM NWOの一部であり、オランダの技術振興財団STW（プロジェクト12151および11350）によってサポートされており、その一部は経済省によって資金を供給されています。私たちは、援助と支援のため、ニコンインスツルメンツヨーロッパBVのキャサリンクリストファー·ピーターDrentに感謝します。 HX助成科学研究費オランダ機構（助成820.02.006）によってサポートされていましたロイヤル·ダッチ·芸術科学アカデミー（助成11CDP10）とWTによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
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