Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Abstract

Dendriten sind Vorsprünge, die aus der Dendriten eines Neurons und stellen die primären Ziele von exzitatorischen postsynaptischen Eingänge im Gehirn. Technologische Fortschritte haben diese Strukturen als Schlüsselelemente in Neuron-Konnektivität und synaptische Plastizität identifiziert. Die quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologie mittels Lichtmikroskopie bleibt ein wesentliches Problem aufgrund technischer Einschränkungen mit intrinsischer Brechungsgrenze Lichts verbunden. Dendritischen Dornen können leicht durch konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie identifiziert werden. , Mess subtile Veränderungen in der Form und Größe der Stacheln ist jedoch schwierig, weil andere ist als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel kleiner als herkömmliche theoretische Auflösungsgrenze von 200 nm Lichtmikroskopie fixiert optische Auflösung.

Mehrere neu entwickelten Super-Resolution-Techniken, um Bild zellulären Strukturen kleiner als die 200 nm, einschließlich dendritischen Dornen verwendet. Tiese Techniken basieren auf klassischen Fernfeld-Operationen auf der Grundlage und ermöglichen die Nutzung der vorhandenen Probenvorbereitung und Bild über die Oberfläche einer Probe. Beschrieben wird hier ein Arbeitsprotokoll zum Super Resolution Structured Illumination Microscopy (SIM), um die Abbildung von dendritischen Dornen in primären hippokampalen Neuronenkulturen gelten. Mögliche Anwendungen der SIM schneiden sich mit denen der konfokalen Mikroskopie. Allerdings präsentieren sich die beiden unterschiedlichen Techniken Anwendbarkeit. SIM bietet eine höhere effektive laterale Auflösung, während der konfokalen Mikroskopie, die auf die Benutzung eines physischen Lochkamera, erreicht Verbesserung der Auflösung auf Kosten der Beseitigung der aus der Fokus Licht. In diesem Protokoll werden die primären Neuronen auf Deckgläschen mit einem Standard-Protokoll, mit DNA-Plasmiden, die fluoreszierende Proteine ​​und abgebildet mit SIM transfiziert, kultiviert. Die hierin beschriebene gesamte Protokoll dauert ca. 2 Wochen, da dendritischen Dornen abgebildet werden nach 16-17 Tagen in vitro, wenndendritischen Entwicklung optimal ist. Nach Beendigung des Protokolls kann dendritischen Dornen in 3D aus der Serie von SIM-Bildstapeln mit spezieller Software rekonstruiert werden.

Introduction

Ein dendritisches Wirbelsäule ist ein kleiner Vorsprung des Neurons Membran. Diese charakteristische Struktur ist darauf spezialisiert, in der Regel erhalten Input von einer einzigen Synapse und stellt die physikalische Kontaktfläche zwischen zwei Nervenzellen. Die meisten funktionell reifen dendritischen Dornen bestehen aus einem kugelförmigen Spitze, genannt Kopf und einem dünnen Hals, der den Kopf mit dem dendritischen Welle verbindet. Allerdings sind nicht statisch, Stacheln und aktiv zu bewegen und ändern ihre Morphologie kontinuierlich auch im erwachsenen Gehirn ^2. In einem 2-wöchigen Zeitraum, Ratte primären Hippocampus-Neuronen-Kulturen vom späten embryonalen oder frühen postnatalen Zeit abgeleitet Entwicklung komplexer dendritischen Dornen mit zahlreichen Membran Vorsprünge, die von Anfang an filipodia stachelartigen Strukturen ³ entwickeln. Basierend auf diesem dynamischen Verhalten und andere Merkmale werden dendritischen Dornen haben, um einen anatomischen Substrat für Speicher und synaptische Transmission ^4,5 bereitzustellen.

Angesichts thE kritischen Rolle, die dendritischen Dorn Größe und Form haben in der synaptischen Funktion, ist es wichtig, ihren Abmessungen exakt zu messen. Stacheln variieren von etwa 200 bis 2000 Nanometer in der Länge und kann leicht mit Hilfe der konfokalen Laserrasterfluoreszenzmikroskopie identifiziert werden. Aber auch andere als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel unter Auflösung der herkömmlichen optischen Systeme ", theoretisch durch Beugung um 200 Nanometer ⁶ befestigt. Diese Auflösungsvermögen unzureichend zur Abbildung feiner Details, wie die Breite der Wirbelsäule Hals und Kopf. Viel Arbeit wurde gewidmet, um dieses Problem zu lösen und viele relativ neue Super-Resolution-Mikroskopie-Techniken haben erhebliche Fortschritte zur Verfügung gestellt. Insbesondere ist es möglich, die Auflösung über die klassische Grenze ohne Verwerfen jede Emissionslicht durch die Verwendung seitlich Structured Illumination Microscopy (SIM) in einer Weitfeld-, nicht-konfokalen Mikroskop ^7-10 zu erreichen. Unter Verwendung dieser Technik in Kombination mit nicht-linear Mikroskopie-Techniken, ist es theoretisch möglich, die laterale Auflösung des Lichtmikroskops von einer unbegrenzten Faktor ¹¹ zu verbessern. Aber in den meisten experimentellen Bedingungen erlaubt SIM zur Auflösungsgrenze um einen Faktor von zwei ¹ übertreffen. Andere höchstauflösenden optischen Mikroskopie-Techniken wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie ¹² und Photoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (PALM) ¹² haben Bildgebung von dendritischen Dornen angewendet. Localization-basierte Verfahren wie PALM erfordern sehr große Zahl von RAW-Bilder zu Super-Auflösung zu erreichen und werden daher in der Geschwindigkeit beschränkt. Andererseits kann STED hohe Abbildungsgeschwindigkeit zu erreichen, wenn auch relativ geringe Photonenzählungen und kleine Sichtfeldern, die nicht für SIM ¹³ sein kann.

In diesem Artikel ist das Ziel, ein Arbeitsprotokoll zum Bild dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro kultiviert bieten

Protocol

Alle Experimente mit Tieren wurden optimiert, um das Leiden der Tiere zu verringern und wurden von der Kommission für Tierversuche, Universität Amsterdam, DEC-Protokoll # DED204 und DED250 genehmigt.

1. Coverslip Vorbereitung

1. Reduzieren Sie die Deckgläser zu einer Größe von 15 mm x 15 mm mit einem Hartmetall-oder Diamant-Schreiber, so dass sie in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte passen.
2. Während der Arbeit in einem Abzug beginnen Deckbeschichtung durch Untertauchen vollDeckGläser in konzentrierter Salpetersäure-Lösung (70% w / w) in einem Glasbehälter. Um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten schütteln, dann Inkubation für mindestens 4 Stunden. Es ist möglich, die konzentrierte Salpetersäure-Lösung für etwa 2-mal wiederverwendet, sondern es kann Farbe durch Bestrahlung mit Licht zu verlieren.
3. Entfernen Sie die konzentrierte Salpetersäure-Lösung und waschen Sie die Deckgläser viermal in destilliertem Wasser für 30 min, sorgfältig nach jeder Wäsche schütteln.
4. Mit Vorsicht zu entfernen dieWasser.
   Hinweis: die nächsten drei Schritte werden in einem sterilen Laminar-Flow-Werkbank durchgeführt.
5. Genießen Sie die Deckgläser in 96% EtOH. Entfernen Sie die Deckgläser aus der EtOH-Lösung und lassen Sie sie trocknen.
6. Flamme die Deckgläser und stellte sie in einem Glasbehälter. Verwenden feinen Pinzette, um die Deckgläser (Dumont Stil Nr.5 Zange zum Beispiel) zu behandeln.
7. Bedecken Sie den Behälter mit Aluminiumfolie und backen in einem Trockenofen für Wärme 12-16 h bei 180 ° C Gebackene Deck kann bei Raumtemperatur für bis zu 1 Monat gelagert werden, wenn dicht abgedeckt werden.

2. Coverslip Coating

Das Deckglas-Beschichtungsverfahren begünstigt Neuron Befestigung an der Glasoberfläche und dendritischen Verzweigung ^14.

1. In einem sterilen Laminar Haube, sterile kleine Zange, um die einzelnen Deckgläser in einzelnen Vertiefungen einer 12-Well-Platte zu platzieren.
2. In 500 ul von Poly-L-Lysin-Lösung (oder ausreichenden Mengen, um die Deckgläser tauchen).
3. Wickeln ter Platte in Aluminiumfolie um Verdunstung zu verhindern und lassen es über Nacht bei Raumtemperatur.
4. Vor Beginn der Kultur, saugen Sie den Poly-L-Lysin-Lösung sorgfältig in einem sterilen Laminar Kapuze.
5. Waschen Sie jedes Well mit 1 ml sterilem Wasser zweimal, während verhindern, dass sie austrocknen.
6. Saugen Sie Wasser vollständig, 1 ml Plattierungsmedium und lassen Sie die Deckgläser in der Gewebekultur-Inkubator bis bereit, um die Zellen zu plattieren. Es wird empfohlen, um die Zellen innerhalb von 24 Stunden zu plattieren.

3. Entfernen der Gehirne von E16-E19 Rattenembryonen

1. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente durch Erhitzen in einem trockenen Sterilisator über Nacht oder Waschen mit 70% EtOH. Gründlich trocknen, wenn EtOH verwendet.
2. Bereiten Sie mehrere 30-mm-Schalen mit 1x HBSS-Puffer und halten sie auf dem Eis.
3. Euthanize die Ratte Damm mit einer intraperitonealen Injektion von Euthasol (160 mg / kg Euthasol in einem Volumen von ± 0,4 ml).
4. Prüfen Sie, ob das Fehlen von Reflexen.
5. Spray der Mutterleib mit 70% EtOH.
6. Einen Einschnitt entlang der Bauch und die Gebärmutter zu entfernen.
7. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und legen Sie sie in einem Durchmesser von 100 mm Petrischale.
8. Entfernen Sie die Köpfe der Embryonen mit großen Scheren und legen die Köpfe in eine neue Petrischale mit kaltem 1x HBSS-Puffer.
   Hinweis: von hier aus mit Schritt 7.1 wird das Verfahren unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt.
9. Halten Sie die Köpfe an den Seiten mit großen Pinzette.
10. Mit einer kleinen Schere, einen sagittalen Schnitt in der Haut auf der Oberseite des Kopfes, dann seitlich schälen die Haut nach unten mit einem großen Pinzette.
11. Verwenden Sie die gleiche Vorgehensweise wie in Schritt 3.10, um den Schädel zu entfernen. Machen Sie einen sagittalen Schnitt beginnend an der Schwanzende; vorsichtig öffnen den Schädel, ohne die Hirngewebe. Falten der beiden Hälften der Schädel entfernt seitlich Aussetzen des Gehirns.
12. Mit der stumpfen Spachtel, schaufelt aus dem Gehirn und legen Sie sie in frischem, kaltem 1x HBSS.
4. Dissection der Hippocampi

Es ist sehr wichtig, dass die Dissektion wird so schnell wie möglich unter sterilen Bedingungen durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Bewahren Sie die Proben kalt auf Eis.

1. Entfernen und entsorgen Sie das Kleinhirn mit den feinen Schere.
2. Trennen Sie die beiden Hemisphären des Gehirns, indem Sie einen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie.
3. Nehmen Sie jede Hemisphäre und setzen beide in einem neuen 30 mm Schale mit frischem, kaltem 1x HBSS.
4. Platzieren jeder Hemisphäre, so dass der Temporallappen den Boden der Schale gegenüberliegt.
   HINWEIS: Ab hier empfiehlt es sich, einem Binokular zu verwenden.
5. Halten Sie das Mittelhirn mit einer kleinen Zange und entfernen Sie das Mittelhirn mit einer anderen Pinzette. Lassen Sie den Rest der Hemisphäre intakt, die den Cortex und Hippocampus.
6. Drehen über das Gewebe, so dass der Hippocampus wird nun gegenüber dem Boden der Schale.
7. Halten Sie das Hemisphäre in pSpitze mit einer feinen Pinzette. Mithilfe einer anderen feinen Pinzette vorsichtig und entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute. Es ist einfacher, im Riechkolben starten. Seien Sie vorsichtig, um nicht den Hippocampus schädigen.
8. Richten Sie das Gewebe, so dass der Hippocampus ist nun nach oben zeigt. Der Hippocampus kann nun durch eine charakteristische C-förmige Struktur zu sehen.
9. Durch die Verwendung von feinen Pinzette, sezieren die Hippocampus. Sammeln Sie es in einem neuen 30 mm Schale mit frischem, kaltem 1x HBSS.

5. Zelldissoziation und Oberflächen

1. Zählen Sie die Anzahl der Hippocampus, dann schneiden Sie sie in kleine Stücke.
2. Sammeln der Stücke in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 3 ml 1x HBSS.
3. Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
4. In 6 ul Trypsin pro Hippocampus.
5. Inkubation für 20 Minuten bei maximal 37 ° C. Schwenken Sie nach 3 min.
6. Zwei Mal Waschen mit 5 ml frischem, kaltem 1x HBSS und den Überstand verwerfen.
7. Nach dem second waschen, fügen Sie 1,5 ml Plattierungsmedium, auf 37 ° C vorgewärmt Das Serum in der Beschichtungsmedium Trypsin zu inaktivieren.
8. Langsam verreiben 30x mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette, bis alle Gewebestücke homogen in einzelne Zellen verteilt. Vermeiden Sie Blasenbildung.
9. 5 ml Agarmedium auf 37 ° C vorgewärmt
10. Zählen von Zellen mit einer Trypanblau-Vitalfärbung.
11. Seed 50.000 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte in 1 ml Plattierungsmedium, in Abschnitt 2 (Gesamtvolumen 2 ml) vorbereitet.
12. Schütteln Sie die Platte gleichmäßig zu verteilen die Zellen.
13. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO _2. Nach 2-3 Tagen, ersetzen Sie die Hälfte der Plattenmedium (0,5 ml) mit Kulturmedium, das 10 uM FUDR.
    Anmerkung: Dendritische Wirbelsäule Bildgebung 16-17 Tage nach dem Plattieren durchgeführt (16-17 Tage in vitro, DIV).

6. Primäre Ratten-Hippocampus Neuron Transfektion mit Lipofectamine

1. Plasmid-DNA herzustellen, die GFP und Inkubationsmedium (10 ml Neurobasalmedium mit 100 ul Glutamax).
2. Pre-warmen das Inkubationsmedium auf 37 ° C
3. Bereiten DNA-Mix (Tube A). Für jeden Deck hinzufügen 1 ug DNA in 100 ul Klar Neurobasalmedium. Vorsichtig mischen.
4. Bereiten Lipofectamine-Mix (Tube B). Für jeden Deck hinzufügen 2 ul Lipofectamine in 100 ul Klar Neurobasalmedium. Vorsichtig mischen.
5. Fügen Sie die Lipofectamine-Mix an die DNA-Mix tropfenweise.
6. Inkubieren im laminaren Strömungshaube für 30 min bei Raumtemperatur.
7. 1 ml der vorgewärmten Inkubationsmedium auf die Platte ein.
8. Speicher Platte 2 für 5 min bei 37 ° C, 5% CO _2.
9. Tropfenweise hinzufügen, vorsichtig 200 ul der DNA / Lipofectamine mischen in jede Vertiefung und Inkubation für 45 min bei 37 ° C, 5% CO _2.
10. Mit der Verwendung von kleinen Zange heben Sie die coverslips, die die Nervenzellen und spülen Sie sie durch Eintauchen in eine 3 cm Schale mit frischen warmen Neurobasalmedium und verschieben Sie sie auf die Platte 2.
11. Die transfizierten Neuronen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 48 Stunden.
12. Check für Transfektionseffizienz 24 Stunden nach der Transfektion.

7. Immunfärbung und Montage des Ratten-Hippocampus primären Neuronen

Um Fluoreszenzintensität in transfizierten Zellen zu verbessern, führen Sie eine Immunfärbung Protokoll zur Erkennung GFP 48 Stunden nach der Transfektion zu verbessern.

1. Bereiten Sie 4% PFA und 0,05 M TBS.
2. Wärmen Sie die 4% PFA-Lösung auf 37 ° C
3. Saugen Sie vorsichtig das Medium aus den Vertiefungen, die die Deckgläser.
4. Add 500 ul warmen 4% PFA sorgfältig Beschädigung der Dendriten zu verhindern.
5. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min.
6. Für 5 min Waschen mit 1x HBSS 3 mal.
   HINWEIS: an diesem Punkt Proben können bis zu 3 Wochen bei 4 ° C gelagert werden,oder Immunfärbung kann sofort gestartet werden.
7. Wenn Proben gespeichert wurden, waschen mit 0,05 M TBS 3-mal für 5 min.
8. Block mit TBS-BSA (1%) Lösung bei Raumtemperatur für 30 min.
9. 5 Minuten Waschen mit 0,05 M TBS 3 mal.
10. Fügen Sie den primären Antikörper in Inkubationsmix verdünnt.
11. Die Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
12. Weiter Inkubieren über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
13. Entfernen Sie den primären Antikörper.
14. Waschen mit 0,05 M TBS 3x für 5 min.
    HINWEIS: von diesem Zeitpunkt an, halten Sie die Deckgläser vor Licht geschützt.
15. Fügen Sie den sekundären Fluoreszenz-konjugierten Antikörper in Inkubationsmix verdünnt.
16. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
17. Entfernen Sie den sekundären Antikörper.
18. 5 Minuten Waschen mit 0,05 M TBS 3 mal.
19. Für 5 min Waschen mit 1X TB 2 mal.
20. Verwenden feinen Pinzette, um den Deckgläser aus den Vertiefungen zu entfernen.
21. Trocknen Sie überschüssiges von TB mit einem Gewebe und montieren Sie die coverslips mit Montage Medium.
22. Dichtung mit Nagellack der Verdampfung von Montagemedium zu verhindern.

8. Dendritische Spine Imaging mit Struktur Illumination Microscopy

Dendritische Wirbelsäule Bildgebung mit Hilfe der in den Materialien beschriebenen SIM-System hat eine laterale Auflösung (XY)-Wert von etwa 85 bis 110 nm und einer axialen (Z) Auflösungswert zwischen 200 bis 250 nm, die eine Faktor 2 mal bessere Auflösung im Vergleich zu Weitfeldmikroskopie.

HINWEIS: Dendritische Wirbelsäule Bildgebung mittels SIM üblicherweise 2 Tage nach Schritt 7.22 geführt, könnte aber bis zu 3 Wochen später durchgeführt, wenn die Proben im Dunkeln und unter einer kontrollierten Temperatur von 22 gehalten werden - 23 ° C.

1. Schalten Sie die 488-nm-Laser, der Quecksilberlampe, die Bühne Controller, der Piezocontroller, der Halogenlampe für Durchlicht und dem PC und starten Sie die SIM-Software in der "ANDOR für N-SIM"-Modus.
2. Reinigen Sie die 100x-TIRF-Objektive mit 95% Ethanol dreimal, und wenn nötig mit Petrolether.
3. Verwenden Sie die folgenden Filtereinstellungen: 520 LP mit einem 488 dichroitischen.
4. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel. Überprüfen Sie, dass sich keine Luftblasen in der Öltropfen. Bewegen Sie das Ziel nach oben, bis das Öl die Probe berührt.
   Hinweis: Legen Sie eine Abdeckung über die Bühne, um die Probe von Umgebungslicht zu schützen und dämpfen Sie das Licht im Raum so weit wie möglich.
5. Stellen Sie den Korrekturring des Objektivs auf 37 ° C, 200 um, um die beste Symmetrie der PSF erhalten. Um die richtige Position Kragen, erste Position das Ziel Ring an der optimalen Soll-Position gesetzt und dann prüfen, eine 100 nm Wulst Probe. Laut der besten PSF Symmetrie, leicht den Kragen Position um den nominalen ändern.
6. Für die Beleuchtung, verwenden Sie 3D-SIM-Gitter (3D 1layer 100X/1.49 alle Wellenlängen). Um den ausgewählten Gitterblock in den SIM-Illuminator beginnen die Gitterausrichtung Ort, mit dem ein00X 1,49 Ziel an Ort und Stelle. Verwenden Sie ein 100 nm Wulst Probe in Medien montiert, mit einer Konzentration, die es können Trenn 10-15 Perlen für ein Sichtfeld (FOV). Nach der Einstellung des Ziel Korrekturring in die gewünschte Position, wählen Sie die 3D-SIM-Beleuchtung und starten Sie die Software-gesteuerte Ausrichtungsverfahren. Es wird laufen (5 Phasen) x (1 Richtung) x (100 Z-Ebenen-) Bilder, aus denen es die FOV mit Perlen zu rekonstruieren. Nach der Auswahl einer einzelnen Perle über einen entsprechenden ROI, die die gesamte Wulst einschließlich der out-of-focus verschwommenes Licht, wird die Software eine automatische PSF starten passend und es wird die Gitterposition entsprechend dem Ergebnis anpassen.
7. Um die Leistung des Mikroskops zu überprüfen, wiederholen Sie den Gitterausrichtung alle 2 Wochen, wegen der möglichen Fehlausrichtung von Tischbewegungen und / oder Temperaturdrift verursacht wird. Darüber hinaus auch die Laserintensität und Stabilität nach den Vorschlägen des Herstellers zu überprüfen.
8. Reinigen Sie die Probenoberfläche mit 95% ethAnol dreimal.
   Hinweis: Für die nächsten Schritte siehe Abbildung 3 für eine Übersicht über die Schalttafeln und den richtigen Einstellungen in der SIM-Software.
9. In der SIM-Software, wählen Sie die optische Konfiguration Augen FITC und wählen Sie einen leeren Filterblock in Revolver 1 für die visuelle Inspektion mit weißem Licht.
10. Stellen Sie den Fokusgeschwindigkeit und die Fahrgeschwindigkeit des XY-Tisches auf "Fine".
11. Öffnen Sie den Auslöser und schnell den Schwerpunkt auf die Probe.
12. Schließen Sie den Auslöser erneut und stellen Sie die Z-Koordinate auf Null.
13. Wählen Sie den Grünfilter in Revolver 1 für die visuelle Inspektion mit den grünen Kanal.
14. Eingestellt, die Intensität der Quecksilberlampe auf die niedrigste Einstellung.
15. Gehen Sie zu der Grenze der Probe vorsichtig, um sicherzustellen, dass das Ziel nicht das Dichtmittel zu berühren.
16. Öffnen Sie den Verschluss und schnell zu scannen durch die Probe mit der geringstmöglichen Intensität.
17. Bei der Begegnung mit einer ausreichend hellen Dendriten von Interesse und Zentrieren eines Segments von Interessein das Blickfeld, schließen Sie den Auslöser.
18. Stellen Sie die Software, um optische Konfiguration 3D-SIM-488 und den Kameraeinstellungen auf Auslesemodus EM gewinnen 1 MHz 16-Bit, Belichtungszeit 100 ms, Laserleistung von 5% und EM 200 gewinnen.
    HINWEIS: Überprüfen Sie, dass die Grün-Filter in Revolver 2 ausgewählt ist und Revolver 1 ist leer.
19. Überprüfen Sie, ob das Gitter zu "bewegen" gesetzt und auf Live, die Probe mit Laserlicht und durch die Kamera zu sehen.
20. Aktivieren Sie die Look-Up-Table.
21. Zentrieren Sie das Objekt von Interesse, wenn notwendig, und konzentrieren sich mit der Fokussierung Geschwindigkeit zu Extra Fine eingestellt.
    HINWEIS: in der Auslesemodus EM gewinnen 1 MHz 16-bit, ist die Zielintensität für eine gute Bild SIM zwischen 30,000-45,000.
22. Schnell einstellen die Kameraeinstellungen auf einen Intensitätswert zwischen 30,000-45,000 im Auslesemodus EM gewinnen 1 MHz 16-Bit zu bekommen. Zunächst verwenden:
    1. Laserleistung: 0% - 20% (mit Proben hergestellt, wie vorstehend beschrieben, 5% oder 2,6 mW ist ausreichend)
    2. Belichtungszeit:50 ms-2 s
    3. Read-Out-Modus: EM gewinnen 1 MHz 16-Bit-
    4. EM gewinnen: 0-300
    5. Conversion Gain: 1x - 5.1x
    6. Format for Live: Nein Binning
    7. Format für Aufnahme: Nein Binning
       HINWEIS: mit diesen Einstellungen 6,3% ± 1,3% Bleich wird routinemäßig erreicht, eine 10%-Grenze der zulässigen Höchst Bleichen, die die Bildqualität ¹⁵ wesentlich beeinträchtigt werden können.
23. Klicken Sie auf Stop, schalten Sie die Live-Ansicht.
24. Konfigurieren Sie die Einstellungen des 3D-Z-Stack im Sequenztafel ND zu:
    1. Reichweite: 2 um
    2. Stellen Größe: 120 nm
    3. Z-Ebene
    4. Klicken Sie auf Home-Position
    5. Wählen Sie das optische Konfiguration 3D-SIM-488 in der Lambda-Abschnitt
25. Wählen Sie 3D-SIM als Erfassungsmodus in der N-SIM-Pad.
26. Führen Sie die Sequenzerfassung ND und speichern Sie die Rohdaten.
27. Wählen Sie das optische Konfiguration Augen FITC wieder und wiederholen Sie die Schritte 8,15-8,27 bis die gesamte Probe abgebildet wurde
28. 3D-Bildrekonstruktion: Die in Schritt 8.23 ​​erworbenen Daten können entweder sofort oder später rekonstruiert werden. Beginnen Sie mit der Rekonstruktion der Z-Stack mit den Standardeinstellungen in den Wiederaufbau oder Neuaufbau Neuaufbau Scheibe Stapel-Modus und ggf. einstellen.
    HINWEIS: Für die besten Ergebnisse sollte Z-Stacks mit der angegebenen Schrittgröße hergestellt und in Reconstruct Stapel-Modus rekonstruiert werden. Überprüfen Sie immer die Gültigkeit des rekonstruierten Bildes durch den Vergleich mit den Rohdaten oder vorzugsweise einem Weitfeldbild. Die Parameter, die für den Rekonstruktionsprozess angepasst werden können, sind der Kontrast und die Hochfrequenz-Rauschunterdrückung. Beide beeinflussen, wie verschiedene Rohstoffe Bildeigenschaften werden während der Wiederaufbauprozess berücksichtigt. Bei niedrigen Modulationstiefe Rohdaten spielt das Kontrastparameter eine wichtige Rolle. Wenn der Benutzer Datensätze mit einem niedrigen Signal-zu-Rausch-Verhältnis, so kann die Unterdrückung Parameter Hochfrequenzrauschen die Rekonstruktion Qualität beeinflussen severely.
29. Wenn Bildgebung in der fertigen, in der Mitte der XY-Bühne und bewegen Sie das Ziel ganz nach unten in seine Ruheposition.
30. Hängen Sie die Probe und reinigen sowohl die Probe und Ziel mit 95% Ethanol.
31. Fahren Sie die Software und den PC und schalten Sie alle anderen Geräte.
32. 3D-Rekonstruktion und der Wirbelsäule Klassifizierung der erfassten Bilder können nach der Konvertierung der Dateien in TIFF, bevor Sie NeuronStudio Software beschrieben (siehe Abbildung 4) ¹⁶ durchgeführt werden.
33. Verwenden Sie die folgenden Parameter für den Wiederaufbau in der NeuronStudios-Software:
    1. Volumen: Voxel-Dimensionen: X: 0,03 um; Y: 0,03 um; Z: 0,120 um.
    2. Dendrite Erkennung: Bringen Verhältnis: 1,3; Mindestlänge: 5 um; Diskretisierung Verhältnis: 1; Richten Gänge: Ja.
    3. Spine-Erkennung: Mindesthöhe: 0,2 um; Maximale Höhe: 5.001 um; Maximale Breite: 3 um; Mindeststummelgröße: 10 Voxel; Der Mindestbetrag nicht Stummelgröße: 5 voxels.
    4. Spine Classifier: Hals-Verhältnis (Kopf-Hals-Verhältnis): 1.1; Thin-Verhältnis: 2,5; Mushroom Größe: 0,35 um;
34. Neuriten Scheitelform: für die Darstellung verwendet NeuronStudio Parameter feste Sonnenfinsternis; Neuriten Vertex Farbe: nach Typ; Neuriten Rand Form: Linie; Neuriten Randfarbe: einfarbig; Spine Form: fest Sonnenfinsternis; Spine Farbe: nach Typ.
    Hinweis: Nach der 3D-Rekonstruktion ist es auch möglich, stellen Sie die Lautstärke machen. Der Standardschwellenwert wurde mit dem "neu generieren Volume Rendering"-Option aktiv auf 20 festgelegt. Deckkraft wurde von 'Automatic Intensity "überprüft wird. 'Nur Surface' und 'Use Punkt Pre-Rendering "-Optionen auch aktiv

Representative Results

Beschrieben wird hier eine standardisierte Arbeitsprotokoll zur Abbildung dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro mit SIM-Karte. Der Protokollablauf sowie die wesentlichen Schritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Insgesamt dauert das Protokoll etwa 2 Wochen nach der experimentellen Arbeit in einer ersten Phase der Probenvorbereitung, einschließlich Kultur, Entwicklung und Transfektion von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen und Immunhistochemie getrennt, und die zweite Phase Probe-Bildgebung mit SIM-Karte. Die Ratten primären Hippocampus-Neuronen sind etwa 2 Wochen nach Beginn der Kultur, wenn Neuronen komplexen dendritischen Dornen entwickelt, wobei zahlreiche dendritischen Dornen ^3,5 fixiert. Unter Verwendung der in den Abschnitten 8.1 beschriebenen Protokoll ist es, systematisch Bild dendritischen Dornen mit Superauflösung möglich. Im Vergleich mit einem herkömmlichen dendritischen Dorn Abbildungsverfahren mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, die vor ¹⁶ beschrieben ^ist,17, bietet die hier die Verwendung der SIM beschriebenen Protokoll deutlich bessere Bildauflösung und 3D-Rekonstruktion, so dass die Identifizierung und Klassifizierung von Neuronenmembran Vorsprünge, die von Anfang an filipodia Wirbelsäule artige Strukturen.

Abbildung 1. Das Schema zeigt ein Protokoll, Workflow, seine Schritte und Timing.

2. Repräsentative Mikrofotografien von Dendriten und dendritischen Dornen mit konfokaler (A) und SIM-Mikroskopie (B) abgebildet wird. Der Vertreter der SIM-Aufnahme wurde wie in Abschnitt 8 beschrieben erworben wurde die repräsentative konfokale Mikrograph u erworbensingen physischen Pinhole Größe: 30 um 2,6 mW Laserleistung, keine Mittelung. Akquisitionen wurden aus konfokalen und SIM-Bilder (C und D) unter Verwendung NeuronStudio Software als vor ¹⁶ beschrieben rekonstruiert. Dendriten wurden verfolgt und Stacheln wurden automatisch mit der Software nach dem Einstellen wichtigsten Parameter, wie Halslänge, Halsdurchmesser und Kopfdurchmesser klassifiziert. Die eingerahmten Bereiche zeigen einen einzelnen dendritischen Dorn mit konfokaler (A) und SIM (B) abgebildet und von ihren entsprechenden Z-Stapel (C und D), der Darstellung Unterschiede in der Auflösung und Genauigkeit der resultierenden 3D-Rekonstruktionen rekonstruiert. Nach SIM die höhere Auflösung, Durchmesser zeigt die quantitative Analyse sowohl der Kopf (E) und Hals (F), dass SIM-Maßnahmen deutlich kleinere Abmessungen als der konfokalen Mikroskopie für die gleichen dendritischen Dornen, die anzeigt, dass SIM ist zum Aufspüren von kleineren Änderungen in dendritischen Dorn Morphologie. D ata in E und F sind normiert auf den Referenz konfokale Messungen. Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD von 3 dendritischen Dornen von 5 dendritischen Segmente sowohl konfokale Mikroskop und SIM-Modus abgebildet extrahiert dargestellt. Für Halsdurchmesser gab es einen signifikanten Unterschied (p = 0,0049 **) zwischen konfokalen (100,0 ± 4,296 normalisierte Einheiten) und SIM-Karte (50,61 ± 7,642 normalisierte Einheiten) Bilder, wie mit einem Studenten t-Test (E) getestet. Für Kopfdurchmesser gab es einen signifikanten Unterschied (p = 0,0209 *) zwischen konfokalen (100,0 ± 6,255 normalisierte Einheiten) und SIM (58.12 ± 9,451 normalisierte Einheiten) Bilder, wie mit einem Student-t-Test geprüft.

Abbildung 3. Screenshot aus der Nikon-NiS Elements 6,14 SIM-Software-Paket mit den in diesem Protokoll beschriebenen Einstellungen.

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Abbildung 4. Screenshot aus NeuronStudio 3D-Rekonstruktion und der Wirbelsäule Klassifikationssoftware einer repräsentativen Bild eines Dendriten.

Tabelle 1. Liste der Reagenzien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

In diesem Artikel wird ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen aus Ratten-Hippocampus-Neuronen primäre Verwendung der SIM in vitro beschrieben. Der primäre Hippocampus Kultur-Methode ist eine Anpassung der von Kaech und Banker ¹⁸ beschrieben ursprünglichen Methode. Die Hauptunterschiede sind die Verwendung von Neurobasal/B27 Kulturmedium, das das Erfordernis der Zuführung Astroglia Kulturen eliminiert, und die Zugabe des mitotischen Inhibitor FUDR an Tag 3, der das Überleben von Neuronen fördert, während Gliazellen-Proliferation unterdrückt, wie von Brewer et al ¹⁹ beschrieben.

Es gibt viele wichtige Schritte in dem Protokoll. Die Dicke der zur Herstellung der Zellen der Platte Deck ist entscheidend für eine genaue SIM Experiment. Sterilität während der Vorbereitung und Deckbeschichtung ist wichtig. Lassen Sie sich nicht Poly-L-Lysin-behandelten Deckgläschen bei 2.3 und 2.4 zu trocknen. Der Durchmesser des Flammenpoliert Pipette in Schritt 5.8 verwendet wird, ist von entscheidender Bedeutung.Eine zu enge Spitze in niedrigen Zelllebensfähigkeit in späteren Phasen führen. Die Isolierung der hippocampi so schnell wie möglich gewährleisten die Lebensfähigkeit der Zellen. Der Zeitpunkt der Inkubation und Trypsin Konzentrationen sind entscheidend für eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Verlust der Enzymaktivität von Trypsin kann auch Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Schließlich ist der Zusatz von FUDR in Schritt 5.14 entscheidend für das Überleben von Neuronen fördern und gliale Proliferation zu hemmen.

Die Probe Bildgebung Phase ist einfach, wenn nach streng das Protokoll hier beschrieben und die Ergebnisse in den Erwerb von Super-Resolution-Bilder, die leicht in 3D rekonstruiert können entsprechend ihrer morphologischen Merkmale zu analysieren und zu klassifizieren dendritischen Dornen werden durchgeführt. Wie in Fig. 2 gezeigt, ist die Qualität der im SIM-Modus aufgenommene Bilder wesentlich besser als Bilder genau den gleichen einzelnen Segmente und dendritischen Dornen mit dem konfokalen Modus des gleichen Mikroskops erfasst. Dieses Ergebnis legt nahe, that die Verwendung von SIM konnte eine ausgezeichnete Gelegenheit, Bild mehr als subtile Veränderungen in dendritischen Dorn Morphologie, wie in den 2E und 2F quantifiziert werden.

Bisher hauptsächlich (Leuchtstoff) Weitfeldmikroskopie zur Bild lebenden Zellen verwendet worden, aufgrund ihrer geringen Phototoxizität. Ebenso aufgrund seiner geringen phototoxische Effekte und gute Kombination mit konventionellen (genetische) Fluophore ermöglicht SIM lebenden Zellen Bildgebung und Identifizierung von dendritischen Dornen in niedrigen fluophore exprimierenden Zellen bei Super-Resolution. Im Vergleich zu anderen Super-Resolution-Mikroskopie Methoden wie STED und PALM, bietet SIM eine schnelle und kostengünstige Methode für die Abbildung von dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro. Obwohl in der Praxis nur SIM erhöht Auflösung von zwei fache im Vergleich zu herkömmlichen konfokalen Mikroskopie.

Ein Beispiel für eine Einschränkung der SIM ist, dass sie beruht auf Fluoreszenz, die ineinige Versuchsaufbauten kann schwierig anzuwenden sein. Zu diesem Zweck kann Mikroskopietechniken, die nicht auf Fluoreszenz wie Elektronenmikroskopie angewiesen sind eine mögliche Lösung. Dennoch ist Elektronenmikroskopie insbesondere eine mühsame, teure eine langsame Methode. Außerdem Elektronenmikroskopie kann nur auf festen Proben durchgeführt werden. Daher ist SIM besser geeignet für Super-Resolution Imaging lebender Zellen. Das Grundprinzip zum Anlegen eines fluoreszierenden Protein kodierenden Plasmid-Transfektion ist, dass es resultiert eine knappe, aber reproduzierbare cytoplasmatische Markierung von isolierten Zellen und verhindert Überlappung von Dendriten aus verschiedenen Zellen und die Identifizierung der einzelnen dendritischen Dornen. Kombination aus Transfektion mit Immunfärbung wurde zuvor gezeigt, um die Fluoreszenz ¹⁷ zu verbessern. Dennoch könnten andere Fluoreszenztechniken auch für die Bildgebung von dendritischen Dornen mit SIM, zum Beispiel ausreichende Fluoreszenzfärbung konnte mit kurzem de erworbenentwickelt Aktin bindenden Sonden ^20.

Da die jüngsten technischen Entwicklungen haben die Anwendung der SIM-dynamische Cell Imaging erlaubt, die zeigen, dass High-Speed-strukturierte Beleuchtung Mikroskop ist in der Lage 100-nm-Auflösung bei Bildraten von bis zu 11 Hz ^13, einer sehr logischen künftigen Anwendung der hier beschriebenen Protokoll könnte die Anwendung auf Zeitraffer-SIM von Live-Ratte primären Hippocampus-Neuronen und die Analyse von schnellen dynamischen Veränderungen in dendritischen Dorn Morphologie. Eine nächste Herausforderung für diese Anwendung könnte die erwartete kumulative Phototoxizität mit langen Zeitintervallen von Live-Mikroskopie in Verbindung gebracht werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil