Imaging dendritiske udløbere af Rat Primær hippocampusneuroner hjælp Structured Illumination Mikroskopi

Summary

Denne artikel beskriver en arbejdsgruppe protokol til billede dendritiske Torner fra hippocampus neuroner in vitro ved hjælp af Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-opløsning mikroskopi hjælp SIM giver billedopløsning betydeligt over den lys diffraktion grænse i alle tre rumlige dimensioner, så billeder af de enkelte dendritiske Torner med forbedret detalje.

Abstract

Dendritiske udløbere er fremspring nye fra dendritceller af en neuron og repræsenterer de primære postsynaptiske mål for excitatoriske input i hjernen. Teknologiske fremskridt har identificeret disse strukturer som centrale elementer i neuron tilslutningsmuligheder og synaptisk plasticitet. Den kvantitative analyse af rygsøjlen morfologi ved hjælp af lys mikroskopi fortsat er en vigtig problem på grund af tekniske begrænsninger, der er forbundet med lys iboende brydning grænse. Dendritiske udløbere kan let identificeres ved konfokal laser-scanning fluorescensmikroskopi. Men måle små ændringer i form og størrelse af pigge er vanskelig, fordi andre end længden rygsøjlen dimensioner er normalt mindre end konventionel optisk opløsning fastsættes ved lysmikroskopi teoretiske opløsning på 200 nm.

Adskillige nyligt udviklede super opløsning teknikker er blevet brugt til billede cellulære strukturer mindre end 200 nm, herunder dendritiske pigge. Tisse teknikker er baseret på klassiske langt operationer i felten og dermed tillade brug af eksisterende prøveforberedelse metoder og at billedet ud over overfladen af ​​en prøve. Beskrevet her er en arbejdsgruppe protokol at anvende super opløsning struktureret belysning mikroskopi (SIM) til billeddannelse af dendritiske Torner i primær hippocampus neuron kulturer. Mulige anvendelser af SIM overlapper konfokal mikroskopi. De to teknikker præsentere forskellige anvendelighed. SIM tilbyder højere effektiv lateral opløsning, mens konfokal mikroskopi, på grund af brugen af ​​et fysisk hul, opnår resolution forbedring på bekostning af fjernelse af ud af fokus lys. I denne protokol, primære neuroner dyrkes på dækglas ved hjælp af en standard-protokol, transficeret med DNA-plasmider, der koder for fluorescerende proteiner og filmede med SIM. Hele protokollen beskrevet heri tager omkring 2 uger, fordi dendritiske spidser afbildes efter 16-17 dage in vitro, nårdendritiske udvikling er optimal. Efter færdiggørelsen af ​​protokollen, kan dendritiske Torner rekonstrueres i 3D fra serier af SIM billedstakke hjælp af specialiseret software.

Introduction

En dendritiske er et lille fremspring i neuron membran. Denne karakteristiske struktur er specialiseret til at typisk modtage input fra en enkelt synapse og repræsenterer den fysiske kontakt området mellem to neuroner. De fleste funktionelt modne dendritiske spidser består af en kugleformet spids, betegnet hoved og en tynd hals, der forbinder hovedet til dendritiske akslen. Men spines er ikke statiske og flytte og ændre deres morfologi kontinuerligt, selv i den voksne hjerne ² aktivt. Inden for en 2 ugers periode af tid, rotte primære hippocampus neuron kulturer stammer fra slutningen af embryonale eller tidlig postnatal tid udvikle komplekse dendritiske dorne med mange membran fremspring, der udvikler sig fra tidlig filipodia til rygsøjlen-lignende strukturer ^3. Baseret på denne dynamiske egenskaber og andre egenskaber, er dendritiske spidser antages at tilvejebringe en anatomisk substrat for hukommelse opbevaring og synaptisk transmission ^4,5.

I betragtning af the afgørende rolle at dendritiske rygsøjlen størrelse og form har i synaptisk funktion, er det vigtigt at måle deres dimensioner præcist. Spines varierer fra omkring 200 til 2000 nanometer i længden og kan let identificeres ved konfokal laser-scanning fluorescensmikroskopi. Men andre end længden rygsøjlen dimensioner er normalt under de konventionelle optiske systemer resolution teoretisk fastsættes af diffraktion omkring 200 nanometer ^6. Disse løse beføjelser er utilstrækkelige til billeddannelse finere detaljer, såsom bredden af ​​rygsøjlen halse og hoveder. Meget arbejde har været dedikeret til at løse dette problem, og mange relativt nye super-opløsning mikroskopi teknikker har givet betydelige fremskridt. I særdeleshed er det muligt at opnå opløsning end den klassiske grænse uden at kassere enhver emission lys ved hjælp af sideværts struktureret belysning mikroskopi (SIM) i et bredt felt, ikke-konfokalt mikroskop ^7-10. Ved at bruge denne teknik i kombination med non-linear mikroskopi teknikker, er det teoretisk muligt at forbedre lateral opløsning af det optiske mikroskop af et ubegrænset faktor ^11. I de fleste eksperimentelle omstændigheder SIM tillader dog overgå grænsen opløsning med en faktor to ^1. Andre super-opløsning optisk mikroskopi teknikker såsom stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi ¹² og foto-aktivering lokalisering mikroskopi (PALM) ¹² er blevet anvendt på billeddannelse af dendritiske Torner. Localization-baserede metoder, såsom PALM kræver meget store mængder af rå billeder for at opnå super-opløsning og er derfor begrænset i hastighed. På den anden side, kan STED opnå en høj billedbehandling hastighed, selv ved relativt lave fotontælninger og små synsfelter, hvilket måske ikke er tilfældet for SIM ^13.

I denne artikel er det målet at give en arbejdsgruppe protokol til billede dendritiske Torner fra rotte primære hippocampus neuroner dyrket in vitro

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer, der involverer dyr blev optimeret for at mindske dyrs lidelser og blev godkendt af Kommissionen for dyreforsøg, University of Amsterdam, Dec protokol # DED204 og DED250.

1.. Coverslip Forberedelse

1. Skær ned dækglas til en størrelse på 15 mm x 15 mm ved hjælp af en hårdmetal eller diamant skriftklog, så de passer ind i brøndene i en 12-brønds plade.
2. Når du arbejder i et stinkskab starte dækglas belægning ved fuldt ud at nedsænke dækglas i koncentreret salpetersyre (70% vægt / vægt) i en glasbeholder. For at sikre en jævn fordeling ryste, så inkuberes i mindst 4 timer. Det er muligt at genbruge koncentreret salpetersyre løsning til cirka 2 gange, men det kan miste farve ved udsættelse for lys.
3. Fjern koncentreret salpetersyreopløsning og vaskes dækglassene fire gange i destilleret vand i 30 minutter, forsigtigt rystning efter hver vask.
4. Med forsigtighed fjernevand.
   Bemærk: de næste tre trin udføres i en steril laminar strømning.
5. Soak dækglas i 96% EtOH. Fjern dækglassene fra EtOH opløsning og lad dem tørre.
6. Flamme dækglas og læg dem i en glasbeholder. Brug fine tænger til at håndtere de dækglas (Dumont stil No.5 pincet for eksempel).
7. Dæk beholderen med folie og bages aluminium i en tør-varme ovn i 12-16 timer ved 180 ° C. Bagte dækglas kan opbevares ved stuetemperatur i op til 1 måned, hvis dækket tæt.

2.. Coverslip Coating

Dækglasset overtrækningsprocedure favoriserer neuron vedhæftning til glasoverfladen og dendritiske arborization ^14.

1. I en steril laminar hætte bruge sterile små pincet til at placere de enkelte dækglas i enkelte brønde i en 12-brønds plade.
2. Tilsæt 500 pi af poly-L-lysin-opløsning (eller tilstrækkelige mængder til at oversvømme dækglas).
3. Wrap than pladen i aluminiumsfolie for at forhindre fordampning og lade det natten over ved stuetemperatur.
4. Før du starter kultur, opsug Poly-L-lysin løsning omhyggeligt i en steril laminar hætte.
5. Vask hver brønd med 1 ml sterilt vand to gange, samtidig med at forhindre dem at tørre ud.
6. Aspirer vandet fuldstændigt, tilsættes 1 ml af udpladningsmedium og forlade dækglas i vævsdyrkningsinkubator indtil den er klar til tallerken cellerne. Det anbefales at pladen cellerne inden for 24 timer.

3.. Fjernelse af Hjerner fra E16-E19 rotteembryoner

1. Sterilisere kirurgiske instrumenter ved at opvarme dem i en tør sterilisator natten over eller vask dem med 70% EtOH. Tørre grundigt hvis EtOH anvendes.
2. Forbered flere 30 mm skåle med 1x HBSS buffer og holde dem på is.
3. Aflive rotte dæmning med en intraperitoneal injektion af Euthasol (160 mg / kg Euthasol i et volumen på ± 0,4 ml).
4. Kontroller for fravær af reflekser.
5. Spray dæmningen underliv med 70% EtOH.
6. Lave et snit langs maven og fjerne livmoderen.
7. Fjern embryoner fra livmoderen og placere dem i en 100 mm diameter petriskål.
8. Fjern lederne af de embryoner med store saks og placere hovedet i en ny petriskål indeholdende kold 1x HBSS buffer.
   Bemærk: herfra til trin 7.1 proceduren er udført under sterile forhold i et lagdelt stinkskab.
9. Hold nede hoveder langs siderne med store pincet.
10. Med små saks, lave en sagittal snit i huden på toppen af ​​hovedet, så sideværts skrælle huden ned med en stor pincet.
11. Brug samme fremgangsmåde som i trin 3.10 for at fjerne skallen. Lav en sagittal snit starter ved caudale ende; forsigtigt åbne kraniet uden at beskadige hjernevæv. Fold de to halvdele af kraniet væk sideværts udsætter hjernen.
12. Med den stumpe spatel, øse ud af hjernen og placere den i frisk kold 1x HBSS.
4.. Dissektion af Hippocampi

Det er meget vigtigt, at dissektion sker så hurtigt som muligt under sterile forhold for at sikre cellelevedygtighed. Hold prøverne koldt på is.

1. Fjern og kassér lillehjernen med de fine saks.
2. Adskil de to halvdele af hjernen ved at lave en sagittal snit langs midterlinien.
3. Tag hver halvkugle og placere både i en ny 30 mm skål indeholdende frisk kold 1x HBSS.
4. Placer hver halvkugle, således at den tidsmæssige lap står i bunden af ​​fadet.
   BEMÆRK: Fra her på, anbefales det at bruge et dissektionsmikroskop.
5. Hold forsigtigt midthjernen med en lille pincet og fjern midthjernen med et andet par pincet. Lad resten af ​​halvkugle intakt indeholdende cortex og hippocampus.
6. Vend vævet, således at hippocampus nu står i bunden af ​​skålen.
7. Hold forsigtigt halvkugle i pblonde med en fin pincet. Ved at bruge en anden fin pincet, forsigtigt og forsigtigt fjerne meninges. Det er lettere at starte på lugtekolben. Udvis forsigtighed for ikke at beskadige hippocampus.
8. Vend det væv, således at hippocampus er nu opad. Hippocampus kan nu ses ved sin karakteristiske C-formet struktur.
9. Ved hjælp af fine tænger, dissekere ud hippocampus. Saml det i en ny 30 mm skål indeholdende frisk kold 1x HBSS.

5.. Celledissociationsbuffer og Belægning

1. Tæl det samlede antal hippocampi, derefter klippe dem i små stykker.
2. Saml stykkerne i et 15 ml centrifugerør indeholder 3 ml 1x HBSS.
3. Centrifuger ved 300 xg i 5 min og fjern forsigtigt supernatanten.
4. Tilsæt 6 pi trypsin pr hippocampus.
5. Inkuber maks. 20 minutter ved 37 ° C. Swirl efter 3 min.
6. Vask to gange med 5 ml frisk kold 1x HBSS og supernatanten.
7. Efter second vaskes, tilsættes 1,5 ml udpladningsmedium, præ-opvarmes til 37 ° C. Serummet i udpladningsmedium inaktiverer Trypsin aktivitet.
8. Langsomt udriv 30x med en brand-poleret Pasteurpipette indtil alle stykker af væv er homogent spredt i enkeltceller. Undgå bobler.
9. Der tilsættes 5 ml udpladningsmedium forvarmet til 37 ° C.
10. Tæl celler under anvendelse af et Trypan blå farvning af levende celler.
11. Frø 50.000 celler per brønd af en 12-brønds plade i 1 ml udpladningsmedium, tilberedt i afsnit 2 (total volumen 2 ml).
12. Vip forsigtigt pladen jævnt cellerne.
13. Inkuberes ved 37 ° C, 5% _CO2. Efter 2-3 dage, erstatte halvdelen af ​​klædningen medium (0,5 ml) med dyrkningsmedium indeholdende 10 uM FUDR.
    Bemærk: Dendritisk rygsøjlen billeddannelse udføres 16-17 dage efter plating (16-17 dage in vitro, DIV).

6.. Rotte Hippocampus Primær Neuron Transfection hjælp Lipofectamine

1. Forbered plasmid DNA, der udtrykker GFP og inkubation medium (10 ml Neurobasal medium med 100 pi glutamax).
2. Forvarm inkubationsmediet til 37 ° C.
3. Forbered DNA mix (Tube A). For hvert dækglas tilsættes 1 ug af DNA i 100 ul almindeligt Neurobasal medium. Bland forsigtigt.
4. Forbered Lipofectamine mix (Tube B). For hvert dækglas tilsættes 2 ul Lipofectamine i 100 ul almindeligt Neurobasal medium. Bland forsigtigt.
5. Tilsæt Lipofectamine mix til dråbevis DNA mix.
6. Der inkuberes i laminær strømning i 30 min ved stuetemperatur.
7. Der tilsættes 1 ml forvarmet inkuberingsmedium til pladen 1.
8. Store plade 2 i 5 minutter ved 37 ° C, 5% _CO2.
9. Forsigtigt tilsættes dråbevis 200 pi DNA / lipofectamin blandes til hver brønd og inkuberes i 45 minutter ved 37 ° C, 5% _CO2.
10. Med brugen af ​​små pincet løfte coverslips indeholder neuroner, og skyl dem ved at dyppe dem i en 3 cm skål indeholdende frisk varm Neurobasal medium og flytte dem til plade 2.
11. Inkuberes de transficerede neuroner ved 37 ° C, 5% _CO2 i 48 timer.
12. Check for transfektionseffektivitet 24 timer efter transfektion.

7.. Immunfarvning og Montering af Rat Hippocampale Primære neuroner

For at forbedre fluorescensintensitet i transfekterede celler, udføre en immunfarvning protokollen til at forbedre GFP detektion 48 timer efter transfektion.

1. Forbered 4% PFA og 0,05 M TBS.
2. Varm 4% PFA opløsning til 37 ° C.
3. Forsigtigt aspireres mediet fra brøndene indeholdende dækglas.
4. Tilsæt 500 ul varm 4% PFA forsigtigt for at undgå at beskadige dendritter.
5. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
6. Vask med 1x HBSS tre gange i 5 min.
   BEMÆRK: på dette tidspunkt prøver kan opbevares i op til 3 uger ved 4 ° Celler immunfarvning kan startes med det samme.
7. Hvis prøverne blev opbevaret, vaskes med 0,05 M TBS 3 gange i 5 min.
8. Bloker med TBS-BSA (1%) opløsning ved stuetemperatur i 30 minutter.
9. Vask med 0,05 M TBS 3 gange i 5 min.
10. Tilsæt primære antistof fortyndet i inkubation mix.
11. Pladerne inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
12. Endvidere inkuberes natten over ved 4 ° C med forsigtig omrystning.
13. Fjern det primære antistof.
14. Vask med 0,05 M TBS 3x i 5 min.
    BEMÆRK: fra dette punkt, holde dækglas beskyttet mod lys.
15. Tilsæt sekundære fluorescerende-konjugeret antistof fortyndet i inkubation mix.
16. Der inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer.
17. Fjern det sekundære antistof.
18. Vask med 0,05 M TBS 3 gange i 5 min.
19. Vask med 1X TB 2 gange i 5 min.
20. Brug fine pincet til at fjerne for at dækglas fra brøndene.
21. Tør eventuel overskydende TB med en serviet og montere coverslips hjælp montage medium.
22. Seal med neglelak at forhindre fordampning af montering medium.

8.. Dendritiske Spine Imaging hjælp Struktur Illumination Mikroskopi

Dendritisk rygsøjlen billeddannelse ved hjælp af SIM-system, der beskrives i de materialer, har en lateral opløsning (XY) værdi på ca 85-110 nm og en aksial (Z) opløsning værdi mellem 200-250 nm, hvilket giver en faktor på 2 gange forbedring i opløsning i forhold til bredt felt mikroskopi.

BEMÆRK: Dendritisk rygsøjlen billeddannelse ved hjælp af SIM sker typisk 2 dage efter trin 7.22, men kan gøres op til 3 uger senere, hvis Prøverne opbevares i mørke og under kontrolleret temperatur af 22 - 23 ° C.

1. Tænd for 488 nm laser, lampen kviksølv, scenen controller, piezo controller, halogenlampe for transmitteret lys og pc'en, og start SIM-softwaren i "ANDOR for N-SIM"-tilstand.
2. Rengør 100x TIRF objektive med 95% ethanol tre gange, og om nødvendigt med petroleumsether.
3. Brug følgende filterindstillinger: 520 LP med en 488 dichroisk.
4. Put en dråbe immersionsolie på målsætningen. Kontrollér at der ikke er luftbobler i olien-drop. Flyt målet opad, indtil olien rører prøven.
   Bemærk: Sted et dække over scenen for at beskytte prøven fra det omgivende lys og dæmpe lyset i rummet så meget som muligt.
5. Indstil korrekturringen af ​​målet til 37 ° C, 200 um, for at opnå den bedste symmetri af polyesterfibre. For at indstille den korrekte krave position, første position målet ring på den optimale nominelle position og derefter kontrollere en 100 nm perleprøve. Ifølge den bedste PSF symmetri, ændrer lidt på kraven position omkring det nominelle.
6. For belysning, bruge 3D-SIM rist (3D 1layer 100X/1.49 alle bølgelængder). Til at begynde risten tilpasning sted den valgte rist blok ind i SIM-lampe, med 100X 1,49 mål på plads. Brug en 100 nm perleprøve monteret i medier, med en koncentration, der kan tillade at isolere 10-15 perler for et synsfelt (FOV). Efter indstilling af objektiv korrekturringen til den ønskede position, skal du vælge 3D-SIM belysning og start software-guidede procedure justeringen. Det vil køre (5 faser) x (1 retning) x (100 z-fly) billeder, hvorfra det vil rekonstruere FOV med perler. Når du har valgt en enkelt perle via et passende ROI, der dækker hele perle herunder out-of-fokus sløret lys, vil softwaren starte en automatisk PSF montering og det vil justere risten position i henhold til resultatet.
7. For at kontrollere udførelsen af ​​mikroskopet, gentages rist justering hver 2. uge, på grund af den mulige skævhed skyldes bord bevægelser og / eller temperatur drifting. Desuden også kontrollere laser intensitet og stabilitet i overensstemmelse med producentens forslag.
8. Rengør prøvens overflade med 95% ethanol tre gange.
   Bemærk: For de næste skridt se figur 3 for en oversigt over kontrolpaneler og de korrekte indstillinger i SIM-software.
9. I SIM-softwaren, skal du vælge Optical Configuration Eye FITC og vælg et tomt filter blok i Turret 1 til visuel inspektion med hvidt lys.
10. Sæt fokus hastighed og kørehastigheden i XY-bord til "Fine".
11. Åbn lukkeren og hurtigt fokusere på prøven.
12. Luk lukkeren igen, og at indstille Z-koordinat til nul.
13. Vælg den grønne filter i Turret 1 til visuel inspektion ved hjælp af den grønne kanal.
14. Indstil intensitet kviksølvlampe til den laveste indstilling.
15. Flyt til grænsen af ​​prøven omhyggeligt, og sørg for, at målet ikke rører fugemasse.
16. Åbn lukkeren og hurtigt scanne gennem prøven med den lavest mulige intensitet.
17. Efter støder en tilstrækkelig lys dendritceller af interesse og centrering et segment af interessei synsfeltet lukke lukkeren.
18. Indstil softwaren til Optical Configuration 3D-SIM 488 og kameraets indstillinger til udlæsning tilstand EM, få 1 MHz 16-bit, eksponeringstid 100 msek lasereffekten 5% og EM vinde 200.
    BEMÆRK: Kontroller, at den grønne filter i Turret 2 er valgt, og at Turret 1 er tom.
19. Kontroller, at risten er sat til 'Flytning' og klik Live til at se prøven med laserlys og gennem kameraet.
20. Aktiver Look Up Table.
21. Centrere objektet af interesse om nødvendigt og fokusere med fokuseringen hastighed sat til Extra Fine.
    BEMÆRK: i udlæsning modus EM vinde 1 MHz 16-bit, er målet for en god SIM billede intensitet er mellem 30,000-45,000.
22. Hurtigt justere kameraindstillingerne for at få en intensitet værdi mellem 30,000-45,000 i udlæsningen modus EM vinde 1 MHz 16-bit. I første omgang bruger:
    1. Laser effekt: 0% - 20% (med prøver fremstillet som ovenfor beskrevet, 5% eller 2,6 mW er tilstrækkeligt)
    2. Eksponering tid:50 msek-2 sek
    3. Udlæsning mode: EM vinde 1 MHz 16-bit
    4. EM vinde: 0-300
    5. Konvertering gevinst: 1x - 5,1 x
    6. Format til Live: Ingen arkivering
    7. Format til Capture: Ingen arkivering
       BEMÆRK: med disse indstillinger 6,3% ± 1,3% blegning rutinemæssigt opnås inden for en grænse på 10% af højeste acceptable blegning, som i væsentlig grad kan påvirke billedkvaliteten ^15.
23. Klik på Stop for at slukke Live View.
24. Konfigurer indstillingerne for 3D-Z stack i ND Sequence panel til:
    1. Rækkevidde: 2 um
    2. Indstil størrelse: 120 nm
    3. Z-planet
    4. Klik på Hjem position
    5. Vælg den optiske konfiguration 3D-SIM 488 i Lambda sektion
25. Vælg 3D-SIM som købet mode i N-SIM pad.
26. Kør Sequence opkøbet ND og gemme de rå data.
27. Vælg det optiske Configuration Eye FITC igen, og gentag trin 8,15-8,27 indtil hele prøven er afbildet
28. 3D Billede rekonstruktion: De tilkøbte i trin 8.23 ​​data kan enten rekonstrueres højre væk eller senere. Start med at rekonstruere Z stakken med standardindstillingerne genopbygning i Genskab Slice eller ombygge Stack mode og juster om nødvendigt.
    BEMÆRK: Du opnår de bedste resultater, bør Z stakke ske med den angivne trin størrelse og rekonstrueret i Genskab Stack tilstand. Altid kontrollere gyldigheden af ​​det rekonstruerede billede ved at sammenligne det med de rå data eller, fortrinsvis, et bredt felt image. De parametre, der kan justeres til genopbygningsprocessen er kontrasten og højfrekvent støj undertrykkelse. Begge af dem indflydelse på, hvordan de forskellige rå billedfiler egenskaber er taget i betragtning under genopbygningsprocessen. I tilfælde af lav modulationsgrad rådata kontrasten parameter spiller en vigtig rolle. Hvis brugeren har datasæt med et lavt signal-til-støj-forhold, så den høje frekvens støjdæmpning parameter kan påvirke rekonstruktionskvaliteten SEhårdt belastede.
29. Når billeddannelse i færdig, center XY scenen og flytte målet hele vejen ned til sin hvileposition.
30. Afmontere prøven og rengøre både prøven og objektiv med 95% ethanol.
31. Luk softwaren og PC og slukke alle andre enheder.
32. 3D rekonstruktion og rygrad klassifikation af den overtagne billeder kan udføres efter at konvertere filer til TIFF, som beskrevet før du bruger NeuronStudio software (se figur 4) ^16.
33. Brug følgende parametre for genopbygning i NeuronStudios software:
    1. Volumen: voxel dimensioner: X: 0,03 m; Y: 0,03 m; Z: 0.120 um.
    2. Dendrite afsløring: Vedhæft ratio: 1.3; Mindste længde: 5 m; Diskretisering Ratio: 1; Juster vejkryds: Ja.
    3. Spine afsløring: Minimum højde: 0,2 m; Største højde: 5.001 m; Største bredde: 3 m; Minimum stumpet størrelse: 10 voxel; Minimum non-stumpet størrelse: 5 voxels.
    4. Spine Classifier: Neck ratio (hoved-hals ratio): 1.1; Tynd ratio: 2,5; Mushroom størrelse: 0,35 m;
34. NeuronStudio parametre, der anvendes til destruktion: neurite vertex form: fast formørkelse; Neurite vertex farve: efter type; Neurite kant form: linje; Neurite kant farve: enkelt farve; Spine form: fast formørkelse; Spine farve: efter type.
    Bemærk: Når 3D-rekonstruktion er det også muligt at indstille lydstyrken gengive. Standarden tærskel blev sat til 20 med "Regenerate volumen rendering 'valgmulighed aktiv. Opacity blev sat af 'Automatisk Intensity' kontrolleret. "Surface kun 'og' Brug Punkt Pre-Rendering 'muligheder var også aktiv

Representative Results

Beskrevet her er et standardiseret arbejdsmiljø protokol til billeddannelse dendritiske Torner fra rotte primære hippocampus neuroner in vitro ved hjælp af SIM. Protokollen workflow og dens afgørende trin er vist i figur 1.. Samlet protokollen tager cirka 2 ugers eksperimentelt arbejde adskilt i en første fase af prøveforberedelse, herunder kultur, udvikling og transfektion af rotte primære hippocampus neuroner og immunhistokemi, og anden fase prøve imaging ved hjælp SIM. Rotte primære hippocampale neuroner fastsættes ca. 2 uger efter start af kulturen, når neuroner har udviklet komplekse dendritiske dorne forsynet talrige dendritiske spidser ^3,5. Anvendelse af protokollen beskrevet i detaljer i afsnit 1-8, er det muligt systematisk at billeddata dendritiske spidser med super opløsning. I sammenligning med en konventionel dendritiske billeddannelse under anvendelse af konfokal fluorescensmikroskopi, der er beskrevet tidligere ^16.17, den protokol, der er beskrevet heri ved hjælp af SIM giver betydeligt bedre billedopløsning og 3D-rekonstruktion, som muliggør identifikation og klassificering af neuron membran fremspring spænder fra tidlig filipodia til rygsøjlen-lignende strukturer.

Figur 1.. Ordningen viser en protokol workflow sine trin og timing.

Figur 2. Repræsentative micrographs af dendritter og dendritiske spidser afbildes med konfokal (A) og SIM-mikroskopi (B). Den repræsentative SIM mikrograf blev erhvervet som beskrevet i afsnit 8, blev den repræsentative konfokal mikrograf erhverves usynge fysisk pinhole størrelse: 30 um laser magt 2,6 mW, ingen gennemsnit. Opkøb var rekonstrueret fra konfokal og SIM billeder (C og D, henholdsvis) ved hjælp NeuronStudio softwaren som beskrevet før den ^16.. Dendritter blev sporet og pigge blev klassificeret automatisk med softwaren efter justering vigtigste parametre såsom hals længde, nakke diameter og hoved diameter. De indrammede områder viser en individuel dendritiske rygsøjlen filmede med konfokal (A) og SIM (B) og rekonstrueret fra deres tilsvarende Z stakke (C og D), der forestiller forskelle i opløsning og nøjagtighed af de resulterende 3D-rekonstruktioner. Ifølge SIM s højere opløsning, kvantitativ analyse af både hoved (E) og hals (F) diameter afslører, at SIM-foranstaltninger betydeligt mindre dimensioner end konfokal mikroskopi for de samme dendritiske Torner, hvilket indikerer, at SIM-kortet er i stand til at detektere mindre ændringer i dendritiske rygsøjlen morfologi. D ata i E og F er normaliseret til henvisning konfokal målinger. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD af 3 dendritiske spidser ekstraheret fra 5 dendritiske segmenter afbildet i både konfokal og SIM mikroskop tilstande. For halsdiameter var der en signifikant forskel (** p = 0,0049) mellem konfokal (100,0 ± 4.296 normaliserede enheder) og SIM-kortet (50.61 ± 7,642 normaliserede enheder) billeder, som testet med en Studerende t-test (E). For hoved diameter var der en signifikant forskel (* p = 0,0209) mellem konfokal (100,0 ± 6.255 normaliserede enheder) og SIM-kortet (58.12 ± 9,451 normaliserede enheder) billeder, som testet med en Studerende t-test.

Figur 3.. Screenshot fra Nikons NiS Elements 6.14 SIM software-pakke med de indstillinger, der er beskrevet i denne protokol.

ve_content "fo: keep-together.within-side =" altid ">
Figur 4.. Screenshot fra NeuronStudio 3D rekonstruktion og rygsøjle klassificering software af en repræsentativ billede af en dendritceller.

Tabel 1.. Liste af reagenser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne artikel en arbejdsgruppe protokol til billede dendritiske Torner fra rotte primære hippocampus neuroner dyrket in vitro ved hjælp af SIM beskrives. Den primære hippocampale neuroner dyrkningsmetode er en tilpasning af den oprindelige metode beskrevet af Kaech og Banker ^18. De væsentligste forskelle er brugen af Neurobasal/B27 dyrkningsmedium, hvilket fjerner kravet om astrogliale feeder kulturer, og tilføjelsen af den mitotiske inhibitor FUDR på dag 3 som fremmer neuronal overlevelse mens undertrykke glial proliferation, som beskrevet af Brewer et al ^19.

Der er mange kritiske trin i protokollen. Tykkelsen af ​​dækglassene anvendes til pladen cellerne er af afgørende betydning for en nøjagtig SIM eksperiment. Sterilitet under dækglasset forberedelse og belægning er vigtig. Lad ikke poly-L-lysin-behandlede dækglas tør under 2.3 og 2.4. Diameteren af ​​flamme-polerede pipette anvendes i trin 5.8 er afgørende.Vil en alt for snæver tip resultere i lav levedygtighed celle på et senere tidspunkt. Isolering af hippocampusen så hurtigt som muligt vil sikre høj cellernes levedygtighed. Timingen af ​​inkubationen og trypsin koncentrationer er afgørende for at sikre en høj cellelevedygtighed. Tab af trypsin enzymatiske aktivitet kan også påvirke cellernes levedygtighed. Endelig tilsætning af FUDR i trin 5.14 er afgørende for at fremme neuron overlevelse og inhibere glial proliferation.

Prøven imaging fase er ligetil, når der udføres efter nøje protokollen beskrevet her og resulterer i erhvervelsen af ​​super opløsning billeder, der let kan rekonstrueres i 3D for at analysere og klassificere dendritiske Torner i henhold til deres morfologiske træk. Som vist i figur 2, er kvaliteten af ​​de billeder, der er erhvervet i SIM-tilstand væsentligt bedre end billeder af nøjagtig de samme dendritiske segmenter og individuelle pigge erhvervet ved hjælp af konfokal tilstand af samme mikroskop. Dette resultat antyder that brugen af SIM kunne give en glimrende mulighed for at billedet mere end subtile ændringer i dendritiske rygsøjlen morfologi, som kvantificeres i figur 2E og 2F.

Hidtil meste (fluorescerende) bredt synsfelt mikroskopi er blevet anvendt til at afbilde levende celler på grund af sin lave fototoksicitet. Ligeledes på grund af sin lave fototoksisk effekt og god kombination med konventionelle (genetiske) fluophores, SIM tillader levende celler billeddannelse og identifikation af dendritiske Torner i lav fluophore udtrykkende celler på super-opløsning. I sammenligning med andre super-opløsning mikroskopi metoder såsom STED eller PALM, SIM giver en hurtig og billig metode til billeddannelse af dendritiske Torner fra rotte primære hippocampusneuroner in vitro. Selv om der i praksis SIM kun øger beslutning dobbelte sammenlignet med konventionel konfokal mikroskopi.

Et eksempel på en begrænsning af SIM-kortet er, at det er baseret på fluorescens, hvilketnogle forsøgsopstillinger kan være vanskelige at anvende. Til dette formål kan mikroskopi teknikker, som ikke er afhængige af fluorescens såsom elektronmikroskopi giver en mulig løsning. Alligevel elektronmikroskopi i særdeleshed er en kedelig, dyr en langsom metode. Desuden kan elektronmikroskopi kun udføres på faste prøver. Derfor SIM er mere egnet til super-opløsning billeddannelse af levende celler. Begrundelsen for at anvende en fluorescerende protein kodning plasmidtransfektion er, at det resulterer i en knappe, men reproducerbar cytoplasmatisk mærkning af isolerede celler, forhindre overlapning af dendritter fra forskellige celler og identifikation af de enkelte dendritiske Torner. Kombination af transfektion med immunofarvning tidligere er blevet vist at øge fluorescens ^17. Ikke desto mindre kunne andre fluorescerende teknikker også gælde for billeddannelse af dendritiske Torner med SIM, for eksempel tilstrækkelig fluorescensfarvede kunne erhverves ved hjælp af for nylig erudviklet actinbindende sonder ^20.

Siden seneste tekniske udvikling har tilladt anvendelsen af SIM-kortet til dynamisk cell imaging, der viser, at høj hastighed struktureret-belysning mikroskop er i stand til 100-nm opløsning på frame rates op til 11 Hz ^13, en meget logisk fremtidig anvendelse af protokollen beskrevet heri kunne være sin ansøgning til time-lapse SIM af levende rotte primære hippocampus neuroner og analysen af ​​hurtige dynamiske ændringer i dendritiske rygsøjlen morfologi. Et næste udfordring for denne ansøgning kan være den forventede kumulative fototoxicitet forbundet med lange tidsintervaller af levende mikroskopi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil