Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi

Summary

Denna artikel beskriver ett arbetsprotokoll till bild Dendritutskotten från hippocampus nervceller in vitro med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi (SIM). Super-upplösning mikroskopi använda SIM ger bildupplösning betydligt längre än ljuset diffraktionsgränsen i alla tre rumsliga dimensioner, vilket gör att avbilda enskilda Dendritutskotten med förbättrad detalj.

Abstract

Dendritutskotten är utskjutande delar som framkommit dendrit av en neuron och representerar de primära postsynaptiska mål för excitatoriska ingångar i hjärnan. Teknologiska framsteg har identifierat dessa strukturer som centrala delar i neuron-anslutning och synaptisk plasticitet. Den kvantitativa analysen av ryggraden morfologi med ljusmikroskop är fortfarande ett viktigt problem på grund av tekniska begränsningar i samband med ljusets inneboende brytningsgräns. Dendritutskotten kan lätt identifieras genom konfokala laserskanning fluorescensmikroskopi. Att mäta subtila förändringar i form och storlek på ryggarna är svårt eftersom andra än längden ryggrad dimensioner är oftast mindre än konventionell optisk upplösning som fastställs genom Ijusmikroskopi teoretiska upplösningsgräns av 200 nm.

Flera nyligen utvecklade superupplösning tekniker har använts för att bilden cellulära strukturer mindre än 200 nm, inklusive dendritiska ryggar. Tessa tekniker bygger på klassiska fjärrfältsoperationer och därmed tillåta användningen av befintliga provberedningsmetoder och bild bortom ytan av provexemplar. Beskrivs här är en arbetsprotokoll för att tillämpa superupplösning strukturerad belysning mikroskopi (SIM) för avbildning av Dendritutskotten i primära hippocampus neuron kulturer. Möjliga tillämpningar av SIM lappar med de av konfokalmikroskopi. De två teknikerna presentera olika tillämplighet. SIM erbjuder högre effektiv lateral upplösning, medan konfokalmikroskopi, på grund av användningen av en fysisk hål, uppnår upplösning förbättring på bekostnad av avlägsna ur fokus ljus. I detta protokoll primära neuroner odlas på täckglas av glas med användning av ett standardprotokoll, som transfekterats med DNA-plasmider som kodar för fluorescerande proteiner och avbildas med SIM. Hela protokollet beskrivet häri tar ungefär två veckor, eftersom Dendritutskotten avbildas efter 16-17 dagar in vitro, närdendritiska utveckling är optimal. Efter slutförandet av protokollet, kan Dendritutskotten rekonstrueras i 3D från serie SIM bildstaplar som använder specialiserad mjukvara.

Introduction

En dendritisk Ryggraden är ett litet utsprång av neuron-membran. Denna egenskap struktur är specialiserad på normalt ta emot synpunkter från en enda synaps och representerar den fysiska kontaktytan mellan två nervceller. De flesta funktionellt mogna Dendritutskotten bestå av en klotformig spets, benämnd huvud, och en tunn hals som ansluter huvudet till den dendritiska skaft. Men ryggar är inte statiska och aktivt flytta och ändra deras morfologi kontinuerligt även i den vuxna hjärnan ^2. Inom en 2 veckors period, råtta primära hippocampus neuron kulturer som härrör från slutet av embryonal eller tidig postnatal tid utveckla komplexa dendritiska hållare med många membran utskjutande delar som utvecklas från tidig filipodia till rygg-liknande strukturer ^3. Baserat på denna dynamiska beteende och andra egenskaper, är Dendritutskotten tänkt att ge en anatomisk substrat för minneslagring och synaptisk överföring ^4,5.

Givet the avgörande roll att dendritiska ryggraden storlek och form har i synapserna, är det viktigt att mäta sina mått exakt. Ryggar variera från cirka 200 till 2000 nanometer i längd och kan lätt identifieras genom konfokala laseravsöknings fluorescensmikroskopi. Men andra än längd ryggrad dimensioner är oftast lägre än de konventionella optiska system "upplösning, teoretiskt fastställas genom diffraktion runt 200 nanometer ^6. Dessa lösa befogenheter är otillräckliga för avbildning finare detaljer, som till exempel bredd ryggraden halsar och huvuden. Mycket arbete har ägnats åt att lösa detta problem och många relativt nya super-upplösning mikroskopitekniker har gett stora framsteg. I synnerhet är det möjligt att uppnå upplösning bortom den klassiska gränsen utan att kassera eventuella emissionsljus genom användning av lateralt strukturerad belysning mikroskopi (SIM) i ett brett fält, icke-konfokalt mikroskop ^7-10. Med hjälp av denna teknik i kombination med icke-linear mikroskopitekniker, är det teoretiskt möjligt att förbättra den laterala upplösningen av den optiska mikroskop av ett obegränsat faktor ^11. Men i de flesta experimentella förhållanden, gör SIM att överträffa upplösningen gränsen med en faktor två ^1. Andra super-upplösning optisk mikroskopi tekniker såsom Stimulerad utarmning utsläpp (Sted) mikroskopi ¹² och fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) ¹² har använts för avbildning av Dendritutskotten. Lokaliseringsbaserade metoder såsom PALM kräver mycket stora mängder råbilder för att uppnå super-upplösning och är därför begränsade i hastighet. Å andra sidan, kan Sted uppnå hög utskriftshastighet, även vid relativt låga fotonräkning och små synfält, vilket inte kan vara fallet för SIM ^13.

I denna artikel är syftet att ge en arbetsprotokoll till bild Dendritutskotten från råtta primära hippocampus nervceller odlade in vitro

Protocol

Alla försöksdjur som deltar i djurförsök har optimerats för att minska djurens lidande och godkändes av kommissionen för djurförsöks Amsterdams universitet, december protokoll # DED204 och DED250.

1. Cover Förberedelse

1. Skär ner täckglas till en storlek på 15 mm x 15 mm med hjälp av en hårdmetall eller diamant skriftlärd, så att de passar in i brunnarna på en 12-brunnar.
2. När du arbetar i ett dragskåp, börja täckbeläggning med fullt sänka ned täckglas i koncentrerad salpetersyra lösning (70% vikt / vikt) i en glasbehållare. För att säkerställa en jämn fördelning skaka, sedan inkubera under ett minimum av fyra timmar. Det är möjligt att återanvända koncentrerad salpetersyralösning i ca 2 gånger, men den kan förlora färg efter exponering för ljus.
3. Avlägsna koncentrerad salpetersyralösning och tvätta täckglasen fyra gånger i destillerat vatten under 30 min, försiktigt skakning efter varje tvätt.
4. Med försiktighet bortvatten.
   Observera: de följande tre steg utförs i en steril laminärt flöde skåp.
5. Blöttäckglasen i 96% EtOH. Avlägsna täckglasen från EtOH-lösning och låt dem torka.
6. Flamma täckglas och lägg dem i en glasbehållare. Använd fin pincett för att hantera de täckglas (Dumont stil No.5 pincett till exempel).
7. Täck behållaren med aluminiumfolie och grädda i en torr värme ugnen i 12-16 timmar vid 180 ° C. Bakade täck kan förvaras i rumstemperatur i upp till 1 månad om täcks ordentligt.

2. Cover Coating

Det täckbeläggningsförfarandet gynnar neuron fastsättning på glasytan och dendritisk arborization ^14.

1. I en steril laminärt huva, använd sterila små pincett för att placera de enskilda täckglas i enskilda brunnar i en 12-brunnar.
2. Addera 500 pl av Poly-L-lysin-lösning (eller tillräckliga mängder för att dränka de täckglas).
3. Wrap than plattan i aluminiumfolie för att förhindra avdunstning och låt stå över natten vid rumstemperatur.
4. Innan kulturen, aspirera poly-L-lysin lösning försiktigt i en steril laminärt huva.
5. Tvätta varje brunn med 1 ml sterilt vatten två gånger, samtidigt som hindrar dem att torka ut.
6. Sug vatten helt, tillsätt 1 ml plätering medium och lämna täckglasen i vävnadsodling inkubatorn tills den ska plattan cellerna. Det rekommenderas att platta cellerna inom 24 timmar.

3. Avlägsnande av hjärnor från E16-E19-råttembryon

1. Sterilisera kirurgiska instrument genom att värma dem i en torr autoklav över natten eller tvätta dem med 70% EtOH. Torka ordentligt om EtOH används.
2. Förbered flera 30 mm skålar med 1x HBSS buffert och hålla dem på is.
3. Euthanize råttan dammen med en intraperitoneal injektion av Euthasol (160 mg / kg Euthasol i en volym av ± 0,4 ml).
4. Kontrollera om avsaknaden av reflexer.
5. Spraya dammens buken med 70% EtOH.
6. Gör ett snitt längs buken och ta bort livmodern.
7. Ta bort embryon från livmodern och placera dem i en 100 mm petriskål.
8. Ta cheferna för de embryon med stora saxar och placera huvudet i en ny petriskål med kall 1x HBSS buffert.
   OBS: härifrån till steg 7,1 proceduren utförs under sterila förhållanden i ett laminärt flöde skåp.
9. Håll huvudet längs sidorna med stora pincett.
10. Med en liten sax, gör en sagittal snitt i huden på toppen av huvudet och sedan lateralt skal huden ner med en stor pincett.
11. Använd samma tillvägagångssätt som i steg 3.10 för att ta bort skallen. Gör en sagittal snitt med början vid den bakre änden; försiktigt öppnande skallen utan att skada hjärnvävnad. Vik de två halvorna av skallen bort lateralt exponerar hjärnan.
12. Med den trubbiga spatel, ösa ut hjärnan och placera den i färskt kallt 1x HBSS.
4. Dissekering av hippocampi

Det är mycket viktigt att den dissekering görs så snabbt som möjligt under sterila betingelser för att säkerställa cellviabilitet. Förvara proverna kalla på is.

1. Ta bort och kasta lillhjärnan med fina sax.
2. Separera de två hjärnhalvorna genom att göra en sagittal snitt längs mittlinjen.
3. Ta varje halvklotet och placera både i en ny 30 mm maträtt som innehåller färsk kall 1x HBSS.
4. Placera varje halvsfär, så att den temporala loben är riktad mot botten av skålen.
   OBS: Från och med nu, är det rekommenderat att använda en dissekera mikroskop.
5. Håll försiktigt mellanhjärnan med hjälp av en liten tång och ta bort mellanhjärnan med en annan pincett. Lägg till den återstående delen av halvklotet intakt innehållande hjärnbarken och hippocampus.
6. Vänd på vävnaden, så att hippocampus är nu vänd mot botten av skålen.
7. Håll försiktigt halvklotet i pspets med en fin pincett. Genom att använda en annan fin pincett, noggrant och försiktigt bort hjärnhinnorna. Det är lättare att börja på luktbulben. Var försiktig så att inte skada hippocampus.
8. Rikta vävnaden så att hippocampus är nu vänd uppåt. Hippocampus kan nu ses av sin karaktäristiska C-formad struktur.
9. Genom att använda fin pincett, dissekera ut hippocampus. Samla den i en ny 30 mm maträtt som innehåller färsk kall 1x HBSS.

5. Cell Dissociation och plätering

1. Räkna det totala antalet hippocampi, sedan skär dem i små bitar.
2. Samla bitarna i ett 15 ml centrifugrör innehållande 3 ml 1x HBSS.
3. Centrifugera vid 300 xg under 5 minuter och ta försiktigt bort supernatanten.
4. Lägg till 6 l trypsin per hippocampus.
5. Inkubera under maximalt 20 min vid 37 ° C. Snurra efter 3 min.
6. Tvätta två gånger med 5 ml färsk kall 1x HBSS och kassera supernatanten.
7. Efter sekond tvätta, tillsätt 1,5 ml plätering medium förvärmas till 37 ° C. Serumet i pläterings-mediet kommer att inaktivera trypsin-aktivitet.
8. Långsamt mal sönder 30x med en brand-polerat pasteurpipett tills alla bitar av vävnad är homogent spridda i enstaka celler. Undvik bubblande.
9. Tillsätt 5 ml plätering medel värmts upp till 37 ° C.
10. Räkna celler med hjälp av en trypanblått vital färgning.
11. Seed 50.000 celler per brunn i en 12-brunnar i 1 ml plätering medium upprättats i avsnitt 2 (totalvolym 2 ml).
12. Skaka plattan för att jämnt fördela cellerna.
13. Inkubera vid 37 ° C, 5% _CO2. Efter 2-3 dagar, byt ut hälften av bordläggningen mediet (0,5 ml) med odlingsmedium innehållande 10 ^ M FUDR.
    OBS: dendritiska ryggraden bildbehandling utförs 16-17 dagar efter plätering (16-17 dagar in vitro, DIV).

6. Rat hippocampus Primär Neuron transfektion med hjälp av Lipofectamine

1. Framställa plasmid-DNA som uttrycker GFP och inkubationsmediet (10 ml Neurobasal-medium med 100 | il av glutamax).
2. Pre-varm inkubationsmediet till 37 ° C.
3. Förbered DNA mix (Tube A). För varje täckglas tillfoga en xg DNA i 100 | il av vanlig Neurobasal medium. Blanda försiktigt.
4. Förbered Lipofectamine mix (Tube B). För varje täckglas tillsätt 2 l Lipofectamine i 100 l av vanligt Neurobasal medium. Blanda försiktigt.
5. Lägg till Lipofectamine blandningen till DNA mix droppvis.
6. Inkubera i dragskåp med laminärt flöde under 30 min vid rumstemperatur.
7. Tillsätt 1 ml förvärmda inkubationsmedium till plattan 1.
8. Butiksplattan 2 under 5 min vid 37 ° C, 5% _CO2.
9. Försiktigt tillsätt droppvis 200 ul av DNA / lipofektamin blanda till varje brunn och inkubera under 45 min vid 37 ° C, 5% _CO2.
10. Med hjälp av små pincett lyfta coverslips innehåller nervceller och skölj dem genom att doppa dem i en 3 cm skål med färskt varmt Neurobasal medium och flytta dem till plattan 2.
11. Inkubera de transfekterade nervceller vid 37 ° C, 5% _CO2 under 48 timmar.
12. Kontrollera för transfektionseffektivitet 24 h efter transfektion.

7. Immunfärgning och Montering av Rat Hippocampus Primära Nervceller

För att förbättra fluorescensintensiteten i transfekterade celler, utföra en immunfärgning protokoll för att förbättra GFP upptäckt 48 timmar efter transfektion.

1. Förbered 4% PFA och 0,05 M TBS.
2. Värm 4% PFA-lösning till 37 ° C.
3. Aspirera försiktigt av mediet från brunnarna innehållande täckglas.
4. Lägg till 500 l av varm 4% PFA noga för att förhindra skada dendriter.
5. Inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
6. Tvätta med 1x HBSS tre gånger under 5 min.
   OBS: vid denna punkt prover kan lagras upp till 3 veckor vid 4 ° Celler immunfärgning kan startas omedelbart.
7. Om proven lagrades, tvätta med 0,05 M TBS 3 gånger under 5 min.
8. Blockera med TBS-BSA (1%)-lösning vid rumstemperatur under 30 min.
9. Tvätta med 0,05 M TBS 3 gånger under 5 min.
10. Lägg till den primära antikroppen späds i inkubation mix.
11. Inkubera plattorna under 1 timme vid rumstemperatur.
12. Vidare inkubera över natten vid 4 ° C med varsam skakning.
13. Ta bort den primära antikroppen.
14. Tvätta med 0,05 M TBS 3x under 5 min.
    OBS: från och med nu, hålla täckglasen skyddas från ljus.
15. Lägg till det sekundära fluorescerande-konjugerad antikropp utspädd i inkubation mix.
16. Inkubera vid rumstemperatur under två timmar.
17. Avlägsna sekundär antikropp.
18. Tvätta med 0,05 M TBS 3 gånger under 5 min.
19. Tvätta med 1X TB två gånger under 5 min.
20. Använd fin pincett för att ta bort till täck från brunnarna.
21. Torka eventuellt överskott av TB med en vävnad och montera coverslips använder monteringsmedel.
22. Tätning med nagellack för att förhindra avdunstning av monteringsmedel.

8. Dendritiska ryggraden Imaging använder Struktur Belysning Mikroskopi

Dendritiska ryggraden avbildning med SIM-systemet som beskrivs i det material som har en lateral upplösning (XY)-värde av ungefär 85 till 110 nm och en axiell (Z) upplösningsvärde mellan 200 - 250 nm, vilket ger en faktor på två gånger förbättring i upplösning jämfört med brett fält mikroskopi.

OBSERVERA: dendritiska ryggraden avbildning med SIM görs typiskt två dagar efter steg 7,22, men kan göras upp till tre veckor senare om proverna hölls i mörker och under en kontrollerad temperatur av 22-23 ° C.

1. Slå på 488 nm laser, kvicksilverlampa, det stadium controller, piezo controller, halogenlampan för transmitterat ljus och datorn och starta upp SIM-mjukvara i "ANDOR för N-SIM"-läge.
2. Rengör 100x TIRF objektetive med 95% etanol tre gånger, och om så är nödvändigt med petroleumeter.
3. Använd följande filterinställningar: 520 LP med en 488 dikroisk.
4. Sätt en droppe immersionsolja på målet. Kontrollera att det inte finns några luftbubblor i oljan-drop. Flytta målet uppåt tills oljan vidrör provet.
   Anm: Placera ett lock över scenen för att skydda provet från omgivande ljus och dämpa belysningen i rummet så mycket som möjligt.
5. Ställ korrekturringen av målet till 37 ° C, 200 nm, för att få bästa symmetri PSF. För att ställa in rätt kragen läge, första läget målet ringen vid den optimala nominella positionen och sedan kontrollera en 100 nm pärla prov. Enligt den bästa PSF s symmetri, något ändra kragen position runt den nominella.
6. För belysning, använder 3D-SIM-galler (3D 1layer 100X/1.49 alla våglängder). Till att börja gallret inriktnings plats den valda gallret blocket i SIM-belysningen, med 100X 1.49 mål i stället. Använd en 100 nm pärla prov monteras i media, med en koncentration som kan göra det möjligt att isolera 10-15 pärlor för ett synfält (FOV). Efter inställning av objektiv korrekturringen till önskat läge, väljer du 3D-SIM-belysning och starta programmet styrd inriktning förfarande. Det kommer att köras (5 faser) x (1 riktning) x (100 z-plan) bilder, som den kommer att rekonstruera FOV med pärlor. När du har valt en enda pärla via en lämplig avkastning, som täcker hela pärla inklusive out-of-fokus suddig ljus, kommer programmet starta en automatisk PSF montering och justerar gallret positionen enligt resultatet.
7. För att kontrollera utförandet av mikroskopet, upprepa galler anpassning var 2 veckor, på grund av den eventuella förskjutning som orsakas av bordsrörelser och / eller temperatur drifting. Dessutom, även kontrollera laserintensiteten och stabiliteten i enlighet med tillverkarens förslag.
8. Rengör provytan med 95% ethanol tre gånger.
   OBS: För nästa steg se figur 3 för en översikt av kontrollpaneler och rätt inställningar inom SIM-programvara.
9. I SIM-programmet väljer den optiska Configuration Eye FITC och markera en tom filterblocket i Revolver 1 för visuell inspektion med vitt ljus.
10. Ställ fokuseringshastighet och körhastigheten av XY-bordet till "Fine".
11. Öppna slutaren och snabbt fokusera på provet.
12. Stänga slutaren igen och ställa in Z-koordinat till noll.
13. Välj den gröna filtret i Revolver 1 för visuell inspektion med hjälp av den gröna kanalen.
14. Ställ in intensiteten hos den kvicksilverlampa till den lägsta inställningen.
15. Flytta till gränsen av provet noggrant och se till att målet inte kommer i kontakt med tätningsmedlet.
16. Öppna slutaren och snabbt söka igenom provet med lägsta möjliga intensitet.
17. På att möta ett tillräckligt ljust dendrit av intresse och centre ett segment av intressei synfältet, stänga slutaren.
18. Ställ in programvaran till optisk konfiguration 3D-SIM 488 och kamerainställningarna för att läsa ut-läge EM, få 1 MHz 16-bitars, exponeringstid 100 ms, lasereffekt 5% och EM vinna 200.
    OBS: Kontrollera att den gröna filtret i torn 2 är vald och att Turret 1 är tom.
19. Kontrollera att gallret är inställd på "Flytta" och klicka på Live för att se provet med laserljus och genom kameran.
20. Aktivera Look Up Table.
21. Centrera objekt av intresse om det är nödvändigt och fokus med fokuseringshastigheten inställd på Extra Fine.
    OBS: i avläsningsläge EM vinna 1 MHz 16-bitars, är målet intensitet för en bra SIM bild mellan 30,000-45,000.
22. Snabbt justera kamerainställningarna för att få ett intensitetsvärde mellan 30,000-45,000 i avläsningsläge EM vinna 1 MHz 16-bitars. Inledningsvis använder:
    1. Lasereffekt: 0% - 20% (med prov som har beretts enligt ovan, 5% eller 2,6 mW räcker)
    2. Exponeringstid:50 ms-2 sek
    3. Läs-out-läge: EM vinna 1 MHz 16-bitars
    4. EM vinna: 0-300
    5. Konvertering vinst: 1x - 5.1x
    6. Format för Live: Nej binning
    7. Format för Capture: Nej binning
       OBS: med dessa inställningar 6,3% ± 1,3% blekning rutinmässigt uppnås, inom 10% gränsen för högsta godtagbara blekning, som avsevärt kan påverka bildkvaliteten ^15.
23. Klicka på Stopp för att stänga av Live view.
24. Konfigurera inställningarna för 3D-Z stacken i ND Sequence panelen:
    1. Räckvidd: 2 pm
    2. Ange storlek: 120 nm
    3. Z-planet
    4. Klicka på Hem ställning
    5. Markera den optiska Configuration 3D-SIM 488 i Lambda avsnittet
25. Välj 3D-SIM som förvärvsläge i N-SIM-pad.
26. Kör ND Sequence förvärv och spara rådata.
27. Markera den optiska konfiguration Eye FITC igen och upprepar steg från 8,15 till 8,27 tills hela provet har avbildats
28. 3D Bildrekonstruktion: De data som samlats in i steg 8.23 ​​kan antingen rekonstrueras direkt eller senare. Börja med att rekonstruera Z-stack med standardåteruppbyggnads inställningarna i Rekonstruera skiva eller Rekonstruera Stack-läge och justera vid behov.
    OBS: För bästa resultat bör Z-stackar göras med den angivna steglängd och rekonstrueras i Rekonstruera Stack-läge. Kontrollera alltid giltigheten av den rekonstruerade bilden genom att jämföra den med rådata eller, helst, ett brett fält image. De parametrar som kan justeras för återuppbyggnadsprocessen är kontrasten och högfrekvent brusreducering. Båda påverkar hur olika rå bildegenskaper beaktas under återuppbyggnadsprocessen. Vid låg modulationsdjup rådata, spelar parameter kontrasten en viktig roll. Om användaren har dataset med ett lågt signal-till-brus-förhållande, då den högfrekventa brusundertryckningsparameter kan påverka rekonstruktionen kvalitet SEverely.
29. När avbildning i klar mitten XY scenen och flytta målet hela vägen ner till sitt viloläge.
30. Avmontera prov och rengör både provet och målet med 95% etanol.
31. Stäng av programvaran och datorn och stäng av alla andra enheter.
32. 3D-rekonstruktion och ryggrad klassificering av de förvärvade bilderna kan utföras efter att konvertera filerna till TIFF som beskrivet innan NeuronStudio programvara (se figur 4) ^16.
33. Använd följande parametrar för återuppbyggnaden i NeuronStudios programvaran:
    1. Volym: Voxel Mått: X: 0,03 m; Y: 0,03 ^ m; Z: 0,120 fim.
    2. Dendrite upptäckt: Bifoga förhållande: 1,3; Minimilängd: 5 pm; Diskretisering faktor: 1; Rikta korsningar: Ja.
    3. Spine upptäckt: Minsta höjd: 0,2 m; Högsta höjd: 5.001 um; Maximal bredd: 3 pm; Minsta trubbiga storlek: 10 voxlar; Minsta icke-trubbiga storlek: 5 voxels.
    4. Spine Klassificerare: Nack ratio (huvud-hals-förhållande): 1,1; Tunna förhållande: 2,5; Svamp storlek: 0,35 m;
34. NeuronStudio parametrar som används för rendering: Neurite vertex form: fast solförmörkelse; Neurite vertex färg: efter typ; Neurite kant form: line; Neurite kant färg: enda färg; Spine form: fast solförmörkelse; Spine färg: efter typ.
    Obs: När 3D-rekonstruktion är det också möjligt att ställa in volymen återge. Standard tröskeln sattes till 20 med den "Generera volymrendering" alternativet aktiv. Opacitet sattes av "Automatisk Intensity" kontrolleras. "Surface endast" och "Använd Point Pre-Rendering 'alternativ var också aktiva

Representative Results

Beskrivs här är ett standardiserat arbetsprotokoll för avbildning Dendritutskotten från råtta primära hippocampus nervceller in vitro med hjälp av SIM. Protokollet arbetsflöde och dess avgörande steg visas i figur 1. Sammantaget tar det protokoll ungefär två veckor av experimentellt arbete åtskilda i en första fas av provberedning, inklusive kultur, utveckling och transfektion av råtta primära hippocampus nervceller och immunohistokemi, och andra etappen prov avbildning med SIM. De råtta primära hippocampus nervceller är fast ca 2 veckor efter starten av kulturen, när nervceller har utvecklat komplexa dendritiska hållare bär många Dendritutskotten ^3,5. Med hjälp av det protokoll som beskrivs i detalj i avsnitten 1-8, är det möjligt att systematiskt bild Dendritutskotten med superupplösning. I jämförelse med en konventionell dendritiska ryggraden avbildningsmetod med användning av konfokal fluorescensmikroskopi som beskrivits tidigare ^16,17, det protokoll som beskrivs här använder SIM ger betydligt bättre bildupplösning och 3D-rekonstruktion, så att identifiering och klassificering av neuronmembran utskjutande delar som sträcker sig från tidig filipodia till ryggradsliknande strukturer.

Figur 1. Systemet visar en protokoll arbetsflöde, dess steg och timing.

Figur 2. Representativa mikrofotografier av dendriter och Dendritutskotten avbildas med konfokal (A) och SIM-mikroskopi (B). Den representativa SIM mikroskop förvärvades enligt beskrivningen i avsnitt 8, var den representativa konfokala mikroskop förvärvade usjunger fysisk Pinhole storlek: 30 pm lasereffekt 2,6 mW, ingen medelvärdes. Förvärv rekonstruerades från konfokala och SIM-bilder (C och D, respektive) som använder NeuronStudio programvara som beskrivits tidigare ^16. Dendriter spårades och ryggar klassificerades automatiskt med programvaran efter justering huvudsakliga parametrar såsom halslängd, halsdiameter och huvud diameter. De inramade områdena visar en enskild dendritiska ryggraden avbildas med konfokal (A) och SIM (B) och rekonstrueras från deras motsvarande Z-stackar (C och D), som visar skillnader i upplösning och noggrannhet av de resulterande 3D-rekonstruktioner. Enligt SIM: s högre upplösning, kvantitativ analys av både huvud (E) och hals (F) diameter avslöjar att SIM åtgärder betydligt mindre dimensioner än konfokalmikroskopi för samma Dendritutskotten, vilket indikerar att SIM kan detektera små förändringar i dendritiska ryggraden morfologi. D ata i E och F är normaliserade till mätningarna referens konfokala. Resultaten presenteras som medelvärde ± SD av tre Dendritutskotten extraherade från 5 dendritiska segment avbildas i både konfokal och SIM mikroskoplägen. För halsdiameter fanns det en signifikant skillnad (** p = 0,0049) mellan konfokala (100.0 ± 4.296 normaliserade enheter) och SIM (50,61 ± 7,642 normaliserade enheter) bilder, som testas med ett Students t-test (E). För huvuddiameter fanns det en signifikant skillnad (* p = 0,0209) mellan konfokala (100.0 ± 6,255 normaliserade enheter) och SIM (58,12 ± 9,451 normaliserade enheter) bilder, som testas med ett Students t-test.

Figur 3. Skärmdump från Nikons NiS Elements 6.14 SIM programpaket med de inställningar som beskrivs i detta protokoll.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 4. Skärmdump från NeuronStudio 3D-rekonstruktion och ryggrad klassificering programvara för en representativ bild av en dendrit.

Tabell 1. Lista med reagenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I den här artikeln ett arbetsprotokoll till bild Dendritutskotten från råtta primära hippocampus nervceller odlade in vitro med hjälp av SIM beskrivs. Den primära hippocampala neuronkultur metod är en anpassning av den ursprungliga metod som beskrivits av Kaech och spikar ^18. De viktigaste skillnaderna är att använda Neurobasal/B27 odlingsmedium, vilket eliminerar kravet på astroglial matar kulturer, och tillägget av mitosinhibitor FUDR på dag 3 som främjar neuronal överlevnad samtidigt undertrycka gliaceller spridning, som beskrivs av Brewer et al ^19.

Det finns många viktiga steg i protokollet. Tjockleken på täckglasen som används för att platta cellerna är avgörande för en korrekt SIM-experiment. Sterilitet under täck förberedelse och beläggning är viktig. Låt inte poly-L-lysin-behandlade täck torka under 2.3 och 2.4. Diametern hos den flamma polerade pipett som används i steg 5,8 är avgörande.För smal ett tips kommer att resultera i låg cellviabilitet i senare skeden. Isolering av hippocampi så snart som möjligt kommer att säkerställa hög cellviabiliteten. Tidpunkten för inkubation och trypsin koncentrationer är avgörande för att säkerställa hög cellviabilitet. Förlust av trypsin enzymatisk aktivitet kan också påverka cellviabiliteten. Slutligen är tillägget av FUDR i steg 5.14 avgörande för att främja neuronöverlevnad och hämmar gliaceller spridning.

Provet imaging fasen är okomplicerad när det utförs efter strikt det protokoll som beskrivs här och resultat i förvärvet av super upplösning som lätt kan rekonstrueras i 3D för att analysera och klassificera Dendritutskotten enligt deras morfologiska egenskaper. Som visas i figur 2, är kvaliteten på bilderna som förvärvats i SIM-läget betydligt bättre än bilder av exakt samma dendritiska segment och enskilda ryggar som förvärvats med hjälp av konfokala läge med samma mikroskop. Detta resultat tyder that att använda SIM kan ge ett utmärkt tillfälle att bilden mer än subtila förändringar i dendritiska ryggraden morfologi, som kvantifieras i figurerna 2E och 2F.

Hittills mestadels (fluorescerande) brett fält mikroskopi har använts för att avbilda levande celler, på grund av dess låga fototoxicitet. På samma sätt, på grund av dess låga fototoxiska effekter och bra kombination med konventionella (genetiska) fluophores tillåter SIM levande celler avbildning och identifiering av Dendritutskotten i låg fluophore uttryckande celler vid super-upplösning. I jämförelse med andra super-upplösning mikroskopi metoder såsom Sted eller PALM, tillhandahåller SIM en snabb och prisvärd metod för avbildning av Dendritutskotten från råtta primära hippocampus nervceller in vitro. Även SIM i praktiken ökar endast upplösning av två gånger jämfört med konventionella konfokalmikroskopi.

Ett exempel på en begränsning av SIM-kortet är att den förlitar sig på fluorescens, vilket inågra experimentella uppställningar kan vara svårt att tillämpa. För detta ändamål kan mikroskopi tekniker som inte är beroende av fluorescens såsom elektronmikroskopi tillhandahålla en möjlig lösning. Ändå är elektronmikroskopi i synnerhet en omständlig, dyr en långsam metod. Dessutom kan elektronmikroskopi endast utföras på fasta prover. Därför är SIM mer passande för superupplösning avbildning av levande celler. Den logiska grunden för att tillämpa ett fluorescerande protein kodning plasmid transfektion är att det resulterar i en bristvara, men reproducerbar cytoplasmatisk märkning av isolerade celler, förhindrar överlappning av dendriter från olika celler och identifiering av enskilda Dendritutskotten. Kombination av transfektion med immunofärgning har tidigare visats att förbättra fluorescensen ^17. Likväl kan andra fluorescerande tekniker också vara tillämplig på avbildning av Dendritutskotten med SIM, till exempel tillräcklig fluorescerande färgning kan förvärvas med hjälp av nyligen devecklas aktinbindning prober ^20.

Sedan den senaste tekniska utvecklingen har gjort det möjligt att tillämpa SIM till dynamiska cell imaging, som visar att hög hastighet strukturerad-belysning mikroskop kan 100-nm upplösning vid bildhastigheter på upp till 11 Hz ^13, en mycket logisk framtida tillämpningen av det protokoll som beskrivs här skulle kunna vara dess tillämpning på time-lapse SIM levande råtta primära hippocampus neuroner och analys av snabba dynamiska förändringar i dendritiska ryggraden morfologi. Ett nästa utmaning för denna applikation kan vara den förväntade ackumulerade fototoxicitet i samband med långa tidsintervaller av levande mikroskopi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil