Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הגדרה למעלה Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

Abstract

מחסום דם המוח (BBB) ​​במיוחד מסדיר שטף מולקולרי ותאי בין הדם ורקמת העצבים. המטרה שלנו הייתה לפתח ולאפיין syngeneic חולדה לשחזור מאוד במודל חוץ גופית של BBB באמצעות שיתוף תרבויות של תאים ראשוניים עכברוש אנדותל המוח (RBEC) והאסטרוציטים ללמוד הקולטנים מעורבים בtranscytosis ברחבי monolayer התא האנדותל. האסטרוציטים בודדו על ידי נתיחה מכאנית הבאה עיכול טריפסין והוקפאו לתרבות משותפת מאוחר יותר. RBEC בודדו מקליפת מוח חולדה 5 שבועות בן. המוחות נוקו של קרומי המוח וחומר לבן, ומכאני ניתקו הבא עיכול אנזימטי. לאחר מכן, homogenate הרקמה היה centrifuged באלבומין בסרום שור להפריד ברי כלי מרקמת עצבים. שברי הכלי עברו עיכול אנזימטי שני לתאי האנדותל חופשיים מהמטריצה ​​תאית שלהם. תאים מזהמים שנותרו כגון pericytes היו further בוטל על ידי ציפוי שברי הדם הקטן במדיום המכיל puromycin. לאחר מכן הם היו passaged על מסננים לתרבות משותפת עם האסטרוציטים גדלו על החלק התחתון של הבארות. RBEC הביע רמות גבוהות של צומת הדוקה (TJ) חלבונים כגון occludin, claudin-5 והסתדרות ציונית-1 עם לוקליזציה טיפוסית בגבולות התא. התנגדות transendothelial החשמלית (Teer) של monolayers אנדותל במוח, המציינת את אטימות של TJS הגיעה 300 אוהם · 2 סנטימטר בממוצע. מקדמי החדירות האנדותל (PE) לוציפר הצהוב (LY) היו לשעתקו מאוד עם ממוצע של x 0.26 ± 0.11 10 -3 סנטימטר / דקה. תאי האנדותל במוח מאורגנים בmonolayers הביעו P-גליקופרוטאין בזרימת טרנספורטר (P-gp), הראו תחבורה מקוטבת של rhodamine 123, ליגנד עבור P-GP, והראו תחבורה ספציפית של transferrin-Cy3 וDiILDL ברחבי monolayer התא האנדותל. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול להקמה במבחנהמודל BBB שהוא שחזור מאוד בשל שיטות אבטחת האיכות, וכי הוא מתאים למחקר על מובילי BBB וקולטנים.

Introduction

תרופות רבות שפותחו לטיפול במערכת עצבים מרכזית (CNS) הפרעות אינן יכולים להגיע למוח parenchyma בריכוזים רלוונטיים טיפולי. BBB מגן על רקמת עצבים במוח מהתנודות של הרכב פלזמה, מגורמים פתוגניים, ושומר על הומאוסטזיס של parenchyma המוח על ידי הגבלת שטף שאינו ספציפי של יונים, פפטידים, חלבונים ואף תאים לתוך ומחוץ למוח 1.

מאפייני BBB מושרים ומתוחזק על ידי קירבה אינטימית ולדבר צולב בין התאים בכיתה מיוחדת microvessel המוח אנדותל והאלמנטים השכנים של יחידת נוירו, גליה וכלי הדם (NGVU) כגון תאי עצב, תאי גליה (לייתר דיוק astrocyte קצה רגליים), וpericytes ensheathed בקרום הבסיס שמורכב בעיקר מסוג IV קולגן, פיברונקטין, laminin וproteoglycans 2,3. Pericytes מכסה כ 22-32% מהאנדותל ברמת הנימים ולשחק חשובתפקיד בוויסות של התפשטות האנדותל, אנגיוגנזה ותהליכים דלקתיים. תאי האנדותל יוצרים גיליון רציף המכסה את פני השטח הפנימיים של נימי הדם. הם מחוברים ביניהם על ידי TJS, אשר יוצר מבנה דמוי חגורה באזור הפסגה ושתורם לתא קיטוב. האסטרוציטים מווסתים את מאפייני BBB ומקורות של גורמים רגולטוריים חשובים כגון TGF-β, GDNF, bFGF ו-IL-6. האסטרוציטים חסרים בGFAP עם פונקציונליות שלמה אינם מסוגלים לווסת את מאפייני BBB 4. הנוירונים לא ישירות מעורבים מבני במבנה של BBB, אלא גם להסדיר היבטים חשובים של ביטוי חלבון ופונקציות BBB 5.

על מנת ללמוד את המבנה, הפיסיולוגיה ופתולוגיה של BBB נוסף, במבחנה מודלים של BBB פותחו ככלי מחקר. תאי האנדותל במוח כבר חולצו ממינים שונים ליישום בדגמי BBB מבחנה מבוססבתרבויות נמוכות מעבר עיקרי מ6,7 שור, חזיריים 8,9, עכברוש 10,11,12, עכבר 13 וגם 14,15 האנושי. דגמים אלה ידועים לחקות את in vivo BBB, במיוחד כאשר שיתוף תרבותי עם תאי גלייה מחולדה או עכברי ו / או pericytes 16,12, ו / או האסטרוציטים שמקורן בתאי אב עצביים 17 ו / או נוירונים 18. הדגמים "במעבדה" לעתים קרובות מיוצרים ממכרסמים משום שהם מאפשרים במבחנה / in vivo ניסויים והשוואות ו / או המחקר של תאי האנדותל במוח המופקים ממודלים מהונדסים 19.

חדש שפותח במודלים של BBB מבחנה גם תוכנן כדי לעזור לנבא ספיגה במוח של תרופות פוטנציאליות במערכת העצבים המרכזית לפני בדיקת in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. במבחנה מודלים BBB משמשים בדרך כלל כדי להשוות ההובלה של תרופות עם: i) חדירה ידועה לתוך מערכת העצבים המרכזית או עם low חדירות פני BBB וללא תופעות מרכזיות, וii) Pe לכאורה של אותן התרופות שנמדדו במודלים של בעלי חיים מאותו המין. התרופות שעוברות בקלות BBB הן בעיקר lipophilic ולחצות את קרום תא אנדותל המוח על ידי תיווך שומנים דיפוזיה חופשית (קפאין, קרבמזפין, וכו '). התרופות מועברים באופן שלילי כגון דיגוקסין, verapamil או ציקלוספורין נמתחים באופן פעיל על ידי מובילים בזרימת אנדותל המוח כגון P-GP. עם זאת, רבים של המולקולות הטיפוליות החדש שפותחו הם תרופות ביולוגיות, כגון חלבונים רקומביננטיים, siRNAs או נוגדנים חד שבטיים. רובם לא לחצות את BBB עקב: א) היעדרות של מובילים מסוימים, וii) השכבה צפופה של תאי האנדותל, המונעים מולקולות במשקל מולקולריות גבוהות מעובר מעבר paracellular. במגבלות אלה, אסטרטגיות "סוס טרויאני" יושמו באמצעות וקטורים (נוגדנים, פפטידים) נגד קולטנים ידועים בBBB, מעורב in קולטן בתיווך תחבורה או transcytosis (RMT), כגון transferrin קולט (TF) (TFR), קולטן האינסולין (IR), או חברים של הקולטן ה-LDL (LDLR) הקשורים למשפחת קולט (LDLR, LRP1). קולטנים כאלה נמצאו בנימים במוח מבודדות ובBBB in vivo 24,25. פרופילי תעתיק לקולטנים אלה, ובמיוחד אלה של משפחת LDLR, נותחו והשוואה בין תאי מוח אנדותל ותאי האנדותל במוח שיתוף תרבותי עם האסטרוציטים או בנימי דם במוח מייד לאחר חילוצם מהמוח 26. 24 Pardridge פתח את השדה עם נוגדן OX-26 נגד קולט transferrin (TFR), ואחריו נוגדנים כנגד קולטן האינסולין והקולטן לגורם צמיחת אינסולין 27,28. עם וקטורי נוגדנים מבוססים אלה, ArmaGen טכנולוגיות פיתחה פלטפורמה טכנולוגית סוס טרויאני BBB מולקולרי, כדי לספק תרופות, כוללים חלבונים, מעבר לBBB 29.הספרות עשירה בנתונים המראים ביטוי LRP1 בתאי האנדותל במוח ואת תפקידה כקולט endocytic / נבלות רבות עוצמה. ניתוח כתם מערבי הציע כי LRP1 מתבטא בשברים מועשרים בנימים במוח ובתאי אנדותל נימים במוח חולדה 30. חברות כמו LRP1 יעד Angiochem עם וקטורי פפטיד נגזרו aprotinin המקדמים זרם תרופה יעיל על פני BBB ביום 31. עם זאת, LRP1 מעורב גם בהובלה פעילה של Aβ והזרימה / פינויה מparenchyma המוח לדם 32. נתונים אלה כוללים LRP1 בתחבורה דו כיוונית על פני BBB בהתאם ligands שלה. biOasis מפתחת טכנולוגית Transcend באמצעות melanotransferrin חלבון להובלת ביולוגי כגון אנזימי lysosomal ונוגדנים פני BBB 33 תוך Vect-הורוס מפתחת וקטורי פפטיד כי יעד LDLR 34. הנתונים מצביעים על כך שיש LRP וLDLR יכולים לשמש להובלת הבדלמולקולות erent כגון אנזימי lysosomal 35,36 או מתחמי nanoparticle פני BBB 37.

תחום העניין שלנו הוא אספקת סמים למערכת העצבים המרכזית באמצעות מולקולות וקטור וסמי מועמדי vectorized לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית. בפרט, משלוח סמים ברחבי BBB יש לשקול בהקשר של neuroinflammation, תהליך שעשויה להשתנות במידה שלה, אבל זה כנראה משותף לכל נגעים במערכת העצבים המרכזית ומחלות, כולל דלקת קרום המוח, טרשת נפוצה, מחלת אלצהיימר ועוד neuroinflammation קשור עם דלקת BBB ואפשרות לשינויים בפיזיולוגיה של BBB וחדירות בהתחשב בכך שparacellular והתחבורה transcellular יכולים להיות מוגברת במצבים פתולוגיים 38,39,40,41,42,43. למשל, TNF-α, לצבוט, וציטוקינים אחרים לווסת את הדלקת, וניסויים במבחנת מודלים BBB הראו כי הם יכולים לשנות את המאפיינים של ה paracellularדואר monolayer אנדותל תא 38,39,40 וכי TNF-α מובילים גם לעלייה בתחבורה transcellular של LDL 41, holotransferrin 42 ולקטופרין 43.

המטרה שלנו הייתה לפתח ולאפיין מותאם ומודל BBB syngeneic עכברוש מאוד לשחזור באמצעות שיתוף תרבויות של תאים ראשוניים במוח אנדותל והאסטרוציטים. אנחנו השתמשנו חולדות Wistar 5 בן שבוע ויילודים לייצור תאי אנדותל במוח וייצור astrocyte בהתאמה. אתגר אחד היה להקים פרוטוקול המאפשר הייצור של דגמי BBB "שבועי לשחזור". כדי להגיע למטרה זו, בכל שלב של פרוטוקול הייצור בוצע בימים קבועים בשבוע, החל מייצור דם קטן במוח ביום רביעי של השבוע הראשון. ניתוחים בוצעו כמעט בכל שבוע במהלך 3 השנים האחרונות. כדי לשפר את שחזור של התרבויות נוספות, מערכת אבטחת איכות הוקמה. כל reagents וכימיקלים היו בהפניה במסד נתונים (מועד כניסתו, מניות, לטווח תפוגה, וכו ').

המודל התאפיין הבא במספר הקריטריונים, כגון ארגון תא האנדותל ובטהרה, Teer, חדירות LY, בתגובה לסוכנים פרו דלקתיים, ביטוי איכותי וכמותית של חלבוני TJ, פונקציונלי של מובילים בזרימת כגון P-GP, וקולטנים מעורב בtranscytosis ברחבי monolayer התא האנדותל כגון TFR או LDLR.

Protocol

1. הפקה של עכברוש האסטרוציטים

עבור כל הכנה להשתמש 10 חולדות Wistar יילודים משני מינים.

  1. להקריב את החולדות על ידי חיתוך ראשים עם זוג מספריים ולהעביר אותם באופן מיידי בצלחת פטרי יבשה תחת הזרימה למינרית. הסר את המוח מהגולגולת בלי המוח הקטן ולהעביר אותם באופן מיידי לתוך צלחת פטרי המכילה חיץ נתיחה קר: HBSS בתוספת 1% הסרום אלבומין שור (רמה הנמוכה של רעלן פנימי BSA), 100 יחידות פניצילין / מיליליטר וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר.
  2. חותכים את המוח לשניים, כדי להפריד בין 2 אונות המוח ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי נקייה עם חיץ לנתיחה על קרח. חותכים את עצב הראייה ולהסיר את קרומי המוח בסטראו.
  3. שטוף את החלקים בקליפת המוח בהרחבה ב50 מיליליטר של חיץ לנתיחה קר.
  4. מניחים את חתיכות קליפת המוח מ3 מוחות לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר ולנתק על ידי pipetting למעלה ולמטה הפיכהle פעמים עם טפטפת חד פעמי 10 מיליליטר מצויד בטיפ כחול ל6 מיליליטר של טריפסין 0.05% - EDTA 0.02% במשך 5 דקות ב37 ° C.
  5. הוספת 24 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS והאנטיביוטיקה הבאות, פניצילין 100 יחידות / מיליליטר וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר, תקשורת בשם תקשורת גליה תא (GCM), ו צנטריפוגות XG 300 5 דקות ב RT. קבוצות FBS נבחרו ואושרו לצמיחה וההישרדות של cutures astrocyte.
  6. Resuspend את הכדור המכיל את התאים ניתקו ב10 GCM מיליליטר וצלחת לתוך 75 סנטימטר 2 T-צפחת (T75). לשנות את המדיום למחרת להסיר את פסולת התא וה-DNA. החלף את תרבות התקשורת פעמיים בשבוע.
  7. לאחר השבוע של ריבוי 1, בעדינות לנער את תאי גלייה עם שייקר מסלולית ב60 סל"ד במהלך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בGCM. אם T75 לא יכול להיות ממוקם באינקובטור עם 5% CO באוויר 2/95% על 37 מעלות אווירת humidified C, להשלים את התקשורת עם 5 HEPES מ"מ. לשטוף את התאים פעמיים לימיןסר תאי microglial שאינם חסיד.
  8. שלושה שבועות לאחר הזריעה, לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 3 מיליליטר של טריפסין החם 0.05%-EDTA 0.02%, דגירה על 37 מעלות צלזיוס ולחכות עד ששכבת התאים מפוזרת (בדרך כלל 5 דקות). לעכב פעילות טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של GCM, להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 120 XG במשך 8 דקות.
  9. Resuspend את כדור astrocyte בFBS 90% - DMSO 10%, להעביר אותם לתוך cryovials (2 x 10 6 תאים לכל cryovial) ולאחסן בחנקן נוזלי.

2. בידוד של microvessels מוח החולדה

הפרוצדורות שלנו מאושרות על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במרסיי ולעמוד בתקנות הלאומיות והאירופית (EU הוראת מס 86/609). כל המאמצים נעשו כדי למזער את הסבל של בעלי חיים ולצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים.

  1. לכל הכנה ולexperimente אחדr, השתמש 3 חולדות Wistar חמישה בשבוע ישנה.
  2. ביום שני של השבוע הראשון, להכין 2 צלוחיות T75 על ידי ציפוי עם סוג IV קולגן ופיברונקטין, הן במיקרוגרם / 1 סנטימטר 2 במי תרבות סטרילי (10 מיליליטר לT75). לאפשר לדבוק ב37 מעלות צלזיוס עד זריעת דם קטנה.
  3. בוקר יום רביעי של השבוע הראשון, להרדים את החולדות תחת שטף גובר של CO 2 לגרום לנמנום, אובדן היציבה והפרעה בנשימה, לאחר מכן על ידי נקע בצוואר הרחם. לרסס את הראשים עם 70% אתנול. חותכים את הראשים עם זוג מספריים ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי יבשה תחת הזרימה למינרית.
  4. הסר את המוח מהגולגולת בלי המוח הקטן ועצבי הראייה, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך צלחת פטרי מקורר בקרח ומלא בחיץ לנתיחה קרה (HBSS השלים עם BSA 1%, 100 יחידות פניצילין / מיקרוגרם / מיליליטר 100 מיליליטר וסטרפטומיצין) .
  5. חותכים את המוח במחצית להפריד את 2 אונות מוח ומוח תיכון נפרד לebrain. העבר forebrains לתוך צלחת פטרי נקייה על קרח עם חיץ לנתיחה.
  6. קח כמה חצאי המוח בצלחת פטרי חדשה עם חיץ לנתיחה קרה כדי להסיר את קרומי המוח בזהירות מforebrains תחת סטראו עם N ° 5 מלקחיים מעוקלים. לאחר מכן, לנקות את הפנים של המוח כדי להסיר את השמיכה של מיאלין ולקבל קליפה של קליפת המוח. צעדים אלה לא צריכים לקחת יותר משעה 2 לשימור רקמות והישרדות תא.
  7. לנתק את הקליפה מ3 מוחות ל6 מיליליטר של חיץ לנתיחה קר ב7 מיליליטר dounce homogenizer ידי 10 למעלה ולמטה משיכות עם כל אחד מ2 עליים של סיווג שונה, 71 מיקרומטר ואחרי 20 מיקרומטר.
  8. מחלקים את ההשעיה כדי להשיג את המקבילה של קליפה 1 ב 1 מיליליטר של צינור 50 מיליליטר פלקון ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. בטל supernatant.
  9. לעכל את ההשעיה מהקליפה 1 עם 1 מיליליטר של תמיסה אנזימטית המכילה תערובת של collagenases / dispase (R מיקרוגרם / מיליליטר 6011; 0.3 U / ml), סוג DNase אני (35 מיקרוגרם / מיליליטר - 20 K יחידות / מיליליטר) וגנטמיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) שבייקר ל30 דקות ב 37 ° C.
  10. מערבבים את 1 מיליליטר לעכל מקליפה 1 עם 10 מיליליטר של BSA 25% / HBSS 1X ונפרד על ידי צנטריפוגה תלויה הצפיפות ב3,600 XG במשך 15 דקות ב RT. להעביר בזהירות את הדיסק העליון (parenchyma המיאלין והמוח) ואת supernatant לתוך צינור פלקון נקי 50 מיליליטר וחזור צנטריפוגה. שמור את הכדור וכתוצאה מכך המכיל microvessels המוח ב 4 ° C.
  11. להשליך בזהירות את הדיסק העליון ואת supernatant. Resuspend שני כדורים וכתוצאה מכך המכילים microvessels המוח עם 1 מיליליטר של קר HBSS 1X ולהעביר לתוך צינור פלקון נקי 50 מיליליטר.
  12. שטוף את microvessels על ידי תוספת של 20 מיליליטר של קר HBSS 1X ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך 5 דקות. בטל supernatant.
  13. עוד לעכל את microvessels מקליפה 1 עם 1 מיליליטר של הפתרון זהה האנזימטית כמתואר בשלב 2.9 בשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס בshאקר.
  14. לאחר מכן, לערבב את microvessels מתעכל מכל אחת מ3 הקורטקס לתוך צינור אחד ולהפריד עוד יותר לשני 50 צינורות מיליליטר פלקון להשיג microvessels חולץ מן המקבילה של וחצי אחד (1.5) קליפת המוח לכל צינור. הוסף 30 מיליליטר של חיץ לנתיחה קרה ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT.
  15. Resuspend את כדור הדם הקטן ב10 מיליליטר של DMEM/F12 בתוספת סרום פלזמה עני 20% טסיות דם שור נגזר, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 2 ng / ml), הפרין (100 מיקרוגרם / מיליליטר), גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וHEPES (2.5 מ"מ), בשם מדיה תא האנדותל (ECM) בתוספת puromycin ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר.
  16. קח 2 צלוחיות T75 מצופים מן החממה, לשאוב את עודף הציפוי וצלחת microvessels מצינור אחד בבקבוק אחד T75 (microvessels מופק 1.5 קליפת המוח לכל בקבוק T75).

3. טיהור והפצתו של RBEC Primocultures

  1. טיהור: יום רביעי עד שישי, להוסיף puromycin ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר לתקשורת והתרבות. לשנות את המדיום ביום חמישי. ביום שישי, לשטוף את התאים ולהוסיף puromycin ב2 מיקרוגרם / מיליליטר עד יום שני.
  2. התפשטות: ביום שני של השבוע השני, לשטוף את התאים ולהוסיף אינסולין, transferrin ותוספת סלניום נתרן לתקשורת והתרבות ועד לתרבויות להגיע למפגש 90% ביום רביעי של השבוע השני.

. 4 בידול: הגדרת המודל חוץ גופית BBB

  1. היום שני של השבוע השני, להכין מסננים (פוליאתילן, 12 בארות, גודל נקבובית 1.0 מיקרומטר) על ידי ציפוי בתערובת של סוג IV קולגן ופיברונקטין הן ב0.5μg/cm 2 במי תרבות סטרילי (500 μl של תערובת בתא העליון ו1.5 מיליליטר של מים סטריליים תרבות בתא התחתון). לאפשר לדבוק ב37 מעלות צלזיוס עד זריעת RBEC.
  2. היום שני של השבוע השני, חמישה ימים לפני הקמתה של התרבות המשותפת, להפשיר את האסטרוציטים מcryovials על 37 מעלות צלזיוס והעברהבפלקון 15 מיליליטר עם 10 GCM מיליליטר. צנטריפוגה ההשעיה ב120 XG במשך 8 דקות ב RT.
  3. Resuspend את כדור astrocyte בGCM וצלחת בצפיפות של 30 x 10 3 תאים לכל 2 סנטימטר ב12 גם צלחות.
  4. יום רביעי של השבוע השני, ממש לפני הניתוק של RBEC עם טריפסין, לשטוף פעמיים את המסנן המצופה מראש עם מדיום DMEM/F12. טרום למלא את התאים עם ECM: 1.5 מיליליטר בתא התחתון ו0.5 מיליליטר בתא העליון.
  5. יום רביעי של השבוע השני, לשטוף פעמיים RBEC עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 4 מיליליטר של טריפסין החם 0.05% - פתרון 0,02% EDTA ב 37 C ° לכל בקבוק T75 במהלך 30 שניות בדיוק. ואז להסיר 3.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין ולבחון מתחת למיקרוסקופ. כאשר שכבת התאים מתחילה להתנתק מהמטריצה, לעזור להם בעדינות על ידי הקשה על קצה בקבוק T75 עד שכל התאים צפים.
  6. הוסף 9 מיליליטר של ECM לכל בקבוק T75 ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. מאוד בעדינות לנתק את התאהשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 4 פעמים עם טפטפת 10 מיליליטר מצויד בקצה צהוב (למנוע את הייצור של בועות בפתרון). ספירת התאים בתרחיף (כ 3 x 10 6 cells/T75) ומייד צלחת על מסננים מראש מצופים ומילאו מראש בצפיפות גבוהה (160 x 10 3 תאים / מסנן ומכאן כ 18 filters/T75) (איור 8 ). למחרת (יום חמישי), לשנות פעמיים את המדיום של התא העליון כדי להסיר פסולת תא.
  7. יום חמישי של השבוע השני, ביום שלפני הקמתה של התרבות המשותפת, להחליף את התקשורת ותרבות astrocyte ידי 1.5 מיליליטר של תקשורת בידול (ECM עם הידרוקורטיזון ב500 ננומטר), שניתן בתוספת 1/3 בינוניים מותנים מהתא הבסיסי של תרבות המשותפת קודם (3 ימים של קשר בין תאים והאסטרוציטים אנדותל).
  8. יום שישי של השבוע השני מוגדר כהיום 0 בידול; להחליף את התקשורת והתרבות מconta המסנניםining RBEC עם תקשורת בידול. העבר את מסנני RBEC לתוך הבארות המכילות את האסטרוציטים. בתנאים אלה, במבחנה מודלים להבדיל ולבטא חלבונים הקשורים לצומת תוך 3 ימים.
  9. המודלים לשמור על הבידול האופטימלי שלהם במהלך 3 ימים נוספים, בין הימים שני ורביעי בשבוע השלישי.

Representative Results

פרוטוקול ייצור
הפרוטוקול ניתן לחלק את 3 שלבים מקבילים לשינויים משמעותיים בהרכב תקשורת ותרבות: (א) טיהור של תאי אנדותל מmicrovessels, (ב) ריבוי והתמיינות (ג) על מסננים (צלחות פוליאתילן 12 גם עם נקבוביות של 1 מיקרומטר) בשיתוף התרבות עם האסטרוציטים. השלבים השונים של פרוטוקול הייצור חולקו לימים ספציפיים בשבוע על מנת להגדיל את שחזור של תרביות תאים ראשוניות (איור 1). ביום רביעי של השבוע הראשון, ומכאן 9 ימים לפני הקמתה של מערכת שיתוף התרבות, microvessels היו מבודד (איור 2 א). כדי לטהר את תאי אנדותל, התרבויות הוחזקו בנוכחות הפחתת ריכוזים של puromycin במשך 5 ימים. התאים מזהמים ביותר (בעיקר pericytes) בוטלו ואת הצמיחה של תאי האנדותל הייתה איטית יותר, ללא שינוים הפנוטיפ שלהם. ציר-sתאי haped לצמוח מתוך שברי הנימים מבודדים מחומר אפור במוח חולדה (איור 2). ביום שני של השבוע השני, האסטרוציטים חולדה היו מצופים בתחתית 12 גם צלחות. יום רביעי, RBEC נוספו לתא luminal של המסננים. זריעה בצפיפות גבוהה ב160 x 10 3 תאים / 2 סנטימטר (איור 2C) עוזר למנוע פערים בפריפריה של המסנן (איור 2 ד), ויוצר בידול הומוגנית של monolayer התא האנדותל. התאים מראים מורפולוגיה ציר בצורת מוארכת הטיפוסית, ליישר לאורך זמן, ויוצר monolayer אחיד. יום חמישי, התרבות בינוני astrocyte שונה למדיום הבידול ממוזג עם התקשורת הקודמת שיתוף התרבות (2E איור). יום שישי, RBEC על מסננים גודלו במדיום תרבות המכיל 500 הידרוקורטיזון ננומטר והמסננים הועברו ל12 גם צלחות המכילות את האסטרוציטים. בשבוע השלישי, ניסויי wפה בוצע בין יום השני ורביעי.

RBEC אפיון ואלמנטים של קביעה חד שכבתי חדירות
RBEC התאפיינו immunostaining של אנדותל וסמני BBB, כמו גם על ידי מדידות של Teer, חדירות של LY ופונקציונליות של מובילים בזרימת כגון P-GP.

RBEC מתקבל על ידי שיטת טיהור puromycin (איור 1 ו -2) גדל בmonolayers הרציף שאינו חופף שהציג עיכוב גדילה בנקודת מפגש ומוצג apposed בחוזקה, כישורי ומורפולוגיה דמויות כישור. תרבויות RBEC הביעו סמנים אופייניים לתאי האנדותל: הם הראו immunostaining החיובי למולקולת טסיות דם האנדותל הידבקות תא (איור 3 א; CD31/PECAM) וביטוי של גורם פון Willebrand (איור 3 ב). ללא טיפול puromycin, RBECs הם פלשו במהירות על ידי pericytes זוהה על ידי immunos desminTaining (איור 3 ג). fibrillary גליה חלבון חומצי (GFAP) הביע ידי האסטרוציטים (איור 3D) הוא סמן בידול חשוב של האסטרוציטים. עם מספר גבוה מעבר, האסטרוציטים לאבד את יכולתם כדי לגרום להתמיינות של תאי האנדותל. מסיבה זו, תרבויות astrocyte היו סטנדרטיות לזמן של תרבות שלהם, ורק עבר קטע אחד.

Culturing RBEC עם תקשורת בתוספת הידרוקורטיזון, ואחריו תרבות משותפת עם האסטרוציטים ועם מדיום מותנה מהתא התחתון של שיתוף תרבויות הקודמות הוביל לאינדוקציה חזקה של TJS interendothelial בהשוואה לRBEC תרבותי בלבד. התאים הביעו claudin-5, ההסתדרות הציונית-1 וoccludin חלבונים, שהיו נקודתיים בצמתים תאי תאים, כפי שמוצגים על ידי immunofluorescence (איור 4 ב-D) ונחשפו על ידי ניתוח כתם מערבי להסתדרות ציונית-1 וoccludin חלבונים (איור 4E ). ההפצה מורפולוגיים בגקשר ell אל התא בתצורה כמו רוכסן משקף () אטימות של monolayer, (ב) המקור המוחי של תאי אנדותל נימים, ו (ג) הוא אופייני לתאי אנדותל מוחין מובחנים מאוד. חדירות Paracellular של שכבת האנדותל הייתה פיקוח על ידי מדידת Teer ושיעור הזרם של LY (457 דא) מהעליון לתא התחתון של המסננים. Teer נמדד באמצעות ENDOHM-12 לכוסות תרבות 12 מ"מ מחוברים לvoltohmmeter EVOM. Teer של monolayers אנדותל במוח, המציין את אטימות של TJS הגיע 300 אוהם · 2 סנטימטר בממוצע (מסננים של 12 צלחות גם, מידע לא מוצגים). Pe לLY (PE (LY), המשמש כשליטת שלמות המחסום ושיתוף הודגרו עם תרכובות נבדקו) הגיע בממוצע של 0.26 x ± 0.11 10 -3 סנטימטר / דקה (איור 4F) על פני תקופה של שנה 1.

על מנת לגרום לדלקת של RBEC השתמשנו ביחסי הציבורTNF-α o דלקתי ציטוקינים ב5 / מיליליטר ng ל24 שעות, ואחריו התגובה הדלקתית על ידי מדידת CCL2 הפרשה (MCP-1) על ידי RBEC בתא העליון של מערכת התרבות אשר הוכפלה מ 120 ng / ml (שאינה טופל שליטה) ל250 מיליליטר ng / (איור 5 א). טיפול TNF-α ב5 ng / ml או 50 / מיליליטר ng ל24 שעות גם פתח BBB כפי שנחשף על ידי Pe מדידה (LY) (איור 5).

P-GP היה דמיינו בRBEC המובחן על ידי (איור 6 א) immunocytochemistry. לוקליזציה P-gp ידוע להיות מקוטבים מאוד והביעה למעשה בקרום הפסגה של תאי האנדותל 44 תוך גלוטמט טרנספורטר-1 (GLT-1) נמצאת בעיקר בחלק basolateral 45. כדי להעריך את מידת הקיטוב של RBEC התרבותי שלנו, חלבוני הפסגה וbasolateral הופרדו מהכנות קרום פלזמה באמצעות צפיפות סוכרוז הדרגתיים 46. ניתוח כתם המערבי היהבוצע כדי להעריך את רמות ביטוי של P-gp וGLT-1 בפלזמה, פסגת והכנות קרום בסיס. Microvessels חילוץ טרי ממוח החולדה שימש כביקורת החיובית הקרובה ביותר להפצה בvivo של חלבונים אלה (איור 6). בשני microvessels והכנות קרום RBEC מובחנות, P-gp בא לידי ביטוי כלהקה של 170 kDa, מקומי בעיקר בחלק קרום פסגת F1 (איור 6 ב ', ג'). ביטוי GLT-1 בא לידי ביטוי אכן בשבריר קרום בסיס F3 של microvessels כלהקה של 65-70 kDa, אך לא זוהה בRBEC בתרבית.

בניסויים מקבילים, הפעילות התפקודית של P-gp בשכבת תאי האנדותל נבדקה באמצעות rhodamine 123 (R123) כיגנד. Abluminal ללומינל (B ל) בזרימת של R123 היה גבוה פי 1.7 מאשר בכיוון ההפוך (איור 6 ד '). כדי להוכיח את מעורבות P-GP, השתמשנו מעכבי P-gp ספציפיים, verapamil (25 מיקרומטר, 30 preincubation דקות) וציקלוספורין (1 מיקרומטר, preincubation דקות 30). עם verapamil וטיפול ציקלוספורין, הצטברות R123 בRBEC הוגדלה 1.6 קיפול וקיפול 2 בהתאמה, בהשוואה לקבוצת ביקורת (איור 6E).

הקולטנים המעורבים בקולטן בתיווך Transcytosis מנגנונים (RMT)
המודל התאפיין נוסף לביטוי של קולטנים שונים שעלולים להיות מעורבים במנגנוני transcytosis בBBB, כגון LRP1, LDLR או TFR (איור 7 א).

מחקרי תחבורה פונקציונליים בוצעו עם ligands לTFR וLDLR. לחיות RBEC הודגרו עם transferrin החולדה שכותרתו עם CY3 (TF-Cy3) ל180 דקות ב 37 ° C (איור 7 ב, ג). כימות של ספיגת TF-Cy3 והובלה בחולדה במודל BBB מבחנה הראתה כי שיפוע העקומים מעט ירד מעבר 2,400 picomoleים (איור 7), המצביע על כך מחייב / הספיגה הייתה saturable. יתר על כן, את הרוויה של מחייבת / הספיגה הייתה בקורלציה עם ההצטברות של TF בתא התחתון. כדי לאשר אבחנה זו, TF-Cy3 היה טופח על 1,200 picomoles (חלק עולה של העקומה) עם עודף של פרובידנס לא פלורסנט ב4,800 picomoles (רמה / רוויה) (איור 7C). ניסויים אלה הראו ירידה של הצטברות TF-Cy3 בתא התחתון ואישרו מנגנון saturable אופייני לאינטראקציה ליגנד לקולטן במודל BBB במבחנה שלנו.

בדומה לכך, פונקציונלי LDLR הודגם על ידי הספיגה וההובלה של DiILDL יגנד ברחבי monolayer תא אנדותל (איור 7D, E). RBEC בשידור חי הודגרו עם DiILDL ל30 דקות ב 37 ° C. הקשירה / הספיגה לא הייתה מתואמת עם ההצטברות של DiILDL בתא התחתון (איור 7D). כימות DiILתחבורת DL הראתה כי שיפוע עקום ירד מעבר 2 מיקרוגרם, המצביע על התחבורה שהייתה saturable והקשורות לקולטן במודל שלנו. אזיד הנתרן נוספה ב0.05%, 15 דקות לפני הדגירה DiILDL (7E איור). העדר הרעילות של דגירה אזיד הנתרן ב0.05% הוערך על ידי Pe מדידה (LY) (מידע לא מוצג). ניסויים אלה הראו ירידה בהצטברות DiILDL בתא התחתון. בסך הכל, התוצאות שלנו מראות RMT לDiILDL במודל BBB במבחנה שלנו.

מודלים במבחנה BBB אחרים המבוססים על תאי האנדותל מחוט השדרה של חולדה או מוח עכבר
עיכול אנזימתי עם שילוב של collagenases / dispase הוא אחד הפרמטרים העיקריים לשליטה במונחים של כדאיות תא ותשואת ייצור של microvessels מוחין. הריכוז של אנזים וחשוב יותר את היחס בין כמות היחסית אנזים לרקמות, needs להיות מכויל בדיוק בין מוח חולדה, בחוט השדרה ובמוח חולדה עכברים. צפיפות זריעת כלי דם קטנה ומספרם של תאי האנדותל כדי להגיע למפגש 90% (זריעת microvessel הודעה 9 ימים) היו קשורים והם פרמטרים חשובים כדי לשפר את צמיחת תאים, להגביל את מספר הכפלת אוכלוסייה והאיכות של הדגמים. microvessels חוט השדרה עכברוש יוצרו עם אותו הפרוטוקול כמו זה מתואר במסמך זה לmicrovessels מוח חולדה (במונחים של כמות רקמה, 2 מיתרי השדרה מתאימים כ למוח 1) כדי להשיג את אותה הכמות של תאים לכל בקבוק T75 בתוך אותו הזמן בקנה מידה . קרומי המוח ממוח עכברי C57BL6 5 שבועות בן היו קשים לחסל משום שהם מקל על קליפת המוח. טיפול קצר של המוח עם dispase מופיע כדי להקל על ההסרה של קרומי המוח. הפרמטרים החשובים שתורמים לייצור של monolayers תא האנדותל לשעתק ממוח חולדה, חוט השדרה חולדה ומוח עכבר מודגשים ומסוכם באיור 8.

איור 1
איור 1. תרשים זרימה המסכם את השלבים העיקריים של במבחנה הכנת מודל BBB. השלבים השונים של פרוטוקול הייצור חולקו לימים ספציפיים בשבוע על מנת להגדיל את שחזור של תרביות תאי אנדותל העיקריות. הפרוטוקול מתחיל ביום רביעי של השבוע הראשון, עם ייצור דם קטן מחולדות Wistar 5 שבועות בן.

איור 2
איור 2. Photomicrographs בניגוד שלב של RBEC, האסטרוציטים ומערכת התרבות המשותפת. (א) שברי 5 שבועות ישנים Wistar microvessel העכברוש בעת ציפוי החוצה.(ב) תרבויות שלושה ימים ישנים RBEC טופלו במשך 2 ימים עם puromycin מצע P-gp ב4 מיקרוגרם / מיליליטר. (C) monolayers אנדותל מחוברות הטהור ביום 1 לאחר ציפוי על מסנני Millipore של צלחת גם 12 מצופה בסוג קולגן הומוגניות IV ופיברונקטין. (ד ') של monolayer התא בפריפריה של המסנן להוסיף. (ה) תרבות astrocyte מחוברות ביום הקמתה של התרבות המשותפת מראה מורפולוגיה חלת דבש מאופיינת. (F) תכנית המייצגת את התרבות המשותפת מערכת עם לוקליזציה של photomicrographs בC, D ו-E

איור 3
איור 3. אפיון תרבויות RBEC ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. (א) בתאי אנדותל במוח להביע את התא האנדותל טסיות דםPECAM/CD31 מולקולת הידבקות בגבול התא, (ב ') גורם פון Willebrand (VWF) מראה כתמים יחסית punctate, בהיר יותר המצטבר בתאים מסוימים יותר מאחרים, והתרכזו באזור perinuclear. (C) ללא טיפול puromycin של RBEC תרבויות, pericytes מזוהים עם immunostaining חיובי עבור desmin (בירוק) ויש גרעינים קטנים ועגולים אופייניים. האסטרוציטים (ד ') להביע את חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. אפיון Immunocytochemical של העכברוש במודל BBB מבחנה וחדירות paracellular שלLY ברחבי monolayer אנדותל. Monolayer התא היה immunostained עם vimentin () כדי לחשוף monolayer תא אנדותל מחוברות המוח עם מורפולוגיה שאינה חופפות ותאים דמויי כישור טיפוסי עם מורפולוגיה אנדותל והביטוי של חלבוני צומת הדוקים (ב ') claudin-5 , (ג) ההסתדרות הציונית-1 ו (ד ') אטימות occludin, גם זוהה על ידי כתם מערבי להסתדרות ציונית-1 וoccludin חלבונים (E). (F) חד שכבתי במודל 12 גם BBB הוערכו על ידי מדידת ההובלה של לוציפר הצהוב (LY-CH, מלח dilithium), מולקולה קטנה הידרופילי (MW 457 דא) ידועה שמרה על ידי BBB. בקצרה, LY הודגר בתא העליון של מערכת התרבות במגע עם תאי אנדותל מוחין עבור 60 דקות ב 37 ° C. אחרי כל הזמן הזה, המדיום של התא התחתון נאסף והקרינה הייתה לכמת ידי ניתוח fluorimetric עם spectrofluorimetאה עם עירור ב430 ננומטר, ופליטה ב535 ננומטר. התוצאות באות לידי ביטוי בחדירות או Pe ב10 -3 סנטימטר / דקה. המכשול נחשב חדיר או פתוח, כאשר Pe של LY הוא מעל 0.6x10 -3 סנטימטר / דקה. במהלך כל ניסוי 1 שעות, הנפח פינה הממוצע היה זמם לעומת זמן והמדרון שהוערך על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית. שיפוע העקום אישור למסנני שליטה עם ציפוי IV-פיברונקטין סוג קולגן שכונה על כוחות הביטחון הפלסטיניים ושיפוע העקום אישור למסננים עם monolayers תא אנדותל במוח היו מסומנים PST. ערך PS לmonolayer אנדותל (PSE) חושב מ: אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

משוואת 1

ערכי PSE חולקו על ידי השטח של porקרום היחידות הארגוניות (1.1 2 סנטימטר על מסנני Millipore של 12 גם צלחות) והתוצאה היה מקדם חדירות (PE) עם ממוצע של x 0.26 ± 0.11 10 -3 סנטימטר / דקה. תוצאות מוצגות עם ייצוג אנכי פיזור עלילה עבור n = 90 מבחני (ממוצע של n = 3 ל n = 6 monolayers לassay).

איור 5
איור 5. במבחנה תגובת BBB מודל לטיפול עם TNF-α הסוכן הפרו דלקתי. התקשורת והתרבות ממערכת התרבות הוחלפה רק לפני טיפול TNF-α ב5 / מיליליטר ng בתא העליון לשעה 6, שעות 12 ו24 שעות. שחרור CCL2 ידי RBEC היה לכמת בתא העליון על ידי assay ELISA בהשוואה לשליטה שאינו מטופלים. שימו לב שרמות MCP-1 להגדיל מעט כפונקציה של זמן, גם בבארות שאינן המטופלים. יושרתו של מכשול התא האנדותל נמדד על ידי Pe אנדותל לLY Pe (LY) גילתה עלייה בחדירות monolayer על ידי טיפול שעה 24 עם TNF-α ב5 ng / ml או 50 / מיליליטר ng בטווח של 0.62 ± 0.02 x 10 - 3 סנטימטר / דקות וx 0.7 ± 0.01 10 -3 סנטימטר / דקה, בהתאמה, בהשוואה לשליטה ב0.33 x ± 0.03 10 -3 סנטימטר / דקות (מבחן t של סטודנט, p <0.05).

איור 6
איור 6. פונקציונליות של טרנספורטר P-gp בזרימת וקיטוב RBEC. הביטוי של טרנספורטר P-gp בזרימת בתאי האנדותל במוח שיתוף תרבותיים עם האסטרוציטים ידי immunocytochemistry () וכתם מערבי (B & C). חלבוני קרום תא חולצו עם fractiona חלבון תאיערכת tion. ממברנות פלזמה התקבלו על ידי centrifugations תמוגה וההפרש hypotonic לחסל אברונים וגרעינים. הפרדת חלבוני הפסגה וbasolateral מקרום הפלזמה התקבלו על ידי שיפוע צפיפות סוכרוז. P-GP היה מקומי בעיקר בחלק apical (F1) תוך גלוטמט טרנספורטר-1 (GLT-1) היה מקומי בעיקר בשבריר basolateral (F3). microvessels מטוהר לפני ציפוי שימש כבקרה ללוקליזציה vivo של החלבונים האלה. פעילותה של P-gp נקבעה על ידי מדידת קוטביות ההובלה של R123, יגנד P-GP. השטף של 1 מיקרומטר R123 נמדד עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס ב( A ל-B) luminal לabluminal ובכיווני abluminal לluminal (B ל) הפוכים. אותו הניסוי היה להתממש ללא RBEC להעריך דיפוזיה פסיבית על פני המסנן להוסיף והנתונים היו מנורמלים ביחס לערך הזה לחישוב Pe (R123) (ראה איור 5 (R123) (A ל-B). Verapamil (25 מיקרומטר, 30 preincubation דקות) וציקלוספורין (1 מיקרומטר, preincubation דקות 30) שימשו כמעכבי P-gp התייחסות. הצטברות R123 בRBEC נמדדה לאחר 2 שעות עם או בלי preincubation עם מעכבי P-gp (של סטודנטים מבחן t, p <0.05). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. אפיון קולטנים המעורבים בקולטן בתיווך Transcytosis (RMT). () monolayer RBEC הבדיל היה immunostained עם נוגדנים כנגד קולטן בצפיפות הנמוך הקשורים ליפופרוטאין 1 (LRP1) וקולטן בצפיפות הנמוכה ליפופרוטאין (LDLR). תמונת confocal של RBEC חקרה לספיגה של DiILDL, יגנד ניאון של LDLR ולספיגה של עכברוש transferrin-Cy3, יגנד ניאון של מכתים punctate מופע TFR על פני התא, עם כמה אשכולות באזור perinuclear. (B) עכברוש TF-Cy3 התווסף לתא העליון המכיל את monolayer RBEC המובחן ב75, 150, 300, 600, 1,200, 2,400 ו 4,800 picomoles / להכניס ל180 דקות ב 37 ° C (200 μL בתא העליון ו1,200 μL ב התא התחתון). אחרי כל הזמן הזה, הקרינה Cy3 הייתה לכמת בlysate התא (200 μL של PBS 0.1% X100 טריטון) ובתא התחתון על ידי ניתוח fluorimetric עם spectrofluorimeter עם עירור ב 550 ננומטר ופליטה ב 570 nמ '. יחידות הקרינה נהפכו בpicomoles באמצעות טווח עבודה ליניארי. (ג) לניסויי רוויה, עכברוש TF-Cy3 התווסף לתא העליון המכיל את monolayer RBEC המובחן ב1,200 picomoles / להכניס ל180 דקות ב 37 ° C עם או בלי 15 דקות מראש דגירה עם 4,800 picomoles / הוספה של פרובידנס לא פלורסנט. התחבורה בתא התחתון הייתה לכמת כב( מבחן t של סטודנט, p <0.05) (ב). (ד ') DiILDL התווסף לתא העליון המכיל את monolayer RBEC המובחן בבית 1, 2, 4 ו 8 מסננים מיקרוגרם / להוסיף ל30 דקות ב 37 ° C (200 μl בתא העליון ו1,200 μl בתא התחתון). אחרי כל הזמן הזה, הקרינה DiI הייתה לכמת בlysate התא (200 μl של PBS 0.1% X100 טריטון) ובתא התחתון על ידי ניתוח fluorimetric עם spectrofluorimeter עם עירור ב554 ננומטר ופליטה ב 571 ננומטר. נורותcence יחידות נהפכו במיקרוגרם באמצעות טווח עבודה ליניארי. (ה) לתחבורה חוסמת את הניסויים, אזיד הנתרן נוספה ב0.05% 15 דקות לפני הדגירה של DiILDL ב2 מיקרוגרם / להכניס ל30 דקות ב 37 ° C. התחבורה בתא התחתון הייתה לכמת כב( מבחן t של סטודנט, p <0.05) (ד '). העדר הרעילות של דגירה אזיד הנתרן ב0.05% הוערך על ידי Pe מדידה (LY) (מידע לא מוצג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8
איור 8. במבחנה המודלים BBB מתאי אנדותל בחוט השדרה חולדה או ממוח עכבר. השולחן גבוהמדליק פרמטרים חשובים למיצוי דם קטן ממוח חולדה, חוט השדרה חולדה ומוח עכבר. Photomicrographs להראות immunostaining לZO1 וoccludin בmonolayers תא אנדותל שהוכן ממוח חולדה, חוט השדרה חולדה ומוח עכבר.

Discussion

אנו מתארים את יישומו של פרוטוקול לשחזור שבועי לבידוד והציפוי של microvessels המוח, בעקבות טיהור והתרבות של RBEC והגדרות נוספות של שיתוף תרבויות עם האסטרוציטים עכברוש עיקריים ליצירת מודל BBB במבחנה עם מאפייני BBB אופייניים.

בהצלחה הקמת טופל בתרבויות BBB מבחנה דורשת תנאים אופטימליים בשלבים רציפים המרובים של התהליך. המודל (א) מותאם כדי להשיג את חדירות paracellular הנמוכה ביותר, אשר נשארה "הגביע הקדוש" של במבחנה מודלים BBB, ו (ב) תוקף לזרימה ומנגנוני RMT.

ייצור, טיהור והפצתו של RBEC

האתגר הגדול ביותר, כאשר טיפוח RBEC הוא להשיג שחזור בין תרבויות השונות. תקינה של הפרוטוקול דורשת כלים באיכות גבוהה עבור דיססעיף, חומרים כימיים באיכות גבוהה ובכבוד של תאריכי תפוגה מגיב. הנסיין צריך להיות מיומן במייקרו לנתיחה תחת סטראו להסרת מהירה של קרומי המוח וכלי שיט גדולים ממשטח קליפת המוח. ברגע שהמוח מבודד ומנותק באופן מכאני, אחד האתגרים העיקריים הוא עיכול אנזימטי האופטימלי של microvessels המוח מבודד הטרי. הסוג והאיכות של האנזימים המשמשים הוא קריטי. שילוב של סוג I ו-II וcollagenases dispase בריכוז גבוה עם שונות נמוכות בין קבוצות היה בשימוש. חשוב גם הם את משך הזמן של עיכול אנזימטי והיחס בין משקל ריכוז האנזים / רקמה / נפח של מערכת העיכול. התשואה הטובה ביותר של ייצור דם קטן במוח שהושגה עם המקבילה של קליפת מוח מהמוח 1 ב 1 מיליליטר של collagenases / dispase לערבב ב60 מיקרוגרם / מיליליטר בשני digestions, בהתאמה 30 דקות ושעה 1.

כמו כן קריטי הוא חיסול זיהום תאs (האסטרוציטים ובעיקר pericytes). תאים אלה מתרבים בקצב גבוה יותר מאשר תאי אנדותל ולא להקים צמתים הדוקים עם האחרונים, ובכך למנוע את הקמתה של monolayer תא הומוגנית עם restrictiveness paracellular טוב. בהתחשב בכך שתאי האנדותל במוח להביע את הרמות גבוהות יותר של משאבות בזרימת, במיוחד P-GP, בהשוואה לסוגי תאים האחרים הנמצאים בmicrovessels, הם יסבלו יותר טובים ריכוזים אחרים הרעילים של תרופות ליגנד P-GP, ואילו תאים שאינם אנדותל בוטלו. טיפול puromycin ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר ביומיים הראשון ואחריו עוד יומיים ב2 מיקרוגרם / מיליליטר להשיג טוהר תא האנדותל טוב. בחירה זו יכולה גם להעדיף תאי אנדותל נימים לעומת אלו מvenules, arterioles מראש נימים או microvessels הגדול יותר, ולהוביל לmonolayers הדוק יותר. בנוסף, השימוש בסרום שור המופק מפלזמה העני הוא הכרחי כדי להשיג תרבויות טהורות של תאי האנדותל 47,48. הפלזמה דרסרום ived חסר גורם הנגזר טסיות גדילה (PDGF), שהוא mitogenic עבור fibroblasts, בתאי שריר חלק ולכן לpericytes.

אנו הבחנו כי טיפול של פלסטיק ומסננים עם שילוב של סוג IV קולגן מעכברים ופיברונקטין האנושי מניב יתרון משמעותי, עם עלייה של פי 2 מהתשואה הריבוי בהשוואה לסוג קולגן המומלץ באופן מסורתי אני מזנב חולדה. רמזים חשובים להתפשטות תאים מסופקים על ידי מטריקס תאי כגון integrin וגורם גדילה (bFGF) הפעלה 49. ריכוז החיץ וה-pH של התקשורת בתרבות תוארו כדי להשפיע לטובה על אטימות paracellular 50 ואנו נצפו שחזור טוב יותר בין תרבויות בתוספת חיץ HEPES ב5 מ"מ.

בידול של RBEC: עמית תרבות ההקמה במסננים הכנס

ברגע שתאי האנדותל במוח יש בeen מטוהר והתרבה ​​במשך 6 ימים, הם יכולים להיות מצופים במסננים. ציפוי תא בצפיפות גבוהה הוא קריטי כדי להשיג monolayer מושלם. צפיפות זריעה של 160x10 3 תאים לכל 12 מסנני צלחת גם הייתה הכרחית ומספיק כדי להשיג monolayer 24 שעות מחוברות לאחר זריעה. עם זאת, בידוד של תאי אנדותל נימים במוח עיקריים מהסביבה שלהם הוא פרדוקס בבניית מודל במבחנה BBB כפי שהוא ידוע כי תאים ראשוניים, ותאי אנדותל נימים בעיקר במוח, הם מאוד מוסדרים על ידי סביבתם וגורמים אינדוקטיביים המיוצרים על ידי סוגי תאים שמסביב השונים. תאי אנדותל נימי מוח בתרבית לבד במהירות דה להבדיל ולאבד קצת סמני אנדותל ספציפיים במוח. לכן, יש להשתמש בתאים האנדותל עיקריים במעבר נמוך (P1) ומתחברים אליה מחדש, לפחות בחלקו, עם סביבתם על ידי שיתוף תרבות עם האסטרוציטים או בינוני מותנה על ידי האסטרוציטים 47,51. זה מחזיקנכון לבידול astrocyte כמו תאי אנדותל במוח והאסטרוציטים מעורבים באינדוקציה דו כיוונית. Culturing RBEC עם האסטרוציטים הוביל לאינדוקציה חזקה של TJ interendothelial 52,23. המנגנונים המולקולריים של מחדש אינדוקציה אינם ידועים ברוב, והמחקר ממשיך בכמה מעבדות לזיהוי גורמים ספציפיים ויסות מופרשים על ידי האסטרוציטים, שיכול לקדם את התמיינות תאי אנדותל אופטימלית 53,54. גורמים המופרשים על ידי תאי האנדותל במוח כולל גורם המעכב לוקמיה (LIF) הוכחו להשרות התמיינות astrocytic 55,56. לפני הקמת שיתוף התרבות, האסטרוציטים נחשפו למדיום בידול המכיל הידרוקורטיזון אגוניסט הקולטן glucocorticoid, ושיתוף תרבות התנו בינונית. הידרוקורטיזון ידוע כדי לשפר את אטימות של תאי האנדותל במוח ומשמש במודלים של BBB במיוחד מחולדה ועכבר 57 58,59 תאי האנדותל. Medi התנהאממ נאסף מהתא התחתון של מערכת תא שיתוף התרבות / astrocyte אנדותל לאחר 3 ימים וקפוא לשימוש מאוחר יותר. השימוש במדיום שיתוף תרבות מותנה הפחית את הזמן של התמיינות תאי האנדותל עד 3 ימים עם חדירות אופטימליות paracellular לעוד 2 ימים ושחזור השתפר גם בין תרבויות.

בסך הכל, בפרוטוקול שאנו מתארים תשואות Teer לשעתק מעל 300 אוהם · 2 סנטימטר ומקדם חדירות paracellular ממוצעת Pe (LY) של x 0.26 ± 0.11 10 -3 סנטימטר / דקה, בדומה לדגמים הטובים ביותר העיקריים מבוסס תאי BBB 22, 12. הפרוטוקול שאנו מתארים בכתב היד בהווה עם האפנון המוצע של עיכול אנזימטי דם קטן ניתן להרחיב לתאי אנדותל מחוט השדרה עכברוש 60 וממוח עכברים.

אפיון מולקולרי ופונקציונלי

בנוסףלאינדוקצית TJ, האסטרוציטים גם תורמים לביטוי של מובילים בזרימת כגון P-gp בתאי האנדותל במוח 61. אנחנו אכן מראים ביטוי של טרנספורטר P-gp בזרימת במודל BBB ואנחנו מדגימים את הקוטביות של לוקליזציה המשאבה בזרימת P-gp תוך שימוש בגישות ביוכימיים, ופעילות P-gp באמצעות assay פונקציונלי. ביטוי GLT-1 זוהה בחלק קרום הבסיס של microvessels אך לא זוהה בRBEC בתרבית. אנו משערים כי GLT-1 היה מוסדר במורד בתרבות RBEC שלנו בהשוואה לin vivo תנאים וכתוצאה מכך לא ניתן לגילוי על ידי ניתוח כתם מערבי. עודף גלוטמט הוא רעיל למערכת עצבים וin vivo, GLT-1 הוא אחראי לזרימת גלוטמט מהתא הבסיסי (parenchyma) לתא apical (זרימת דם). בתרבויות astrocyte, ביטוי GLT-1 נותר נמוך מאוד והיא נגרמת על ידי התוספת של גלוטמט ב62,63 בינוניים.

אנחנו גם confIRM הביטוי של מובילי זרם בקרום הפסגה כגון LRP1, LDLR וTFR. הפונקציונליות של TFR וLDLR הודגמה עם כריכה והובלת ניסויים של TF-Cy3 וDiLDL מluminal לצד abluminal של monolayer כפי שמוצג בעבר עם שור במודל BBB מבחנה 64. מעניין, זה כבר הראה כי דרישת שומנים מהאסטרוציטים מגבירה את הביטוי של LDLR על תאי אנדותל נימי מוח 65,66 מאשרים נוספים crosstalk הפיזיולוגי בין האסטרוציטים ותאי האנדותל במוח, כוללים במבחנה. אנחנו בחרנו להדגים תחבורה עם צבעי ניאון כגון כCy3 וDiI בהתחשב בעובדה שניתוח spectrofluorimetric זמין ברוב המעבדות, ויכול להיות שימושי כדי לאמת במודלים של BBB מבחנה. עם זאת, כימות של הקרינה היא הרבה פחות רגישה מרדיואקטיביות ודורשת גידול במספר של ניסויים כדי לקבל נתונים משמעותיים. באופן אידיאלי, פרובידנס ו-LDL הם בדרך כלל רדיואקטיבי (יוד 125) לניסויים מחייבות / ספיגה והובלה כאמור.

כמו כן, אנו מראים כי monolayer תא אנדותל הבדיל שהושג עם הפרוטוקול המוצע מגיב לדלקת הנגרמת על ידי TNF-α, כפי שנחשף על ידי שחרור CCL2 ופתיחת BBB. CCL2 (MCP-1) וCCR2 הקולטן שלו מעורבים בפתולוגיות מערכת העצבים המרכזית כגון טרשת נפוצה, Encephalomyelitis הניסיוני אוטואימוניות (EAE) 67, טראומה במערכת העצבים המרכזית 68 וידועים כמתווכים של הגירה לויקוציטים לתוך מערכת העצבים המרכזית בתנאי neuroinflammatory 69,70. עם הפרוטוקול שנבדק, אנחנו לא יכולים להסיק על הפרשה מקוטבת של CCL2 בגלל פתיחת BBB מאפשרת ריכוז CCL2 לאזן בין שני תאים העליונים (apical) ותחתונים (בסיס). כתוצאה מכך, ברור לנו לזלזל בסכום של CCL2 מיוצר על ידי RBEC בתא apical ב24 שעות (איור 5 א).

> סקירה כללית ומגבלות של BBB במודלים חוץ גופית: אני n Vivo לעומת במבחנה ומכרסמת לעומת השוואות אדם

תרופות למערכת העצבים המרכזית מבטיחות רבות שהוכיחו את יעילותה במעבר BBB במבחנה נכשלו בניסויים קליניים בשל חוסר יכולת החיזוי ממודלי BBB מבחנה מבוססת לעתים קרובות על תאים מבודדים ממינים אחרים מאשר אדם. למיטב ידיעתנו, במבחנה המודלים BBB הם כנראה חזוי יותר כשמדובר בלימוד היבטים מכניסטית של רשתות חלבון, הולכים אותות, מובילים וקולטנים. כל מנגנון, מסלול או יעד להיחקר במבחנה צריך להיות מאופיין ברגולציה שלה על ידי רמזים משלימים סביבתיים (סוגי תאים, כימיקלים, חלבונים אחרים) ושילוב במחקרים באתר עם ​​אותו המין של בעלי החיים, וכאשר הדבר אפשרי, עם microvessels ותאי האנדותל מבודד מבני האדם, במגבלות ובזהירות עורר להלן.

במבחנה מודלים BBB צריכים להיתפס כמערכות אוטונומיות, מבודדות מרגולציה גוף, אך עדיין ניחן במאפייני vivo גדולים ופוטנציאל לרגולציה על ידי רמזים סביבתיים. לא "אידיאלי" במבחנה מודל BBB הוצע עדיין 71,72,73 כי monolayers התא האנדותל חסר מספר המרכיבים החשובים של יחידת נוירו גליה כלי הדם (NGVU) ומבודד מהדם והרגולציה גוף. חוסר pericytes 74,16 או נוירונים 17,18 או המרכיבים השונים של מטריקס תאי המשמש לציפוי פלסטיק או מדיום התרבות והסרום המשמש לגדילת תאים ובנפוץ ביותר במבחנה מודלים "שנעשה הקל ביותר" BBB מבוססים על האנדותל תאים מובחנים עם האסטרוציטים עשויים לווסת i ביטוי החלבוןn השוואה למצב in vivo 75. מודלים אלה עשויים לבטא מובילים רבים מוצגים בvivo, אך לא כולם. במקרים מסוימים, פרמטרים תחבורה אומתו ראשון בmicrovessels המבודד (הקרוב ביותר למצב בvivo), ולאחר מכן למדו במערכות תרבית תאי 76,61.

מחקר בביולוגיה מולקולרי אפשר האפיון של ביטוי גנים והחלבונים בmicrovessels המבודד ותרביות תאי האנדותל נמוכות מעבר מאותו המין, ובין מינים שונים, לרוב מבעלי חיים קטנים כמו מכרסמים (עכברים וחולדות) או מפרה וחזיר ב השוואה לבני אדם 77,78,75,15. השוואת transcriptomic בין in vivo ו בתאי אנדותל כלי הדם במוח במבחנה הראתה תעתיקי גנים רבים שבאו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי ולרוב downregulated משמעותי במבחנה. תמלילי קידוד מובילי זרם כגון TFR ויחסי ציבורoteins מעורב בסחר בשלפוחית ​​הם downregulated בעיקר בתאי האנדותל במוח בתרבית, דבר המצביע על ירידה כללית באנדוציטוזה והתחבורה ועי בתאים מסוג זה. מניפולציה תרבות במונחים של טוהר (טיפול puromycin) וטיפול עם הידרוקורטיזון עשויה לעזור להחזיר את "בדמוי vivo" פרופיל ביטוי גנים יותר 77. מחקרי transcriptomic חשפו גם הבדלים חשובים בין מינים שמסבכים עוד יותר את תחזיות על ספיגת תרופה בבני אדם המבוססים על מכרסמים במודלים של BBB מבחנה 75. במבחנה המודלים BBB מעורב תרבות משותפת של תאי אנדותל אנושיים והאסטרוציטים תוארו 15. למרות רלוונטי, מודלים אלה קשים יותר ליישום על בסיס קבוע כפי שהם דורשים גישה מוסדרת לרקמה אנושית שלאחר המוות ויש הטרוגניות באיכות / המאפיינים של תאי האנדותל המוח האנושיים בהתאם לגיל, מחלות, ואולי גם רפואי treatmenלא של תורמים. מאמצים צריכים להיעשות כדי לפתח במבחנה מודלים חדשים שטוב יותר להתרבות פיסיולוגי, אנטומי ומאפיינים פונקציונליים של in vivo BBB. שיתוף תרבויות מעורבים שלושת סוגי תא הן מגבילות ביותר ומופיעות קשה ליישום באופן שיגרתי. נכון להיום, במבחנה המודלים BBB המורכבים ביותר הם במבחנה המודלים הדינמיים (DIV-BBB) הכוללים ארגון כמו כלי עם האסטרוציטים וכוללים זרימת בינונית המחקה את זרימת דם 75,79,80,81,82, 83,84,85. כאשר תאי אנדותל מוחין חשופים לזרימה, מאמץ הגזירה שנוצר מפעיל mechanotransducers על פני התא, המווסת את הביטוי של גנים שונים המעורבים בפיזיולוגיה של תא האנדותל כגון חלוקת תאים, התמיינות, הגירה ואפופטוזיס 80. בvivo, מאמץ גזירה נוצר על ידי זרימת הדם הוא אחראי למעצר mitotic במגע התא, המאפשר את הקמתה שלmonolayer תא האנדותל בכלי דם 80. אנליזה גנומית וproteomic של תאי אנדותל כלי הדם במוח האנושי נורמלים הראתה את ההשפעה של מאמץ גזירה בפיסיולוגיה אנדותל BBB 84. מאמץ גזירה הוא אחראי להישרדות תא, דרגה גבוהה יותר של הידבקות תא אנדותל, אינדוקציה משאבה בזרימת וקיטוב טוב יותר של מובילים 75, ויסות חילוף חומרים של הגלוקוז 75,86, חמצון מתווך על ידי אנזימי CYP450 75 והרגולציה של חדירות paracellular ידי הגדלת הביטוי של הגנים מקודדים לאלמנטי junctional אינטר כמו occludin וההסתדרות ציוני 1 87,75,80 וגבוה וכתוצאה מכך Teer סביב 1,500 - 2,000 אוהם · 2 סנטימטר, הקרוב ביותר לידוע בvivo פרמטרי 79,80

בתעשיית הביוטכנולוגיה והתרופות, הקרנה שגרתית של תרופות או הקרנה גם תפוקה גבוהה (HTS) ומאמצים כדי לצמצם את הניסויים בבעלי החיים, בראשותלפיתוח של שורות תאים שונות לשימוש בהחלפה של התרבות העיקרית של תאי אנדותל מוחין שנותרו קשה יותר להגדרה באופן שיגרתי. ברוב המקרים, תרבויות עיקריות של תאי אנדותל מוחין היו transduced עם גן מנציח (T-אנטיגן הגדול SV40 או polyoma וירוס או E1A adenovirus), או על ידי transfection של DNA פלסמיד או על ידי זיהום באמצעות וקטורי retroviral 88,89,75. כמה שורות תאי אנדותל ממוצא מוחין פותחו כגון RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS או שורות תאי חולדה rBCEC4 88,75, שורת תאי b.End3 עכבר 90,75, PBMEC/C1 - 2 חזירי שורת תאים 87,75, וקו התא האנושי hCMEC/D3 89,75. מודלים אחרים מבוססים על תאים ממקור לא מוחי כגון כליות מדין-דארבי כלבים (MDCK) או שורות תאי Caco2 12,75. בין הקווים השונים אנושי מוחין אנדותל תא, hCMEC/D3 כבר לצטט נרחבד והשתפר כמודל של BBB מאז הקמתה בשנת 2005 91,92. כמו תרבויות עיקריות, יתרונות הווה שורות תאים ואת מגבלות. הם קלים יותר לטפל מאשר תרבויות עיקריות, יש תוחלת חיים ארוכה, מאופיינים היטב ולאפשר שחזור בין ניסויים בקנה מידה גדולים. עם זאת, שורות תאים יכולות לאבד את פונקציות רקמות ספציפיות, לרדת ברגולציה סביבתית ולרכוש פנוטיפ מולקולרי שונה לגמרי מתאי in vivo 75, 89. בפרט, monolayers שנוצר משורות תאים לחצו בהווה מופחת, Teer הנמוך ווריאצית פרופיל טרנספורטר מופע 75,89. לכן ניסויים או מחקרים בבעלי חיים בתאים ראשוניים הם העדיפו לעתים קרובות על אף מורכבות נוסף שלהם.

Acknowledgments

תמיכה כספית לVect-הורוס הוא הודה מFonds ייחודי Interministériel (פרויקט fui / MEDUL) וVect-הורוס והמעבדה UMR7259 מNationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, adhoc ופרויקטים משותפים PREVENTAD) . המעבדה UMR7259 גם מכירה תמיכה כספית מCNRS ומAix-Marseille האוניברסיטה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
  2. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
  3. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  4. Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22 (4), 390-400 (1998).
  5. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  6. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  7. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34 (11), 1935-1943 (2006).
  9. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
  10. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  11. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85 (6), 734-746 (2005).
  14. Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316 (1), 79-86 (2006).
  15. Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8 (3), 651-663 (2011).
  16. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  17. Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119 (3), 507-520 (2011).
  18. Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  19. Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 3 (2013).
  20. Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42 (1-2), 148-155 (2011).
  21. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  22. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  23. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
  24. Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259 (1), 66-70 (1991).
  25. Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53 (2), 340-345 (1989).
  26. Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
  27. Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 299-321 (1999).
  28. Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
  29. Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110 (5), 1456-1465 (2013).
  30. Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56 (3), 246-252 (2006).
  31. Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324 (3), 1064-1072 (2008).
  32. Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283 (50), 34554-34562 (2008).
  33. Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206 (3), 191-203 (2012).
  34. Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55 (5), 2227-2241 (2012).
  35. Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (8), 2999-3004 (2013).
  36. Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7594-7599 (2007).
  37. Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10 (4), 317-325 (2002).
  38. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to 'open' the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6 (3), 179-192 (2008).
  39. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  40. Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10 (9), (2013).
  41. Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74 (1-2), 173-184 (1997).
  42. Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22 (4), 835-844 (2005).
  43. Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73 (6), 2491-2500 (1999).
  44. Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311 (2), 449-455 (2004).
  45. Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  46. Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73 (1), 390-399 (1999).
  47. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (1), 23-37 (1992).
  48. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  49. Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224 (1-2), 81-89 (2001).
  50. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12 (4), 759-770 (2010).
  51. Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6 (5), 573-575 (1996).
  52. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  53. Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13 (7), 1185-1199 (2013).
  54. Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 25-39 (2005).
  55. Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21 (5), 1538-1547 (2001).
  56. Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200 (6), 629-638 (2002).
  57. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97 (4), 922-933 (2006).
  58. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
  59. Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
  60. Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 209-214 (2006).
  61. Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018 (1), 1-9 (2004).
  62. Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19 (23), 10193-10200 (1999).
  63. Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37 (2-3), 163-170 (2000).
  64. Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15 (5-6), 254-264 (2008).
  65. Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126 (2), 465-473 (1994).
  66. Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138 (4), 877-889 (1997).
  67. Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15 (1), 23-32 (2003).
  68. Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5 (1), 3-12 (1999).
  69. Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (5), 593-606 (2005).
  70. Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (3), 459-473 (2010).
  71. Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6 (2), 107-118 (2011).
  72. Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40 (6), 335-338 (2012).
  73. Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17 (26), 2755-2761 (2011).
  74. Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8 (4), 258-269 (2011).
  75. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14 (1), 120-136 (2013).
  76. Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
  77. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (1), 135-148 (2008).
  78. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339 (2), 579-588 (2011).
  79. Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8 (1), 89-99 (2005).
  80. Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  81. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  82. Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  83. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  84. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12 (40), (2011).
  85. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. , (2013).
  86. Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49 (3), 595-617 (2005).
  87. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 41-58 (2005).
  89. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  90. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 995-112 (2003).
  91. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  92. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 312-328 (2008).

Tags

רפואה גיליון 88 תאי האנדותל במוח חולדה (RBEC) עכבר חוט השדרה צומת הדוק (TJ) תחבורה בתיווך הקולטן (RMT) ליפופרוטאין בצפיפות הנמוכה (LDL) LDLR transferrin TFR P-גליקופרוטאין (P -GP) התנגדות חשמלית transendothelial (Teer),
הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Molino, Y., Jabès, F.,… More

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter