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Medicine

설정 - 업 Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

Abstract

혈액 뇌 장벽 (BBB)​​은 특히 혈액 및 신경 조직 사이의 분자 및 세포 광속을 조절한다. 우리의 목표는 내피 세포 단일 층에 걸쳐 transcytosis에 관련된 수용체를 연구하는 기본 쥐의 뇌 혈관 내피 세포 (RBEC)의 공동 문화와 성상 세포를 사용하여 BBB의 체외 모델의 높은 재현성 쥐 동계을 개발하고 특성화하는 것이 었습니다. 성상 세포는 트립신 소화 다음과 같은 기계적 박리에 의해 분리 된 이후 공동 문화 동결했다. RBEC 5 주 된 쥐의 피질에서 분리되었다. 두뇌는 수막과 흰색 물질의 청소, 기계적 소화 효소 다음 해리했다. 그 후, 조직 파쇄 액은 신경 조직에서 혈관 단편을 분리하기 위해 혈청 알부민에서 원심 분리 하였다. 용기의 조각은 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서 무료로 내피 세포에 두 번째 효소 소화를 시행 하였다. 이러한 혈관 주위 세포로 남아있는 오염 세포는 f를했다urther 퓨로 마이신 - 함유 배지에서 미세 혈관 단편을 도금함으로써 제거. 그들은 그 우물의 바닥에 성장 성상 세포와 공동 배양 필터에 계대 배양 하였다. RBEC 꽉 접합 높은 수준의 표현 등 occludin 등 (TJ) 단백질, 셀 테두리의 일반적인 현지화와 claudin-5와 ZO-1. TJS의 압박감을 나타내는 뇌의 혈관 내피 세포 단층의 내피 전기 저항 (봉사자)는 300 옴 · 평균 cm 2에 도달했습니다. (LY) 노란색 루시퍼의 내피 세포의 투과성 계수 (PE)은 / 분 0.26 ± 0.11 × 10 -3 cm의 평균 고도의 재현했다. 단일 층으로 구성 뇌 혈관 내피 세포는 유출 수송의 P-당 단백질 (P-GP)를 표현 로다 민 123, P-GP에 대한 리간드의 편광 전송을 보였으며, 내피 세포 단일 층에 걸쳐 트랜스페린 -를 Cy3와 DiILDL의 특정 전송을 보여 주었다. 결론적으로, 우리는 시험관을 설정하기위한 프로토콜을 제공한다때문에 품질 보증 방법에 높은 재현성, 그리고 그 BBB 컨베이어 및 수용체에 대한 연구에 적합 BBB 모델.

Introduction

중추 신경계 (CNS)을 치료하기 위해 개발 된 대부분의 약물은 질환 치료 관련 농도에서 뇌 실질에 도달 할 수 없습니다. BBB는 병원체로부터 혈장 조성물의 변동으로부터 뇌 신경 조직을 보호하고, 뇌 (1) 내로 및 밖으로 이온, 펩티드, 단백질 및 심지어 세포의 비특이적 자속을 제한함으로써 뇌 실질 조직의 항상성을 유지한다.

BBB의 특성 등의 신경과 전문 클래스 뇌 미세 혈관 내피 세포와 신경 교세포 혈관 장치의 주변 요소 (NGVU) 사이의 친밀한 근접하고 크로스 토크 (cross-talk)에 의해 유도 및 유지, glial 세포 (정확하게 성상 세포 최종 피트), 및 혈관 주위 세포는 콜라겐 유형 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 프로테오글리칸 2,3의 주로 구성되어 기저막에 ensheathed. 모세관 수준에서 내피 세포의 32 %와 중요한 재생 - 혈관 주위 세포는 약 22를 커버내피 세포의 증식, 혈관 신생과 염증 과정의 조절에서 역할. 내피 세포는 모세 혈관의 내면을 덮는 연속 시트를 형성한다. 이들은 꼭대기 영역에 띠 형상 구조를 형성하고 그 편광 셀에 올릴 TJS 의해 상호 접속된다. 성상 세포는 BBB 속성을 조절하고 TGF-β, GDNF, bFGF에와 IL-6와 같은 중요한 규제 요소의 소스입니다. 불완전한 기능을 GFAP 결핍 성상 세포는 BBB 속성 4를 조절 할 수 없습니다. 뉴런은 직접 BBB의 형성에 구조적으로 참여뿐만 아니라, 단백질 발현 및 BBB 기능 5의 중요한 측면을 조절하지 않습니다.

상기 BBB의 구조, 생리 및 병리를 연구하기 위해, BBB의 시험 관내 모델 연구 도구로 개발되었다. 뇌 혈관 내피 세포 기반 체외 BBB 모델에서 구현하는 다양한 종에서 추출 된소 6,7에서 낮은 통로 차 문화, 돼지 8, 9, 10,11,12 쥐, 마우스 (13) 또한 인간의 14, 15에. 이 모델은 생체 BBB를 모방하는 것으로 알려져있다 특히 쥐 또는 쥐 및 / 또는 혈관 주위 세포 16,12에서 glial 세포 및 / 또는 신경 전구 세포 유래 성상 세포 (17) 및 / 또는 신경 (18)와 공동 배양 하였다. 그들은 시험관 / 생체 실험과 비교 및 / 또는 유전자 변형 모델을 19 일부터 생산 뇌 혈관 내피 세포의 연구에 수 있기 때문에 "의 실험실"모델은 주로 설치류에서 생산됩니다.

새로 체외 BBB 모델 개발도 전에 생체 내 시험 15,20,21,3,6,22,11,23 잠재적 CNS 약물 후보의 뇌 흡수를 예측할 수 있도록 설계되었습니다. 체외 BBB 모델은 일반적으로 비교하는 데 사용됩니다 CNS에 내가) 알려진 침투 또는 L과 :와 약물의 수송BBB없이 중앙 효과 걸쳐 오우 투과성, 및 ⅱ) 동일한 종의 동물 모델에서 측정 된 동일 약품의 겉보기 PE. 쉽게 BBB를 전달하는 약물은 대부분 친 유성이며, 지질 매개 자유 확산 (카페인, 카르 바 마제 핀 등)에 의해 뇌의 혈관 내피 세포의 세포막을 교차. 이러한 디곡신, 베라파밀 또는 사이클로스포린과 같은 부정적인 수송 약물은 적극적으로 P-GP와 같은 뇌 내피 유출 컨베이어에 의해 압출된다. 그러나 새로 개발 된 치료 분자의 대부분은 이러한 재조합 단백질, siRNA를 또는 단일 클론 항체 등 바이오 의약품이다. 특정 운송의 I)의 부재, 그리고 세포층의 통로를 겪고에서 고 분자량의 분자를 방지 내피 세포의 II) 단단히 포장 층 : 그들 대부분은 인해 BBB를 통과하지 않습니다. 이러한 제한으로, "트로이 목마"전략은 내가, BBB 알려진 수용체에 대해 벡터 (항체, 펩티드) 참여를 사용하여 구현 된N 수용체 등 트랜스페린 (TF) 수용체 (TFR), 인슐린 수용체 (IR), 또는 LDL 수용체 (LDLR) 관련 수용체 가족 (LDLR, LRP1을)의 구성원으로 전송 또는 transcytosis (RMT)를, 중재. 이러한 수용체는 생체 (24, 25)에 고립 된 뇌 모세 혈관에와 BBB에서 발견되었다. 이러한 수용체 전사 프로필, 특히 LDLR 가족의 사람들은, 분석 및 공동 배양 직접 뇌 (26)로부터 자신의 추출 후 성상 세포 또는 뇌의 모세 혈관에서 뇌 혈관 내피 세포와 뇌 혈관 내피 세포를 비교 하였다. 파트 리지 (24)는 인슐린 수용체와 인슐린 성장 인자 수용체에 대한 항체 27,28이어서, 트랜스페린 수용체 (TFR)에 대하여 OX-26 항체 필드를 열었다. 이러한 항체 기반의 벡터로, ArmaGen 기술은 BBB (29)를 통해, 단백질을 포함, 약물을 전달하기 위해 BBB 분자 트로이 목마 플랫폼 기술을 개발했다.문학은 LRP1 뇌 혈관 내피 세포에서 발현과 강력한 세포 내 이입 / 스 캐빈 저 수용체의 역할을 보여주는 데이터 풍부하다. 웨스턴 블롯 분석 LRP1가 뇌의 모세 혈관이 풍부한 분수와 쥐의 뇌 모세 혈관 내피 세포 (30)로 표현하는 것이 좋습니다. 같은 BBB (31)에 걸쳐 효율적인 마약 유입을 촉진 아프로 티닌에서 파생 된 펩타이드 벡터를 Angiochem 대상 LRP1 같은 회사. 그러나, LRP1은 활성 Aβ의 수송 및 뇌 실질 조직에서 혈액 32의 유출 / 통관에 참여하고있다. 이러한 데이터는 리간드에 따라 BBB에서 양방향 전송에 LRP1을 포함한다. biOasis는 VECT - HORUS가 LDLR (34)를 대상으로 펩타이드 벡터를 개발하는 동안 같은 BBB 33에서 리소좀 효소와 항체 등 바이오 의약품의 수송을위한 단백질 melanotransferrin를 사용하여 초월 기술을 개발하고 있습니다. 데이터는 LRP 및 LDLR는 비교를 전송하는데 사용될 수 있음이 시사된다같은 BBB 37에서 리소좀 효소 (35, 36) 또는 나노 입자 복합체로 erent 분자.

우리의 관심 분야는 벡터 분자와 중추 신경계 질환의 치료를위한 벡터화 된 약물 후보를 사용하여 CNS에 약물 전달합니다. 특히, BBB에 걸쳐 약물 전달은 신경 염증, 그 정도가 다를 수 있습니다 프로세스의 맥락에서 고려되어야하지만, 그 뇌염, 다발성 경화증, 알츠하이머 병 등의 신경 염증을 포함, 아마 CNS 병변 및 질환에 공통적 인 세포층 및 세포 횡단 수송이 병적 인 상태 38,39,40,41,42,43에서 증폭 할 수 있음을 고려 BBB 생리학과 투자율의 변화와 BBB의 염증과 잠재적으로 관련이있다. 예를 들어, TNF-α, 비틀기, 기타 사이토 카인은 염증을 조절하고, 체외 BBB 모델과 실험들은 일의 세포층의 속성을 변경할 수있는 것으로 나타났습니다전자 내피 세포 단일 층 38,39,40하고 TNF-α는 또한 LDL (41)의 세포 횡단 수송의 증가로 연결, 42, 락토페린 43 holotransferrin.

우리의 목표는 개발의 특성을했다 최적화 및 높은 재현성 쥐 동계 BBB 모델은 기본 뇌 혈관 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 사용하여. 우리는 각각 뇌 혈관 내피 세포의 생산 및 성상 세포 제조를위한 5 주 된 신생아의 Wistar 쥐를 사용했다. 하나의 도전은 "주간 재현성"BBB 모델의 생산을 허용하는 프로토콜을 확립했다. 이 목적을 달성하기 위해 생산 프로토콜의 모든 단계는 첫 번째 주 수요일에 뇌의 미세 혈관의 생산에서 시작, 일주일의 고정 일에 실시 하였다. 해부는 지난 3 년 동안 거의 매주 실시 하였다. 또한 문화의 재현성을 향상시키기 위해 품질 보증 시스템이 설치되었다. 모든 reagenTS와 화학 물질 데이터베이스 (항목의 날짜, 주식, 유효 기간 등)에서 참조 하였다.

이 모델은 내피 세포의 조직과 순도 같은 기준의 숫자, 다음과 같은 특징으로하고, 봉사자, LY 침투성, 염증성 요원, TJ 단백질의 정성 및 정량 식, 같은 P-GP로 유출 수송의 기능 및 수용체에 대한 응답 이러한 TFR 또는 LDLR과 내피 세포 단일 층에 걸쳐 transcytosis에 참여.

Protocol

쥐 성상 1. 생산

각 준비는 섹스 중 하나의 10 신생아의 Wistar 쥐를 사용하십시오.

  1. 가위로 머리를 절단하고 층류 후드에서 건조 페트리 접시에 즉시 전송하여 쥐를 희생. 소뇌없이 두개골에서 뇌를 제거하고 차가운 해부 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 즉시 전송 : HBSS 1 % 소 혈청 알부민 (독소 BSA의 낮은 수준), 100 ㎍ / ㎖의 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신과 보충.
  2. 2 대뇌 반구를 분리하고 얼음에 해부 버퍼 깨끗한 세균 배양 용 접시에 그들을 전송, 절반의 머리를 잘라. 시신경을 잘라 실체 현미경을 이용하여 수막을 제거합니다.
  3. 차가운 해부 버퍼 50 ㎖에 광범위하게 대뇌 피질의 조각을 씻으십시오.
  4. 15 ML 팔콘 튜브에 3 뇌에서 대뇌 피질의 조각을 넣고 피펫 팅에 의해 쿠데타 아래 해리EDTA 5 분 0.02 %를 37 ° C에서 - 르 0.05 % 트립신 6 ㎖에 파란색 팁이 장착 된 10 ㎖ 일회용 피펫 회
  5. 24 10 % FBS와 보충 DMEM의 ML 다음과 같은 항생제, 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신 100 ㎍ / ㎖, 아교 세포 미디어 (GCM)라는 이름의 미디어, RT에서 5 분 300 XG에 원심 분리기를 추가합니다. FBS의 배치는 성상 세포 cutures의 성장과 생존을위한 선택과 검증되었다.
  6. 75cm 2 T-플라스크 (T75)에 10 ㎖의 GCM 플레이트에서 해리 세포를 포함하는 펠렛을 Resuspend. 세포의 파편과 DNA를 제거하려면 다음 하루 매체를 변경합니다. 일주일에 두 번 배양액을 교체합니다.
  7. 확산 후 1 주일 후, 부드럽게 GCM에서 37 ° C에서 24 시간 동안 60 rpm에서 진탕와 glial 세포를 흔들. T75는 37 ° C 습한 분위기에서 5 % CO 95분의 2 % 년 공기 인큐베이터에 배치 할 수없는 경우, 5 mM의 HEPES와 미디어를 보충합니다. R로 두 번 세포를 씻으십시오비 점착성 미세 아교 세포를 emove.
  8. 3 주 파종 후, 칼슘, 마그네슘하지 않고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 따뜻한 트립신 0.05 %-EDTA 0.02 %의 3 mL를 넣고 37 ° C에서 배양 및 세포 층 (일반적으로 5 분) 분산 될 때까지 기다립니다. , GCM 10 ㎖를 추가하여 트립신의 활동을 억제 8 분 120 XG에 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다.
  9. 90 % FBS의 성상 세포 펠렛을 재현 탁 - 10 % DMSO, 액체 질소 (2 × 10 6 cryovial 당 세포) 및 저장 cryovials로 전송할 수 있습니다.

쥐 뇌 미세 혈관의 2. 격리

우리의 실험 절차는 마르세유의 의료 학부의 윤리위원회의 승인을 국가와 유럽 규정 (EU 지침 번호 6백9분의 86)을 준수합니다. 모든 노력이 동물의 고통을 최소화하고 사용 된 동물의 수를 줄이기 위해 만들어졌다.

  1. 각 준비를위한 하나의 experimente에 대한R, 3 오주 이전의 Wistar 쥐를 사용합니다.
  2. 첫 번째 주 월요일, 모두 무균 배양 물에 1 ㎍ / cm 2 (T75 당 10 ㎖)에, 콜라겐 유형 IV 및 피브로넥틴으로 코팅하여 2 T75 플라스크를 준비합니다. 미세 혈관 파종 할 때까지 37 ° C에 부착 할 수 있습니다.
  3. 첫 번째 주 수요일 아침, 졸음을 유발하는 CO 2의 증가 흐름에 따라 쥐를 안락사, 자세와 호흡 중단의 손실은 다음 자궁 경부 전위 하였다. 70 % 에탄올로 스프레이 헤드. 가위로 머리를 잘라 층류 후드에서 건조 페트리 접시에 그들을 전송합니다.
  4. 얼음에 냉각 차가운 해부 버퍼로 가득 페트리 접시에 그들을 전송 한 후, 소뇌 및 시신경없이 두개골에서 뇌를 제거 (HBSS는 1 % BSA, 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신 100 ㎍ / ㎖로 보충) .
  5. 용에서 2 대뇌 반구와 별도의 중뇌를 분리하는 반 머리를 잘라ebrain. 해부 버퍼 얼음에 깨끗한 페트리 접시에 forebrains을 전송합니다.
  6. 주의 깊게 N ° 5 곡선 집게와 실체 현미경 forebrains에서 수막을 제거하는 차가운 해부 버퍼를 새로운 배양 접시에서 반구의 정도 소요. 그런 다음, 수초의 이불을 제거하고 껍질의 쉘을 얻을 수있는 뇌의 내부를 청소합니다. 이 단계는 조직의 보존 및 세포 생존을위한 2 개 이상의 시간이 걸릴 수 없습니다.
  7. 다른 간극의 2 방앗 공이 각각 10 상하 스트로크, 20 μm의 다음 71 μm의에 의해 균질 다운스 7 ㎖의 차가운 해부 버퍼 6 ㎖에 3 두뇌의 피질을 떼어 놓다.
  8. RT에서 5 분 1,000 XG에 50 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기 1 ㎖에 1 피질의 등가를 얻기 위해 서스펜션을 나눈다. 상층 액을 버린다.
  9. 콜라게나 제 / 디스 파제의 혼합 (60 ㎍ / ㎖의 정보 R을 포함하는 효소 용액 1 ㎖로 한 외피로부터 현탁액 다이제스트11; 0.3 U / ㎖), DNA 분해 효소 타입 I (35 ㎍ / ㎖의 - 20 K 단위 / ㎖) 및 37 ℃에서 30 분 동안 진탕에서 겐타 마이신 (50 ㎍ / ㎖)
  10. 1 ㎖의 10 25 % BSA / HBSS 1X ㎖의 실온에서 15 분 동안 3,600 XG에 따라 밀도 원심 분리하여 별도의와 1 피질에서 소화 섞는다. 조심스럽게 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 위 디스크 (myelin의 뇌 실질 조직)과 뜨는을 전송하고 원심 분리를 반복합니다. 4 ℃에서 뇌 미세 혈관을 포함하는 결과 펠렛을 유지
  11. 조심스럽게 상단 디스크와 상층 액을 버린다. 차가운 HBSS 1X 1 ㎖와 뇌의 미세 혈관을 포함하는 두 결과 펠렛을 재현 탁하고 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다.
  12. 5 분 1,000 XG에 20 차가운 HBSS 1X ㎖의 원심 분리기를 첨가하여 미세 혈관을 씻으십시오. 상층 액을 버린다.
  13. 또한 쉬에서 37 ° C에서 1 시간 동안 단계 2.9과 동일한 효소 용액 1 ㎖를 1 피질에서 미세 혈관을 소화AKER.
  14. 그런 다음, 하나의 튜브에 3 피질의 각에서 소화 미세 혈관을 혼합하고 추가 튜브 당 1과 2 분의 1 (1.5) 피질의 동등한에서 추출 된 미세 혈관을 얻기 위해 두 개의 50 ㎖ 팔콘 튜브로 구분합니다. RT에서 5 분 1,000 XG에서 차가운 해부 버퍼와 원심 분리기 30 ML을 추가합니다.
  15. 20 % 소 혈소판별로 혈장 유래 혈청, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF,이 NG / ㎖), 헤파린 (100 ㎍ / ㎖), 겐타 마이신 (50 ㎍ / ml)로 보충 된 DMEM/F12 10ml에 미세 혈관 펠렛을 재현 탁 와 HEPES 내피 세포 미디어 (ECM)라는 이름의 (2.5 mM)을, 4 ㎍ / ml로 마이신과 보충.
  16. , 인큐베이터에서 2 코팅 T75 플라스크을 코팅의 과잉을 대기음 한 T75 플라스크 (T75 플라스크 1.5 피질에서 추출 된 미세 혈관)의 각 관에서 미​​세 혈관을 접시.

RBEC Primocultures 3. 정제 및 대량 살상 무기 확산

  1. 정화 : 수요일, 금요일에, purom 추가ycin 배양 배지 4 ㎍ / ml로. 목요일에 매체를 변경합니다. 금요일에, 월요일까지 2 ㎍ / ml로 세포를 씻어 퓨로 마이신을 추가합니다.
  2. 대량 살상 무기 확산 : 두 번째 주 월요일에, 세포를 세척하고 문화가 두 번째 주 수요일에 90 %의 합류에 도달 할 때까지 배양 배지에 인슐린, 트랜스페린과 셀렌 산 나트륨 보충을 추가합니다.

. 4 차별화 : 체외 BBB 모델 설정

  1. 두 번째 주 월요일 (상단 구획 믹스 500 μL 모두 무균 배양 물에 0.5μg/cm 2에서 콜라겐 유형 IV 및 피브로넥틴의 혼합 코팅 필터 (폴리에틸렌, 12 우물, 기공 크기 1.0 μm의) 준비 하부 격실에있는 무균 배양 물 1.5 ㎖). RBEC 파종 할 때까지 37 ° C에 부착 할 수 있습니다.
  2. 두 번째 주 월요일 5 일 공동 문화의 설립 전에, 37 ° C와 전송에 cryovials의 성상 세포를 해동10 ㎖의 GCM과 15 ML 팔콘. 실온에서 13 분 동안 120 XG에서 현탁액을 원심 분리기.
  3. 12 - 웰 플레이트에 cm 2 당 30 × 10 3 세포의 밀도로 GCM과 판의 성상 세포 펠렛을 Resuspend.
  4. 두 번째 주 수요일, 단지 트립신 RBEC의 분리하기 전에, DMEM/F12 배지로 두 번 사전 코팅 필터를 세척한다. 아래 칸에 1.5 ㎖의 상부 구획에 0.5 ㎖ : ECM과 챔버를 미리 입력합니다.
  5. 두 번째 주 수요일, 칼슘과 마그네슘하지 않고 DPBS로 두 번 RBEC 씻는다. 정확히 30 초 동안 T75 플라스크 당 37 ° C에서 EDTA 0.02 % 용액 - 따뜻한 트립신의 4 ml의 0.05 %를 추가합니다. 이어서 트립신 용액 3.5 ㎖를 제거하고 현미경으로 관찰한다. 세포층은 매트릭스에서 분리 모든 셀이 플로팅 될 때까지 온화 T75 플라스크의 가장자리를 눌러이를 돕기 시작하면.
  6. T75 플라스크 당 ECM의 10 ML을 추가하고 15 ML 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. 아주 부드럽게 세포를 해리노란색 팁 탑재 10 ㎖ 피펫으로 다운 4 회 피펫 팅에 의해 현탁 (용액 중의 기포의 생성을 방지). 현탁액에있는 세포 (약 3 × 10 6 cells/T75)를 즉각 세고 높은 밀도 (160 × 10 3 셀 / 필터, 따라서 약 18 filters/T75) (그림 8에 미리 코팅 및 프리 필드 필터에 접시 ). 다음 날 (목요일), 세포 파편을 제거하기 위해 상부 구획의 두 배 매체를 변경합니다.
  7. 두 번째 주 목요일, 공동 문화의 설립 전날, 기초 구획에서 1 / 3 에어컨 매체로 보충 할 수있는 차별화 매체의 1.5 ML (500 nm에서 하이드로 코르티손과 ECM)에 의해 성상 세포 배양 배지를 교체 (내피 세포와 성상 세포 사이의 접촉의 3 일) 공동 문화 이전의.
  8. 두 번째 주 금요일은 차별화의 날 0으로 정의된다; 필터 콘타에서 배양 배지를 교체차별화 미디어 RBEC ining. 성상 세포를 포함하는 우물에 RBEC 필터를 전송합니다. 이러한 조건에서, 체외 모델은 차별화하고 3 일 이내에 접합 관련 단백질을 표현한다.
  9. 모델은 세 번째 주 월요일과 수요일 사이에 3 일 이상 동안 자신의 최적의 분화를 유지합니다.

Representative Results

생산 프로토콜
의 다공성 미세 혈관의 내피 세포의 (a) 정제, (b) 증식, 및 필터에 대한 (c) 분화 (12 - 웰 폴리에틸렌 플레이트 : 프로토콜은 배양 배지 조성물에있어서 큰 변화에 대응하는 3 단계로 나눌 수있다 1 성상 세포와 공동 배양 μm의). 생산 프로토콜의 서로 다른 단계가 일차 세포 배양의 재현성 (도 1)을 증가시키기 위해 특정 요일에 할당했다. 첫 번째 주 수요일에, 따라서 구일 공동 배양 시스템의 설립 전에, 미세 혈관은 (그림 2A)을 분리 하였다. 내피 세포를 순화, 배양 5 일 동안 푸로 마이신의 농도를 감소의 존재에 보관 하였다. 대부분의 오염 세포 (주로 혈관 주위 세포)을 제거하고 혈관 내피 세포의 성장은 표현형의 수정없이 느렸다했다. 스핀들의을 haped 세포는 쥐의 뇌 회백질 (그림 2B)에서 분리 된 모세관 조각의 성장한다. 두 번째 주 월요일에, 쥐의 성상 세포는 12 - 웰 플레이트의 하단에 도금했다. 수요일은 RBEC는 필터의 내강 구획에 첨가 하였다. 고밀도 시드 × 10 160 / ㎠ (그림 2C) 3 세포는 필터 (그림 2D)의 주변에서 격차를 방지하는 데 도움이 및 내피 세포의 단일 층의 균일 한 차별화를 생성합니다. 셀은 길이 방향으로 정렬하고 균일 한 단층을 형성 전형적인 가늘고 긴 방추형 형태를 보여준다. 목요일, 성상 세포 배양 배지는 이전 공동 배양 배지 (그림 2E)와 에어컨 차별화 매체에 변경되었습니다. 금요일 RBEC은 필터에 500 nm의 하이드로 코르티손을 함유하는 배양 배지에서 성장시키고, 필터는 성상 세포를 함유하는 12 - 웰 플레이트로 옮겼다. 세 번째 주에서 실험 승감수 월요일과 수요일 사이에 수행.

RBEC 특성 및 단층 투수의 결정 요소
RBEC은 내피와 BBB 마커의 면역 염색에 의해뿐만 아니라 봉사자, LY의 투과성과 같은 P-GP로 유출 수송의 기능 측정을 특징으로했다.

RBEC는 퓨로 마이신의 정제 방법에 의해 얻어진 (그림 1, 2) 합류 성장 억제를 전시 겹치지 연속 단층의 성장과 밀접하게 나란히 놓여, 방추형 스핀들 모양의 형태를 표시. RBEC 문화 내피 세포의 전형적인 마커를 발현 : 그들은 혈소판 내피 세포 접착 분자 (그림 3A, CD31/PECAM)에 대한 긍정적 인 면역 염색을 보여 폰 빌레 브란트 인자 (그림 3B)의 식입니다. 퓨로 마이신의 치료를하지 않으면 RBECs 신속 최근 desmin의 immunos에 의해 검출 된 혈관 주위 세포로 침입하는이닝 (그림 3C). 성상 세포 (그림 3D)에 의해 표현 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)는 성상 세포의 중요한 분화 마커입니다. 높은 통로 번호, 성상 세포는 내피 세포의 분화를 유도 할 수있는 능력을 잃게됩니다. 이러한 이유로, 성상 세포 배양 문화에 대한 시간을 표준화하고 하나의 통로가 시행되었다.

성상 세포와 공 배양 한 다음 하이드로 보충 미디어와 이전의 공동 문화의 아래 칸에서 조절 된 배지로 RBEC을 배양하는 것은 단독으로 배양 RBEC에 비해 interendothelial TJS의 강력한 유도되었다. 세포는 표현 claudin-5, 면역 형광 (그림 4B-D)로 나타낸 바와 같이, 세포 - 세포 접합에서 지역화 및 ZO-1, occludin 단백질 (그림 4E에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 밝혀진 ZO-1, occludin 단백질, ). C의 형태 학적 분포지퍼와 같은 구성에서 엘에 세포 접촉이 단층의 (a) 압박감을 반영 (b) 뇌 모세 혈관 내피 세포의 기원, 및 (c)는 차별화 된 대뇌 내피 세포의 특성이다. 내피 층의 세포층 투과성 필터의 하부 구획에 상부로부터 티이 및 LY (457 다)의 유입 속도를 측정하여 모니터링 하였다. 티이은 EVOM의 voltohmmeter 접속 12mm 배양 개분 ENDOHM-12을 사용하여 측정 하였다. TJS의 압박감을 나타내는 뇌의 혈관 내피 세포 단일 층의 봉사자는 (12 웰 플레이트의 필터, 데이터가 표시되지 않음) 평균 300 옴 · cm 2에 도달했습니다. (장벽 및 시험 화합물과 공동 배양의 무결성 대조군으로 사용 PE (LY)) LY의 PE는 1 년 기간에 0.26 ± 0.11 × 10 -3 cm / 분의 평균 (그림 4 층)에 도달했습니다.

RBEC의 염증을 유도하기 위해 우리는 홍보를 사용24 시간 동안 5 겨 / ㎖에서 O-염증성 사이토 카인 TNF-α, 및 120 겨 / ㎖ (비 두 배 배양 시스템의 상부 구획에 RBEC에 의해 (MCP-1)의 분비 CCL2를 측정하여 염증 반응을 따라 250 겨 / ㎖ (그림 5A) 제어를) 처리. PE (LY) 측정 (그림 5B)에 의해 계시 된 ML 5 NG / 또는 24 시간 50 겨 / ㎖에서 TNF-α 치료는 BBB를 열었다.

P-GP는 면역 세포 화학 (그림 6A)에 의해 차별화 RBEC으로 시각화했다. P-GP 현지화는 매우 편광 것으로 알려진 글루타메이트 수송-1 (GLT-1)을 중심으로 기저 부분 (45)에서 발견되는 동안 내피 세포 (44)의 정점 막에 기본적으로 표시됩니다. 우리 배양 RBEC의 분극의 정도를 평가하기 위해, 정점 및 측저 단백질 자당 밀도를 이용하여 세포막 제제로부터 분리 된 46 그라디언트. 웨스턴 블롯 분석했다혀끝 플라즈마 내의 P-GP 및 GLT-1의 발현 수준 및 기초 막 제제를 평가하기 위해 수행 하였다. 갓 쥐의 뇌 미세 혈관으로부터 추출은 이러한 단백질의 생체 내 분포 (도 6b)에 가까운 양의 대조군으로 사용 하였다. 미세 혈관과 차별화 된 RBEC 막 준비 모두에서, P-GP는 주로 F1 정점 막 분획 (그림 (b), C)로 번역, 170 kDa의의 밴드로 표현했다. GLT-1의 발현은 실제로 65-70 kDa의 밴드 등의 미세 혈관의 F3 기저 막 분획에서 발현 되었으나 RBEC 배양에서 검출되지 않았다.

평행 실험에서, 내피 세포의 단층에서 P-GP의 기능적 활성은 리간드로서 로다 민 123 (R123)을 사용하여 시험 하였다. R123의 유출 (A에 B)에 ​​내강하는 abluminal는 반대 방향 (도 6D)보다 1.7 배 높았다. P-GP 참여를 증명하기 위해, 우리는 verapami, 특정 P-GP 억제제를 사용L (25 μM, 30 분 예비 배양)과 사이클로스포린 A (1 μM, 30 분 예비 배양). 베라파밀과 사이클로스포린 치료, RBEC에서 R123의 축적은 치료를받지 않은 (그림 6E)에 비해 각각 1.6 배와 2 배 증가했다.

수용체 매개 Transcytosis (RMT) 메커니즘에 관여하는 수용체
이 모델은 또한 잠재적으로 LRP1, LDLR 또는 TFR (그림 7A)와 BBB에서 transcytosis 메커니즘에 관여 다른 수용체의 발현을 특징으로했다.

기능 전송 연구 TFR과 LDLR에 대한 리간드와 함께 실시 하였다. 라이브 RBEC는 37 ° C (그림 (b), C)에서 180 분 동안 CY3 (TF-Cy3가)으로 표시 쥐 트랜스페린으로 배양 하였다. 체외 BBB 모델 쥐의 TF-Cy3에 흡수 및 수송의 정량화는 곡선의 기울기가 약간 2,400 피코 몰 이상 감소 것을 보여 주었다의 (그림 7B), 바인딩 / 흡수가 포화 것을 제안. 또한, 결합 / 흡수 포화가 하부 구획은 Tf의 축적과 관련이 있었다. 이러한 관찰을 확인하려면, TF-Cy3로는 4,800 picomoles (고원 / 채도) (그림 7C)에 비 형광은 Tf의 과잉으로 1200 picomoles (곡선의 상승 부분)에서 배양 하였다. 이러한 실험은 하부 구획의 TF-Cy3가 축적의 감소를 보여 우리 체외 BBB 모델에서 리간드 - 수용체 상호 작용의 전형적인 가포 메커니즘을 확인했다.

마찬가지로, LDLR 기능은 내피 세포의 단층 (그림 7D, E)에서의 리간드 DiILDL의 흡수와 수송에 의해 입증되었다. 라이브 RBEC은 37 ℃에서 30 분 동안 DiILDL으로 배양 하였다 바인딩 / 흡수가 낮은 구획 (그림 7D)의 DiILDL의 축적과 상관 관계가 없었다. DiIL의 정량화DL 전송은 곡선의 기울기가 해당 전송이 포화이었고, 우리의 모델에서 수용체와 관련된 제안, 2 μg 이상 감소 것을 보여 주었다. 아 지드 화 나트륨은 15 분 전에 DiILDL 배양 (그림 7E)로, 0.05 %에서 추가되었습니다. 0.05 %의 아 지드 화 나트륨의 인큐베이션 독성의 유무는 PE (LY) 둘레 (데이터는 도시하지 않음)에 의해 평가 하였다. 이 실험은 낮은 구획에 DiILDL 축적을 감소했다. 전반적으로, 우리의 결과는 우리의 체외 BBB 모델 DiILDL 위해 RMT를 제안한다.

쥐 척수 또는 마우스의 뇌에서 혈관 내피 세포에 따라 다른 체외 BBB 모델
콜라게나 / 디스 파제의 혼합과 소화 효소는 세포 생존과 뇌 미세 혈관의 생산 수율의 측면에서 제어 할 수있는 주요 변수 중 하나입니다. 조직에 대하여 효소의 양, N 간 효소 및 더 중요한 비의 농도쥐의 뇌, 척수 쥐와 쥐의 뇌 사이에 정확하게 보정 할 eeds. 미세 혈관 파종 밀도 및 내피 세포의 수를 90 % 합류 (구일 포스트 미세 혈관 시드)에 도달하기가 연결되고, 세포 성장을 향상 집단 배증 및 모델의 품질의 수를 제한하는 중요한 파라미터이다 하였다. 래트 척수 미세 혈관은 동일한 시간 스케일 내에 T75 플라스크 당 세포의 동일한 양을 구하는 (티슈 량 한 뇌에 대략 대응이 척수 환산) 쥐의 뇌 미세 혈관을 위해 본원에 기재된 것과 동일한 프로토콜로 제작했다 . 5 주 된 C57BL6 마우스의 뇌에서 수막들은 피질에 붙어 있기 때문에 제거하기 어려웠다. 디스 파제와 뇌의 간단한 처리는 수막의 제거를 용이하게 나타난다. 쥐의 뇌, 쥐의 척수와 마우스의 뇌에서 재생 가능한 내피 세포 단일 층의 생산에 기여하는 중요한 매개 변수는 강조에 요약되어있다그림 8.

그림 1
도 1. 체외 BBB 모델 제제의 주요 단계를 요약 한 플로우 차트. 생산 프로토콜의 서로 다른 단계가 차 내피 세포 배양의 재현성을 높이기 위해 특정 요일에 할당했다. 이 프로토콜은 5 주령의 Wistar 쥐에서 미세 혈관의 생산, 첫 주 수요일에 시작됩니다.

그림 2
그림 2. RBEC, 성상 세포와 공동 배양 시스템의 위상 콘트라스트 현미경 사진. 아웃 도금시의 (A) 5 주령의 Wistar 래트 미세 혈관 단편.(B) 4 ㎍ / ml로 P-GP 기판 퓨로 마이신 2 일 동안 치료를 세 일 이전 RBEC 문화. 형 콜라겐으로 코팅 된 12 웰 플레이트의 밀리 포아 필터에 도금 후 (C) 1 일에서 순수 합류 내피 단층 공동 문화를 대표하는 특성화 된 벌집 형태를 보여주는 공동 문화의 설립의 날에 삽입 필터의 주변에서 세포 단일 층의 IV 및 피브로넥틴. (D) 균질성. (E) 플루 성상 세포 배양. (F) 계획 C, D와 E의 현미경 사진의 현지화와 시스템

그림 3
면역 형광 현미경으로 RBEC 문화의 그림 3. 특성은. (A) 뇌 혈관 내피 세포는 혈소판 내피 세포를 표현셀 테두리의 접착 분자 PECAM/CD31는, (B) 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)는 상대적으로 작은 반점 염색, 더 밝고 다른 사람보다 몇 가지 세포 집계 및 핵 주변 영역에 집중을 보여줍니다. RBEC의 퓨로 마이신 치료없이 (C) 문화가, 혈관 주위 세포는 (녹색) 최근 desmin에 대한 긍정적 인 면역 염색 검출 및 특성 작은 둥근 핵이있다. (D) 성상은 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)을 표현하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 체외 BBB 모델 쥐의 세포층의 투과성의 면역 세포 화학 특성LY는 내피 세포 단일 층에 걸쳐. 세포 단일 층은 내피 세포의 형태와 꽉 접합 단백질의 발현과 겹치지 않는 형태와 일반적인 스핀들 모양의 세포와 융합 뇌 혈관 내피 세포 단일 층을 나타 내기 위해 (A) 멘틴과 면역 염색 된 (B) claudin-5 , (C) ZO-1 및 (D) 12 - 웰 BBB 모델도 ZO-1 및 occludin 단백질 (E)에 대한 웨스턴 블롯에 의해 검출 occludin. (F) 단층 견고 황색 루시퍼의 수송을 측정함으로써 평가했다 (LY-CH, 디 리튬 염), BBB에 의해 유지되는 것으로 알려져 작은 친수성 ​​분자 (MW 457 다). 간단히, LY는 37 ℃에서 60 분 동안 대뇌 혈관 내피 세포와 접촉하는 문화 시스템의 상부 구획에 배양 하였다 이 시간 후에, 상기 하부 구획의 중간 회수하여 형광 spectrofluorimet로적인 형광 분석에 의해 정량 하였다430 nm에서 여기 및 535 nm에서 방출과 어. 결과는 10-3 cm / 분의 투과성 또는 PE로 표현된다. LY의 PE는 0.6x10 -3 cm / 분 이상일 때 장벽을 투과 또는 오픈 간주됩니다. 각 실험에서 1 시간 동안, 보통 맑게 볼륨은 시간과 선형 회귀 분석에 의해 추정 경사 대 플롯 하였다. 콜라겐 타입 IV-피브로넥틴 코팅 제어 필터 간극 곡선의 기울기는 PSF와 뇌 내피 세포 단층을 가진 필터 간극 곡선의 기울기는 태평양 표준시로 표기 하였다 표기 하였다. : 내피 세포 단일 층 (PSE)의 PS 값이 계산 된 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

식 (1)

PSE에 값 POR의 영역으로 나누었다멤브레인의 OU (12 - 웰 플레이트의 밀리 포아 필터 1.1 cm 2) 및 결과 / 분 0.26 ± 0.11 × 10 -3 cm의 평균으로 투과성 계수 (PE)이었다. 결과는 N = 90 분석에 대한 수직 산점도 표현 (분석 기준, N = 6 단층에 N = 3의 의미)와 함께 제공됩니다.

그림 5
그림 5. 체외 염증성 에이전트 TNF-α 치료에 BBB 모델 응답. 배양 시스템에서 배양 배지는 6 시간, 12 시간의 상한 실 5 겨 / ㎖에서 바로 TNF-α 처리하기 전에 대체되었다 24 시간. RBEC로 CCL2 자료는 처리하지 않은 컨트롤과 비교하여 ELISA 분석에 의해 상부 구획에 정량 하였다. MCP-1 수준을 시간의 함수로서 약간 증가 유의도 처리하지 않은 우물. LY PE (LY)에 대한 내피 PE에 의해 측정 된 내피 세포 장벽의 무결성 ML 5 NG / 또는 0.62 ± 0.02 × 10의 범위에서 50 겨 / ㎖에서 TNF-α와 24 시간 처리하여 단일 층의 투과성의 증가를 밝혀 - / 분 3cm 0.7 ± 0.01 × 10 -3 cm / / 분 (학생의 T 테스트, P <0.05), 0.33 ± 0.03 × 10 -3 cm의 제어에 비해 각각 분.

그림 6
P-GP 유출 수송 및 RBEC 편광 면역 세포 (A) 및 웨스턴 블롯 (B & C)에 의한 성상 세포와 공동 배양 된 뇌 혈관 내피 세포에서 유출 운송업자 P-GP의. 식의 그림 6. 기능. 세포막 단백질은 세포질 단백질로 추출 하였다 fractiona기 장비. 세포막은 세포 소기관과 핵을 제거하는 저장성 용해 및 차등 centrifugations 의해 수득 하였다. 세포막으로부터 정점과 측저 단백질의 분리는 자당 밀도 구배에 의해 수득 하였다. 글루타민산 염 수송-1 (GLT-1)을 중심으로 기저 부분 (F3)로 번역하는 동안 P-GP는 주로 꼭대기 부분 (F1)로 번역되었다. 이전 도금 정화 미세 혈관은이 단백질의 생체 내 현지화 대조군으로 사용 하였다. P-GP의 활성은 R123, P-GP 리간드의 전송 극성을 측정하여 결정 하였다. 1 μM R123의 유출은 내강 - 투 - abluminal (B에 A)에 반대 abluminal - 투 - 내강 (A에 B) 방향으로 37 ° C에서 1 시간 동안 측정 하였다. 동일한 실험을 삽입 필터를 통해 수동적 확산을 평가하는 RBEC없이 실현 된 데이터는 PE (R123) 계산이 값에 상대적으로 정상화되었다 (그림 5 참조 (R123)에 근거 내강 투 abluminal 수송 100 % (B를 A)로 표현된다. 베라파밀은 (25 μM은 30 분 예비 배양)과 사이클로스포린 A (1 μM, 30 분 예비 배양)를 참조 P-GP 억제제로 사용되었다. RBEC에서 R123의 축적이 P-GP 억제제 (학생의 T 테스트, P <0.05)와 예비 배양 유무에 관계없이 2 시간 후 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
수용체 매개 트라에 관련된 수용체의 그림 7. 특성nscytosis (RMT). (A) 차별화 된 RBEC 단일 층은 저밀도 지방 단백질 관련 수용체 1 (LRP1)과 저밀도 지방 단백질 수용체 (LDLR)에 대한 항체로 면역 염색 하였다. RBEC의 공 촛점 이미지가 핵 주변 지역의 일부 클러스터링, DiILDL의 이해, LDLR의 형광 리간드과 쥐 트랜스페린-Cy3에, 세포 표면에 TFR 쇼 반점 염색의 형광 리간드의 이해를위한 프로빙. (B)에게 쥐 TF-Cy3로는 75에서 차별화 된 RBEC 단일 층을 포함하는 상부 구획에 추가 된, 150, 300, 600, 1,200, 2,400 및 4,800 picomoles / 상단 칸에 37 ° C (200 μL 180 분, 1,200 μL에 대한 삽입 아래 칸). 이 시간이 지나면를 Cy3 형광은 570 N에서 550 nm의 방출에 여기와 spectrofluorimeter과적인 형광 분석에 의해 세포 용 해물 (PBS 200 μL 0.1 % 트리톤 X100) 및 하부 구획에 정량 하였다m. 형광 단위가 선형 작동 범위 포화 실험하십시오. (C)를 ​​사용하여 picomoles에 형질 전환시키고, 쥐 TF-Cy3에는 / 15 유무에 관계없이 37 ° C에서 180 분 동안 삽입 1,200 picomoles에서 차별화 된 RBEC 단일 층을 포함하는 상부 구획에 추가 된 분 비 형광은 Tf의 4,800 picomoles / 삽입으로 배양 사전. 하부 구획의 전송은 (B) (스튜던트 t 시험, p <0.05)로 정량 하였다. (D) DiILDL는 1, 2, 4, 8 ㎍ / 인서트 필터에서 차별화 RBEC 단일 층을 포함하는 상부 구획에 첨가 하였다 37 ° C (상단 칸에 200 ㎕의 하부 격실에있는 1,200 μL)에서 30 분. 이 시간이 지나면, DII 형광은 571 nm에서 554 nm의 방출에 여기와 spectrofluorimeter과적인 형광 분석에 의해 세포 용 해물 (PBS 0.1 % 트리톤 (Triton) X100 200 μL) 및 하부 구획에 정량 하였다. Fluorescence 단위는 선형 작동 범위를 사용하여 μg에서 변형되었다. (E) 실험을 차단 운송, 아 지드 화 나트륨이 2 ㎍ / 37 ℃에서 30 분 동안 삽입에 DiILDL의 부화하기 전에 0.05 %에 15 분 추가 된 하단 부분에있는 수송은 (D) (학생의 T 테스트, P <0.05)로 정량 하였다. 0.05 %의 나트륨 아 지드 배양 독성의 부재는 PE (LY) 측정 (데이터가 표시되지 않음)에 의해 평가 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8.에서 쥐의 척수 혈관 내피 세포 나 마우스의 뇌에서 생체 BBB 모델. 높은 테이블쥐의 뇌, 쥐의 척수와 마우스의 뇌에서 미세 혈관 추출을위한 중요한 매개 변수를 켜집니다. 현미경은 쥐의 뇌, 쥐의 척수와 마우스의 뇌에서 준비 내피 세포 단일 층에 ZO1 및 occludin에 대한 면역 염색을 보여줍니다.

Discussion

우리는 RBEC의 정화와 문화를 다음과 추가 특성 BBB 특성을 가진 생체 BBB 모델을 생성하는 기본 쥐의 성상 세포와 공동 배양의 설정, 뇌의 미세 혈관의 분리 및 도금 주간 재현 프로토콜의 구현을 설명합니다.

성공적으로 체외 BBB 문화에서 표준화 수립하는 프로세스의 여러 순차적 단계에서 최적의 조건을 필요로한다. 모델은 (a) 시험 관내 BBB 모델 "성배"남아 있고, (b) 및 유출 RMT 메커니즘에 대한 유효성 세포층 낮은 투과성을 얻을 수 있도록 최적화되었다.

생산, 정제 및 RBEC의 대량 살상 무기 확산

RBEC 재배의 가장 큰 문제는 서로 다른 문화 간의 재현성을 달성하는 것입니다. 프로토콜의 표준화가 표시 높은 품질 도구가 필요합니다섹션 고품질 시약 및 시약 만료일 대하여. 실험은 피질 표면에서 수막 및 대형 선박의 신속한 제거를 위해 입체 현미경 미세 해부에 숙련 될 필요가있다. 뇌가 절연 및 기계적 해리되면, 주요 과제 중 하나는 갓 격리 뇌 미세 혈관의 최적 소화 효소이다. 사용되는 효소의 종류와 품질이 중요하다. 일괄 처리 사이의 낮은 변동성과 높은 농도의 콜라게나 제 I 형 및 II와 디스 파제의 혼합 사용 하였다. 또 다른 중요한 효소 소화 기간과 소화 효소의 농도 / 티슈 중량 / 부피 사이의 비율이다. 뇌 미세 혈관 생산 최고의 수율은 30 분 ~ 1 시간에 각각 두 digestions 동안 60 ㎍ / ml로 혼합 디스 파제 / 콜라게나 제 1 ㎖에 1부터 뇌 피질의 등가 얻었다.

또 다른 중요한 세포 오염의 제거이다S (성상 세포, 주로 혈관 주위 세포). 이들 세포는 내피 세포보다 더 높은 속도로 증식 및 양호한 세포층 제한성으로 균질 세포 단층의 설립을 방지 후자 타이트 접속점을 설정하지 않는다. 비 - 내피 세포가 제거되는 동안 뇌 내피 세포는 미세 혈관에있는 다른 세포 유형에 비해 유출 펌프의 훨씬 높은 수준, 특히 P-GP를 표현하는 것을 고려하여, 그들은 더 P-GP 리간드 약물 달리 독성 농도를 용인. 처음 두 일 4 ㎍ / ml로 마이신 치료가 좋은 내피 세포의 순도를 얻기 위해 2 ㎍ / ㎖의 두 일 이상으로 이어졌습니다. 이 선택은 또한 세정맥, 전 모세관 동맥 이상 미세 혈관에서 그 대 모세 혈관 내피 세포를 선호하고, 엄격한 단일 층으로 이어질 수 있습니다. 또, 불량 혈장 유래 혈청의 사용은 내피 세포 47,48의 순수 배양을 얻는 것이 필수적이다. 플라즈마 데르ived 혈청 평활근 세포에 대해, 따라서 혈관 주위 세포를 들어, 섬유 아세포를위한 분열 촉진 혈소판 - 유래 성장 인자 (PDGF)를, 결여된다.

우리는 쥐의 꼬리에서 전통적으로 권장 콜라겐 I 형에 비해 확산 수익률의 2 배 증가, 생쥐와 인간 피브로넥틴은 상당한 이점을 얻을 수에서 콜라겐 유형 IV의 혼합 플라스틱 및 필터의 치료를 관찰했다. 세포 증식에 중요한 단서가 같은 인테그린 및 성장 인자 (bFGF를) 활성화 49과 세포 외 기질 (extracellular matrix)에 의해 제공된다. 버퍼 농도와 배양액의 pH는 세포층의 견고 (50)에 긍정적 인 영향을 설명하고 우리는 5 ㎜로 HEPES 버퍼의 추가와 문화 사이의 더 나은 재현성을 관찰했다.

삽입 필터에 공동 문화 구축 : RBEC의 분화

뇌 혈관 내피 세포는 ㄴ하면EEN은 정제 6 일 동안 증식 한, 그들은 필터에 도금 될 수있다. 고밀도 셀 도금은 완벽한 단일 층을 얻을하는 것이 중요합니다. 12 웰 플레이트 필터 당 160x10 3 세포의 파종 밀도는 파종 후 합류 단층 24 시간을 얻기 위해 필요 충분했다. 그러나, 자신의 환경으로부터 기본 뇌 모세 혈관 내피 세포의 분리는이 일차 전지 및 특히 뇌 모세 혈관 내피 세포를 강하게 그들의 환경 규제와 유도 요소에 의해 생성되는 것으로 알려진 바와 BBB 시험 관내 모델을 건설 역설 다른 주변 세포 유형. 뇌 모세 혈관 내피 세포는 단독으로 신속하게 해제 차별화를 배양하고 일부 특정 뇌의 혈관 내피 세포 마커를 풀어. 따라서, 기본 내피 세포는 낮은 통로 (P1)에서 사용되어야하고 다시 연결, 적어도 부분적으로, 성상 세포 47,51에 의해 조절 성상 세포 또는 매체와 공동 배양하여 자신의 환경. 이 보유뇌 혈관 내피 세포와 성상 세포와 같은 성상 세포의 분화에 대한 사실은 양방향 유도에 참여하고 있습니다. 성상 세포와 RBEC을 배양하는 것은 interendothelial TJ 52,23 강한 유도되었다. 다시 유도의 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않은 남아 있고, 연구는 최적의 내피 세포 분화 (53, 54)을 촉진 할 수 성상 세포에 의해 분비되는 특정 변조 요소를 식별하는 여러 실험실에서 진행되고있다. 백혈병 억제 인자 (LIF) 등의 뇌 혈관 내피 세포에 의해 분비 요인 성상 세포의 분화 (55, 56)을 유도하는 것으로 나타났다. 공동 문화 구축하기 전에, 성상 세포는 글루코 코르티코이드 수용체 작용제 하이드로 코티손을 포함하는 차별화 매체에 노출 및 공동 문화 매체를 가동했다. 하이드로 코티손은 뇌 내피 세포의 기밀성을 향상시키기 위해 공지되어 있고, 특히 57 래트 및 마우스 58,59 내피 세포로부터 BBB 모델에서 사용된다. 에어컨 메디음은 3 일 후 내피 세포 / 성상 세포 공동 배양 시스템의 하부 구획에서 수집하고 나중에 사용하기 위해 냉동. 공동 문화 에어컨 매체의 사용은 2 일 이상 최적의 세포층의 투과성과 문화 사이도 향상 재현성 3 일 내피 세포 분화의 시간을 감소시켰다.

전반적으로, 우리가 설명하는 프로토콜은 0.26 ± 0.11 × 10 -3 cm 가장 기본 셀 기반 BBB 모델 22과 유사 / 분, 300 옴을 통해 재현 봉사자 · cm 2, 평균 세포층의 투과성 계수 PE (LY)를 산출 12. 우리는 미세 혈관 효소 소화의 제안 변조하여 본 논문에서 설명하는 프로토콜은 쥐의 척수 (60)와 쥐의 뇌에서 내피 세포 확장 할 수 있습니다.

분자 및 기능적 특성

게다가TJ 유도로, 성상 세포는 뇌의 내피 세포 (61) P-GP로 유출 트랜스 포터의 발현에 기여한다. 우리는 실제로 BBB 모델의 유출 운송업자 P-GP의 발현을 표시하고 우리는 생화학 적 방법을 사용하여 P-GP 유출 펌프 국산화의 극성을 설명하고, P-GP 활동의 기능 분석을 사용하여. GLT-1의 발현은 미세 혈관의 기저 막 분획에서 검출 되었으나 배양 RBEC 검출되지 않았다. 우리는 GLT-1 아래에있는 생체 조건과 웨스턴 블롯 분석에 의한 결과 불검출에 비해 우리의 RBEC 문화에 규정 된 가설. 과도한 글루타메이트는 신경 독성과 생체 내에서, GLT-1은 혀끝의 구획 (혈액 순환)에 기초 함 (실질)에서 글루타메이트 유출에 대한 책임이 있습니다. 성상 세포 배양에서는 GLT-1의 발현은 매우 낮게 유지되고 매체 62, 63에 글루타메이트를 첨가함으로써 유도된다.

우리는 또한 믿어IRM 같은 LRP1, LDLR 및 TFR로 정점 막에 유입 운송업자의 표현. TFR과 LDLR의 기능은 이전에 체외 BBB 모델 64 소와 같이 단일 층의 abluminal 측에 내강에서 TF-를 Cy3와 DiLDL의 실험을 바인딩 및 전송 시연했다. 흥미롭게는 성상 세포에서 그 지질 요구 (65, 66)는 상기 체외 포함한 교세포와 뇌 내피 세포 간의 생리적 누화를 확인한 뇌 모세 혈관 내피 세포에 LDLR의 발현을 증가 보여왔다. 우리는 형광 염료로 전송을 예시하기로 선택한 예 를 Cy3와 DII는 spectrofluorimetric 분석은 대부분의 실험실에서 사용할 수 있으며, 시험 관내 BBB 모델에서 유효성을 검사하는 데 유용 할 수 있다는 생각으로. 그러나, 형광의 정량화는 방사능보다 훨씬 덜 민감하고 중요한 데이터를 얻는 실험을 수의 증가를 요구한다.이상적은 Tf 및 LDL은 바인딩 / 흡수 및 전송 실험에 보통 (요오드 125) 방사성 동위 원소이다.

우리는 또한 제안 된 프로토콜을 얻은 차별화 된 내피 세포의 단층이 CCL2 해제하고 BBB 개방에 의해 밝혀로, TNF-α에 의해 유도 된 염증 반응을 보여준다. CCL2는 (MCP-1)와 그 수용체 CCR2는 다중 경화증, 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 67, CNS 외상 (68)와 신경 염증성 조건 69, 70에서 CNS에 백혈구 이동의 매개체로 알려져 있습니다와 같은 중추 신경계 병변에 참여하고 있습니다. BBB 개방은 CCL2 농도가 위 (꼭대기)와 하부 (기초) 구획 둘 사이의 평형을 할 수 있기 때문에 테스트 프로토콜로, 우리는 CCL2의 편광 분비에 결론을 내릴 수 없습니다. 결과적으로, 우리는 분명히 24 시간 (그림 5A)의 정점 구획에 RBEC에 의해 생성 CCL2의 양을 과소 평가하는 경향이있다.

일반 개요 및 체외 모델에서 BBB의 제한 : 나는 N 생체 대 생체 외 및 설치류 인간의 비교 대

체외에서 BBB 통로에 효과가 입증 많은 유망 CNS 약물은 종종 인간 이외의 종에서 분리 된 세포를 기반으로 생체 BBB 모델에 의한 예측의 부족으로 임상 시험에 실패했습니다. 이 단백질 네트워크, 신호 전달, 수송 및 수용체의 기계적인 측면을 공부에 관해서는 우리가 아는 한, 체외 BBB 모델은 아마 예측이다. 체외에서 공부하는 모든 장치, 경로 또는 대상은 같은 동물의 종으로 보완 환경 단서 (다른 세포 유형, 화학 물질, 단백질)에 의해 조절에 대한 특징과 현장 연구에 결합 할 수있다및 제한 사항 및주의, 인간으로부터 격리 미세 혈관 내피 세포, 가능한 아래 유발합니다.

체외에서 BBB 모델은 몸의 규제에서 분리 된 자동 시스템으로 볼 수있다,하지만 여전히 중요한 생체 내 특성과 환경 단서에 의해 규제 가능성을 부여. 내피 세포 단일 층은 신경 교세포 혈관 장치 (NGVU)의 중요한 구성 성분의 수 부족과 혈액 및 신체 조절 분리되어 있기 때문에 더는 "이상적인"체외 BBB 모델은 아직 71,72,73를 제안하지 않았습니다. 혈관 주위 세포 74,16 또는 17,18 뉴런 또는 플라스틱 코팅 또는 내피하여 가장 일반적이고 "쉬운 제"체외 BBB 모델에서 세포 성장을 위해 사용 배지 및 혈청 사용 외 기질의 서로 다른 성분의 부족 성상 세포로 분화 된 세포가 단백질 발현을 조절 제가있다n은 생체 내 상황 75과 비교. 이러한 모델은 생체 내에서 표시 많은 수송을 표현하지만, 모든 수 있습니다. 일부의 경우, 전송 매개 변수는 제 고립 미세 혈관 (생체 내 상황에 가장 가까운)에서 검증 한 후, 세포 배양 시스템 76,61 공부.

분자 생물학 연구를 허용 한 같은 종에서 고립 된 미세 혈관과 낮은 통로 내피 세포 배양에있는 유전자와 단백질 발현의 특성, 그리고 다른 종 사이에, 가장 자주 설치류 (쥐 및 쥐)로 또는에서 소와 돼지의 작은 동물에서 인간 77,78,75,15 비교. 생체 내 및 생체 외 뇌 미세 혈관 내피 세포 사이의 Transcriptomic 비교 차별적 표현과 자주 크게 체외에서 하향 조절 된 다수의 유전자 사본을 보여 주었다. 이러한 TFR 및 홍보 등의 유입 수송을 인코딩 성적 증명서소포 인신 매매에 연루 oteins는 주로 세포 내 이입과 기공을 갖는 전송의 일반적인 감소를 제안하고, 배양 된 뇌 혈관 내피 세포에서 하향 조절된다. 순도 (퓨로 마이신 처리) 및 하이드로 치료의 관점에서 문화의 조작보다 "생체와 같은"유전자 발현 프로파일 (77)을 복원하는 데 도움이 될 수 있습니다. Transcriptomic 연구는 또한. 인간의 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 체외 BBB 모델 (15)를 설명 하였다 또한 체외 BBB 모델 75 설치류를 기반으로 인간의 약물 흡수에 대한 예측을 복잡 종 사이의 중요한 차이점을 공개했다. 관련 비록 그들이 사후 인간 조직에 규제 액세스를 필요로하고 이질성은 연령, 질병, 그리고 아마도 의료에 따라 인간의 뇌 내피 세포의 품질 / 속성있어, 이러한 모델은 정기적으로 구현하기가 더 어렵다 treatmen기증자의 t. 노력은 더 생리 해부학 및 생체 BBB의 기능적 특성을 재현 신규 체외 모델을 개발하기 위해 만들 수있다. 세 종류의 세포를 포함하는 공동의 문화는 매우 제한하고 정기적으로 구현하기 어려운 나타납니다. 현재까지 가장 복잡한 체외 BBB 모델은 성상 세포와 혈관과 같은 조직을 포함하고 혈액의 흐름 75,79,80,81,82을 모방 매체의 흐름을 포함하는 동적 체외 모델 (DIV-BBB)입니다 83,84,85. 대뇌 내피 세포가 흐름에 노출되는 경우, 생성 된 전단 응력은 세포 분열, 분화, 이동 및 아폽토시스 80 내피 세포 생리학에 관련된 다른 유전자의 발현을 조절하는 세포 표면에서 mechanotransducers를 활성화한다. 생체, 전단 응력 혈류에서 생성의 확립을 허용 세포 접촉에 유사 분열 정지를 책임진다혈관 (80)의 내피 세포 단일 층. 정상적인 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포의 게놈 및 단백질 체학 분석 BBB 내피 생리학 (84)에서 전단 응력의 ​​영향을 보여 주었다. 전단 응력은 CYP450에 의해 매개 75,86, 산화 75 효소 및 세포의 생존, 내피 세포 접착의 높은 수준, 유출 펌프 유도 및 운송 75, 포도당 대사의 조절을 더 잘 편광에 대한 책임의 표현을 증가시켜 세포층의 투과성을 조절 occludin과 ZO-1 87,75,80 결과적으로 높은 티이 같은 세포 간 접합부 요소에 대한 코딩 유전자의 1,500 - 2,000 옴 · cm 2, 생체 내에서 알려진 가장 가까운는 79,80 매개 변수

생명 공학 및 제약 산업에서 약물 또는 높은 처리량 검사 (HTS) 및 동물 실험을 줄이기위한 노력의 일상적인 검사가 주도셋업 일상적 어려워 남아 대뇌 내피 세포의 일차 배양 보충에 사용되는 상이한 세포주의 개발. 대부분의 경우에, 대뇌 내피 세포의 일차 배양은 레트로 바이러스 벡터를 사용 88,89,75 플라스미드 DNA의 형질 감염 또는 감염에 의해 하나, 불멸화 유전자 (SV40 나 폴리오 마 바이러스 큰 T 항원 또는 아데노 바이러스 E1A)로 형질 도입 하였다. 뇌 유래의 여러 내피 세포 라인은 RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS 또는 rBCEC4 쥐 세포주 88,75, b.End3 마우스 세포주 90,75, PBMEC/C1에게로 개발되고있다 - 2 돼지 세포주 87,75 및 hCMEC/D3 인간 세포주 89,75. 다른 모델은 같은 Madin-다비 개 신장 (MDCK) 또는 Caco2 세포주 12,75 같은 비 대뇌 유래의 세포를 기반으로합니다. 다른 인간 대뇌 내피 세포주 중에서도 hCMEC/D3 널리 인용되었다D 2005 년 91, 92 년에 설립 된 이후 BBB의 모델로 개선되었다. 차 문화, 세포주 선물 한 장점과 단점이있다. 그들은 차 문화를보다 쉽게​​ 처리 할 수​​ 있습니다 확장 된 수명을 가지고, 잘 특징 및 대규모 실험 사이의 재현성을 할 수 있습니다. 그러나, 세포주, 조직 고유의 기능을 잃게 환경 규제를 잃고 생체 75, 89에있는 세포와는 다른 분자 표현형을 획득 할 수있다. 특히, 세포주 현재 감소 압박감, 낮은 봉사자 및 쇼 수송 프로파일 변화 75,89에서 생성 된 단일 층. 따라서 일차 전지에있는 동물 실험이나 연구는 종종 자신의 복잡성에도 불구하고 바람직하다.

Acknowledgments

VECT - HORUS에 대한 금융 지원은 드퐁 고유 Interministériel (FUI / MEDUL 프로젝트)하고 VECT - HORUS과 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC 및 PREVENTAD 공동 프로젝트)에서 UMR7259 실험실에서 인정 . UMR7259 연구소는 CNRS에서와 엑스 - 마르세유 대학이 재정 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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의학 제 88 쥐의 뇌 혈관 내피 세포 (RBEC) 마우스 척수 꽉 접합 (TJ) 수용체 매개 교통 (RMT) 저밀도 지단백 (LDL) LDLR 트랜스페린 TFR P-당 단백질 (P -GP) 내피 전기 저항 (봉사자)
설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점
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Molino, Y., Jabès, F.,… More

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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