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Medicine

Istituzione di un Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Abstract

La barriera ematoencefalica (BBB) ​​specificamente disciplina flusso molecolare e cellulare tra il sangue ed il tessuto nervoso. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare e caratterizzare un singenico ratto altamente riproducibile modello in vitro di BBB con co-colture di ratto cellule endoteliali cerebrali primari (RBEC) e astrociti a studiare recettori coinvolti nella transcitosi tutto il monostrato di cellule endoteliali. Gli astrociti sono stati isolati dalla dissezione meccanica seguendo la digestione tripsina e sono stati congelati per la successiva co-coltura. RBEC sono stati isolati da 5 settimane di età corteccia di ratto. I cervelli sono stati puliti delle meningi e sostanza bianca, e dissociate meccanicamente seguendo digestione enzimatica. Successivamente, il tessuto omogenato è stato centrifugato in sieroalbumina bovina per separare i frammenti del vaso da tessuto nervoso. I frammenti del vaso subito una seconda digestione enzimatica di cellule endoteliali liberi dalla loro matrice extracellulare. Le cellule contaminanti rimanenti come periciti sono stati fLTERIORI eliminato con placcatura i frammenti dei microvasi nel medio-puromicina contiene. Sono stati poi diversi passaggi su filtri di co-coltura con astrociti coltivate sul fondo dei pozzetti. RBEC espresso alti livelli di giunzione a tenuta (TJ) proteine ​​come occludina, claudin-5 e ZO-1 con una localizzazione tipica ai bordi della cella. La resistenza elettrica transendoteliale (TEER), del cervello monostrati endoteliali, che indica la tenuta del TJs raggiunto 300 ohm · cm 2 in media. I coefficienti di permeabilità endoteliale (PE) per lucifer yellow (LY) era altamente riproducibile con una media di 0.26 ± 0.11 x 10 -3 cm / min. Cellule endoteliali cerebrali organizzati in monostrati espressi trasportatore d'efflusso P-glicoproteina (P-gp), hanno mostrato un trasporto polarizzato di rodamina 123, un ligando per P-gp, e mostravano trasporto specifico di transferrina-Cy3 e DiILDL attraverso il monostrato di cellule endoteliali. In conclusione, forniamo un protocollo per la creazione di un in vitroModello BBB che è altamente riproducibile a causa dei metodi di garanzia della qualità, e che è adatto per la ricerca sulle trasportatori BBB e recettori.

Introduction

Molti farmaci sviluppati per il trattamento di Sistema Nervoso Centrale (SNC) disturbi sono in grado di raggiungere il parenchima cerebrale in concentrazioni terapeuticamente rilevanti. La BBB protegge il tessuto nervoso cerebrale dalla fluttuazione della composizione plasma, dagli agenti patogeni, e mantiene l'omeostasi del parenchima cerebrale limitando non specifico flusso di ioni, peptidi, proteine ​​e anche le cellule e verso il cervello 1.

Caratteristiche BBB sono indotte e mantenuti da intima vicinanza e cross-talk tra la classe specializzata microvasi cerebrali cellule endoteliali e gli elementi adiacenti dell'unità neuro-glia-vascolari (NGVU) come i neuroni, cellule gliali (più precisamente astrociti finali piedi), e periciti ensheathed nella membrana basale che consiste principalmente di collagene tipo IV, fibronectina, la laminina e proteoglicani 2,3. Periciti coprono circa il 22 - 32% dell'endotelio a livello capillare e svolgono un importanteruolo nella regolazione della proliferazione dell'endotelio, angiogenesi e processi infiammatori. Le cellule endoteliali formano un foglio continuo che copre la superficie interna dei capillari. Essi sono interconnessi da TJs, che formano una struttura di cintura in corrispondenza della zona apicale e che contribuiscono alla cella di polarizzazione. Gli astrociti regolano le proprietà BBB e sono fonti di importanti fattori normativi, come TGF-β, GDNF, bFGF e IL-6. Gli astrociti carenti di GFAP con funzionalità incomplete non sono in grado di regolare BBB proprietà 4. Neuroni non sono direttamente coinvolti strutturalmente nella formazione della BBB ma regolano anche aspetti importanti di espressione proteica e funzioni BBB 5.

Per studiare ulteriormente la struttura, fisiologia e patologia del BBB, modelli in vitro della BBB sono stati sviluppati come strumenti di ricerca. Cellule endoteliali cerebrali sono stati estratti da varie specie di attuare in vitro modelli BBB basatoil passaggio colture basse primarie da bovini, suini 6,7 8,9, 10,11,12 ratto, topo 13 e anche umano 14,15. Questi modelli sono noti per imitare in vivo BBB, in particolare quando co-coltura con cellule gliali di ratto o murina e / o periciti 16,12, e / o derivati ​​da cellule progenitrici neurali astrociti 17 e / o 18 neuroni. I modelli "in laboratorio" sono spesso prodotti da roditori perché permettono esperimenti in vitro / in vivo e confronti e / o lo studio delle cellule endoteliali cerebrali prodotte da modelli transgenici 19.

Di recente sviluppato in modelli in vitro di BBB sono stati progettati per aiutare a prevedere l'assorbimento del cervello di potenziali candidati farmaci del sistema nervoso centrale prima del test in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modelli in vitro BBB sono di solito utilizzati per confrontare il trasporto di farmaci con: i) penetrazione noto nel SNC o con low permeabilità attraverso la BBB e senza effetti centrali, e ii) l'apparente Pe degli stessi farmaci misurati in modelli animali della stessa specie. I farmaci che passano rapidamente la BBB sono prevalentemente lipofilo e attraversano le membrane delle cellule endoteliali cerebrali da lipidi mediata libera diffusione (caffeina, carbamazepina, ecc). I farmaci trasportati negativamente come la digossina, verapamil o ciclosporina A sono attivamente estrusi da endoteliali cerebrali trasportatori di efflusso come la P-gp. Tuttavia, molte delle molecole terapeutiche nuova concezione sono biofarmaceutici, come proteine ​​ricombinanti, siRNA o anticorpi monoclonali. La maggior parte di loro non attraversare la BBB a causa di: i) l'assenza di trasportatori specifici, e ii) lo strato fitto di cellule endoteliali, che impediscono molecole ad alto peso molecolare dalla fase di passaggio paracellulare. Con questi limiti, le strategie di "Trojan horse", sono state implementate utilizzando vettori (anticorpi, peptidi) contro i recettori noti al BBB, ha coinvolto in recettore trasporto mediato o transcitosi (RMT), come la transferrina (Tf) recettore (TfR), il recettore dell'insulina (IR), o membri del recettore LDL (LDLR) connessi famiglia di recettori (LDLR, LRP1). Tali recettori sono stati trovati su isolati capillari cerebrali e nella BBB in vivo 24,25. Profili trascrizionali per questi recettori, in particolare quelli della famiglia LDLR, sono stati analizzati e confrontati tra cellule endoteliali cerebrali e le cellule endoteliali cerebrali in co-coltura con astrociti o nei capillari cerebrali direttamente dopo la loro estrazione dal cervello 26. Pardridge 24 aperto il campo con l'anticorpo OX-26 contro il recettore della transferrina (TfR), seguito da anticorpi contro il recettore dell'insulina e il fattore di crescita insulino recettore 27,28. Con questi vettori anticorpi basato, ArmaGen Technologies ha sviluppato una piattaforma tecnologica cavallo di Troia molecolare BBB per fornire farmaci, tra cui le proteine, attraverso la BBB 29. Illa letteratura è ricca di dati che mostrano l'espressione LRP1 in cellule endoteliali cerebrali e il suo ruolo come un potente recettore endocytic / scavenger. Analisi Western blot ha suggerito che LRP1 è espresso in frazioni arricchite in capillari cerebrali di ratto e in cellule endoteliali capillari cervello 30. Aziende come Angiochem bersaglio LRP1 con vettori di peptidi derivati ​​da aprotinin che promuovono efficiente afflusso farmaco attraverso la BBB 31. Tuttavia, LRP1 si occupa anche di trasporto attivo di Ap e il suo efflusso / spazio da parenchima cerebrale al sangue 32. Tali dati implicano LRP1 in un trasporto bidirezionale di tutti i BBB a seconda dei suoi ligandi. biOasis sviluppa la tecnologia Transcend utilizzando un melanotransferrin proteina per il trasporto di farmaci biologici come gli enzimi lisosomiali e anticorpi attraverso la BBB 33 mentre VECT-HORUS sviluppa vettori peptidici che colpiscono il LDLR 34. Ci sono dati suggerendo che la LRP e LDLR possono essere utilizzati per il trasporto di differenti molecole come gli enzimi lisosomiali 35,36 o complessi di nanoparticelle attraverso la BBB 37.

Il nostro campo di interesse è la somministrazione di farmaci al SNC utilizzando molecole vettoriali e vettorializzate droga candidati per il trattamento di malattie del SNC. In particolare, la somministrazione di farmaci attraverso la BBB deve essere considerato nel contesto di neuroinflammation, un processo che può variare nella sua estensione, ma che è probabilmente comune a tutte le lesioni e malattie del SNC, compreso l'encefalite, sclerosi multipla, morbo di Alzheimer, ecc Neuroinflammation è associato con infiammazione BBB e potenzialmente con i cambiamenti nella fisiologia e BBB permeabilità considerando che paracellular e trasporto transcellulare possono essere amplificati in condizioni patologiche 38,39,40,41,42,43. Ad esempio, TNF-α, Tweak, e di altre citochine modulano l'infiammazione, e gli esperimenti in vitro con modelli BBB a hanno dimostrato che possono alterare le proprietà paracellulare di secoloe monostrato di cellule endoteliali 38,39,40 e che il TNF-α porta anche ad un aumento del trasporto transcellulare di LDL 41, holotransferrin 42 e 43 lattoferrina.

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare e caratterizzare un ottimizzato e altamente riproducibile ratto singenico modello BBB con co-colture di cellule endoteliali cerebrali primari e astrociti. Abbiamo usato 5 settimane vecchi e neonatali ratti Wistar per la produzione di cellule endoteliali cerebrali e la produzione di astrociti, rispettivamente. Una sfida era quella di stabilire un protocollo che consente la produzione di modelli BBB "settimanale riproducibili". Per raggiungere questo obiettivo, ogni passo del disciplinare di produzione è stata eseguita in giorni fissi della settimana, a partire dalla produzione dei microvasi cerebrali il Mercoledì della prima settimana. Dissezioni sono stati eseguiti quasi ogni settimana nel corso degli ultimi 3 anni. Per migliorare ulteriormente la riproducibilità delle culture, è stato istituito un sistema di garanzia della qualità. Tutti Reagents e sostanze chimiche sono state utilizzate in una banca dati (data di entrata, magazzino, scadenze, ecc).

Il modello è stato caratterizzato a seguito di una serie di criteri, quali l'organizzazione delle cellule endoteliali e la purezza, TEER, LY permeabilità, risposta agli agenti pro-infiammatori, espressione qualitativa e quantitativa delle proteine ​​TJ, funzionalità dei trasportatori di efflusso come la P-gp, e recettori coinvolti in transcitosi di tutti i monostrato cellulare endoteliale come il TfR o il LDLR.

Protocol

1. Produzione di Rat astrociti

Per ogni preparazione utilizzare 10 neonatali ratti Wistar di entrambi i sessi.

  1. Sacrifica i ratti tagliando la testa con un paio di forbici e trasferire immediatamente in una capsula di Petri asciutto sotto una cappa a flusso laminare. Rimuovere il cervello dal cranio, senza il cervelletto e trasferire immediatamente in una capsula di Petri contenente tampone dissezione a freddo: HBSS integrato con 1% di sieroalbumina bovina (basso livello di endotossine BSA), penicillina 100 unità / ml e streptomicina 100 pg / ml.
  2. Tagliare il cervello a metà, per separare i due emisferi cerebrali e trasferirli in un piatto di Petri pulita con buffer di dissezione su ghiaccio. Tagliare il nervo ottico e togliere le meningi sotto uno stereomicroscopio.
  3. Lavare le parti corticali estesamente in 50 ml di tampone di dissezione a freddo.
  4. Mettere i pezzi corticali da 3 cervelli in una provetta Falcon 15 ml e dissociare pipettando su e giù un colpo di statoLe volte con 10 ml pipetta monouso provvisto di punta blu in 6 ml di tripsina 0,05% - EDTA 0,02% per 5 min a 37 ° C.
  5. Aggiungere 24 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e seguenti antibiotici, penicillina 100 unità / ml e streptomicina 100 pg / ml, un supporto multimediale denominato cellule gliali (GCM) e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Lotti FBS sono stati selezionati e validati per la crescita e la sopravvivenza di cutures astrociti.
  6. Risospendere il pellet contenente le cellule dissociate in 10 GCM ml e la piastra in 75 cm 2 T-pallone (T75). Cambiare il mezzo giorno successivo per rimuovere i detriti cellulari e DNA. Sostituire la cultura dei media due volte a settimana.
  7. Dopo 1 settimana di proliferazione, scuotere delicatamente le cellule gliali con un agitatore orbitale a 60 giri al minuto per 24 ore a 37 ° C in GCM. Se il T75 non può essere collocato in un incubatore con il 5% di CO 2/95% aria a 37 ° C ambiente umidificato, integrare il supporto con 5 mM HEPES. Lavare le cellule due volte per rTogliete le cellule microgliali non aderenti.
  8. Tre settimane dopo la semina, lavare le cellule due volte con DPBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 3 ml di tripsina 0,05% warm-EDTA 0,02%, incubare a 37 ° C e attendere che lo strato di cellule viene disperso (solitamente 5 min). Inibire l'attività della tripsina aggiungendo 10 ml di GCM, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml Falcon e centrifugare a 120 xg per 8 min.
  9. Risospendere il pellet astrociti nel 90% FBS - 10% DMSO, trasferirli in cryovials (2 x 10 6 cellule per esageratamente) e conservare in azoto liquido.

2. Isolamento di cervello di ratto microvasi

Le nostre procedure sperimentali sono approvati dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina di Marsiglia e conformi alle normative nazionali ed europee (direttiva UE n ° 86/609). Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e ridurre il numero di animali utilizzati.

  1. Per ogni preparazione e per una Experimenter, utilizzare 3 cinque settimane ratti Wistar.
  2. Lunedi della prima settimana, preparare 2 palloni T75 rivestendo con collagene di tipo IV e fibronectina, sia a 1 mg / cm 2 in acqua coltura sterile (10 ml per T75). Lasciare aderire a 37 ° C fino microvasi seeding.
  3. Mercoledì mattina della prima settimana, i ratti eutanasia sotto un flusso crescente di CO 2 per indurre sonnolenza, perdita di postura e respirazione interruzione, seguita da una dislocazione cervicale. Spruzzare le teste con il 70% di etanolo. Tagliare le teste con un paio di forbici e trasferirli in una capsula di Petri asciutto sotto una cappa a flusso laminare.
  4. Rimuovere il cervello dal cranio senza il cervelletto e dei nervi ottici, poi trasferirli in una capsula di Petri raffreddata su ghiaccio e riempita con tampone di dissezione a freddo (HBSS supplementato con 1% BSA, penicillina 100 unità / ml e streptomicina 100 mg / ml) .
  5. Tagliare il cervello a metà per separare i due emisferi cerebrali e mesencefalo separati da perebrain. Trasferire le forebrains in un piatto pulito Petri su ghiaccio con tampone di dissezione.
  6. Prendete un paio di emisferi in un nuovo piatto di Petri con tampone dissezione a freddo per rimuovere con attenzione le meningi dal forebrains allo stereomicroscopio con N ° 5 pinze curve. Poi, pulire l'interno del cervello per rimuovere il piumone di mielina e ottenere un guscio di corteccia. Questi passaggi non devono assumere più di 2 ore per la conservazione dei tessuti e la sopravvivenza cellulare.
  7. Dissociare la corteccia da 3 cervelli in 6 ml di tampone dissezione a freddo in un 7 ml Dounce omogeneizzatore da 10 in su e giù colpi con ciascuno dei due pestelli di diverse liberatorie, 71 micron seguita da 20 micron.
  8. Dividere la sospensione per ottenere l'equivalente di 1 corteccia in 1 ml di un tubo da 50 ml Falcon e centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
  9. Digerire la sospensione da 1 corteccia con 1 ml di una soluzione enzimatica contenente una miscela di collagenasi / dispasi (60 mcg / ml R11; 0,3 U / ml), DNasi tipo I (35 mg / ml - 20 K unità / ml) e gentamicina (50 mg / ml) in un agitatore per 30 min a 37 ° C.
  10. Mescolare il 1 digest ml da 1 corteccia con 10 ml di 25% BSA / HBSS 1X e separata dalla densità centrifugazione dipendente a 3.600 xg per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire con cautela il disco superiore (mielina e cervello parenchima) e il surnatante in un ambiente pulito 50 ml tubo Falcon e ripetere la centrifugazione. Mantenere il pellet risultante contenente i microvasi cerebrali a 4 ° C.
  11. Eliminare attentamente il disco superiore e il surnatante. Risospendere entrambi i pellets risultanti contenenti i microvasi cerebrali con 1 ml di freddo HBSS 1X e trasferire in un ambiente pulito 50 ml tubo Falcon.
  12. Lavare microvasi per aggiunta di 20 ml di HBSS 1X freddo e centrifugare a 1000 xg per 5 min. Scartare il surnatante.
  13. Ulteriori digerire i microvasi da 1 corteccia di 1 ml della stessa soluzione enzimatica come descritto al punto 2.9 per 1 ora a 37 ° C in un shAker.
  14. Poi, mescolare i microvasi digeriti da ciascuno dei 3 cortecce in una provetta e in seguito separare in due provette Falcon da 50 ml avere microvasi estratti da l'equivalente di uno e mezzo (1,5) corteccia per provetta. Aggiungere 30 ml di tampone di dissezione a freddo e centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  15. Risospendere il pellet microvasi in 10 ml di DMEM/F12 addizionato con siero bovino 20% plasma povero di piastrine derivato, fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 2 ng / ml), eparina (100 mcg / ml), gentamicina (50 mg / ml) e HEPES (2,5 mm), denominato supporti cellule endoteliali (ECM) integrata con puromicina a 4 mg / ml.
  16. Prendete i due palloni T75 rivestite dal termostato, aspirare l'eccesso di rivestimento e piastra microvasi da ogni provetta in un pallone T75 (microvasi estratti da 1,5 corteccia per bombola T75).

3. Purificazione e proliferazione delle RBEC Primocultures

  1. Purificazione: Mercoledì a Venerdì, aggiungere puromycin a 4 mg / ml per terreni di coltura. Modificare il supporto su Giovedi. Venerdì scorso, lavare le cellule e aggiungere puromicina a 2 mg / ml fino a Lunedi.
  2. Proliferazione: il Lunedi della seconda settimana, lavare le cellule e aggiungere insulina, transferrina e supplemento selenite di sodio al terreno di coltura fino a quando le culture raggiungono il 90% di confluenza il Mercoledì della seconda settimana.

. 4 Differenziazione: Impostazione del modello in vitro BBB

  1. Lunedi della seconda settimana, preparare filtri (polietilene, 12 pozzi, dimensione dei pori 1.0 micron), rivestendo con un mix di collagene di tipo IV e fibronectina sia a 0.5μg/cm 2 in acqua coltura sterile (500 ml di mix nel vano superiore e 1,5 ml di acqua sterile cultura nel vano inferiore). Lasciare aderire a 37 ° C fino RBEC seeding.
  2. Lunedi della seconda settimana, cinque giorni prima della costituzione della co-coltura, scongelare gli astrociti da cryovials a 37 ° C e il trasferimentoin 15 ml Falcon da 10 ml GCM. Centrifugare la sospensione a 120 xg per 8 minuti a temperatura ambiente.
  3. Risospendere il pellet in astrociti GCM e piastra ad una densità di 30 x 10 3 cellule per cm 2 in piastre da 12 pozzetti.
  4. Mercoledì della seconda settimana, poco prima dissociazione di RBEC con tripsina, lavare due volte il filtro pre-rivestito con mezzo DMEM/F12. Pre-riempire le camere con ECM: 1,5 ml nel vano inferiore e 0,5 ml nel compartimento superiore.
  5. Mercoledì della seconda settimana, lavare due volte la RBEC con DPBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 4 ml di tripsina caldo 0,05% - EDTA soluzione 0,02% a 37 ° C al pallone T75 durante 30 sec esattamente. Quindi rimuovere 3,5 ml di soluzione di tripsina e osservare al microscopio. Quando lo strato di cellule inizia a staccarsi dalla matrice, aiutarli agitando leggermente il bordo del pallone T75 fino a quando tutte le celle sono galleggianti.
  6. Aggiungere 9 ml di ECM per bombola T75 e trasferire in una provetta Falcon 15 ml. Molto dissociare delicatamente il cellularesospensione pipettando su e giù 4 volte con una pipetta 10 ml munito di una punta gialla (evitare la produzione di bolle nella soluzione). Contare le cellule in sospensione (circa 3 x 10 6 cells/T75) e piastra immediatamente su filtri pre-rivestiti e preriempite ad alta densità (160 x 10 3 cellule / filtro quindi circa 18 filters/T75) (Figura 8 ). Il giorno seguente (Giovedi), cambiate due volte la media del vano superiore per rimuovere i detriti cellulari.
  7. Giovedi della seconda settimana, il giorno prima della costituzione della co-coltura, sostituire il mezzo di coltura astrociti di 1,5 ml di mezzi di differenziazione (ECM con idrocortisone a 500 nm), che possono essere integrati con un terzo mezzo condizionato dal compartimento basale di una precedente co-coltura (3 giorni di contatto tra cellule endoteliali e astrociti).
  8. Venerdì della seconda settimana è definito come il giorno 0 di differenziazione; sostituire il mezzo di coltura dalla filtri Containing il RBEC con i media differenziazione. Trasferire i filtri RBEC nei pozzetti contenenti gli astrociti. In queste condizioni, i modelli in vitro e differenziare esprimono proteine ​​di giunzione connessi entro 3 giorni.
  9. I modelli mantengono la loro differenziazione ottimale durante più di 3 giorni, tra Lunedi e Mercoledì della terza settimana.

Representative Results

Protocollo di Produzione
Il protocollo può essere divisa in 3 fasi corrispondenti a grandi cambiamenti nella coltura composizione mezzi: (a) Purificazione di cellule endoteliali dei microvasi, (b) proliferazione, e (c) differenziazione su filtri (piastre da 12 pozzetti in polietilene poroso 1 micron) in co-coltura con astrociti. Le varie fasi del protocollo di produzione sono stati assegnati a giorni specifici della settimana per aumentare la riproducibilità delle colture cellulari primarie (Figura 1). Il Mercoledì della prima settimana, quindi nove giorni prima della costituzione del sistema di co-coltura, i microvasi sono stati isolati (Figura 2A). Per purificare cellule endoteliali, le colture sono state mantenute in presenza di concentrazioni decrescenti di puromicina per 5 giorni. La maggior parte delle cellule contaminanti (principalmente periciti) sono stati eliminati e la crescita delle cellule endoteliali era inferiore senza modifica del loro fenotipo. Mandrino-shaped cellule crescono su frammenti capillari isolati da cervello di ratto materia grigia (Figura 2B). Sulla Lunedi della seconda settimana, astrociti di ratto sono state piastrate sul fondo di piastre da 12 pozzetti. Mercoledì, RBEC sono stati aggiunti al compartimento luminale dei filtri. Alta densità di semina a 160 x 10 3 cellule / cm 2 (Figura 2C) aiuta ad evitare vuoti alla periferia del filtro (Figura 2D) e genera una differenziazione omogenea del monostrato di cellule endoteliali. Le cellule mostrano la tipica morfologia fusiforme allungato, allineare longitudinalmente, e formano un monostrato uniforme. Giovedi, astrociti terreno di coltura è stato cambiato per il mezzo di differenziazione condizionato con il supporto di co-coltura precedente (Figura 2E). Venerdì, RBEC su filtri sono state coltivate in mezzo di coltura contenente 500 nM e idrocortisone i filtri sono stati trasferiti a piastre da 12 pozzetti contenenti gli astrociti. Nella terza settimana, esperimenti were eseguiti tra Lunedi e Mercoledì.

RBEC Caratterizzazione e determinare elementi di monostrato Permeabilità
Il RBEC stati caratterizzati mediante immunocolorazione delle endoteliale e marcatori BBB come anche per le misurazioni di TEER, permeabilità di LY e funzionalità di trasportatori di efflusso come P-gp.

RBEC ottenuta con il metodo di purificazione puromicina (Figura 1 e 2) è cresciuto in senza sovrapposizioni continue monostrati che mostravano inibizione della crescita a confluenza e visualizzato ermeticamente apposed, fusiforme e mandrino morfologia forma. Culture RBEC espressi marcatori tipici delle cellule endoteliali: hanno mostrato immunocolorazione positiva per piastrinica endoteliale molecola di adesione cellulare (Figura 3A; CD31/PECAM) e l'espressione del fattore di von Willebrand (Figura 3B). Senza trattamento puromicina, RBECs sono rapidamente invase da pericytes rilevati da Immunos desminaTaining (Figura 3C). Proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) espressi dagli astrociti (Figura 3D) è un importante indicatore differenziazione di astrociti. Con numero elevato passaggio, astrociti perdono la loro capacità di indurre il differenziamento delle cellule endoteliali. Per questo motivo, colture di astrociti sono stati standardizzati per il loro tempo di cultura e solo sottoposti a un passaggio.

Coltura RBEC con supporti integrati con idrocortisone, seguita da co-coltura con astrociti e con medium condizionato dal compartimento inferiore precedenti co-colture hanno portato a forte induzione di interendothelial TJ rispetto a RBEC colta da solo. Le cellule espressi claudin-5, ZO-1 e occludina proteine, che sono state localizzate in corrispondenza delle giunzioni cellula-cellula, come dimostrato da immunofluorescenza (Figura 4B-D) e rivelati mediante analisi western blot per ZO-1 e occludina proteine ​​(Figura 4E ). La distribuzione morfologica in cell-cellula contatti in una configurazione simile a cerniera riflette (a) la tenuta del monostrato, (b) l'origine cerebrale delle cellule endoteliali capillari, e (c) è caratteristica delle cellule endoteliali cerebrali altamente differenziate. Paracellulare permeabilità dello strato endoteliale è stato monitorato misurando la TEER e il tasso di afflusso di LY (457 Da) dall'alto verso il vano inferiore dei filtri. TEER è stata misurata utilizzando un ENDOHM-12 per 12 millimetri tazze di coltura collegati a un voltohmmeter Evom. Il TEER di cervello monostrati endoteliali, indicando la tenuta di TJs raggiunto 300 ohm · cm 2 in media (filtri da 12 pozzetti, dati non mostrati). Il Pe per LY (Pe (LY), utilizzato come controllo integrità della barriera e co-incubate con i composti testati) ha raggiunto una media di 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (Figura 4F) per un periodo di 1 anno.

Per indurre infiammazione RBEC abbiamo usato il pro-citochine infiammatorie TNF-α a 5 ng / ml per 24 ore, e seguì la risposta infiammatoria misurando CCL2 (MCP-1) secrezione da RBEC nel vano superiore del sistema di coltura che raddoppiato da 120 ng / ml (non- trattata controllo) a 250 ng / ml (Figura 5A). TNF-α a 5 ng / ml o 50 ng / ml per 24 ore anche aperto la BBB come rivelato da Pe (LY) misurazione (Figura 5B).

P-gp è stata visualizzata in RBEC differenziato per immunoistochimica (Figura 6A). Localizzazione P-gp è noto per essere altamente polarizzato e espresso essenzialmente nella membrana apicale delle cellule endoteliali 44 mentre il glutammato trasportatore-1 (GLT-1) si trova principalmente nella frazione basolaterale 45. Per valutare il grado di polarizzazione della nostra RBEC colta, proteine ​​apicali e basolaterali sono stati separati dalle preparazioni di membrana plasmatica con densità di saccarosio gradienti 46. Analisi Western Blot è statoeseguito per valutare i livelli di espressione di P-gp e GLT-1 nel plasma, apicali e preparazioni di membrane basali. Microvasi appena estratti dal cervello di ratto sono stati usati come controlli positivi vicini alla distribuzione in vivo di queste proteine ​​(Figura 6B). In entrambi i microvasi e differenziate preparazioni di membrane RBEC, P-gp è stata espressa come una banda di 170 kDa, localizzata principalmente nella frazione di membrana apicale F1 (figura 6B, C). GLT-1 è stato effettivamente espresso nella frazione di membrana basale F3 di microvasi come una banda di 65-70 kDa, ma non è stato rilevato nel RBEC colta.

In esperimenti paralleli, l'attività funzionale della P-gp in monostrato di cellule endoteliali è stata testata con rodamina 123 (R123) come ligando. Il abluminal a luminale (B ad A) efflusso di R123 era 1,7 volte superiore nella direzione opposta (Figura 6D). Per dimostrare il coinvolgimento P-gp, abbiamo usato specifici inibitori della P-gp, verapamil (25 micron, 30 min preincubazione) e ciclosporina A (1 micron, 30 min preincubazione). Con il verapamil e il trattamento ciclosporina, l'accumulo di R123 in RBEC è aumentata 1,6 volte e 2 volte, rispettivamente, rispetto al controllo non trattato (Figura 6E).

Recettori coinvolti nella mediata dal recettore transcitosi (RMT) Meccanismi
Il modello è stato ulteriormente caratterizzato per l'espressione di diversi recettori potenzialmente coinvolti nei meccanismi transcitosi al BBB, come il LRP1, LDLR o TfR (Figura 7A).

Studi di trasporto funzionali sono stati eseguiti con i ligandi TFR e LDLR. Vivere RBEC state incubate con ratto transferrina marcata con CY3 (Tf-Cy3) per 180 min a 37 ° C (Figura 7B, C). Quantificazione di Tf-Cy3 assorbimento e il trasporto nel ratto in vitro modello BBB ha dimostrato che la pendenza delle curve leggermente diminuita oltre 2.400 picomoles (Figura 7B), suggerendo che il legame / assorbimento è saturabile. Inoltre, la saturazione del legante / assorbimento è stata correlata con l'accumulo di Tf nel vano inferiore. A conferma di questa osservazione, Tf-Cy3 è stata incubata a 1.200 picomoli (crescente parte della curva), con un eccesso di Tf non fluorescente a 4.800 picomoli (plateau / saturazione) (Figura 7C). Questi esperimenti hanno mostrato una diminuzione di accumulo Tf-Cy3 nel vano inferiore e confermato un meccanismo saturabile tipica di interazione ligando-recettore nel nostro modello BBB in vitro.

Allo stesso modo, la funzionalità LDLR è stato dimostrato dal assorbimento e il trasporto del suo DiILDL ligando di tutti i monostrato di cellule endoteliali (Figura 7D, E). Vivo RBEC stati incubati con DiILDL per 30 min a 37 ° C. Il legante / assorbimento non è stata correlata con l'accumulo di DiILDL nel vano inferiore (figura 7D). Quantificazione del DIILTrasporto DL ha dimostrato che la pendenza delle curve è diminuito al di là 2 mg, suggerendo che il trasporto era saturabile e del recettore-correlata nel nostro modello. Sodio azide è stato aggiunto al 0,05%, 15 min prima DiILDL incubazione (Figura 7E). L'assenza di tossicità di sodio azide incubazione a 0,05% è stata valutata mediante Pe (LY) misurazione (dati non mostrati). Questi esperimenti hanno diminuito accumulo DiILDL nel vano inferiore. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono RMT per DiILDL nel nostro modello BBB in vitro.

Altri modelli in vitro BBB a base di cellule endoteliali da Rat midollo spinale o il cervello di topo
Digestione enzimatica con una miscela di collagenasi / dispasi è uno dei principali parametri di controllo in termini di vitalità cellulare e resa di produzione di microvasi cerebrali. La concentrazione di enzima più importante il rapporto tra la quantità di enzima rispetto al tessuto, needs essere calibrato precisamente tra ratto cervello, midollo spinale di ratto e topo cervello. Microvasi densità di semina e il numero di cellule endoteliali a raggiungere il 90% di confluenza (9 giorni dopo la semina dei microvasi) sono stati collegati e sono parametri importanti per migliorare la crescita cellulare, limitare il numero di raddoppio della popolazione e la qualità dei modelli. Rat microvasi del midollo spinale sono stati prodotti con lo stesso protocollo come quello qui descritto per ratto microvasi cerebrali (in termini di quantità di tessuto, 2 midolli spinali corrispondenti all'incirca 1 cervello) per avere la stessa quantità di celle per beuta T75 all'interno della stessa scala di tempo . Meningi da 5 settimane di età C57Bl6 topi cervello erano difficili da eliminare perché si attaccano alla corteccia. Un breve trattamento del cervello con dispasi sembra facilitare la rimozione delle meningi. I parametri importanti che contribuiscono alla produzione di riproducibili monostrati di cellule endoteliali da cervello di ratto, topo midollo spinale e cervello di topo sono evidenziati e riassunti nellaFigura 8.

Figura 1
Figura 1. Diagramma di flusso che riassume le principali fasi della vitro BBB preparazione del modello in. Le varie fasi del disciplinare di produzione sono stati assegnati a giorni specifici della settimana per aumentare la riproducibilità delle colture primarie di cellule endoteliali. Il protocollo inizia il Mercoledì della prima settimana, con la produzione dei microvasi da 5 settimane di età ratti Wistar.

Figura 2
Figura 2. Fase microfotografie contrasto di RBEC, astrociti e il sistema di co-coltura. (A) 5 settimane vecchi Wistar frammenti ratto microvasali al momento della placcatura out.(B) tre giorni di età culture RBEC trattati per 2 giorni con la P-gp substrato puromicina a 4 mg / ml. (C) Pure monostrati confluenti endoteliali al giorno 1 dopo la placcatura sui filtri Millipore di una piastra a 12 pozzetti rivestite con collagene di tipo IV e fibronectina. (D) omogeneità del monostrato cellulare alla periferia del filtro inserto. (E) confluenti cultura astrociti il giorno della costituzione della co-coltura mostrando caratterizzato favo morfologia. (F) Schema che rappresenta la co-coltura sistema di localizzazione delle microfotografie in C, D e E.

Figura 3
Figura 3. Caratterizzazione delle culture RBEC mediante microscopia di immunofluorescenza. (A), le cellule del cervello endoteliali esprimono cellule endoteliali delle piastrinemolecola di adesione PECAM/CD31 al bordo della cella, (B) fattore di von Willebrand (VWF) mostra una colorazione relativamente puntata, più luminoso e più aggregate in alcune cellule di altri, e concentrato nella zona perinucleare. (C) Senza trattamento puromicina di RBEC culture, periciti sono rilevati con un immunocolorazione positiva per desmin (in verde) e hanno caratteristici nuclei piccolo rotondo. (D) Gli astrociti esprimere gliale fibrillare proteina acida (GFAP). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Caratterizzazione immunocitochimica del ratto in vitro modello BBB e la permeabilità di paracellulareLY attraverso il monostrato endoteliale. Il monostrato cellulare è stato immunostained con (A) vimentina per rivelare un monostrato di cellule endoteliali cerebrali confluente non sovrapponibile morfologia e cellule fusiformi con tipica morfologia endoteliale e l'espressione di proteine ​​di giunzione stretti (B) claudin-5 , (C) ZO-1 e (D) occludina, rilevata anche mediante western blot per ZO-1 e occludina proteine ​​(E). (F) monostrato oppressione al modello 12 pozzetti BBB è stata valutata misurando il trasporto di Lucifero giallo (LY-CH, sale dilitio), una piccola molecola idrofila (MW 457 Da), noto per essere conservato dal BBB. Brevemente, LY è stata incubata nel vano superiore del sistema di coltura in contatto con le cellule endoteliali cerebrali per 60 min a 37 ° C. Trascorso questo tempo, il mezzo del vano inferiore è stato raccolto e la fluorescenza è stata quantificata mediante analisi fluorimetrica con spectrofluorimeter con eccitazione a 430 nm ed emissione a 535 nm. I risultati sono espressi in permeabilità o Pe a 10 -3 cm / min. La barriera è considerato permeabile o aperto quando il Pe di LY è sopra 0.6x10 -3 cm / min. Durante ogni esperimento 1 ora, il volume medio è stato eliminato funzione del tempo, e la pendenza stimata mediante analisi di regressione lineare. La pendenza della curva di liquidazione per i filtri di controllo con collagene tipo di rivestimento IV-fibronectina è stato indicato PSF e la pendenza della curva di liquidazione per filtri con monostrati di cellule endoteliali cerebrali è stata indicati PSt. Il valore di PS per il monostrato endoteliale (PSE) è stata calcolata da: cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Equazione 1

I valori PSE sono state divise per l'area della pormembrana dente (1,1 cm 2 per filtri Millipore di piastre da 12 pozzetti) e il risultato è stato il coefficiente di permeabilità (Pe) con una media di 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. I risultati sono presentati con una dispersione di rappresentanza trama verticale per n = 90 saggi (media di n = 3 n = 6 monolayers per saggio).

Figura 5
Figura 5. In vitro BBB risposta del modello al trattamento con l'agente pro-infiammatoria TNF-α. I terreni di coltura dal sistema di coltura è stato sostituito poco prima di TNF-α a 5 ng / ml nel vano superiore per 6 ore, 12 ore e 24 ore. Rilascio CCL2 da RBEC stata quantificata nel vano superiore mediante saggio ELISA in confronto con il controllo non trattato. Si noti che MCP-1 aumentano leggermente in funzione del tempo, Anche nei pozzetti non trattate. Integrità della barriera endoteliale misurata da endoteliale Pe per LY Pe (LY) ha rivelato un aumento della permeabilità monostrato da 24 ore di trattamento con TNF-α a 5 ng / ml o 50 ng / ml nell'intervallo 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 centimetri / min e 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min, rispettivamente, rispetto al controllo a 0.33 ± 0.03 x 10 -3 cm / min (test t di Student, p <0.05).

Figura 6
Figura 6. Funzionalità della P-gp efflusso trasportatore e RBEC polarizzazione. Espressione del trasportatore d'efflusso P-gp in cellule endoteliali cerebrali co-coltura con astrociti mediante immunocitochimica (A) e Western Blot (B & C). Proteine ​​della membrana cellulare sono stati estratti con una fraziona proteina cellularekit zione. Membrane plasmatiche sono stati ottenuti da lisi ipotonica e differenziali centrifugazione per eliminare organelli e nuclei. Separazione delle proteine ​​apicali e basolaterale dalle membrane plasmatiche erano ottenuta con gradiente di densità di saccarosio. P-gp è stato localizzato principalmente nella frazione apicale (F1) mentre glutamato trasportatore-1 (GLT-1) è stato localizzato principalmente nella frazione basolaterale (F3). Microvasi purificata prima placcatura sono stati usati come controllo per la localizzazione in vivo di queste proteine. Attività di P-gp è stata determinata misurando la polarità trasporto di R123, un ligando P-gp. Il flusso di 1 pM R123 è stata misurata per 1 ora a 37 ° C nel luminale a abluminal (da A a B) e nelle opposte direzioni abluminale-to-luminale (B ad A). Lo stesso esperimento è stato realizzato senza RBEC valutare diffusione passiva attraverso il filtro inserto e dati sono stati normalizzati rispetto a questo valore per Pe (R123) calcolo (vedi Figura 5 (R123) (da A a B). Verapamil (25 pM, 30 min preincubazione) e ciclosporina A (1 mM, 30 min preincubazione) sono stati utilizzati come inibitori di riferimento P-gp. Accumulo R123 in RBEC è stata misurata dopo 2 ore, con o senza preincubazione con gli inibitori della P-gp (test t di Student, p <0,05). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Caratterizzazione di recettori coinvolti in Receptor Mediated Transcytosis (RMT). (A) Il RBEC monostrato differenziata stata immunoistochimica con anticorpi contro la bassa densità lipoproteina correlata recettore 1 (LRP1) e il recettore della lipoproteina a bassa densità (LDLR). Immagine confocale di RBEC sondato per l'assorbimento di DiILDL, un ligando fluorescente del LDLR e per l'assorbimento di ratto transferrina-Cy3, un ligando fluorescente del TfR mostra punctate colorazione sulla superficie cellulare, con un certo raggruppamento nella regione perinucleare. (B) Rat Tf-Cy3 stato aggiunto al vano superiore contenente il monostrato RBEC differenziato a 75, 150, 300, 600, 1.200, 2.400 e 4.800 picomoli / inserto per 180 min a 37 ° C (200 microlitri nel vano superiore e 1.200 ml in vano inferiore). Trascorso questo tempo, Cy3 fluorescenza è stata quantificata nel lisato cellulare (200 microlitri di PBS 0,1% Triton X100) e nel vano inferiore mediante analisi fluorimetrica con uno spettrofluorimetro con eccitazione a 550 nm ed emissione a 570 nm. Unità di fluorescenza sono state trasformate in picomoli utilizzando un campo di lavoro lineare. (C) Per gli esperimenti di saturazione, ratto Tf-Cy3 stato aggiunto al vano superiore contenente il monostrato RBEC differenziata a 1.200 picomoli / inserire per 180 min a 37 ° C con o senza 15 min pre-incubazione con 4.800 picomoli / inserto di Tf non fluorescente. Il trasporto nel vano inferiore è stato quantificato come in (B) (test t di Student, p <0,05). (D) DiILDL stato aggiunto al vano superiore contenente la RBEC monostrato differenziato a 1, 2, 4 e 8 filtri mcg / insert per 30 min a 37 ° C (200 microlitri nel vano superiore e 1.200 microlitri nel vano inferiore). Trascorso questo tempo, DII fluorescenza è stata quantificata nel lisato cellulare (200 microlitri di PBS 0,1% Triton X100) e nel vano inferiore mediante analisi fluorimetrica con uno spettrofluorimetro con eccitazione a 554 nm ed emissione a 571 nm. FluorescenzaCence unità sono state trasformate in mg utilizzando un campo di lavoro lineare. (E) Per il trasporto di blocco esperimenti, sodio azide è stato aggiunto al 0,05% 15 min prima della incubazione di DiILDL a 2 ug / inserto per 30 min a 37 ° C. Il trasporto nel vano inferiore è stato quantificato come in (D) (test t di Student, p <0,05). L'assenza di tossicità di sodio azide incubazione a 0,05% è stata valutata da Pe (LY) misura (dati non riportati). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8. Modelli in vitro BBB da cellule endoteliali del midollo spinale di ratto o di cervello di topo. La tabella in altoluci parametri importanti per l'estrazione dei microvasi dal cervello di ratto, ratto midollo spinale e cervello di topo. Microfotografie mostrano immunostaining per ZO1 e occludina in monostrati di cellule endoteliali preparati da cervello di ratto, ratto midollo spinale e cervello di topo.

Discussion

Descriviamo l'attuazione di un protocollo riproducibile settimanale per l'isolamento e la placcatura di microvasi cerebrali, seguendo la purificazione e la cultura di RBEC e ulteriore creazione di co-colture di astrociti primari di ratto per generare un modello in vitro BBB con caratteristiche proprietà BBB.

Stabilire con successo standardizzato di culture BBB vitro richiede condizioni ottimali nelle diverse fasi sequenziali del processo. Il modello è stato (a) ottimizzato per avere la permeabilità paracellulare più bassa, che rimane il "Santo Graal" della vitro modelli BBB a, e (b) convalidato per efflusso ed i meccanismi RMT.

Produzione, purificazione e proliferazione delle RBEC

La sfida più grande quando coltivare RBEC è quello di raggiungere la riproducibilità tra culture diverse. Standardizzazione del protocollo richiede strumenti di alta qualità per dissezione, reagenti di alta qualità e il rispetto delle date di scadenza dei reagenti. Lo sperimentatore deve essere abile in micro-dissezione sotto stereomicroscopio per la rimozione rapida di meningi e grandi vasi dalla superficie corticale. Una volta che i cervelli sono isolati e meccanicamente dissociati, una delle principali sfide è la digestione enzimatica ottimale dei microvasi cerebrali appena isolate. Il tipo e la qualità degli enzimi utilizzati è fondamentale. Un mix di tipo collagenasi I e II e dispasi ad alta concentrazione con una bassa variabilità tra i lotti è stato utilizzato. Importanti sono anche la durata della digestione enzimatica e il rapporto tra peso concentrazione dell'enzima / tessuto / volume di digestione. La migliore resa di produzione microvasi cervello è stato ottenuto con l'equivalente di cortecce cerebrali da 1 a 1 ml di collagenasi / dispasi miscela a 60 mcg / ml durante entrambe le digestioni, rispettivamente 30 minuti e 1 ora.

Inoltre critico è l'eliminazione di contaminare cellas (astrociti e soprattutto periciti). Queste cellule proliferano a velocità superiore a quella delle cellule endoteliali e non stabiliscono giunzioni strette con quest'ultimo, evitando così la creazione di un monostrato cellulare omogenea con una buona paracellulare restrittività. Considerando che le cellule endoteliali cervello esprimono livelli molto più alti di pompe di efflusso, specialmente P-gp, rispetto agli altri tipi di cellule presenti in microvasi, tollerano meglio le concentrazioni altrimenti tossiche di P-gp farmaci ligando, mentre le cellule non endoteliali sono eliminati. Trattamento puromicina a 4 mcg / ml per i primi due giorni seguito da altri due giorni a 2 ug / ml per ottenere una buona purezza delle cellule endoteliali. Questa selezione può anche favorire le cellule endoteliali dei capillari rispetto a quelli provenienti da venule, arteriole pre-capillari o microvasi più grandi, e portare a monostrati strette. Inoltre, l'uso di poveri siero bovino derivato dal plasma è un imperativo per ottenere colture pure di cellule endoteliali 47,48. Il plasma-dersiero ived manca fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), che è mitogenico per i fibroblasti, le cellule muscolari lisce e quindi per periciti.

Abbiamo osservato che il trattamento di plastica e filtri con un mix di collagene tipo IV da topi e fibronectina umana produce un vantaggio significativo, con un aumento di 2 volte della resa proliferazione in confronto con il collagene di tipo tradizionalmente raccomandato io da ratto coda. Spunti importanti per la proliferazione cellulare sono ottenute dalla matrice extracellulare come integrine e fattore di crescita (bFGF) attivazione 49. Concentrazione del tampone e pH del terreno di coltura sono stati descritti per influenzare positivamente paracellular tenuta 50 e abbiamo osservato una migliore riproducibilità tra culture con l'aggiunta di tampone HEPES a 5 mM.

Differenziazione dei RBEC: Co-cultura Istituzione su Insert Filters

Una volta che le cellule endoteliali cerebrali hanno been purificato e hanno proliferato per 6 giorni, possono essere piastrate su filtri. Placcatura cellulare ad alta densità è fondamentale per ottenere un monostrato perfetto. Una densità di semina di 160x10 3 celle per 12 filtri a piastre e era necessaria e sufficiente per ottenere un monostrato confluente 24 ore dopo la semina. Tuttavia, isolamento delle cellule endoteliali dei capillari del cervello primari dal loro ambiente è un paradosso nella costruzione di un modello BBB in vitro come è noto che le cellule primarie, e le cellule endoteliali dei capillari del cervello in particolare, sono fortemente regolati dal loro ambiente e fattori induttivi prodotte da i diversi tipi di cellule circostanti. Cellule endoteliali dei capillari cerebrali coltivate solo rapidamente de-differenziare e perdono alcuni marcatori specifici endoteliali cerebrali. Così, le cellule endoteliali primarie dovrebbero essere usati a partire passaggio (P1) e ricollegati, almeno in parte, con il loro ambiente mediante co-coltura con astrociti o mezzo condizionato da astrociti 47,51. Questo valevero per la differenziazione astrociti come cellule endoteliali cerebrali e astrociti sono coinvolti nell'induzione due vie. Coltura RBEC con astrociti hanno portato a una forte induzione di TJ interendothelial 52,23. I meccanismi molecolari di re-induzione rimangono in gran parte sconosciute, e la ricerca è in corso in diversi laboratori di individuare specifici fattori di modulazione secreti dagli astrociti, che potrebbero promuovere ottimale differenziazione delle cellule endoteliali 53,54. Fattori secreti dalle cellule endoteliali cerebrali, tra cui il fattore inibente la leucemia (LIF) hanno dimostrato di indurre la differenziazione astrocitaria 55,56. Prima di stabilimento co-coltura, astrociti sono stati esposti a mezzo di differenziazione contenente glucocorticoidi agonista del recettore idrocortisone, e co-coltura condizionati medie. L'idrocortisone è noto per migliorare la tenuta di cellule endoteliali cervello e viene utilizzato nei modelli BBB specialmente da 57 ratto e topo 58,59 cellule endoteliali. La medicina condizionataum viene raccolto dal vano inferiore della cella / astrociti sistema di co-coltura endoteliale dopo 3 giorni e congelati per un uso successivo. L'uso di un terreno co-coltura condizionato ridotto il tempo di differenziazione delle cellule endoteliali a 3 giorni ad elevatissima permeabilità paracellular per ulteriori 2 giorni e anche migliorato la riproducibilità tra culture.

Nel complesso, il protocollo descriviamo produce un TEER riproducibile su 300 ohm · cm 2 e un coefficiente medio paracellular permeabilità Pe (LY) di 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, simile alle migliori modelli basati su cellule primarie BBB 22, 12. Il protocollo descriviamo nel presente manoscritto con la modulazione proposta di microvasi digestione enzimatica può essere esteso alle cellule endoteliali dal midollo spinale di ratto 60 e da topi cervello.

Caratterizzazione molecolare e funzionale

Inoltreall'induzione TJ, astrociti contribuiscono anche l'espressione di trasportatori di efflusso come P-gp in cellule endoteliali cerebrali 61. Noi mostriamo infatti espressione del trasportatore d'efflusso P-gp nel modello BBB e dimostriamo la polarità della pompa di efflusso localizzazione P-gp utilizzando approcci biochimici e di attività P-gp utilizzando un saggio funzionale. GLT-1 è stato rilevato nella frazione di membrana basale di microvasi ma non è stato rilevato in RBEC coltura. Noi ipotizziamo che GLT-1 è stato regolato verso il basso nella nostra cultura RBEC in confronto con le condizioni in vivo e, di conseguenza, non rilevabili mediante analisi Western Blot. Glutammato in eccesso è neurotossico e in vivo, GLT-1 è responsabile di glutammato efflusso dal vano basale (parenchima) al compartimento apicale (circolazione del sangue). In colture di astrociti, GLT-1 rimane molto bassa e viene indotta mediante l'aggiunta di glutammato nel medio 62,63.

Abbiamo anche confIRM l'espressione dei trasportatori afflusso a livello della membrana apicale come LRP1, LDLR e TFR. Funzionalità di TfR e LDLR stata dimostrata con il legame e trasporto esperimenti di Tf-Cy3 e DiLDL dal luminale al lato abluminale del monostrato come precedentemente indicato con una bovina in vitro modello BBB 64. È interessante notare, è stato dimostrato che requisito lipidi dagli astrociti aumenta l'espressione di LDLR sulle cellule endoteliali dei capillari del cervello 65,66 conferma ulteriormente la diafonia fisiologica tra astrociti e cellule endoteliali cerebrali, compresi in vitro. Abbiamo scelto di esemplificare trasporto con coloranti fluorescenti come come Cy3 e DII considerando che l'analisi spettrofluorimetrico è disponibile nella maggior parte dei laboratori, e può rivelarsi utile per validare modelli in vitro BBB. Tuttavia, la quantificazione della fluorescenza è molto meno sensibile di radioattività e richiede un aumento del numero di esperimenti per ottenere dati significativi.Idealmente, Tf e LDL sono di solito radioattivo (iodio 125) per tali vincolante / assorbimento e trasporto esperimenti.

Mostriamo anche che il monostrato di cellule endoteliali differenziata ottenuti con il protocollo proposto alle infiammazione indotta da TNF-α, come rivelato dal rilascio CCL2 e apertura BBB. CCL2 (MCP-1) e il suo recettore CCR2 sono coinvolti nelle patologie del SNC come la sclerosi multipla, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) 67, CNS trauma 68 e sono noti come mediatori della migrazione dei leucociti nel SNC in condizioni neuroinfiammatori 69,70. Con il protocollo testato, non possiamo concludere su una secrezione polarizzata di CCL2 perché apertura BBB permette la concentrazione CCL2 di equilibrarsi tra i due (apicali) e inferiore (basale) vani superiori. Di conseguenza, sottovalutiamo chiaramente la quantità di prodotto dal CCL2 RBEC nel compartimento apicale a 24 ore (Figura 5A).

Generale e limitazioni di BBB modelli in vitro: I n Vivo vs In Vitro ed Roditore contro Confronti umani

Molti farmaci promettenti del sistema nervoso centrale che si sono dimostrati efficaci nel BBB passaggio in vitro falliti in studi clinici a causa della mancanza di prevedibilità da modelli in vitro di BBB spesso basati su cellule isolate da specie diverse umana. Per quanto a nostra conoscenza, i modelli in vitro BBB a sono probabilmente più predittivo quando si tratta di studiare gli aspetti meccanicistici delle reti di proteine, trasduzione del segnale, trasportatori e recettori. Ogni meccanismo, percorso o la destinazione ad essere studiato in vitro deve essere caratterizzata per la sua regolamentazione da stimoli ambientali complementari (altri tipi di cellule, sostanze chimiche, proteine) e combinati a studi in situ con le stesse specie animali, E quando possibile, con microvasi e le cellule endoteliali isolate da esseri umani, con le restrizioni e cautela evocati qui di seguito.

In vitro modelli BBB devono essere visti come sistemi autonomi, isolati dal regolamento del corpo, ma comunque dotati di maggiori proprietà in vivo e un potenziale per la regolamentazione da stimoli ambientali. No "ideale" in vitro modello BBB è stato ancora proposto 71,72,73 perché i monostrati di cellule endoteliali mancano di un certo numero di importanti costituenti delle unità vascolare neuro-glia (NGVU) e sono isolati dal sangue e la regolazione del corpo. La mancanza di periciti 74,16 o neuroni 17,18 o diversi costituenti della matrice extracellulare utilizzato per il rivestimento di plastica o il terreno di coltura e siero utilizzato per la crescita cellulare nel più comune e più semplice "misura" in vitro in modelli BBB basato su endoteliale cellule differenziate con astrociti possono modulare l'espressione della proteina in rispetto alla situazione in vivo 75. Questi modelli possono esprimere molti trasportatori sono in vivo, ma non tutti. In alcuni casi, i parametri di trasporto sono stati verificati nei microvasi isolate (più vicini alla situazione in vivo), e quindi studiate in sistemi di colture cellulari 76,61.

Ricerche di biologia molecolare ha permesso la caratterizzazione di espressione genica e proteica in microvasi isolati e passaggio endoteliali colture cellulari bassi delle stesse specie e tra specie diverse, il più delle volte da piccoli animali come roditori (topi e ratti) o di mucca e maiale in confronto all'uomo 77,78,75,15. Confronto tra transcriptomic in vivo e in cellule endoteliali microvascolari cerebrali in vitro hanno mostrato numerosi trascritti genici che erano differenzialmente espressi e più spesso significativamente inibiti in vitro. Trascritti codificanti trasportatori afflusso come TfR e proteins implicati nel traffico di vescicole vengono inibiti principalmente nelle cellule endoteliali cerebrali coltivate, suggerendo una generale diminuzione endocitosi e trasporto vescicolare in tali cellule. Manipolazione cultura in termini di purezza (trattamento puromicina) e il trattamento con idrocortisone può contribuire a ripristinare un "in vivo-like" profilo più espressione genica 77. Studi di trascrittomica anche rivelato importanti differenze tra le specie che complicano ulteriormente le previsioni sulla diffusione della droga negli esseri umani sulla base di roditore in modelli in vitro di BBB 75. Modelli in vitro BBB coinvolgono co-coltura di cellule endoteliali umane e astrociti sono stati descritti 15. Anche se del caso, questi modelli sono più difficili da attuare su base regolare in quanto richiedono l'accesso regolamentato al tessuto umano post mortem e c'è eterogeneità nelle qualità / proprietà delle cellule endoteliali cerebrali umane a seconda dell'età, delle malattie, ed eventualmente medico treatment dei donatori. Gli sforzi devono essere fatti per sviluppare nuovi modelli in vitro che meglio riproducono la fisiologica, caratteristiche anatomiche e funzionali della BBB in vivo. Co-culture che coinvolgono tre tipi di cellule sono molto restrittive e appaiono di difficile attuazione di routine. Ad oggi, le vitro modelli più complessi in BBB sono i modelli dinamici in vitro (DIV-BBB), che comprendono l'organizzazione nave-come con astrociti e comprendono un flusso di media che imita il flusso di sangue 75,79,80,81,82, 83,84,85. Quando le cellule endoteliali cerebrali sono esposti a un flusso, lo sforzo di taglio generato attiva mechanotransducers sulla superficie cellulare, che modulano l'espressione di diversi geni coinvolti nella fisiologia delle cellule endoteliali, come la divisione cellulare, la differenziazione, la migrazione e l'apoptosi 80. In vivo, shear stress generata dal flusso sanguigno è responsabile per l'arresto mitotico al contatto cellula, che consente la creazione di unmonostrato di cellule endoteliali dei vasi sanguigni 80. Analisi genomica e proteomica delle normali cellule endoteliali microvascolari cervello umano ha mostrato l'impatto dello stress di taglio a BBB endoteliale fisiologia 84. Shear stress è responsabile per la sopravvivenza cellulare, un grado di adesione delle cellule endoteliali superiore, induzione pompa di efflusso e migliore polarizzazione dei trasportatori 75, regolazione del metabolismo glucidico 75,86, ossidazione mediata da enzimi CYP450 75 e la regolazione della permeabilità paracellular aumentando l'espressione di geni che codificano per elementi giunzionali intercellulari come occludina e ZO-1 87,75,80 e conseguentemente elevata TEER circa 1,500 - 2,000 ohm · cm 2, più vicino a noto in vivo Parametri 79,80

Nel settore della biotecnologia e farmaceutica, lo screening di routine di farmaci o addirittura ad alto throughput screening (HTS) e gli sforzi per ridurre la sperimentazione animale, ha portatoallo sviluppo di linee cellulari differenti da utilizzare in sostituzione della coltura primaria di cellule endoteliali cerebrali che rimangono più difficile set-up di routine. Nella maggior parte dei casi, colture primarie di cellule endoteliali cerebrali sono state trasdotte con un gene immortalando (SV40 o polioma virus grande T-antigene o adenovirus E1A), mediante trasfezione di DNA plasmidico o da infezione utilizzando vettori retrovirali 88,89,75. Diverse linee di cellule endoteliali di origine cerebrale sono stati sviluppati come il RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs o rBCEC4 linee di cellule di ratto 88,75, la linea cellulare b.End3 topo 90,75, il PBMEC/C1 - 2 porcine linea cellulare 87,75, e la linea cellulare umana hCMEC/D3 89,75. Altri modelli sono basati su cellule di origine non cerebrale come il rene canino Madin-Darby (MDCK) o linee cellulari Caco2 12,75. Tra le diverse linee di cellule endoteliali cerebrali umani, il hCMEC/D3 è stato ampiamente citared e migliorato come modello di BBB sin dalla sua istituzione nel 2005, 91,92. Come colture primarie, linee cellulari presenti vantaggi e limitazioni. Essi sono più facili da gestire rispetto colture primarie, hanno una durata di vita estesa, sono ben caratterizzati e consentire la riproducibilità tra esperimenti su larga scala. Tuttavia, le linee cellulari possono perdere funzioni tessuto-specifici, perde la normativa ambientale e di acquisire un fenotipo molecolare molto diverse dalle cellule in vivo 75, 89. In particolare, monostrati generati da linee cellulari presenti tenuta ridotto, bassa Teer e profilo mostra trasportatore variazione 75,89. Così esperimenti su animali o studi in cellule primarie sono spesso preferiti nonostante la loro complessità.

Acknowledgments

Sostegno finanziario alle VECT-HORUS è riconosciuta dal Fonds unico interministeriale (progetto FUI / MEDUL) e vect-HORUS e il laboratorio UMR7259 dalla Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC e PREVENTAD progetti di collaborazione) . Il laboratorio UMR7259 riconosce anche il sostegno finanziario del CNRS e da Aix-Marseille Université.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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References

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Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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