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Medicine

Mise en place d'un Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d'un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L'expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l'inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués.

Abstract

La barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​régule spécifiquement flux moléculaire et cellulaire entre le sang et le tissu nerveux. Notre objectif était de développer et de caractériser un syngénique de rat hautement reproductible modèle in vitro de la BHE en utilisant des co-cultures de cellules endothéliales de cerveau de rat primaires (RBEC) et les astrocytes pour étudier les récepteurs impliqués dans la transcytose à travers la monocouche de cellules endothéliales. Les astrocytes ont été isolés par dissection mécanique après digestion de la trypsine et ont été gelés pour la co-culture plus tard. RBEC ont été isolés à partir de 5 semaines d'âge cortex de rat. Les cerveaux ont été nettoyés des méninges et de la substance blanche, et dissociées mécaniquement après digestion enzymatique. Ensuite, l'homogénat a été centrifugé dans les tissus de l'albumine de sérum bovin pour séparer les fragments de vaisseaux à partir de tissu nerveux. Les fragments de navires ont subi une deuxième digestion enzymatique des cellules endothéliales libres de leur matrice extracellulaire. Les cellules contaminantes restantes telles que les pericytes ont été Futres éliminé par l'étalement des fragments de microvaisseaux dans un milieu contenant la puromycine. Elles ont ensuite été soumises à des passages sur des filtres pour la co-culture avec des astrocytes cultivés sur le fond des puits. RBEC exprimé des niveaux élevés de jonctions serrées (TJ) des protéines telles que occludine, claudine-5 et ZO-1 avec une localisation typique aux frontières cellulaires. La résistance électrique transendothéliale (TEER) de cerveau monocouches endothéliales, indiquant l'étanchéité du JT atteint 300 ohms · cm 2 en moyenne. Les coefficients de perméabilité endothéliale (Pe) pour le jaune lucifer (LY) était très reproductible avec une moyenne de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. les cellules endothéliales de cerveau organisés en monocouches ont exprimé le transporteur d'efflux P-glycoprotéine (P-gp), ont montré un transport polarisé de la rhodamine 123, un ligand de P-gp, et ont montré transport spécifique de la transferrine-Cy3 et DiILDL à travers la monocouche de cellules endothéliales. En conclusion, nous proposons un protocole pour la mise en place in vitroModèle du Bureau qui est hautement reproductible en raison des méthodes d'assurance de la qualité, et qui est approprié pour la recherche sur les transporteurs et les récepteurs BBB.

Introduction

De nombreux médicaments développés pour traiter le système nerveux central (SNC) ne parviennent pas à le parenchyme cérébral à des concentrations thérapeutiques pertinentes. La BHE protège les tissus nerveux du cerveau à partir de la fluctuation de la composition du plasma, à partir d'agents pathogènes, et maintient l'homéostasie du parenchyme cérébral, en limitant le flux non spécifique des ions, des peptides, des protéines et même des cellules dans et hors du cerveau 1.

Caractéristiques BBB sont induite et maintenue par la proximité intime et la diaphonie entre les classes spécialisées des cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux et des éléments voisins de l'unité neuro-glie-vasculaire (NGVU) comme les neurones, les cellules gliales (plus précisément astrocytes fin-pieds), et péricytes ensheathed dans la membrane basale, qui se compose essentiellement de collagène de type IV, la fibronectine, la laminine et les protéoglycanes 2,3. Péricytes couvrent environ 22 - 32% de l'endothélium au niveau des capillaires et jouent un rôle importantrôle dans la régulation de l'endothélium prolifération, l'angiogenèse et des processus inflammatoires. Les cellules endotheliales forment une nappe continue couvrant la surface interne des capillaires. Ils sont reliés entre eux par JT, qui forment une structure en forme de bande à la région apicale et qui contribuent à la cellule de polarisation. Les astrocytes régulent les propriétés et BBB sont des sources de facteurs de régulation importants tels que le TGF-β, du GDNF, du bFGF et de l'IL-6. Astrocytes déficientes en GFAP avec des fonctionnalités incomplètes ne sont pas en mesure de réglementer BBB propriétés 4. Les neurones ne sont pas directement impliqués dans la formation de structure de la BHE, mais également des aspects importants de réguler l'expression des protéines et les fonctions BBB 5.

Afin d'étudier davantage la structure, la physiologie et la pathologie du Bureau, des modèles in vitro du Bureau ont été développées comme outils de recherche. les cellules endothéliales de cerveau ont été extraits de diverses espèces de mettre en oeuvre dans les modèles in vitro basé BBBde faibles cultures primaires de passage de bovin 6,7, 8,9 porcine, rat 10,11,12, 13 souris et aussi humain 14,15. Ces modèles sont connus pour imiter le Bureau vivo dans, en particulier lorsqu'ils sont co-cultivées avec des cellules gliales de rat ou de souris et / ou de péricytes, 16,12 et / ou des astrocytes dérivées de cellules progénitrices neurales 17 et / ou 18 neurones. Les modèles "de laboratoire" en sont souvent fabriqués à partir de rongeurs car ils permettent à des expériences in vitro et des comparaisons et / ou l'étude des cellules endothéliales de cerveau produites à partir de modèles transgéniques / 19 in vivo.

Nouvellement développé des modèles in vitro BBB ont également été conçus pour aider à prévoir cerveau absorption de médicaments potentiels SNC candidats avant le test in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modèles in vitro BBB sont généralement utilisés pour comparer le transport de la drogue avec: i) la pénétration connu dans le SNC ou avec low perméabilité à travers la barrière hématoencéphalique et aucun des effets centraux, et ii) la Pe apparente des mêmes médicaments mesurées dans des modèles animaux de la même espèce. Les médicaments qui passent facilement la BBB sont principalement lipophiles et traversent les membranes des cellules endothéliales du cerveau par diffusion libre médiée par un lipide (caféine, la carbamazépine, etc.) Les médicaments transportés négativement tels que la digoxine, le vérapamil ou la cyclosporine A sont activement extrudées par endothéliales cérébrales transporteurs d'efflux telles que la P-gp. Cependant, la plupart des molécules thérapeutiques nouvellement développés sont produits biopharmaceutiques, tels que les protéines recombinantes, siRNA ou des anticorps monoclonaux. La plupart d'entre eux ne traversent pas la BBB en raison de: i) l'absence de transporteurs spécifiques, et ii) la couche serrées des cellules endotheliales, qui empêchent les molécules de poids moléculaire élevé de subir passage paracellulaire. Avec ces limites, les stratégies "Troie de cheval" ont été mis en œuvre en utilisant des vecteurs (anticorps, peptides) contre les récepteurs connus au Bureau, impliqués in médiée par le récepteur du transport ou de transcytose (RMT), tels que la transferrine (Tf) récepteur (TfR), le récepteur de l'insuline (IR), ou des membres du récepteur des LDL (LDLR), liés à la famille du récepteur (LDLR, LRP1). Ces récepteurs ont été trouvés sur isolés capillaires du cerveau et dans le Bureau in vivo 24,25. Les profils de transcription pour ces récepteurs, en particulier ceux de la famille LDLR, ont été analysés et comparés entre les cellules endothéliales cérébrales et cellules endothéliales cérébrales co-cultivées avec des astrocytes ou des capillaires du cerveau directement après leur extraction à partir de cerveau 26. Pardridge 24 a ouvert le champ avec l'anticorps OX-26 contre le récepteur de la transferrine (TfR), suivis par des anticorps dirigés contre le récepteur de l'insuline et le récepteur du facteur de croissance de type insuline 27,28. Avec ces vecteurs de base d'anticorps, ArmaGen Technologies a développé un cheval de Troie moléculaire technologie de plate-forme de cheval du Bureau pour fournir des médicaments, y compris les protéines, à travers le Bureau 29. Lalittérature est riche en données montrant l'expression de LRP1 dans des cellules endothéliales de cerveau et de son rôle en tant que récepteur d'endocytose / scavenger puissant. L'analyse Western blot a suggéré que LRP1 est exprimée en fractions enrichies dans des capillaires du cerveau et dans le cerveau de rat cellules endothéliales capillaires 30. Des sociétés telles que AngioChem cible LRP1 avec des vecteurs peptidiques dérivées de l'aprotinine qui favorisent efficace afflux de drogues à travers le Bureau 31. Cependant, LRP1 est également impliquée dans le transport actif de Aß et son efflux / jeu de parenchyme cérébral à sang 32. Ces données impliquent LRP1 dans un transport bidirectionnel à travers le Bureau en fonction de ses ligands. biOasis développe la technologie de Transcend utilisant un mélanotransferrine de protéine pour le transport de produits biologiques tels que des enzymes lysosomales et des anticorps à travers la BHE 33 tandis que VECT-HORUS développe des vecteurs peptidiques qui ciblent le LDLR 34. Il données suggère que le PRL et LDLR peuvent être utilisés pour le transport de diffmolécules érents tels que les enzymes lysosomales 35,36 ou complexes de nanoparticules à travers la BHE 37.

Notre champ d'intérêt est l'administration de médicaments pour le système nerveux central en utilisant des molécules de vecteur et de candidats-médicaments vectorisés pour le traitement des maladies du système nerveux central. En particulier, l'administration de médicaments à travers la BHE doit être considérée dans le contexte de la neuro-inflammation, un processus qui peut varier dans son étendue, mais qui est probablement commun à toutes les lésions et les maladies du système nerveux central, y compris l'encéphalite, la sclérose en plaques, la maladie d'Alzheimer, etc Neuroinflammation est associée à l'inflammation du Bureau et potentiellement à des changements dans la physiologie du Bureau et de la perméabilité paracellulaire et considérant que le transport transcellulaire peuvent être amplifiés dans des conditions pathologiques 38,39,40,41,42,43. Par exemple, le TNF-α, tordre, et d'autres cytokines modulent l'inflammation, et des expériences avec des modèles in vitro à BBB ont montré qu'ils peuvent modifier les propriétés de paracellulaires ee monocouche de cellules endothéliales 38,39,40 et que le TNF-α conduit également à une augmentation du transport transcellulaire de LDL 41, holotransférrine 42 et 43 de la lactoferrine.

Notre objectif était de développer et caractériser un optimisée et syngénique de rat hautement reproductible modèle du Bureau en utilisant des co-cultures de cellules primaires endothéliales cérébrales et les astrocytes. Nous avons utilisé cinq semaines vieux et néonatale rats Wistar pour la production de cellules endothéliale du cerveau et de la production des astrocytes respectivement. Un défi a été d'établir un protocole permettant la production de modèles BBB "hebdomadaire reproductibles». Pour atteindre cet objectif, chaque étape du protocole de production a été réalisée à des jours fixes de la semaine, à partir de la production cerveau des microvaisseaux le mercredi de la première semaine. Les dissections ont été réalisées presque chaque semaine au cours des 3 dernières années. Pour améliorer encore la reproductibilité des cultures, un système d'assurance de la qualité a été créé. Tous Reagents et les produits chimiques ont été référencés dans une base de données (date d'entrée, stock, la date d'expiration, etc.)

Le modèle a été caractérisée après un certain nombre de critères, tels que l'organisation des cellules endothéliales et la pureté, TEER, LY perméabilité, la réponse aux agents pro-inflammatoires, l'expression qualitative et quantitative des protéines TJ, la fonctionnalité des transporteurs d'efflux telles que la P-gp, et les récepteurs impliqués dans la transcytose à travers la monocouche de cellules endotheliales tels que le TfR ou le LDLR.

Protocol

1. Production de Rat astrocytes

Pour chaque préparation utiliser 10 rats Wistar néonatale de l'autre sexe.

  1. Sacrifier les rats par des têtes de coupe avec une paire de ciseaux et de les transférer immédiatement dans une boîte de Pétri sec sous une hotte à flux laminaire. Retirer le cerveau du crâne sans le cervelet et les transférer immédiatement dans une boîte de Pétri contenant un tampon de dissection froid: HBSS complété avec 1% de sérum-albumine bovine (niveau bas d'endotoxine BSA), de la pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml.
  2. Couper le cerveau en deux, pour séparer les deux hémisphères cérébraux et les transférer dans une boîte de Pétri propre avec un tampon de dissection sur la glace. Couper le nerf optique et retirez les méninges sous un stéréomicroscope.
  3. Laver les morceaux corticales largement dans 50 ml de tampon de dissection froide.
  4. Placez les morceaux corticales de 3 cerveaux dans un tube Falcon de 15 ml et dissocier par aspiration et refoulement d'un couple de fois avec une pipette jetable de 10 ml équipé d'une pointe bleue dans 6 ml de trypsine à 0,05% - EDTA 0,02% pendant 5 min à 37 ° C.
  5. Ajouter 24 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques suivants pénicilline, 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml, un milieu appelé milieu cellulaire gliale (MCG), et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Lots de FBS ont été sélectionnés et validés pour la croissance et la survie de cutures d'astrocytes.
  6. Reprendre le culot contenant les cellules dissociées dans 10 ml GCM et la plaque en 75 cm 2 T-ballon (T75). Changer le support le lendemain pour enlever les débris de cellules et de l'ADN. Remplacez le support de culture deux fois par semaine.
  7. Après 1 semaine de la prolifération, secouez doucement les cellules gliales avec un agitateur orbital à 60 rpm pendant 24 heures à 37 ° C dans GCM. Si le T75 ne peut pas être placé dans un incubateur avec 5% de CO 2/95% d'air à 37 ° C atmosphère humidifiée, compléter les médias mM HEPES 5. Laver les cellules deux fois pour rEDéplacez les cellules microgliales non-adhérentes.
  8. Trois semaines après le semis, laver les cellules deux fois avec DPBS sans calcium et magnésium. Ajouter 3 ml de trypsine chaud 0,05%-EDTA 0,02%, incuber à 37 ° C et attendre jusqu'à ce que la couche de cellules est dispersée (généralement 5 min). Inhiber l'activité de la trypsine en ajoutant 10 ml de GCM, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et Falcon à 120 g pendant 8 min.
  9. Reprendre le culot des astrocytes dans 90% de FBS - 10% de DMSO, les transférer dans des cryotubes (2 x 10 6 cellules par tube cryogénique) et magasin dans l'azote liquide.

2. Isolement des microvaisseaux du cerveau de rat

Nos procédures expérimentales sont approuvés par le comité d'éthique de la faculté de médecine de Marseille et sont conformes aux réglementations nationales et européennes (directive européenne n ° 86/609). Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum la souffrance des animaux et de réduire le nombre d'animaux utilisés.

  1. Pour chaque préparation et pour un experimenter, utiliser 3 vieilles cinq semaines des rats Wistar.
  2. Lundi de la première semaine, de préparer deux flacons T75 par revêtement avec du collagène de type IV et de la fibronectine, à la fois à 1 pg / cm 2 dans l'eau de culture stérile (10 ml par T75). Laisser adhérer à 37 ° C jusqu'à ce que microvaisseaux semis.
  3. Mercredi matin de la première semaine, euthanasier les rats sous un flux croissant de CO 2 pour induire la somnolence, la perte de la posture et la respiration interruption, suivie d'une dislocation cervicale. Vaporiser les têtes avec 70% d'éthanol. Couper les têtes avec une paire de ciseaux et de les transférer dans une boîte de Pétri sec sous une hotte à flux laminaire.
  4. Retirer le cerveau du crâne sans le cervelet et les nerfs optiques, puis de les transférer dans une boîte de Pétri refroidi sur de la glace et rempli avec du tampon de dissection froide (HBSS complété avec 1% de BSA, de la pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml) .
  5. Couper le cerveau en deux pour séparer les deux hémisphères cérébraux et le mésencéphale séparée de pourebrain. Transférer les forebrains dans une boîte de Petri propre sur la glace avec un tampon de dissection.
  6. Prenez quelques hémisphères dans une nouvelle boîte de Pétri avec un tampon de dissection froide pour enlever soigneusement les méninges des forebrains sous un stéréomicroscope avec N ° 5 des pinces courbes. Ensuite, nettoyer l'intérieur du cerveau pour enlever la couette de la myéline et obtenir une enveloppe de cortex. Ces mesures ne devraient pas prendre plus de 2 heures pour la préservation des tissus et la survie cellulaire.
  7. Dissocier le cortex du cerveau en 3 6 ml de tampon de dissection froide dans un 7 ml DOUNCE homogénéisation par 10 de haut en bas coups avec chacun des deux pilons de différents jeux, 71 pm suivie par 20 um.
  8. Diviser la suspension pour obtenir l'équivalent d'une cortex dans 1 ml d'un tube Falcon de 50 ml et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant.
  9. Digérer la suspension de 1 cortex avec 1 ml d'une solution enzymatique contenant un mélange de collagénase / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), la DNase de type I (35 ug / ml - 20 K unités / ml) et de la gentamicine (50 pg / ml) dans un agitateur pendant 30 minutes à 37 ° C.
  10. Mélanger le 1 ml de digérer 1 cortex avec 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X et séparé par centrifugation dépend de la densité à 3600 g pendant 15 min à température ambiante. Transférer délicatement le disque supérieur (la myéline et le parenchyme cérébral) et le surnageant dans un 50 ml tube Falcon propre et répéter la centrifugation. Gardez le culot obtenu contenant les microvaisseaux du cerveau à 4 ° C.
  11. Prenez soin de le disque supérieur et le surnageant. Reprendre les culots résultants contenant les microvaisseaux du cerveau avec 1 ml de HBSS 1X froid et transférer dans un 50 ml tube Falcon propre.
  12. Laver les microvaisseaux par addition de 20 ml de HBSS 1X froid et centrifuger à 1000 g pendant 5 min. Jeter le surnageant.
  13. Digérer en outre les microvaisseaux du cortex une avec 1 ml de la même solution enzymatique telle que décrite dans l'étape 2.9 pendant 1 heure à 37 ° C dans un shAker.
  14. Ensuite, mélanger les microvaisseaux digérés à partir de chacun des trois cortex dans un tube et en outre séparer en deux 50 ml tubes Falcon pour obtenir des microvaisseaux extraites à partir de l'équivalent d'une fois et demie (1,5) cortex par tube. Ajouter 30 ml de tampon de dissection froid et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante.
  15. Remettre en suspension le culot de microvaisseaux dans 10 ml de DMEM/F12 supplémenté avec 20% de plaquettes bovine plasma pauvre en sérum dérivé, fibroblastes facteur de croissance basique (bFGF, 2 ng / ml), de l'héparine (100 ug / ml), de la gentamicine (50 pg / ml) et HEPES (2,5 mM), du nom de support de cellules endotheliales (ECM) supplémenté avec de la puromycine à 4 pg / ml.
  16. Prendre les deux flacons T75 revêtues de l'incubateur, aspirer l'excès de revêtement et de la plaque les microvaisseaux de chaque tube dans un flacon T75 (des microvaisseaux extraits de cortex 1,5 par flacon T75).

3. Purification et la prolifération des RBEC Primocultures

  1. Purification: du mercredi au vendredi, ajouter puromycin à 4 pg / ml de milieu de culture. Changer le support le jeudi. Le vendredi, laver les cellules et ajouter puromycine à 2 pg / ml jusqu'à lundi.
  2. Prolifération: le lundi de la deuxième semaine, laver les cellules et ajouter de l'insuline, de la transferrine et le supplément de sélénite de sodium pour les milieux de culture jusqu'à ce que les cultures atteignent 90% de confluence le mercredi de la deuxième semaine.

. 4 Différenciation: Mise en place du modèle in vitro du Bureau

  1. Lundi de la deuxième semaine, préparer filtres (polyéthylène, 12 puits, la taille des pores 1,0 um) par enrobage avec un mélange de collagène de type IV et de la fibronectine à la fois à 0.5μg/cm 2 dans l'eau de culture stérile (500 pi de mélange dans le compartiment supérieur et 1,5 ml d'eau stérile de culture dans le compartiment inférieur). Laisser adhérer à 37 ° C jusqu'à ce que RBEC semis.
  2. Lundi de la deuxième semaine, cinq jours avant la création de la co-culture, dégeler les astrocytes de cryotubes à 37 ° C et le transfertdans 15 ml Falcon avec 10 ml GCM. Centrifuger la suspension à 120 g pendant 8 min à température ambiante.
  3. Reprendre le culot dans des astrocytes et GCM plaque à une densité de 30 x 10 3 cellules par cm 2 dans des plaques à 12 puits.
  4. Mercredi de la deuxième semaine, juste avant la dissociation de RBEC avec de la trypsine, laver deux fois le filtre de pré-enduit avec du milieu DMEM/F12. Pré-remplir les chambres avec ECM: 1,5 ml dans le compartiment inférieur et 0,5 ml dans le compartiment supérieur.
  5. Mercredi de la deuxième semaine, laver deux fois avec du DPBS RBEC sans calcium et magnésium. Ajouter 4 ml de trypsine 0,05% chaud - EDTA solution de 0,02% à 37 ° C par flacon T75 pendant 30 secondes exactement. Ensuite, retirer 3,5 ml de solution de trypsine et observer au microscope. Lorsque la couche de cellules commence à se détacher de la matrice, les aider à en tapotant doucement le bord du flacon T75 jusqu'à ce que toutes les cellules sont flottantes.
  6. Ajouter 9 ml d'ECM par flacon T75 et transférer dans un tube Falcon de 15 ml. Très dissocier doucement la cellulesuspension par pipetage de haut en bas quatre fois avec une pipette de 10 ml, muni d'un embout jaune (éviter la production de bulles dans la solution). Compter les cellules dans la suspension (environ 3 x 10 6 cells/T75) et de la plaque immédiatement sur ​​des filtres de pré-revêtues et pré-remplis à haute densité (160 x 10 3 cellules / filtre donc environ 18 filters/T75) (Figure 8 ). Le lendemain (jeudi), changer deux fois la moyenne du compartiment supérieur pour éliminer les débris cellulaires.
  7. Jeudi de la deuxième semaine, la veille de la création de la co-culture, remplacer le milieu de culture des astrocytes par 1,5 ml de milieu de différenciation (ECM avec hydrocortisone à 500 nM) qui peuvent être complétés par des tiers milieu conditionné du compartiment basal d'une précédente co-culture (3 jours de contact entre les cellules endothéliales et les astrocytes).
  8. Vendredi de la deuxième semaine est défini comme le jour 0 de différenciation; remplacer le milieu de culture à partir de la conta filtresining la RBEC avec les médias de différenciation. Transférer les filtres de RBEC dans les puits contenant les astrocytes. Dans ces conditions, des modèles in vitro se différencient et expriment des protéines liées à jonction-dans les 3 jours.
  9. Les modèles gardent leur différenciation optimale pendant 3 jours, entre le lundi et le mercredi de la troisième semaine.

Representative Results

Protocole de fabrication
Le protocole peut être divisé en trois phases correspondant à des changements majeurs dans la composition des milieux de culture: (a) purification des cellules endotheliales des microvaisseaux, (b) de prolifération, et (c) différenciation sur les filtres (plaques de polyéthylène de 12 puits avec une porosité d' 1 um) en co-culture avec des astrocytes. Les différentes étapes du protocole de production ont été attribués à certains jours de la semaine afin d'augmenter la reproductibilité des cultures de cellules primaires (Figure 1). Le mercredi de la première semaine, donc 9 jours avant la mise en place du système de co-culture, les microvaisseaux ont été isolés (figure 2A). Pour purifier les cellules endothéliales, les cultures ont été maintenues en présence de concentrations décroissantes de la puromycine pendant 5 jours. La plupart des cellules contaminantes (principalement des péricytes) ont été éliminées et la croissance des cellules endothéliales a été plus lent, sans modification de leur phénotype. Broche-shaped cellules se développent sur ​​les fragments capillaires isolés à partir de cerveau de rat matière grise (Figure 2B). Le lundi de la deuxième semaine, les astrocytes de rat ont été déposées sur le fond de plaques à 12 puits. Mercredi RBEC ont été ajoutés au compartiment luminal des filtres. Ensemencement à haute densité à 160 x 10 3 cellules / cm 2 (figure 2C) permet d'éviter les écarts à la périphérie du filtre (figure 2D) et génère une différenciation homogène de la monocouche de cellules endothéliales. Les cellules présentent une morphologie en forme de fuseau allongé typique, aligner longitudinalement, et former une monocouche uniforme. Jeudi, le milieu de culture des astrocytes a été changé pour le milieu de différenciation conditionné avec le support de co-culture précédente (figure 2E). Vendredi RBEC sur les filtres ont été cultivées dans du milieu de culture contenant 500 nM d'hydrocortisone, et les filtres ont été transférés à des plaques à 12 puits contenant les astrocytes. Sur la troisième semaine, les expériences wavant effectué entre le lundi et le mercredi.

RBEC Caractérisation et éléments déterminants de monocouche perméabilité
Le RBEC ont été caractérisées par immunomarquage des cellules endothéliales et des marqueurs BBB ainsi que par des mesures de TEER, la perméabilité de LY et la fonctionnalité des transporteurs d'efflux telles que la P-gp.

RBEC obtenue par le procédé de purification de la puromycine (Figure 1 et 2) a augmenté dans des monocouches continues ne se chevauchant pas qui présentaient une inhibition de croissance à confluence et affichée étroitement accolées, fusiforme et morphologie en forme de broche. RBEC cultures ont exprimé des marqueurs typiques des cellules endothéliales: ils ont montré une immunocoloration positive pour plaquettes endothéliale molécule d'adhésion cellulaire (Figure 3A; CD31/PECAM) et l'expression du facteur de von Willebrand (Figure 3B). Sans traitement de la puromycine, RBECs sont rapidement envahies par les péricytes détectés par Immunos de desmineTaining (figure 3C). Fibrillaire gliale de la protéine acide (GFAP) exprimé par les astrocytes (figure 3D) est un marqueur important de différenciation des astrocytes. Avec un nombre élevé de passage, les astrocytes perdent leur capacité à induire la différenciation des cellules endothéliales. Pour cette raison, les cultures d'astrocytes ont été standardisés pour leur temps de culture et seulement subi un passage.

La mise en culture des milieux supplémentés avec RBEC avec hydrocortisone, suivie de co-culture avec des astrocytes et de milieu conditionné à partir du compartiment inférieur de co-cultures précédentes conduit à une forte induction de interendothéliales JT par rapport à RBEC cultivées seules. Les cellules ont exprimé la claudine-5, ZO-1 et occludines protéines, qui ont été localisés au niveau des jonctions cellule-cellule, comme indiqué par immunofluorescence (figure 4B-D) et révélées par analyse western blot pour ZO-1 et Occludin protéines (Figure 4E ). La distribution morphologique à cell contacts à cellule dans une configuration de type glissière à reflet (a) l'étanchéité de la monocouche, (b) l'origine cérébrale des cellules endotheliales des capillaires, et (c) est caractéristique de cellules endothéliales cérébrales hautement différenciées. La perméabilité paracellulaire de la couche endothéliale a été suivie par mesure de la TEER et le taux d'arrivée de LY (457 Da) de la partie supérieure du compartiment inférieur des filtres. TEER a été mesurée en utilisant un Endohm-12 pour 12 mm tasses de culture liées à un voltohmmeter de EVOM. La TEER des monocouches endotheliales cérébrales, ce qui indique l'étanchéité du JT atteint 300 ohm · cm 2 en moyenne (filtres de plaques de 12 puits, données non présentées). Le Pe pour LY (Pe (LY), utilisé comme un contrôle de l'intégrité de la barrière et co-incubés avec des composés testés) a atteint une moyenne de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (figure 4F) sur une période de 1 an.

Pour induire une inflammation de RBEC nous avons utilisé le prcytokine o-inflammatoire TNF-α à 5 ng / ml pour 24 heures, et suivie de la réponse inflammatoire en mesurant CCL2 (MCP-1) la sécrétion par RBEC dans le compartiment supérieur du système de culture qui a doublé de 120 ng / ml (non- traitée contrôle) à 250 ng / ml (Figure 5A). TNF-α traitement à 5 ng / ml ou 50 ng / ml pour 24 heures a également ouvert le Bureau tel que révélé par Pe (LY) mesure (figure 5B).

P-gp a été visualisée dans RBEC différenciée par immunocytochimie (figure 6A). P-gp localisation est connu pour être très polarisé et s'exprime essentiellement dans la membrane apicale des cellules endothéliales 44 alors que le transporteur du glutamate-1 (GLT-1) se trouve principalement dans la fraction basolatérale 45. Pour évaluer l'ampleur de la polarisation de notre RBEC culture, protéines apical et basolatéral ont été séparés des préparations de membranes de plasma en utilisant des gradients de densité de sucrose 46. L'analyse Western blot a étéeffectuée pour évaluer les niveaux d'expression de la P-gp et GLT-1 dans le plasma, apical et des préparations de membranes basales. Microvaisseaux fraîchement extraites à partir de cerveau de rat ont été utilisés comme témoins positifs les plus proches de la distribution in vivo de ces protéines (figure 6B). Dans les deux microvaisseaux et différenciées des préparations de membranes de BREC, la P-gp a été exprimé sous la forme d'une bande de 170 kDa, principalement localisée dans la fraction de membrane apicale F1 (figure 6B, C). GLT-1 expression a en effet exprimé dans la fraction de membrane basale F3 de microvaisseaux que une bande de 65-70 kDa, mais n'a pas été détecté dans la région Europe et CEI culture.

Dans des expériences parallèles, l'activité fonctionnelle de P-gp dans la monocouche de cellules endotheliales a été testée en utilisant de la rhodamine 123 (R123) en tant que ligand. Le abluminale à luminal (B à A) de l'efflux R123 était 1,7 fois plus élevé que dans la direction opposée (Figure 6D). Pour prouver l'implication de la P-gp, nous avons utilisé des inhibiteurs spécifiques P-gp, verapamil (25 uM, 30 min de préincubation) et la cyclosporine A (1 uM, 30 min de préincubation). Avec le vérapamil et le traitement de la ciclosporine, l'accumulation R123 dans RBEC a augmenté de 1,6 fois et 2 fois respectivement, par rapport à un témoin non traité (Figure 6E).

Récepteurs impliqués dans la transcytose médiée par le récepteur (RMT) Mécanismes
Le modèle a été caractérisé en outre pour l'expression de différents récepteurs potentiellement impliqués dans les mécanismes de transcytose à la BHE, tels que la LRP1, LDLR ou TfR (Figure 7A).

Études de transport fonctionnelles ont été menées avec les ligands pour TfR et LDLR. Banque RBEC ont été incubées avec la transferrine de rat marqué au Cy3 (Tf-Cy3) pendant 180 min à 37 ° C (Figure 7B, C). Quantification de Tf-Cy3 absorption et le transport dans le modèle de rat in vitro Bureau a montré que la pente de la courbe diminue légèrement au-delà de 2400 picomoless (figure 7B), suggérant que la liaison / absorption était saturable. En outre, la saturation de la liaison / absorption était en corrélation avec l'accumulation de Tf dans le compartiment inférieur. Pour confirmer cette observation, Tf-Cy3 a été incubée à 1200 pmol (partie ascendante de la courbe) avec un excès de Tf non fluorescent à 4800 pmol (plateau / saturation) (figure 7C). Ces expériences ont montré une diminution de l'accumulation Tf-Cy3 dans le compartiment inférieur et un mécanisme saturable confirmé typique d'interaction ligand-récepteur dans notre modèle in vitro du Bureau.

De même, la fonctionnalité de la protéine chimère LDLR a été démontrée par l'absorption et le transport de son DiILDL de ligand à travers la monocouche de cellules endotheliales (Figure 7D, E). RBEC en direct ont été incubées avec DiILDL pendant 30 min à 37 ° C. La fixation / absorption n'a pas été corrélée avec l'accumulation de DiILDL dans le compartiment inférieur (figure 7D). Quantification des Diiltransport de DL a montré que la pente des courbes a diminué au-delà de 2 ug, ce qui suggère que le transport était saturable et récepteur-lié dans notre modèle. L'azoture de sodium a été ajouté à 0,05%, 15 min avant l'DiILDL incubation (Figure 7E). L'absence de toxicité de l'azide de sodium à 0,05% incubation a été évaluée par Pe (LY) mesure (données non présentées). Ces expériences ont montré diminué DiILDL accumulation dans le compartiment inférieur. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent RMT pour DiILDL dans notre modèle in vitro du Bureau.

Autres modèles in vitro BBB basés sur les cellules endothéliales de rat la moelle épinière ou du cerveau de souris
Digestion enzymatique par un mélange de collagénase / dispase est l'un des principaux paramètres à contrôler en termes de la viabilité cellulaire et le rendement de microvaisseaux cérébraux de production. La concentration de l'enzyme, et plus important que le rapport entre la quantité d'enzyme par rapport au tissu, nEED être calibré précisément entre le cerveau de rat, rat de la moelle épinière et le cerveau des souris. Étaient liés densité de semis microvaisseaux et le nombre de cellules endothéliales pour atteindre 90% de confluence (9 jours après microvaisseaux de semis) et sont des paramètres importants pour améliorer la croissance des cellules, de limiter le nombre de doublement de la population et la qualité des modèles. Rat épinière microvaisseaux de la moelle ont été produites avec le même protocole que celui décrit ici pour rat microvaisseaux du cerveau (en termes de quantité de tissu, deux moelles épinières correspondant approximativement à une cerveau) pour obtenir la même quantité de cellules par flacon T75 à l'intérieur de la même échelle de temps . Méninges de 5 semaines, âgé C57BL6 souris cerveau étaient difficiles à éliminer car ils collent au cortex. Un bref traitement du cerveau à la dispase apparaît pour faciliter l'élimination des méninges. Les paramètres importants qui contribuent à la production de la reproductibilité des monocouches de cellules endothéliales de cerveau de rat, le rat de la moelle épinière et le cerveau de la souris sont mises en évidence et résumées dansFigure 8.

Figure 1
Figure 1. Diagramme résumant les principales étapes de la préparation in vitro du Bureau de modèle. Les différentes étapes du protocole de production ont été affectés à certains jours de la semaine afin d'augmenter la reproductibilité des cultures de cellules endothéliales primaires. Le protocole commence le mercredi de la première semaine, avec une production de microvaisseaux de 5 semaines des rats Wistar.

Figure 2
Figure 2. Contraste de phase microphotographies de RBEC, les astrocytes et le système de co-culture. (A) 5 semaines vieux fragments de microvaisseaux de rat Wistar, au moment de l'étalement.(B) les cultures de RBEC vieux de trois jours traités pendant 2 jours avec le substrat puromycine de la P-gp à 4 ng / ml. (C) des monocouches endothéliales confluentes et pures à jour 1 après étalement sur ​​les filtres Millipore d'une plaque à 12 puits revêtue de collagène de type IV et de la fibronectine. (D) L'homogénéité de la monocouche de cellules à la périphérie du filtre d'insertion. (E) Confluent astrocyte culture le jour de la mise en place de la co-culture montrant caractérisé en nid d'abeilles de la morphologie. (F) Schéma représentant la co-culture Système de localisation des photomicrographies par C, D et E.

Figure 3
Figure 3. Caractérisation des cultures RBEC par microscopie d'immunofluorescence. (A) des cellules endothéliales du cerveau exprimer cellules endothéliales plaquettesmolécule d'adhésion PECAM/CD31 à la frontière de la cellule, (B) le facteur de von Willebrand (VWF) montre une coloration relativement ponctuée, plus lumineux et plus agrégées dans certaines cellules que les autres, et concentrée dans la zone périnucléaire. (C) l'absence de traitement de la puromycine de RBEC cultures, péricytes sont détectés avec un immunomarquage positif pour la desmine (en vert) et ont caractéristiques petite noyaux arrondis. (D) Les astrocytes exprimer protéine acide fibrillaire gliale (GFAP). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Caractérisation immunocytochimique du rat in vitro modèle du Bureau et de la perméabilité paracellulaire deLY à travers la monocouche endothéliale. La monocouche de cellules a été immunocolorées avec (A) la vimentine pour révéler un cerveau endothéliales monocouche cellulaire confluente avec sans chevauchement morphologie et les cellules en forme de broche typique de la morphologie de l'endothélium et l'expression des protéines de jonctions serrées (B) claudine-5 , (C) ZO-1 et (D) occludine, également détectée par western blot pour ZO-1 et occludines protéines (E). (F) monocouche étanchéité dans le modèle de 12 puits du Bureau a été évaluée en mesurant le transport de lucifer jaune (LY-CH, le sel de dilithium), une petite molécule hydrophile (MW 457 Da) connu pour être retenu par le Bureau. Brièvement, LY a été incubée dans le compartiment supérieur du système de culture en contact avec les cellules endothéliales cérébrales pendant 60 min à 37 ° C. Après ce temps, le milieu du compartiment inférieur a été recueilli et la fluorescence a été quantifiée par analyse fluorimétrique avec un spectrofluorimeter avec une excitation à 430 nm, et une émission à 535 nm. Les résultats sont exprimés de la perméabilité ou Pe à 10 -3 cm / min. La barrière perméable ou est considéré comme ouvert lorsque l'Pe est au-dessus de LY 0.6x10 -3 cm / min. Au cours de chaque expérience 1 h, le volume dégagé moyenne a été représentée graphiquement en fonction du temps et de la pente estimée par analyse de régression linéaire. La pente de la courbe de dégagement pour les filtres de contrôle avec le collagène de type IV, la fibronectine-revêtement a été notée PSf et la pente de la courbe de dégagement pour les filtres avec des monocouches de cellules endothéliales de cerveau de PSt a été notée. La valeur PS pour la monocouche endothéliale (PSE) a été calculée à partir de: S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Equation 1

Les valeurs PSE ont été divisées par la surface de la porous membrane (1,1 cm 2 pour des filtres Millipore de plaques à 12 puits) et le résultat a été le coefficient de perméabilité (Pe) avec une moyenne de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Les résultats sont présentés avec une dispersion de la représentation graphique vertical pour n = 90 essais (moyenne de n = 3 à n = 6 monocouches par essai).

Figure 5
Figure 5. In vitro Bureau réponse du modèle à un traitement avec l'agent pro-inflammatoire TNF-α. Les milieux de culture à partir du système de culture a été remplacé juste avant le traitement par le TNF-α à 5 ng / ml dans le compartiment supérieur pour les 6 h, 12 h et 24 h. CCL2 libération par RBEC a été quantifiée dans le compartiment supérieur par dosage ELISA en comparaison avec le contrôle non traité. Notez que MCP-1 niveaux augmentent légèrement en fonction du temps, Même dans les puits non traités. L'intégrité de la barrière de cellules endothéliales mesurée par endothéliale Pe pour LY Pe (LY) a révélé une augmentation de la monocouche perméabilité par un traitement de 24 h avec du TNF-α à 5 ng / ml ou 50 ng / ml dans la gamme de 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 cm / min et 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min respectivement, par rapport au témoin à 0,33 ± 0,03 x 10 -3 cm / min (test t de Student, p <0,05).

Figure 6
Figure 6. Fonctionnalité de la pompe d'efflux P-gp et RBEC polarisation. Expression de la pompe d'efflux P-gp dans les cellules endothéliales cérébrales co-cultivées avec des astrocytes par immunocytochimie (A) et Western blot (B & C). des protéines membranaires de cellules ont été extraits avec un fractionnement des protéines cellulaireskit tion. membranes de plasma ont été obtenus par lyse hypotonique et différentielles centrifugations à éliminer organites et des noyaux. La séparation des protéines apicales et basolatérales de membranes plasmatiques ont été obtenus par gradient de densité de saccharose. P-gp était principalement localisée dans la fraction apicale (F1) tandis que le transporteur du glutamate-1 (GLT-1) est principalement localisée dans la fraction basolatérale (F3). Microvaisseaux purifiés avant placage ont été utilisées comme contrôle pour la localisation in vivo de ces protéines. Activité de la P-gp a été déterminée par mesure de la polarité de transport de R123, un ligand de P-gp. Le flux de 1 pM de R123 a été mesurée pendant une heure à 37 ° C dans le luminal à abluminale (A à B) et dans les directions abluminales-à-luminal (B à A) opposées. La même expérience a été réalisée sans RBEC pour évaluer la diffusion passive à travers le filtre d'insertion et les données ont été normalisés par rapport à cette valeur pour Pe (R123) calcul (voir la figure 5 (R123) (A à B). Vérapamil (25 uM, 30 min de préincubation) et la cyclosporine A (1 uM, 30 min de préincubation) ont été utilisés comme inhibiteurs de référence de la P-gp. Accumulation R123 dans RBEC a été mesurée après 2 heures avec ou sans pré-incubation avec les inhibiteurs de la P-gp (test t de Student, p <0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Caractérisation des récepteurs impliqués dans la médiation par un récepteur Transcytosis (RMT). (A) Le RBEC monocouche a été différenciée immunocolorée avec des anticorps contre la densité en fonction de récepteur des lipoprotéines de basse 1 (LRP1), et le récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR). Image confocale de RBEC sondé pour l'absorption de DiILDL, un ligand fluorescent du LDLR et pour l'absorption de rat transferrine-Cy3, un ligand fluorescent du TfR spectacle coloration ponctuée sur la surface de la cellule, avec un certain regroupement dans la région périnucléaire. (B) Rat Tf-Cy3 a été ajouté au compartiment supérieur contenant la monocouche RBEC différenciée à 75, 150, 300, 600, 1200, 2400 et 4800 picomoles / insert pendant 180 min à 37 ° C (200 uL dans le compartiment supérieur et 1 200 uL dans le compartiment inférieur). Après ce temps, la fluorescence Cy3 a été quantifiée dans le lysat cellulaire (200 ul de PBS 0,1% Triton X100) et dans le compartiment inférieur par une analyse fluorimétrique avec un spectrofluorimètre avec une excitation à 550 nm et émission à 570 nm. les unités de fluorescence ont été transformées en picomoles en utilisant une plage de travail linéaire. (C) Pour les expériences de saturation, rat Tf-Cy3 a été ajouté au compartiment supérieur contenant la monocouche RBEC différenciée à 1200 pmol / insérer pendant 180 min à 37 ° C avec ou sans 15 min de pré-incubation avec 4800 pmol / insert de Tf non fluorescent. Le transport dans le compartiment inférieur a été quantifiée comme dans (B) (test t de Student, p <0,05). (D) DiILDL a été ajouté dans le compartiment supérieur contenant la RBEC monocouche différenciée à 1, 2, 4 et 8 filtres ug / d'insertion pendant 30 min à 37 ° C (200 pl dans le compartiment supérieur et 1,200 pl dans le compartiment inférieur). Après ce temps, la fluorescence a été quantifiée en DiI dans le lysat cellulaire (200 ul de PBS 0,1% Triton X100) et dans le compartiment inférieur par une analyse fluorimétrique avec un spectrofluorimètre avec une excitation à 554 nm et émission à 571 nm. Fluorescencecence unités ont été transformées en utilisant ug une plage de travail linéaire. (E) Pour le transport des expériences de blocage, de l'azide de sodium a été ajouté à raison de 0,05% 15 min avant l'incubation de DiILDL à 2 ug / insérer pendant 30 min à 37 ° C. Le transport dans le compartiment inférieur a été quantifiée comme dans (D) (test t de Student, p <0,05). L'absence de toxicité de l'azoture de sodium incubation à 0,05% a été évaluée par Pe (LY) mesure (données non présentées). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8. Modèles in vitro à partir de cellules de BBB endothéliales de la moelle épinière de rats ou de cerveau de souris. Le tableau hauts'allume paramètres importants pour l'extraction des microvaisseaux du cerveau de rat, rat de la moelle épinière et le cerveau de la souris. Microphotographies montrent immunomarquage pour ZO1 et occludine dans des monocouches de cellules endothéliales préparés à partir de cerveau de rat, rat de la moelle épinière et le cerveau de la souris.

Discussion

Nous décrivons la mise en oeuvre d'un protocole reproductible hebdomadaire pour l'isolement et le placage des microvaisseaux du cerveau, à la suite de la purification et de la culture RBEC et la mise en place de plus de co-cultures avec des astrocytes primaires de rat afin de générer un modèle in vitro avec du Bureau BBB propriétés caractéristiques.

Établir avec succès normalisés dans des cultures in vitro BBB nécessite des conditions optimales dans les multiples étapes successives du processus. Le modèle a été (a) optimisé pour obtenir le meilleur perméabilité paracellulaire, qui reste le «Saint Graal» de modèles in vitro à BBB, et (b) validé pour l'efflux et les mécanismes de RMT.

Production, purification et la prolifération des RBEC

Le plus grand défi pour la culture des RBEC est d'obtenir une reproductibilité entre les différentes cultures. Standardisation du protocole nécessite des outils de haute qualité pour affichagesection, des réactifs de haute qualité et le respect des dates d'expiration réactifs. L'expérimentateur doit être homme de micro-dissection sous microscope stéréoscopique pour l'enlèvement rapide des méninges et de grands navires de la surface du cortex. Une fois que les cerveaux sont isolées et dissociées mécaniquement, l'un des défis majeurs est la digestion enzymatique optimale des microvaisseaux du cerveau fraîchement isolés. Le type et la qualité des enzymes utilisées est critique. Un mélange de type collagénase I et II et dispase à forte concentration avec une faible variabilité entre les lots a été utilisé. Il importe aussi de la durée de la digestion enzymatique et le rapport entre la concentration en poids d'enzyme / tissu / volume de la digestion. Le meilleur rendement de production des microvaisseaux du cerveau a été obtenue avec l'équivalent de cortex cérébral de 1 dans 1 ml de collagénase / dispase mélange à 60 pg / ml pendant deux digestions, respectivement 30 minutes et 1 heure.

De plus essentiel est l'élimination de la contamination de cellules (astrocytes et principalement des péricytes). Ces cellules prolifèrent à un taux plus élevé que les cellules endothéliales et n'établissent pas de jonctions serrées avec celui-ci, empêchant ainsi l'établissement d'une monocouche cellulaire homogène avec un bon caractère restrictif paracellulaire. Considérant que les cellules endothéliales cérébrales expriment des niveaux beaucoup plus élevés de pompes d'efflux, en particulier la P-gp, par rapport aux autres types de cellules présents dans les microvaisseaux, ils tolèrent mieux les concentrations autrement toxiques des médicaments de ligand P-gp, tandis que les cellules non-endothéliales sont éliminés. traitement de la puromycine à 4 pg / ml pour les deux premiers jours a été suivie par deux autres jours à 2 ug / ml pour obtenir une bonne pureté des cellules endothéliales. Cette sélection peut aussi favoriser les cellules endothéliales des capillaires par rapport à ceux de veinules, artérioles pré-capillaires ou de grands microvaisseaux, et conduire à des monocouches strictes. En outre, l'utilisation de sérum bovin dérivé du plasma pauvre est un impératif pour obtenir des cultures pures de cellules endothéliales 47,48. Le plasma-derIved sérum dépourvu de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), qui est mitogene pour les fibroblastes, les cellules du muscle lisse et par conséquent pour les péricytes.

Nous avons observé que le traitement de matière plastique et les filtres avec un mélange de collagène de type IV à partir de la souris et la fibronectine humaine donne un avantage significatif, avec une augmentation de 2 fois du rendement de la prolifération par comparaison avec le collagène de type traditionnellement recommandée I de queue de rat. Cues importantes pour la prolifération cellulaire sont fournis par la matrice extracellulaire telles que l'intégrine et de facteur de croissance (bFGF) d'activation 49. concentration de tampon et le pH du milieu de culture ont été décrites pour avoir un impact positif sur paracellulaire étanchéité 50 et nous avons observé une meilleure reproductibilité entre les cultures, avec l'ajout de tampon HEPES à 5 mM.

Différenciation des RBEC: Co-culture Création de filtres d'insertion

Une fois les cellules endothéliales du cerveau ont been purifié et ont proliféré pendant 6 jours, ils peuvent être étalées sur des filtres. Cellule placage de haute densité est essentielle pour obtenir une monocouche parfait. Une densité d'ensemencement de 160x10 3 cellules par des filtres à plaques 12 puits était nécessaire et suffisante pour obtenir une monocouche confluente de 24 h après l'ensemencement. Cependant, l'isolement des primaires de cellules du cerveau capillaire endotheliales à partir de leur environnement est un paradoxe dans la construction d'un modèle du Bureau in vitro comme il est connu que les cellules primaires et les cellules endothéliales des capillaires notamment cérébrales, sont fortement régulés par l'environnement et des facteurs d'induction produits par les différents types de cellules environnantes. cellules endothéliales des capillaires du cerveau cultivées seules rapidement dé-différencier et perdent certains marqueurs spécifiques endothéliales du cerveau. Ainsi, les cellules endotheliales primaires doivent être utilisés à faible passage (P1) et re-liés, au moins en partie, avec leur environnement en co-culture avec des astrocytes ou un milieu conditionné par les astrocytes 47,51. Cela estvrai pour la différenciation des astrocytes comme les cellules endothéliales du cerveau et les astrocytes sont impliqués dans les deux sens induction. La culture RBEC avec des astrocytes conduit à une forte induction de TJ interendothéliales 52,23. Les mécanismes moléculaires de ré-induction demeurent largement inconnus, et la recherche est en cours dans plusieurs laboratoires pour identifier les facteurs de modulation spécifiques sécrétées par les astrocytes, qui pourraient favoriser la différenciation des cellules endothéliales optimale 53,54. Facteurs sécrétés par les cellules endothéliales du cerveau dont le facteur inhibiteur de leucémie (LIF) ont été montré pour induire la différenciation astrocytaire 55,56. Avant mise en place de co-culture, les astrocytes ont été exposées à un milieu de différenciation contenant l'agoniste de récepteur de glucocorticoïde de l'hydrocortisone, et la co-culture un milieu conditionné. L'hydrocortisone est connu pour améliorer l'étanchéité des cellules endothéliales cérébrales et est utilisé dans des modèles de rat BBB en particulier 57 et 58,59 souris des cellules endothéliales. La médecine conditionnéum est recueillie à partir du compartiment inférieur du système de co-culture de cellules / astrocytes endothéliale après 3 jours et congelé pour une utilisation ultérieure. L'utilisation du milieu de co-culture conditionné a réduit le temps de la différenciation des cellules endotheliales 3 jours avec optimal perméabilité paracellulaire de 2 jours de plus et également l'amélioration de la reproductibilité des cultures.

Dans l'ensemble, nous décrivons le protocole fournit une TEER reproductible plus de 300 ohm · cm 2 et un coefficient de perméabilité paracellulaire moyenne Pe (LY) de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, similaires aux meilleurs modèles basés sur des cellules primaires BBB 22, 12. Le protocole que nous décrivons dans la présente manuscrit avec la modulation proposée de microvaisseaux digestion enzymatique peut être étendu à des cellules endothéliales de la moelle épinière de rat et de souris 60 cerveau.

Caractérisation moléculaire et fonctionnelle

En outreTJ à induction, les astrocytes contribuent également à l'expression des transporteurs d'efflux telles que la P-gp dans des cellules endothéliales de cerveau 61. On montre en effet l'expression de la pompe d'efflux P-gp dans le modèle de BHE et nous démontrons la polarité de la pompe d'efflux localisation de P-gp en utilisant des approches biochimiques, et l'activité de la P-gp au moyen d'un dosage fonctionnel. GLT-1 expression a été détectée dans la fraction de membrane basale des microvaisseaux, mais n'a pas été détectée dans RBEC cultivées. Nous émettons l'hypothèse que GLT-1 a été normalisée chez notre culture de RBEC en comparaison avec les conditions in vivo et donc pas détectable par analyse Western blot. L'excès de glutamate est neurotoxique et in vivo, GLT-1 est responsable de l'efflux de glutamate à partir du compartiment basal (parenchyme) au compartiment apical (circulation sanguine). Dans les cultures d'astrocytes, GLT-1 expression reste très faible et est induite par l'addition de glutamate dans le milieu 62,63.

Nous Conf aussiirm l'expression des transporteurs d'afflux à la membrane apicale comme LRP1, LDLR et TfR. Fonctionnalité de l'ISF et LDLR a été démontrée par des expériences de Tf-Cy3 et DiLDL liaison et de transport de la luminale du côté abluminale de la monocouche, comme indiqué précédemment avec un bovin modèle in vitro du Bureau 64. Fait intéressant, il a été montré que cette exigence de lipides à partir des astrocytes augmente l'expression de LDLR sur les cellules endotheliales des capillaires cérébraux 65,66 confirmant encore la diaphonie physiologique entre les astrocytes et les cellules endothéliales du cerveau, y compris in vitro. Nous avons choisi pour illustrer le transport avec des colorants fluorescents tels comme Cy3 et Dil considérant que l'analyse spectrofluorimétrique est disponible dans la plupart des laboratoires, et peut s'avérer utile pour valider des modèles BBB in vitro. Cependant, la quantification de la fluorescence est beaucoup moins sensible que la radioactivité et nécessite une augmentation du nombre d'expériences pour obtenir des données significatives.Idéalement, Tf et LDL sont généralement radioactif (iode 125) pour de telles expériences de liaison / absorption et de transport.

Nous montrons également que la monocouche de cellules endothéliales différenciées obtenu avec le protocole proposé répond à l'inflammation induite par le TNF-α, tel que révélé par CCL2 presse et du Bureau ouverture. CCL2 (MCP-1) et de son récepteur CCR2 sont impliqués dans les pathologies du système nerveux central telles que la sclérose en plaques, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) 67, un traumatisme du SNC et 68 sont connus en tant que médiateurs de la migration des leucocytes dans le SNC dans des conditions de neuro-inflammatoires 69,70. Avec le protocole testé, nous ne pouvons pas conclure sur une sécrétion polarisée de CCL2 parce Bureau ouverture permet la concentration de CCL2 s'équilibrer entre les deux (apicale) et inférieures (de fond) compartiments supérieurs. Par conséquent, nous sous-estimons clairement le montant de CCL2 produite par le RBEC dans le compartiment apical à 24 h (figure 5A).

Présentation générale et les limites de Bureau dans des modèles in vitro: Je n Vivo In Vitro contre les rongeurs et contre comparaisons humaines

Beaucoup de médicaments prometteurs du SNC qui se sont révélées efficaces dans Bureau passage in vitro ont échoué dans les essais cliniques en raison du manque de prévisibilité dans les modèles de BBB in vitro souvent basées sur des cellules isolées à partir d'autres espèces que l'homme. Au meilleur de notre connaissance, les modèles in vitro à BBB sont probablement plus prédictive quand il s'agit d'étudier les aspects mécanistiques de réseaux de protéines, la transduction du signal, les transporteurs et les récepteurs. Chaque mécanisme, voie ou cible à étudier in vitro doit être caractérisé pour sa régulation par des signaux environnementaux complémentaires (types cellulaires autres, les produits chimiques, protéines) et combinée à des études in situ les mêmes espèces animalesEt, si possible, avec les microvaisseaux et les cellules endothéliales isolées chez l'homme, les restrictions et les précautions évoquées ci-dessous.

Modèles in vitro BBB doivent être considérés comme des systèmes autonomes, isolées de la réglementation des corps, mais encore dotés de grandes propriétés in vivo et un potentiel de régulation par des signaux environnementaux. Non "idéal" modèle in vitro du Bureau a été encore proposé 71,72,73 parce que les monocouches de cellules endothéliales manque un certain nombre de constituants importants de l'unité neuro-vasculaire des cellules gliales (NGVU) et sont isolées du sang et de la réglementation du corps. Le manque de péricytes 74,16 ou 17,18 neurones ou les différents constituants de la matrice extracellulaire utilisé pour le revêtement plastique ou le milieu de culture et le sérum utilisé pour la croissance cellulaire in vitro modèles "plus facile" faites à BBB la plus commune et sur ​​la base de l'endothélium cellules différenciées avec des astrocytes peuvent moduler l'expression des protéines in comparaison avec la situation in vivo 75. Ces modèles peuvent exprimer plusieurs transporteurs affichées in vivo, mais pas tous. Dans certains cas, les paramètres de transport ont d'abord été vérifié dans les microvaisseaux isolés (les plus proches de la situation in vivo), puis étudié dans les systèmes de culture de cellules 76,61.

La recherche en biologie moléculaire a permis la caractérisation de gènes et l'expression des protéines dans les micro-vaisseaux isolés et des cultures de cellules endothéliales de passage bas de la même espèce, et entre les différentes espèces, le plus souvent de petits animaux tels que les rongeurs (souris et rats) ou de vache et de porc en comparaison à l'homme 77,78,75,15. Comparaison entre transcriptomique in vivo et dans les cellules endotheliales microvasculaires cérébrales in vitro ont montré de nombreux transcrits de gènes qui ont été exprimés de manière différentielle et le plus souvent significativement régulée à la baisse in vitro. Transcrits codant pour les transporteurs d'afflux tels que TfR et proteins impliqués dans le trafic vésiculaire sont principalement régulés à la baisse dans les cellules endothéliales du cerveau en culture, ce qui suggère une diminution générale de l'endocytose et le transport vésiculaire dans ces cellules. manipulation de la culture en termes de pureté (traitement de puromycine) et le traitement par hydrocortisone peut aider à restaurer un «in vivo comme« profil d'expression génique plus 77. Études transcriptomiques ont également révélé des différences importantes entre les espèces qui compliquent encore les prévisions sur l'absorption du médicament chez l'homme sur la base de rongeurs dans des modèles in vitro BBB 75. Modèles in vitro BBB impliquant la co-culture de cellules endothéliales humaines et les astrocytes ont été décrits 15. Bien que pertinente, ces modèles sont plus difficiles à mettre en œuvre sur une base régulière car ils nécessitent l'accès réglementé pour les tissus humains post-mortem et il est l'hétérogénéité de la qualité / propriétés des cellules endothéliales du cerveau humains en fonction de l'âge, les maladies, et peut-être médical traitement des bailleurs de fonds. Des efforts doivent être faits pour développer de nouveaux modèles in vitro qui reproduisent le mieux physiologiques, anatomiques et les caractéristiques fonctionnelles du Bureau vivo dans. Co-cultures impliquant des types trois cellules sont très restrictives et semblent difficiles à mettre en œuvre régulièrement. À ce jour, in vitro modèles les plus complexes de BBB sont les modèles dynamiques in vitro (DIV-BBB) qui comprennent l'organisation en forme de cuve avec des astrocytes et comprennent un flux de fluide qui imite le flux sanguin 75,79,80,81,82, 83,84,85. Lorsque les cellules endothéliales cérébrales sont exposées à un écoulement, la contrainte de cisaillement générée active mechanotransducers à la surface de la cellule, qui modulent l'expression des différents gènes impliqués dans la physiologie des cellules endotheliales tels que la division cellulaire, la différenciation, la migration et l'apoptose 80. In vivo, la contrainte de cisaillement générée par l'écoulement du sang est responsable de l'arrêt de la mitose au contact avec la cellule, ce qui permet l'établissement d'unmonocouche de cellules endotheliales dans les vaisseaux sanguins 80. L'analyse génomique et protéomique des cellules du cerveau humain microvasculaire endothéliales normales a montré l'impact de la contrainte de cisaillement dans du Bureau endothéliale physiologie 84. La contrainte de cisaillement est responsable de la survie des cellules, un degré plus élevé d'adhésion des cellules endothéliales, pompe à efflux induction et une meilleure polarisation des transporteurs 75, la régulation du métabolisme du glucose 75,86, oxydation médiée par le CYP450 enzymes 75 et la régulation de la perméabilité paracellulaire en augmentant l'expression des gènes codant pour des éléments de jonction intercellulaires comme occludine et ZO-1 et par conséquent une grande 87,75,80 TEER autour de 1500 - 2000 ohm · cm 2, le plus proche de paramètres connus in vivo 79,80

Dans l'industrie biotechnologique et pharmaceutique, le dépistage systématique de médicaments ou de criblage à haut même (HTS) et les efforts pour réduire l'expérimentation animale, a conduitpour le développement de lignées cellulaires différentes pour être utilisées en remplacement de la culture primaire de cellules endothéliales cérébrales qui restent plus difficiles à mettre en place de façon routinière. Dans la plupart des cas, les cultures primaires de cellules endothéliales cérébrales ont été transduites avec un gène d'immortalisation (virus SV40 ou le virus du polyome grand antigène T ou d'adénovirus E1A), soit par transfection de l'ADN de plasmide ou par une infection en utilisant des vecteurs rétroviraux 88,89,75. Plusieurs lignées de cellules endothéliales d'origine cérébrale ont été développés comme le RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BEC ou rBCEC4 lignées de cellules de rat 88,75, la lignée cellulaire b.End3 souris 90,75, la PBMEC/C1 - 2 porcine lignée cellulaire 87,75, et la lignée cellulaire humaine hCMEC/D3 89,75. D'autres modèles sont basés sur des cellules d'origine non-cérébrale, tels que le rein de chien Madin-Darby (MDCK) ou des lignées de cellules Caco2 12,75. Parmi les différentes lignées cellulaires humaines endothéliales cérébrales, la hCMEC/D3 a été largement citerd et amélioré comme un modèle de Bureau depuis sa création en 2005 91,92. Comme les cultures primaires, les lignées cellulaires présentent des avantages et des limites. Ils sont plus faciles à manipuler que les cultures primaires, ont une durée de vie prolongée, sont bien caractérisés et permettre la reproductibilité entre les expériences à grande échelle. Cependant, les lignées cellulaires peuvent perdre les fonctions spécifiques d'un tissu, de perdre la réglementation environnementale et acquérir un phénotype moléculaire très différente de cellules in vivo, 75, 89. En particulier, les monocouches générés à partir de lignées cellulaires présente d'étanchéité réduit, peu TEER et Afficher le profil de transporteur variation 75,89. Ainsi expériences animales ou d'études dans les cellules primaires sont souvent préférés en dépit de leur complexité supplémentaire.

Acknowledgments

Le soutien financier à VECT-HORUS est reconnu dans le Fonds Unique Interministériel (projet FUI / MEDUL) et à Vect-Horus et le laboratoire UMR7259 de l'Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, l'ADHOC et des projets de collaboration PREVENTAD) . Le laboratoire UMR7259 reconnaît également le soutien financier du CNRS et de l'Université d'Aix-Marseille.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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Médecine numéro 88 les cellules de cerveau de rat endothéliales (RBEC) la souris la moelle épinière des jonctions serrées (TJ) le transport médié par le récepteur (RMT) de lipoprotéines de basse densité (LDL) LDLR la transferrine TfR la P-glycoprotéine (P -gp) résistance électrique transendothéliale (TEER),
Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur
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Molino, Y., Jabès, F.,… More

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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