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Medicine

सेटिंग अप एक Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक चूहा syngeneic endothelial कोशिकाओं और astrocytes के सह संस्कृति से जुड़े एक में इन विट्रो बीबीबी मॉडल के reproducibility मान्य करने के लिए था. endothelial सेल monolayer उच्च तीर और कम भंडारण पारगम्यता प्रस्तुत किया. विशिष्ट टी जे प्रोटीन की अभिव्यक्ति, सूजन और ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता को कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया गया.

Abstract

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​विशेष रूप से रक्त और तंत्रिका ऊतक के बीच आणविक और सेलुलर प्रवाह को नियंत्रित करता है. हमारा उद्देश्य endothelial सेल monolayer भर transcytosis में शामिल रिसेप्टर्स अध्ययन करने के लिए प्राथमिक चूहे के मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (RBEC) के सह संस्कृतियों और astrocytes का उपयोग बीबीबी की इन विट्रो मॉडल में एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चूहा syngeneic के विकास और करने के लिए चिह्नित किया गया था. Astrocytes trypsin पाचन निम्नलिखित यांत्रिक विच्छेदन से अलग थे और बाद में सह संस्कृति के लिए जमे हुए थे. RBEC 5 सप्ताह पुराने चूहे cortices से अलग थे. दिमाग तानिका और सफेद बात के साफ, और यंत्रवत् enzymatic पाचन निम्नलिखित अलग थे. इसके बाद, ऊतक homogenate तंत्रिका ऊतक से पोत टुकड़े को अलग करने के गोजातीय सीरम albumin में centrifuged था. पोत टुकड़े उनके बाह्य मैट्रिक्स से मुक्त endothelial कोशिकाओं को एक दूसरे enzymatic पाचन कराना पड़ा. ऐसे pericytes के रूप में शेष contaminating कोशिकाओं च गयाurther puromycin युक्त मध्यम में microvessel टुकड़े चढ़ाना से सफाया कर दिया. वे तो कुओं के नीचे पर हो astrocytes के साथ सह संस्कृति के लिए फिल्टर पर passaged गया. RBEC तंग जंक्शन के उच्च स्तर व्यक्त ऐसी occludin के रूप में (टी जे) प्रोटीन, सेल सीमाओं पर एक ठेठ स्थानीयकरण साथ claudin -5 और ZO-1. TJS की तंगी का संकेत मस्तिष्क endothelial monolayers के transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर), 300 ओम · औसतन 2 सेमी पहुंच गया. (ly) पीले लूसिफ़ेर के लिए endothelial पारगम्यता गुणांक (पे) / मिनट 0.26 ± 0.11 x 10 -3 सेमी की एक औसत के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था. Monolayers में आयोजित मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं, तपका ट्रांसपोर्टर पी ग्लाइकोप्रोटीन (पी जीपी) व्यक्त rhodamine 123, पी जीपी के लिए एक ligand के एक polarized परिवहन दिखाया, और endothelial सेल monolayer भर transferrin-Cy3 और DiILDL की विशिष्ट परिवहन दिखाया. अंत में, हम एक में इन विट्रो की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदानकारण गुणवत्ता आश्वासन तरीकों को अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और कि बीबीबी ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स पर अनुसंधान के लिए उपयुक्त है कि बीबीबी मॉडल.

Introduction

केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के इलाज के लिए विकसित कई दवाओं विकारों therapeutically प्रासंगिक सांद्रता में मस्तिष्क पैरेन्काइमा तक पहुँचने में असमर्थ हैं. बीबीबी रोगजनक एजेंटों से, प्लाज्मा रचना के उतार - चढ़ाव से मस्तिष्क तंत्रिका ऊतकों को बचाता है, और मस्तिष्क 1 में और बाहर आयनों, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और यहां तक कि कोशिकाओं की गैर विशिष्ट प्रवाह को सीमित द्वारा मस्तिष्क पैरेन्काइमा के homeostasis बनाए रखता है.

बीबीबी विशेषताओं ऐसे न्यूरॉन्स के रूप में विशेष वर्ग मस्तिष्क microvessel endothelial कोशिकाओं और न्यूरो glia संवहनी इकाई के पड़ोसी तत्वों (NGVU) के बीच अंतरंग निकटता और परस्पर बात से प्रेरित और बनाए रखा है, glial कोशिकाओं (अधिक ठीक astrocyte अंत फुट), और pericytes कोलेजन प्रकार चतुर्थ, fibronectin, laminin और proteoglycans 2,3 की मुख्य रूप से होते हैं जो बेसल झिल्ली में ensheathed. केशिका स्तर पर endothelium के 32% और एक महत्वपूर्ण खेलने - pericytes लगभग 22 कवरअन्तःचूचुक प्रसार, angiogenesis और सूजन प्रक्रियाओं के नियमन में भूमिका. Endothelial कोशिकाओं केशिकाओं की भीतरी सतह को कवर करने के लिए एक सतत पत्र के रूप में. वे शिखर क्षेत्र में एक बेल्ट की तरह की संरचना के रूप में और है कि ध्रुवीकरण सेल के लिए जो योगदान TJS, से जुड़े रहते हैं. Astrocytes बीबीबी गुणों को विनियमित करने और इस तरह के TGF-β, GDNF, bFGF और आईएल -6 के रूप में महत्वपूर्ण नियामक कारकों के स्रोत हैं. अधूरा कार्यक्षमता के साथ GFAP में कमी astrocytes बीबीबी गुण 4 को विनियमित करने में सक्षम नहीं हैं. न्यूरॉन्स सीधे बीबीबी के गठन में संरचनात्मक रूप से शामिल है लेकिन यह भी प्रोटीन अभिव्यक्ति और बीबीबी कार्यों 5 के महत्वपूर्ण पहलुओं को विनियमित नहीं कर रहे हैं.

आगे बीबीबी की संरचना, शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए, बीबीबी की इन विट्रो मॉडल अनुसंधान उपकरण के रूप में विकसित किया गया. मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं आधारित इन विट्रो बीबीबी मॉडल में लागू करने के लिए विभिन्न प्रजातियों से निकाले गए हैंगोजातीय 6,7 से कम बीतने प्राथमिक संस्कृतियों, सुअर का 8,9, चूहे 10,11,12, माउस 13 और भी मानव 14,15 पर. इन मॉडलों में विवो बीबीबी, नकल करने के लिए जाना जाता है, खासकर जब चूहे या murine और / या pericytes 16,12 से glial कोशिकाओं, और / या तंत्रिका पूर्वज सेल व्युत्पन्न astrocytes 17 और / या न्यूरॉन्स 18 के साथ सह सुसंस्कृत. वे इन विट्रो / vivo प्रयोगों और तुलना और / या ट्रांसजेनिक मॉडल 19 से उत्पादित मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के अध्ययन में अनुमति देते हैं, क्योंकि "में प्रयोगशाला" मॉडल अक्सर कृन्तकों से उत्पादित कर रहे हैं.

हाल में इन विट्रो बीबीबी मॉडल में विकसित भी पूर्व में विवो परीक्षण 15,20,21,3,6,22,11,23 को संभावित सीएनएस दवा उम्मीदवारों के दिमाग तेज भविष्यवाणी करने में मदद करने के लिए डिजाइन किया गया है. इन विट्रो बीबीबी मॉडल आम तौर पर तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है सीएनएस में मैं) में जाना पैठ या एल के साथ: के साथ दवाओं का परिवहनBBB और कोई केंद्रीय प्रभाव भर ओउ पारगम्यता, और द्वितीय) एक ही प्रजाति के पशु मॉडल में मापा एक ही दवाओं के स्पष्ट पे. आसानी से बीबीबी पारित दवाओं है कि ज्यादातर lipophilic हैं और लिपिड की मध्यस्थता मुक्त प्रसार (कैफीन, carbamazepine, आदि) से मस्तिष्क endothelial कोशिका झिल्ली को पार. ऐसे digoxin, verapamil या cyclosporine एक के रूप में नकारात्मक जाया दवाओं सक्रिय रूप से इस तरह के पी जीपी के रूप में मस्तिष्क endothelial तपका ट्रांसपोर्टरों से चली जाती हैं. हालांकि, नव विकसित चिकित्सकीय अणुओं के कई ऐसे पुनः संयोजक प्रोटीन, siRNAs या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में biopharmaceuticals, कर रहे हैं. विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों की मैं) अभाव, और paracellular बीतने के दौर से गुजर से उच्च आणविक भार अणुओं को रोकने के जो endothelial कोशिकाओं के द्वितीय) कसकर बांध परत: उनमें से ज्यादातर के कारण बीबीबी पार नहीं करते. इन सीमाओं के साथ, "ट्रोजन हॉर्स" रणनीतियों मैं, बीबीबी पर जाना जाता रिसेप्टर्स के खिलाफ वैक्टर (एंटीबॉडी, पेप्टाइड्स) शामिल उपयोग कर कार्यान्वित किया गया हैn रिसेप्टर ऐसे transferrin (TF) रिसेप्टर (टीएफआर), इंसुलिन रिसेप्टर (आईआर), या एलडीएल रिसेप्टर (LDLR) से संबंधित रिसेप्टर परिवार (LDLR, LRP1) के सदस्यों के रूप में परिवहन या transcytosis (RMT), मध्यस्थता. इस तरह के रिसेप्टर्स विवो 24,25 में अलग मस्तिष्क केशिकाओं पर और बीबीबी में पाया गया है. इन रिसेप्टर्स के लिए transcriptional प्रोफाइल, विशेष रूप से LDLR परिवार के उन लोगों का विश्लेषण किया और सह सुसंस्कृत सीधे मस्तिष्क 26 से उनकी निकासी के बाद astrocytes के साथ या मस्तिष्क केशिकाओं में मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के बीच तुलना की गई. Pardridge 24 इंसुलिन रिसेप्टर और इंसुलिन वृद्धि कारक रिसेप्टर 27,28 के खिलाफ एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया, transferrin रिसेप्टर (टीएफआर) के खिलाफ बैल 26 एंटीबॉडी के साथ क्षेत्र खोला. इन एंटीबॉडी आधारित वैक्टर के साथ, ArmaGen टेक्नोलॉजीज बीबीबी 29 के पार, प्रोटीन सहित, दवाएं वितरित करने के लिए एक बीबीबी आणविक ट्रोजन हॉर्स मंच प्रौद्योगिकी विकसित की है.साहित्य LRP1 मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में अभिव्यक्ति और एक शक्तिशाली endocytic / मेहतर रिसेप्टर के रूप में अपनी भूमिका दिखा डेटा में समृद्ध है. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण LRP1 मस्तिष्क केशिकाओं में समृद्ध भागों में और चूहे के मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं 30 में व्यक्त किया है कि सुझाव दिया. ऐसे बीबीबी 31 के पार कुशल दवा बाढ़ का प्रचार करने वाले aprotinin से व्युत्पन्न पेप्टाइड वैक्टर साथ Angiochem लक्ष्य LRP1 के रूप में कंपनियों. हालांकि, LRP1 भी सक्रिय Aβ के परिवहन और मस्तिष्क पैरेन्काइमा से रक्त 32 को अपने तपका / निकासी में शामिल है. इस तरह के डेटा अपने ligands के आधार पर बीबीबी भर में एक द्वि - दिशात्मक परिवहन में LRP1 शामिल है. biOasis VECT-HORUS LDLR 34 कि लक्ष्य पेप्टाइड वैक्टर विकसित करता है, जबकि इस तरह के बीबीबी 33 के पार lysosomal एंजाइम और एंटीबॉडी के रूप में biologics के परिवहन के लिए एक प्रोटीन melanotransferrin का उपयोग बढकर प्रौद्योगिकी विकसित करता है. डेटा एलआरपी और LDLR अन्तर परिवहन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वहाँ का सुझाव दे रहा हैऐसे बीबीबी 37 के पार lysosomal एंजाइमों 35,36 या nanoparticle परिसरों के रूप में erent अणुओं.

हमारे हित के क्षेत्र वेक्टर अणुओं और सीएनएस रोगों के उपचार के लिए vectorized दवा उम्मीदवारों का उपयोग सीएनएस के लिए दवा वितरण है. विशेष रूप से, BBB भर दवा वितरण Neuroinflammation अपने हद में भिन्न हो सकते हैं कि एक प्रक्रिया के संदर्भ में विचार किया जाना है, लेकिन है कि इन्सेफेलाइटिस, एकाधिक काठिन्य, अल्जाइमर रोग आदि Neuroinflammation सहित, शायद सभी सीएनएस घावों और बीमारियों के लिए आम है paracellular और transcellular परिवहन रोग की स्थिति 38,39,40,41,42,43 में परिलक्षित किया जा सकता है कि विचार बीबीबी शरीर विज्ञान और पारगम्यता में परिवर्तन के साथ बीबीबी सूजन के साथ और संभवतः जुड़ा हुआ है. उदाहरण के लिए, TNF-α, tweak, और अन्य साइटोकिन्स सूजन मिलाना, और इन विट्रो बीबीबी मॉडल के साथ प्रयोग वे वीं के paracellular गुणों को बदल सकते पता चला है किई endothelial सेल monolayer 38,39,40 और है कि TNF-α भी एलडीएल की 41 transcellular परिवहन में वृद्धि हो जाती है, 42 और लैक्टोफेरिन 43 holotransferrin.

हमारा उद्देश्य को विकसित करने और करने के लिए चिह्नित किया गया था एक अनुकूलित और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चूहा syngeneic बीबीबी मॉडल प्राथमिक मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और astrocytes के सह संस्कृतियों का उपयोग कर. हम क्रमशः मस्तिष्क endothelial सेल उत्पादन और astrocyte उत्पादन के लिए 5 सप्ताह पुराने और नवजात Wistar चूहों का इस्तेमाल किया. एक चुनौती "साप्ताहिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य" बीबीबी मॉडलों के उत्पादन की अनुमति एक प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए था. इस लक्ष्य तक पहुंचने के लिए, उत्पादन प्रोटोकॉल के हर कदम पहले सप्ताह के बुधवार को मस्तिष्क microvessel उत्पादन से शुरू, सप्ताह के निर्धारित दिनों पर प्रदर्शन किया गया था. Dissections पिछले 3 वर्षों के दौरान लगभग हर हफ्ते प्रदर्शन किया गया. आगे संस्कृतियों के reproducibility में सुधार करने के लिए, एक गुणवत्ता आश्वासन प्रणाली की स्थापना की गई थी. सभी Reagenटीएस और रसायन एक डेटाबेस (प्रवेश की तिथि, स्टॉक, समाप्ति अवधि, आदि) में संदर्भित कर रहे थे.

मॉडल ऐसे endothelial सेल संगठन और शुद्धता के रूप में मानदंडों के एक नंबर, निम्नलिखित विशेषता थी, तीर, भंडारण पारगम्यता, समर्थक भड़काऊ एजेंटों, टी जे प्रोटीन की गुणात्मक और मात्रात्मक अभिव्यक्ति, ऐसे पी जीपी के रूप में तपका ट्रांसपोर्टरों की कार्यक्षमता, और रिसेप्टर्स के जवाब ऐसे टीएफआर या LDLR के रूप में endothelial सेल monolayer भर transcytosis में शामिल किया गया.

Protocol

चूहा astrocytes के 1. उत्पादन

प्रत्येक तैयारी या तो सेक्स के 10 नवजात Wistar चूहों का उपयोग करें.

  1. कैंची की एक जोड़ी के साथ सिर काटने और एक लामिना का प्रवाह हुड के नीचे एक सूखी पेट्री डिश में उन्हें तुरंत हस्तांतरण द्वारा चूहों बलिदान. सेरिबैलम बिना खोपड़ी से दिमाग निकालें और ठंड विच्छेदन बफर युक्त एक पेट्री डिश में उन्हें तुरंत स्थानांतरण: HBSS 1% गोजातीय सीरम albumin (endotoxin बीएसए का स्तर कम), 100 ग्राम / एमएल पेनिसिलिन 100 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
  2. 2 मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग और बर्फ पर विच्छेदन बफर के साथ एक साफ पेट्री डिश में उन्हें स्थानांतरित करने के लिए, आधे में दिमाग काटें. ऑप्टिक तंत्रिका कट और एक stereomicroscope के तहत तानिका हटा दें.
  3. ठंड विच्छेदन बफर के 50 एमएल में बड़े पैमाने पर cortical टुकड़े धो लें.
  4. एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 3 दिमाग से cortical टुकड़े रखें और ऊपर pipetting द्वारा और एक तख्तापलट नीचे अलग कर देनाEDTA 5 मिनट के लिए 0.02% 37 डिग्री सेल्सियस पर - Le 0.05% trypsin के 6 मिलीलीटर में एक नीले रंग की टिप से सुसज्जित एक 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल विंदुक के साथ कई बार
  5. 24 से 10% FBS के साथ पूरक DMEM के मिलीलीटर और निम्न एंटीबायोटिक दवाओं, पेनिसिलिन 100 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल, glial सेल मीडिया (GCM) नामक एक मीडिया, और आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र जोड़ें. FBS बैचों astrocyte cutures के विकास और अस्तित्व के लिए चयनित और मान्य किया गया.
  6. एक 75 सेमी 2 टी कुप्पी (T75) में 10 मिलीलीटर GCM और थाली में अलग कोशिकाओं से युक्त गोली Resuspend. सेल मलबे और डीएनए को दूर करने के लिए अगले दिन मध्यम बदलें. एक सप्ताह में दो बार संस्कृति मीडिया की जगह.
  7. प्रसार के 1 सप्ताह के बाद, धीरे GCM में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के दौरान 60 rpm पर एक कक्षीय हिलनेवाला साथ glial कोशिकाओं हिला. T75 37 डिग्री सेल्सियस humidified वातावरण में 5% सीओ 2/95% हवा के साथ एक मशीन में नहीं रखा जा सकता है, तो 5 मिमी HEPES के साथ मीडिया के पूरक. अनुसंधान के लिए दो बार कोशिकाओं को धो लेंगैर पक्षपाती microglial कोशिकाओं emove.
  8. तीन हफ्ते बोने के बाद, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो. , गर्म trypsin 0.05% EDTA 0.02% की 3 मिलीलीटर जोड़ें 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और सेल परत (आमतौर पर 5 मिनट) छितरी हुई है जब तक प्रतीक्षा करें. , GCM की 10 मिलीलीटर जोड़कर trypsin गतिविधि को बाधित 8 मिनट के लिए 120 XG पर एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन हस्तांतरण.
  9. 90% FBS में astrocyte गोली Resuspend - 10% DMSO, तरल नाइट्रोजन में (2 एक्स 10 6 cryovial प्रति कोशिकाओं) और दुकान cryovials में उन्हें स्थानांतरण.

चूहा मस्तिष्क microvessels के 2. अलगाव

हमारे प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं मार्सिले की मेडिकल संकाय की आचार समिति ने मंजूरी दे दी है और राष्ट्रीय और यूरोपीय नियमों (यूरोपीय संघ के निर्देश सं 86/609) के अनुरूप हैं. सभी प्रयासों पशु पीड़ा को कम करने और इस्तेमाल किया जानवरों की संख्या कम करने के लिए किए गए थे.

  1. प्रत्येक तैयारी के लिए और एक experimente के लिएआर, 3 पाँच सप्ताह पुरानी Wistar चूहों का उपयोग करें.
  2. पहले सप्ताह के सोमवार, दोनों बाँझ संस्कृति पानी में 1 ग्राम / 2 सेमी (T75 प्रति 10 मिलीलीटर) में, कोलेजन प्रकार चतुर्थ और fibronectin साथ कोटिंग से 2 T75 बोतल तैयार करते हैं. Microvessel बोने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर पालन करने की अनुमति.
  3. पहले सप्ताह के बुधवार की सुबह, तंद्रा प्रेरित करने के लिए सीओ 2 के एक बढ़ती हुई प्रवाह के तहत चूहों euthanize, आसन और साँस लेने में रुकावट की हानि, तो एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया. 70% इथेनॉल के साथ सिर स्प्रे. कैंची की एक जोड़ी के साथ सिर कट और एक लामिना का प्रवाह हुड के नीचे एक सूखी पेट्री डिश में उन्हें स्थानांतरण.
  4. बर्फ पर ठंडा और ठंड विच्छेदन बफर से भरा एक पेट्री डिश में उन्हें स्थानांतरण तो, सेरिबैलम और ऑप्टिक नसों के बिना खोपड़ी से दिमाग निकालें (HBSS 1% BSA, पेनिसिलिन 100 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक) .
  5. के लिए 2 से मस्तिष्क गोलार्द्धों और अलग मध्यमस्तिष्क अलग करने के लिए आधे में दिमाग कटebrain. विच्छेदन बफर के साथ बर्फ पर एक साफ पेट्री डिश में forebrains स्थानांतरण.
  6. ध्यान से एन ° 5 घुमावदार संदंश के साथ एक stereomicroscope के तहत forebrains से तानिका दूर करने के लिए ठंड विच्छेदन बफर के साथ एक नया पेट्री डिश में गोलार्द्धों के एक जोड़े को ले लो. फिर, माइलिन के duvet हटाने और प्रांतस्था का एक खोल प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क के इंटीरियर साफ. ये कदम ऊतक संरक्षण और सेल अस्तित्व के लिए अधिक से अधिक 2 घंटा नहीं लेना चाहिए.
  7. अलग मंजूरी की 2 pestles से प्रत्येक के साथ 10 के ऊपर और नीचे स्ट्रोक, 20 मीटर द्वारा पीछा 71 माइक्रोन से homogenizer Dounce एक 7 मिलीलीटर में ठंड विच्छेदन बफर के 6 मिलीलीटर में 3 दिमाग से प्रांतस्था अलग कर देना.
  8. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब और अपकेंद्रित्र के 1 मिलीलीटर में 1 प्रांतस्था के बराबर प्राप्त करने के लिए निलंबन फूट डालो. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  9. Collagenases / dispase का मिश्रण (60 माइक्रोग्राम / एमएल आर युक्त एक enzymatic समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ 1 प्रांतस्था से निलंबन डाइजेस्ट11; 0.3 यू / एमएल), DNase प्रकार मैं (35 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर - 20 कश्मीर इकाइयों / एमएल) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन में gentamicin (50 माइक्रोग्राम / एमएल)
  10. 1 मिलीलीटर 10 से 25% बीएसए / HBSS 1X की मिलीलीटर और आरटी पर 15 मिनट के लिए 3600 XG पर घनत्व निर्भर centrifugation द्वारा अलग से 1 प्रांतस्था से पचाने में मिलाएं. ध्यान से एक साफ 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में ऊपरी डिस्क (माइलिन और मस्तिष्क पैरेन्काइमा) और सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण और centrifugation दोहराएँ. 4 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क microvessels युक्त जिसके परिणामस्वरूप गोली रखें
  11. ध्यान से ऊपरी डिस्क और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. ठंड HBSS 1X के 1 मिलीलीटर के साथ मस्तिष्क microvessels युक्त दोनों परिणामस्वरूप छर्रों Resuspend और एक साफ 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में स्थानांतरण.
  12. 5 मिनट के लिए 1000 XG पर 20 ठंड HBSS 1X की मिलीलीटर अपकेंद्रित्र के अलावा द्वारा microvessels धो लें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  13. इसके अलावा एक श में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के दौरान कदम 2.9 में वर्णित के रूप में एक ही एंजाइमी समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ 1 प्रांतस्था से microvessels पचानेAker.
  14. फिर, एक ट्यूब में 3 cortices में से प्रत्येक से पच microvessels मिश्रण और आगे ट्यूब प्रति डेढ़ (1.5) प्रांतस्था के बराबर से निकाले microvessels प्राप्त करने के लिए दो 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में अलग. आरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर ठंड विच्छेदन बफर और अपकेंद्रित्र के 30 मिलीलीटर जोड़ें.
  15. 20% गोजातीय प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा व्युत्पन्न सीरम, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF, 2 एनजी / एमएल), हेपरिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल), gentamicin (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक DMEM/F12 के 10 मिलीलीटर में microvessel गोली Resuspend और HEPES endothelial सेल मीडिया (ईसीएम) नाम (2.5 मिमी), 4 ग्राम / एमएल puromycin के साथ पूरक.
  16. इनक्यूबेटर से 2 लेपित T75 बोतल ले लो कोटिंग की अतिरिक्त aspirate और एक T75 फ्लास्क (T75 फ्लास्क प्रति 1.5 प्रांतस्था से निकाले microvessels) में प्रत्येक ट्यूब से microvessels थाली.

RBEC Primocultures की 3. शोधन और प्रसार

  1. शुद्धीकरण: बुधवार से शुक्रवार तक, purom जोड़ycin संस्कृति मीडिया के लिए 4 ग्राम / एमएल. गुरुवार को मध्यम बदलें. शुक्रवार को सोमवार तक 2 ग्राम / मिलीलीटर में कोशिकाओं को धोने और puromycin जोड़ें.
  2. प्रसार: दूसरे सप्ताह के सोमवार को, कोशिकाओं को धोने और संस्कृतियों दूसरे सप्ताह के बुधवार को 90% संगम तक पहुँचने तक संस्कृति मीडिया के लिए इंसुलिन, transferrin और सोडियम चन्द्रकांत पूरक जोड़ें.

. 4 भेदभाव: इन विट्रो बीबीबी मॉडल की स्थापना

  1. दूसरे सप्ताह के सोमवार, (ऊपरी डिब्बे में मिश्रण के 500 μl दोनों बाँझ संस्कृति पानी में 0.5μg/cm 2 पर कोलेजन प्रकार चतुर्थ और fibronectin का मिश्रण के साथ कोटिंग से फिल्टर (पॉलीथीन, 12 कुओं, ताकना आकार 1.0 माइक्रोन) को तैयार और कम डिब्बे में बाँझ संस्कृति पानी की 1.5 एमएल). RBEC बोने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर पालन करने की अनुमति.
  2. दूसरे सप्ताह के सोमवार, पांच दिनों के सह संस्कृति की स्थापना से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस और हस्तांतरण पर cryovials से astrocytes पिघलना10 मिलीलीटर GCM साथ एक 15 मिलीलीटर फाल्कन में. आरटी पर 8 मिनट के लिए 120 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र.
  3. 12 अच्छी तरह प्लेटें में 2 सेमी प्रति 30 x 10 3 कोशिकाओं के घनत्व पर GCM और थाली में astrocyte गोली Resuspend.
  4. दूसरे सप्ताह के बुधवार, बस trypsin के साथ RBEC की हदबंदी से पहले, DMEM/F12 माध्यम के साथ दो बार पूर्व में लिपटे फिल्टर धो लो. कम डिब्बे में 1.5 मिलीग्राम और ऊपरी डिब्बे में 0.5 मिलीलीटर: ईसीएम के साथ कक्षों पहले भरें.
  5. दूसरे सप्ताह के बुधवार, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना DPBS के साथ दो बार RBEC धो लो. ठीक 30 सेकंड के दौरान T75 फ्लास्क प्रति 37 डिग्री सेल्सियस पर EDTA 0,02% समाधान - गर्म trypsin के 4 मिलीलीटर 0.05% जोड़ें. फिर trypsin समाधान के 3.5 मिलीलीटर हटाने और माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं. सेल परत, मैट्रिक्स से अलग सभी कोशिकाओं चल रहे हैं जब तक धीरे T75 फ्लास्क की बढ़त दोहन द्वारा उनकी मदद करने के लिए शुरू होता है.
  6. T75 फ्लास्क प्रति ईसीएम के 9 मिलीलीटर जोड़ें और एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में स्थानांतरण. बहुत धीरे सेल अलग कर देनाएक पीले रंग की टिप से सुसज्जित एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ नीचे 4 बार ऊपर pipetting और से निलंबन (समाधान में बुलबुले के उत्पादन से बचने). निलंबन में कोशिकाओं (लगभग 3 एक्स 10 6 cells/T75) गणना और तुरंत एक उच्च घनत्व (160 x 10 3 कोशिकाओं / फिल्टर इसलिए लगभग 18 filters/T75) (8 चित्र पर पूर्व में लिपटे और पहले से भरे फिल्टर पर थाली ). अगले दिन (गुरुवार), सेल मलबे को हटाने के ऊपरी डिब्बे के दो बार मध्यम बदल जाते हैं.
  7. दूसरे सप्ताह के गुरुवार, सह संस्कृति की स्थापना के पहले दिन, बेसल डिब्बे से 1/3 वातानुकूलित माध्यम के साथ पूरक हो सकता है कि भेदभाव मीडिया के 1.5 मिलीलीटर (500 एनएम पर hydrocortisone साथ ईसीएम) द्वारा astrocyte संस्कृति मीडिया की जगह एक (endothelial कोशिकाओं और astrocytes के बीच संपर्क के 3 दिन) सह संस्कृति पिछले की.
  8. दूसरे सप्ताह के शुक्रवार भेदभाव का दिन 0 के रूप में परिभाषित किया गया है; फिल्टर conta से संस्कृति मीडिया की जगहभेदभाव मीडिया के साथ RBEC ining. Astrocytes युक्त कुओं में RBEC फिल्टर स्थानांतरण. इन शर्तों के तहत, इन विट्रो मॉडल अंतर और 3 दिनों के भीतर जंक्शन से संबंधित प्रोटीन व्यक्त करते हैं.
  9. मॉडल तीसरे सप्ताह के सोमवार और बुधवार के बीच 3 अधिक दिनों के दौरान उनके इष्टतम भेदभाव रखना.

Representative Results

उत्पादन प्रोटोकॉल
की एक porosity के साथ microvessels से endothelial कोशिकाओं (क) शुद्धि, (ख) प्रसार, और फिल्टर पर (ग) भेदभाव (12 अच्छी तरह से पॉलीथीन प्लेट: प्रोटोकॉल संस्कृति मीडिया संरचना में बड़े बदलाव को इसी 3 चरणों में विभाजित किया जा सकता है 1 astrocytes के साथ सह संस्कृति में माइक्रोन). उत्पादन प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों का प्राथमिक सेल संस्कृतियों के reproducibility चित्रा (1) को बढ़ाने के लिए सप्ताह के विशेष दिन के लिए सौंपा गया. पहले सप्ताह के बुधवार को इसलिए 9 दिनों के सह संस्कृति प्रणाली की स्थापना से पहले, microvessels (2A चित्रा) अलग थे. Endothelial कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए, संस्कृतियों 5 दिनों के लिए puromycin की सांद्रता कम की उपस्थिति में रखा गया था. अधिकांश contaminating कोशिकाओं (मुख्य रूप से pericytes) का सफाया कर दिया और endothelial कोशिकाओं के विकास को उनके phenotype के संशोधन के बिना धीमी थी रहे थे. तकला-Shaped कोशिकाओं चूहे के मस्तिष्क ग्रे मैटर (चित्रा 2B) से अलग केशिका टुकड़े से बाहर हो जाना. दूसरे सप्ताह के सोमवार को चूहे astrocytes 12 अच्छी तरह प्लेटें के तल पर चढ़ाया गया. बुधवार, RBEC फिल्टर की luminal डिब्बे में जोड़ा गया. उच्च घनत्व बोने एक्स 10 160/2 सेमी (चित्रा -2) 3 कोशिकाओं फिल्टर (चित्रा 2 डी) की परिधि में अंतराल से बचने के लिए मदद करता है और endothelial सेल monolayer के एक सजातीय भेदभाव उत्पन्न करता है. कोशिकाओं अनुलंबीय संरेखित, और एक समान monolayer फार्म, ठेठ लम्बी धुरी के आकार आकारिकी दिखा. गुरुवार, astrocyte संस्कृति के माध्यम से पिछले सह संस्कृति मीडिया (चित्रा 2 ई) के साथ वातानुकूलित भेदभाव मध्यम के लिए बदल गया था. शुक्रवार, RBEC फिल्टर पर 500 एनएम hydrocortisone युक्त संस्कृति के माध्यम में बड़े हो रहे थे और फिल्टर astrocytes युक्त 12 अच्छी तरह प्लेटें में हस्तांतरित किया गया. तीसरे सप्ताह में, प्रयोगों डब्ल्यूपहले सोमवार और बुधवार के बीच प्रदर्शन किया.

RBEC विशेषता और Monolayer पारगम्यता के निर्धारण तत्वों
RBEC endothelial और बीबीबी मार्कर के immunostaining द्वारा और साथ ही तीर, भंडारण की पारगम्यता और ऐसे पी जीपी के रूप में तपका ट्रांसपोर्टरों की कार्यक्षमता की माप की विशेषता थे.

RBEC puromycin शोधन विधि द्वारा प्राप्त (चित्रा 1 और 2) संगम पर विकास निषेध का प्रदर्शन किया है कि गैर अतिव्यापी निरंतर monolayers में वृद्धि हुई है और कसकर apposed, तकली जैसा और धुरी आकार आकारिकी प्रदर्शन किया. RBEC संस्कृतियों endothelial कोशिकाओं के विशिष्ट मार्करों व्यक्त: वे प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु (चित्रा 3, CD31/PECAM) के लिए सकारात्मक immunostaining दिखाया और वॉन Willebrand कारक (3B चित्रा) की अभिव्यक्ति. Puromycin उपचार के बिना, RBECs जल्दी desmin immunos ने पता लगाया pericytes द्वारा हमला कर रहे हैंTaining (चित्रा -3 सी). Astrocytes (चित्रा 3 डी) द्वारा व्यक्त glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) astrocytes के एक महत्वपूर्ण भेदभाव मार्कर है. उच्च बीतने संख्या के साथ astrocytes endothelial कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने की क्षमता खो देते हैं. इस कारण से, astrocyte संस्कृतियों संस्कृति के अपने समय के लिए मानकीकृत और केवल एक मार्ग लिया गया.

Astrocytes के साथ सह संस्कृति द्वारा पीछा hydrocortisone के साथ पूरक मीडिया के साथ और पिछले सह संस्कृतियों के निचले कम्पार्टमेंट से वातानुकूलित माध्यम से RBEC संवर्धन अकेले सुसंस्कृत RBEC की तुलना में interendothelial TJS की मजबूत प्रेरण का नेतृत्व किया. कोशिकाओं व्यक्त claudin -5, immunofluorescence (चित्रा 4 बी डी) के रूप में दिखाया, सेल सेल जंक्शनों पर स्थानीयकृत और ZO-1 और occludin प्रोटीन (चित्रा 4E के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला रहे थे जो ZO-1 और occludin प्रोटीन, ). सी में रूपात्मक वितरणएक ज़िप की तरह विन्यास में पक्ष के लिए सेल संपर्कों monolayer के (ए) में जकड़न को दर्शाता है, (ख) मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं की उत्पत्ति, और (ग) अत्यधिक विभेदित मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की विशेषता है. Endothelial परत की Paracellular पारगम्यता फिल्टर के निचले कम्पार्टमेंट ऊपरी से तीर और भंडारण (457 दा) की आमद की दर को मापने के द्वारा नजर रखी थी. तीर एक EVOM voltohmmeter से जुड़े 12 मिमी संस्कृति कप के लिए एक ENDOHM-12 का उपयोग कर मापा गया था. TJS की तंगी का संकेत मस्तिष्क endothelial monolayers के तीर, (12 अच्छी तरह से प्लेटों के फिल्टर, डेटा दिखाया गया है) औसतन 300 ओम · सेमी 2 पर पहुंच गया. (बाधा और परीक्षण यौगिकों के साथ सह incubated की एक अखंडता नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल पीई (भंडारण),) भंडारण के लिए पे एक 1 साल की अवधि में 0.26 ± 0.11 x 10 -3 सेमी / मिनट की एक औसत (चित्रा 4F) पर पहुंच गया.

RBEC की सूजन पैदा करने के लिए हमें जनसंपर्क इस्तेमाल किया24 घंटे के लिए 5 एनजी / एमएल ओ भड़काऊ साइटोकाइन TNF-α, और 120 एनजी / एमएल (गैर से दोगुनी जो संस्कृति प्रणाली के ऊपरी डिब्बे में RBEC द्वारा (MCP-1) स्राव CCL2 मापने के द्वारा भड़काऊ प्रतिक्रिया पीछा 250 एनजी / एमएल (चित्रा 5A) के लिए नियंत्रण) का इलाज किया. पीई (भंडारण) माप (चित्रा 5 ब) द्वारा पता चला मिलीलीटर 5 एनजी / या 24 घंटे के लिए 50 एनजी / एमएल TNF-α इलाज भी बीबीबी खोला.

पी जीपी immunocytochemistry (चित्रा 6A) द्वारा विभेदित RBEC में कल्पना की गई थी. पी जीपी स्थानीयकरण अत्यधिक बनाई जानी चाहिए जाना जाता है और ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर -1 (GLT -1) मुख्य रूप से basolateral अंश 45 में पाया जाता है, जबकि endothelial कोशिकाओं 44 के शिखर झिल्ली में अनिवार्य रूप से व्यक्त की है. हमारे सभ्य RBEC के ध्रुवीकरण की सीमा का आकलन करने के लिए, शिखर और basolateral प्रोटीन सुक्रोज घनत्व का उपयोग प्लाज्मा झिल्ली की तैयारियों से अलग हो गए थे 46 gradients. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण थाशिखर प्लाज्मा में पी जीपी और GLT-1 की अभिव्यक्ति के स्तर, और बेसल झिल्ली तैयारियों का आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया. हौसले से चूहे के मस्तिष्क से निकाले microvessels इन प्रोटीनों के vivo वितरण (चित्रा 6B) के सबसे करीब सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. Microvessels और विभेदित RBEC झिल्ली तैयारी दोनों में, पी जीपी मुख्य रूप से एफ 1 शिखर झिल्ली अंश (चित्रा 6B, सी) में स्थानीयकृत, 170 केडीए के एक बैंड के रूप में व्यक्त की गई थी. GLT -1 अभिव्यक्ति वास्तव में 65-70 केडीए के एक बैंड के रूप में microvessels की F3 बेसल झिल्ली अंश में व्यक्त की गई थी, लेकिन सुसंस्कृत RBEC में पता नहीं था.

समानांतर प्रयोगों में, endothelial सेल monolayer में पी जीपी के कार्यात्मक गतिविधि एक ligand के रूप में rhodamine 123 (R123) का उपयोग कर परीक्षण किया गया था. R123 के तपका (A) luminal को abluminal विपरीत दिशा (चित्रा 6D) की तुलना में 1.7 गुना अधिक था. पी जीपी भागीदारी को साबित करने के लिए, हम verapami, विशिष्ट पी जीपी inhibitors इस्तेमाल कियाएल (25 माइक्रोन, 30 मिनट preincubation) और cyclosporine ए (1 माइक्रोन, 30 मिनट preincubation). Verapamil और cyclosporine के उपचार के साथ, RBEC में R123 संचय अनुपचारित नियंत्रण (चित्रा 6E) की तुलना में क्रमश: 1.6 गुना और 2 गुना वृद्धि की गई थी.

रिसेप्टर मध्यस्थता Transcytosis (RMT) तंत्र में शामिल रिसेप्टर्स
मॉडल आगे संभावित LRP1, LDLR या टीएफआर (चित्रा 7A) के रूप में बीबीबी पर transcytosis तंत्र में शामिल विभिन्न रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के लिए होती थी.

कार्यात्मक परिवहन पढ़ाई टीएफआर और LDLR के लिए ligands के साथ प्रदर्शन किया गया. लाइव RBEC 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 7B, सी) में 180 मिनट के लिए CY3 (TF-Cy3) के साथ लेबल चूहा transferrin साथ incubated रहे थे. इन विट्रो बीबीबी मॉडल में चूहे में TF-Cy3 तेज और परिवहन की मात्रा घटता की ढलान थोड़ा 2,400 picomole परे कमी आई से पता चला किएस (चित्रा 7B), बंधन / तेज saturable था कि सुझाव. इसके अलावा, बंधन / तेज की संतृप्ति कम डिब्बे में TF के संचय के साथ सहसंबद्ध था. इस अवलोकन की पुष्टि, TF-Cy3 4,800 picomoles (पठार / संतृप्ति) (चित्रा 7C) पर गैर फ्लोरोसेंट TF के एक अतिरिक्त के साथ 1,200 picomoles (वक्र के आरोही हिस्सा) पर incubated था. इन प्रयोगों कम डिब्बे में TF-Cy3 संचय की कमी देखी गई और हमारे में इन विट्रो बीबीबी मॉडल में ligand-रिसेप्टर बातचीत की ठेठ एक saturable तंत्र की पुष्टि की.

इसी तरह, LDLR कार्यक्षमता endothelial सेल monolayer (चित्रा 7 दिन, ई) में अपने ligand DiILDL के तेज और परिवहन के द्वारा प्रदर्शन किया गया. लाइव RBEC 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए DiILDL साथ incubated रहे थे बंधन / तेज निचले कम्पार्टमेंट (चित्रा 7 दिन) में DiILDL के संचय के साथ सहसंबद्ध नहीं किया गया था. DiIL की मात्राडीएल परिवहन घटता की ढाल कि परिवहन saturable था और हमारे मॉडल में रिसेप्टर संबंधी सुझाव, 2 ग्राम से परे की कमी हुई थी. सोडियम azide 15 मिनट पूर्व DiILDL ऊष्मायन (चित्रा 7E) के लिए, 0.05% पर जोड़ा गया है. 0.05% पर सोडियम azide ऊष्मायन की विषाक्तता के अभाव पीई (भंडारण) माप (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा मूल्यांकन किया गया था. इन प्रयोगों कम डिब्बे में DiILDL संचय कमी आई दिखाया. कुल मिलाकर, हमारे परिणाम हमारी इन विट्रो बीबीबी मॉडल में DiILDL के लिए RMT सुझाव देते हैं.

चूहा रीढ़ की हड्डी या माउस मस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं पर आधारित अन्य इन विट्रो बीबीबी मॉडल
Collagenases / dispase का मिश्रण के साथ enzymatic पाचन सेल व्यवहार्यता और मस्तिष्क microvessels का उत्पादन उपज के मामले में नियंत्रण के लिए प्रमुख मानकों में से एक है. ऊतक एंजाइम रिश्तेदार की मात्रा, एन के बीच एंजाइम और अधिक महत्वपूर्ण अनुपात की एकाग्रताचूहे के मस्तिष्क, चूहे रीढ़ की हड्डी और चूहों के मस्तिष्क के बीच ठीक calibrated होना eeds. Microvessel बोने घनत्व और endothelial कोशिकाओं की संख्या 90% संगम (9 दिनों के बाद microvessel बोने) तक पहुँचने से जुड़ा हुआ है और सेल के विकास में सुधार जनसंख्या दुगनी और मॉडलों की गुणवत्ता की संख्या सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों थे. चूहा रीढ़ की हड्डी microvessels एक ही समय के पैमाने में T75 फ्लास्क प्रति कोशिकाओं का एक ही मात्रा प्राप्त करने के लिए (ऊतक राशि, 1 मस्तिष्क को लगभग इसी 2 रीढ़ की हड्डी डोरियों के संदर्भ में) चूहे के मस्तिष्क microvessels के लिए यहाँ बताया एक के रूप में एक ही प्रोटोकॉल के साथ उत्पादन किया गया . 5 सप्ताह पुरानी C57BL6 चूहों के मस्तिष्क से तानिका वे प्रांतस्था से चिपके रहते हैं क्योंकि समाप्त करने के लिए मुश्किल थे. Dispase साथ मस्तिष्क का एक संक्षिप्त उपचार तानिका को हटाने की सुविधा के लिए प्रकट होता है. चूहे के मस्तिष्क, चूहे रीढ़ की हड्डी और माउस मस्तिष्क से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य endothelial सेल monolayers के उत्पादन में योगदान देने वाले महत्वपूर्ण मापदंडों पर प्रकाश डाला और संक्षेप मेंचित्रा 8.

चित्रा 1
चित्रा 1. इन विट्रो बीबीबी मॉडल तैयार करने का मुख्य चरण सारांश चार्ट प्रवाह. उत्पादन प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों का प्राथमिक endothelial सेल संस्कृतियों के reproducibility बढ़ाने के लिए सप्ताह के विशेष दिन के लिए सौंपा गया. प्रोटोकॉल 5 सप्ताह पुराने Wistar चूहों से microvessel उत्पादन के साथ, पहले सप्ताह के बुधवार को शुरू होता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. RBEC, astrocytes और सह संस्कृति प्रणाली के चरण विपरीत photomicrographs. बाहर चढ़ाना के समय में (ए) 5 सप्ताह पुराने Wistar चूहा microvessel टुकड़े.(बी) 4 ग्राम / एमएल पी जीपी सब्सट्रेट puromycin साथ 2 दिनों के लिए इलाज तीन दिन पुरानी RBEC संस्कृतियों. कोलेजन प्रकार के साथ लेपित एक 12 अच्छी तरह से थाली की Millipore फिल्टर पर चढ़ाना के बाद (सी) दिन 1 पर शुद्ध मिला हुआ endothelial monolayers सह संस्कृति का प्रतिनिधित्व विशेषता छत्ते आकारिकी दिखा सह संस्कृति की स्थापना के दिन पर डालने फिल्टर की परिधि में सेल monolayer के चतुर्थ और fibronectin. (डी) एकरूपता. (ई) मिला हुआ astrocyte संस्कृति. (एफ) योजना सी, डी और ई में photomicrographs का स्थानीयकरण के साथ प्रणाली

चित्रा 3
Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा RBEC संस्कृतियों का आंकड़ा 3. विशेषता. (ए) मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं प्लेटलेट endothelial सेल व्यक्तसेल सीमा पर आसंजन अणु PECAM/CD31, (बी) वॉन Willebrand कारक (VWF) एक अपेक्षाकृत कबरा धुंधला हो जाना, उज्जवल और अधिक दूसरों की तुलना में कुछ कोशिकाओं में एकत्रित, और perinuclear क्षेत्र में केंद्रित से पता चलता है. RBEC की puromycin उपचार के बिना (सी) संस्कृतियों, pericytes (हरे रंग में) desmin के लिए एक सकारात्मक immunostaining के साथ पकड़ा और विशेषता छोटे गोल नाभिक है. (डी) Astrocytes glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) व्यक्त कर रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. विट्रो बीबीबी मॉडल में चूहे और के paracellular पारगम्यता के Immunocytochemical लक्षण वर्णनभंडारण endothelial monolayer भर में. सेल monolayer endothelial आकारिकी और चुस्त जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ गैर अतिव्यापी आकारिकी और ठेठ धुरी आकार की कोशिकाओं के साथ मिला हुआ मस्तिष्क endothelial सेल monolayer प्रकट करने के लिए (ए) vimentin साथ immunostained गया था (बी) claudin-5 , (सी) ZO-1 और (डी) 12 अच्छी तरह से बीबीबी मॉडल में भी ZO-1 और occludin प्रोटीन (ई) के लिए वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा पता लगाया occludin,. (एफ) Monolayer तंगी पीले लूसिफ़ेर के परिवहन को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था (LY-CH, dilithium नमक), बीबीबी द्वारा बनाए रखा करने के लिए जाना जाता है एक छोटे हाइड्रोफिलिक अणु (मेगावाट 457 दा). संक्षेप में, भंडारण 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के संपर्क में संस्कृति प्रणाली के ऊपरी डिब्बे में incubated था इस समय के बाद, कम डिब्बे के मध्यम एकत्र किया गया था और प्रतिदीप्ति एक spectrofluorimet साथ fluorimetric विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था430 एनएम पर उत्तेजना, और 535 एनएम उत्सर्जन के साथ ईआर. परिणाम 10 -3 सेमी / मिनट में पारगम्यता या पीई में व्यक्त कर रहे हैं. भंडारण के पीई 0.6x10 -3 सेमी / मिनट से ऊपर है जब बाधा पारगम्य या खुले में माना जाता है. प्रत्येक 1 घंटा प्रयोग के दौरान, औसत मंजूरी दे दी मात्रा समय और रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण से अनुमान लगाया ढलान बनाम साजिश रची गई थी. कोलेजन प्रकार चतुर्थ-फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग के साथ नियंत्रण फिल्टर के लिए मंजूरी वक्र की ढलान पीएसएफ और मस्तिष्क endothelial सेल monolayers साथ फिल्टर के लिए मंजूरी वक्र की ढलान पीएसटी चिह्नित किया गया था चिह्नित किया गया था. : Endothelial monolayer (सार्वजनिक उपक्रम) के लिए पुनश्च मूल्य से गणना की गई इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

1 समीकरण

सार्वजनिक उपक्रम मूल्यों क्रम के क्षेत्र द्वारा विभाजित किया गयाous झिल्ली (12 अच्छी तरह से प्लेटों के Millipore फिल्टर के लिए 1.1 सेमी 2) और परिणाम / मिनट 0.26 ± 0.11 x 10 -3 सेमी की एक औसत के साथ पारगम्यता गुणांक (पे) था. परिणाम N = 90 assays के लिए एक ऊर्ध्वाधर तितर बितर साजिश प्रतिनिधित्व (परख प्रति N = 6 monolayers को एन = 3 का मतलब है) के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5. इन विट्रो समर्थक भड़काऊ एजेंट TNF-α साथ इलाज के लिए बीबीबी मॉडल प्रतिक्रिया. संस्कृति प्रणाली से संस्कृति मीडिया 6 घंटा, 12 घंटा के लिए ऊपरी डिब्बे में 5 एनजी / एमएल पर सिर्फ TNF-α इलाज से पहले बदल दिया गया था और 24 घंटे. RBEC द्वारा CCL2 रिहाई गैर इलाज नियंत्रण के साथ तुलना में एलिसा परख द्वारा ऊपरी डिब्बे में मात्रा निर्धारित किया गया था. MCP-1 स्तर समय के एक समारोह के रूप में थोड़ा बढ़ा कि नोट, यहां तक ​​कि गैर इलाज कुओं में. भंडारण पीई (भंडारण) के लिए endothelial पे द्वारा मापा endothelial सेल बाधा की वफ़ादारी मिलीलीटर 5 एनजी / या 0.62 ± 0.02 x 10 की सीमा में 50 एनजी / एमएल TNF-α के साथ 24 घंटे के इलाज से monolayer पारगम्यता में वृद्धि से पता चला है - / मिनट 3 सेमी और 0.7 ± 0.01 x 10 -3 सेमी / / मिनट (छात्र टी परीक्षण, पी <0.05) 0.33 ± 0.03 x 10 -3 सेमी पर नियंत्रण की तुलना में क्रमशः मिनट,.

चित्रा 6
पी जीपी तपका ट्रांसपोर्टर और RBEC ध्रुवीकरण immunocytochemistry (ए) और वेस्टर्न ब्लॉट (बी एंड सी) द्वारा astrocytes के साथ सह सुसंस्कृत मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में तपका ट्रांसपोर्टर पी जीपी की. अभिव्यक्ति की चित्रा 6. कार्यशीलता. कोशिका झिल्ली प्रोटीन एक सेलुलर प्रोटीन fractiona के साथ निकाला गयाtion किट. प्लाज्मा झिल्ली organelles और नाभिक को खत्म करने के लिए hypotonic lysis और अंतर centrifugations द्वारा प्राप्त किया गया. प्लाज्मा झिल्ली से शिखर और basolateral प्रोटीन की जुदाई सुक्रोज घनत्व ढाल द्वारा प्राप्त किया गया. ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर -1 (GLT -1) मुख्य रूप से basolateral अंश (F3) में स्थानीयकृत किया गया था, जबकि पी जीपी मुख्य रूप से शिखर अंश (एफ 1) में स्थानीयकृत किया गया था. पूर्व चढ़ाना शुद्ध करने के लिए microvessels इन प्रोटीनों के vivo स्थानीयकरण के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. पी जीपी की गतिविधि R123, एक पी जीपी ligand के परिवहन ध्रुवता को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था. 1 माइक्रोन R123 के प्रवाह luminal से abluminal (बी ए) में और विपरीत abluminal करने वाली luminal (A) दिशाओं में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मापा गया था. एक ही प्रयोग डालने फिल्टर भर निष्क्रिय प्रसार का आकलन करने के लिए RBEC बिना महसूस किया गया और डेटा पीई (R123) गणना के लिए यह मूल्य के सापेक्ष सामान्यीकृत थे (चित्रा 5 देखें (R123) पर आधारित luminal से abluminal परिवहन की 100% (बी ए) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. Verapamil (25 माइक्रोन, 30 मिनट preincubation) और cyclosporine ए (1 माइक्रोन, 30 मिनट preincubation) संदर्भ पी जीपी inhibitors के रूप में इस्तेमाल किया गया. RBEC में R123 संचय पी जीपी अवरोधक (छात्र टी परीक्षण, पी <0.05) के साथ preincubation साथ या बिना 2 घंटे के बाद मापा गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
रिसेप्टर मध्यस्थता टीआरए में शामिल रिसेप्टर्स की चित्रा 7. विशेषताnscytosis (RMT). (ए) विभेदित RBEC monolayer कम घनत्व से संबंधित लेपोप्रोटीन रिसेप्टर 1 (LRP1) और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunostained गया था. RBEC की confocal छवि perinuclear क्षेत्र में कुछ क्लस्टरिंग के साथ, DiILDL के तेज, LDLR की एक फ्लोरोसेंट ligand के लिए और चूहा Transferrin-Cy3, सेल सतह पर टीएफआर शो कबरा धुंधला की एक फ्लोरोसेंट ligand के तेज के लिए जांच की. (बी) चूहा TF-Cy3 75 पर भेदभाव RBEC monolayer युक्त ऊपरी डिब्बे में जोड़ा गया था, 150, 300, 600, 1,200, 2,400 और 4,800 picomoles / ऊपरी डिब्बे में 37 डिग्री सेल्सियस (200 μL में 180 मिनट और 1200 μL में डालने कम डिब्बे). इस समय के बाद, Cy3 प्रतिदीप्ति 570 n पर 550 एनएम और उत्सर्जन में उत्तेजना के साथ एक spectrofluorimeter साथ fluorimetric विश्लेषण से सेल lysate (पीबीएस के 200 μL 0.1% ट्राइटन X100) में और कम डिब्बे में मात्रा निर्धारित किया गया थाएम. प्रतिदीप्ति इकाइयों एक रैखिक काम सीमा संतृप्ति प्रयोगों के लिए. (सी) का उपयोग picomoles में तब्दील हो रहे थे, चूहा TF-Cy3 / 15 के साथ या बिना 37 डिग्री सेल्सियस से कम 180 मिनट के लिए सम्मिलित 1,200 picomoles में विभेदित RBEC monolayer युक्त ऊपरी डिब्बे में जोड़ा गया था मिनट गैर फ्लोरोसेंट TF के 4,800 picomoles / डालने के साथ ऊष्मायन पूर्व. कम डिब्बे में परिवहन (बी) (छात्र टी परीक्षण, पी <0.05) में रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था. (डी) DiILDL 1, 2, 4 और 8 ग्राम / डालने फिल्टर में विभेदित RBEC monolayer युक्त ऊपरी डिब्बे में जोड़ा गया था 37 डिग्री सेल्सियस (ऊपरी डिब्बे में 200 μl और कम डिब्बे में 1,200 μl) पर 30 मिनट के लिए. इस समय के बाद, DiI प्रतिदीप्ति 571 एनएम पर 554 एनएम और उत्सर्जन में उत्तेजना के साथ एक spectrofluorimeter साथ fluorimetric विश्लेषण से सेल lysate (पीबीएस 0.1% ट्राइटन X100 के 200 μl) में और कम डिब्बे में मात्रा निर्धारित किया गया था. Fluorescence इकाइयों एक रेखीय काम रेंज का उपयोग ग्राम में तब्दील हो गया. (ई) प्रयोगों अवरुद्ध परिवहन के लिए, सोडियम azide 2 ग्राम / 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए डालने पर DiILDL की ऊष्मायन से पहले 0.05% पर 15 मिनट के लिए जोड़ा गया कम डिब्बे में परिवहन (डी) (छात्र टी परीक्षण, पी <0.05) में रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था. 0.05% पर सोडियम azide ऊष्मायन की विषाक्तता के अभाव पीई (भंडारण) माप (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा मूल्यांकन किया गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

8 चित्रा
चित्रा 8. में चूहे रीढ़ की हड्डी endothelial कोशिकाओं से या माउस मस्तिष्क से इन विट्रो बीबीबी मॉडल. उच्च तालिकाचूहे के मस्तिष्क, चूहे रीढ़ की हड्डी और माउस मस्तिष्क से microvessel निकासी के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर रोशनी. Photomicrographs चूहे के मस्तिष्क, चूहे रीढ़ की हड्डी और माउस मस्तिष्क से तैयार endothelial सेल monolayers में ZO1 और occludin के लिए immunostaining दिखा.

Discussion

हम RBEC की शुद्धि और संस्कृति का पालन और आगे विशेषता बीबीबी गुणों के साथ एक में इन विट्रो बीबीबी मॉडल उत्पन्न करने के लिए प्राथमिक चूहा astrocytes के साथ सह संस्कृतियों की स्थापना, मस्तिष्क microvessels का अलगाव और चढ़ाना के लिए एक साप्ताहिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन का वर्णन है.

सफलतापूर्वक इन विट्रो बीबीबी संस्कृतियों में मानकीकृत स्थापना प्रक्रिया के कई अनुक्रमिक चरणों में इष्टतम स्थितियों की आवश्यकता है. मॉडल (एक) में इन विट्रो बीबीबी मॉडल की "पवित्र कंघी" बनी हुई है, और (ख) तपका और RMT तंत्र के लिए मान्य है, जो सबसे कम paracellular पारगम्यता, प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था.

उत्पादन, शोधन और RBEC का प्रसार

RBEC खेती जब सबसे बड़ी चुनौती अलग संस्कृतियों के बीच reproducibility को प्राप्त है. प्रोटोकॉल के मानकीकरण जिले के लिए उच्च गुणवत्ता वाले उपकरणों की आवश्यकताअनुभाग, उच्च गुणवत्ता वाले अभिकर्मकों और अभिकर्मक समाप्ति तिथियों का सम्मान. प्रयोगकर्ता प्रांतस्था सतह से तानिका और बड़े जहाजों के तेजी से हटाने के लिए stereomicroscope के तहत सूक्ष्म विच्छेदन में कुशल होने की जरूरत है. दिमाग अलग और यंत्रवत् अलग हो जाने के बाद प्रमुख चुनौतियों में से एक हौसले से अलग मस्तिष्क microvessels के इष्टतम enzymatic पाचन है. इस्तेमाल किया एंजाइमों के प्रकार और गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है. बैचों के बीच कम परिवर्तनशीलता के साथ उच्च एकाग्रता में collagenases प्रकार मैं और द्वितीय और dispase का मिश्रण इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा महत्वपूर्ण enzymatic पाचन की अवधि और पाचन के एंजाइम एकाग्रता / ऊतक वजन / मात्रा के बीच का अनुपात है. मस्तिष्क microvessel उत्पादन का सबसे अच्छा उपज 30 मिनट और 1 घंटा क्रमशः, दोनों digestions दौरान 60 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में मिश्रण dispase / collagenases के 1 मिलीलीटर में 1 दिमाग से cortices के समकक्ष के साथ प्राप्त हुई थी.

इसके अलावा महत्वपूर्ण सेल contaminating के उन्मूलन हैएस (astrocytes और मुख्य रूप से pericytes). इन कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं की तुलना में अधिक दर पर पैदा करना और इस प्रकार अच्छा paracellular restrictiveness साथ एक सजातीय सेल monolayer की स्थापना को रोकने, बाद के साथ तंग जंक्शनों स्थापित नहीं है. गैर endothelial कोशिकाओं का सफाया कर रहे हैं, जबकि मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं microvessels में पाया अन्य प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में तपका पंपों के बहुत उच्च स्तर, विशेष रूप से पी जीपी, कि एक्सप्रेस को ध्यान में रखते, वे बेहतर पी जीपी ligand दवाओं की अन्यथा विषाक्त सांद्रता बर्दाश्त. पहले दो दिनों के लिए 4 ग्राम / एमएल puromycin उपचार अच्छा endothelial सेल पवित्रता प्राप्त करने के लिए 2 ग्राम / एमएल में दो दिन बाद किया गया. यह चयन भी venules, पूर्व केशिका धमनियों या बड़ा microvessels से उन बनाम केशिका endothelial कोशिकाओं के पक्ष में है, और तंग monolayers करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, गरीब प्लाज्मा व्युत्पन्न गोजातीय सीरम का उपयोग endothelial कोशिकाओं 47,48 का शुद्ध संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए एक जरूरी है. प्लाज्मा डेरived सीरम चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए और इसलिए pericytes के लिए, fibroblasts के लिए mitogenic है जो प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF), अभाव है.

हम चूहे की पूंछ से पारंपरिक रूप से सिफारिश की कोलेजन प्रकार मैं के साथ तुलना में प्रसार उपज का 2 गुना वृद्धि के साथ, चूहों और मानव fibronectin एक महत्वपूर्ण लाभ पैदावार से कोलेजन प्रकार चतुर्थ का मिश्रण के साथ प्लास्टिक और फिल्टर की है कि उपचार मनाया. सेल प्रसार के लिए महत्वपूर्ण cues ऐसे integrin और वृद्धि कारक (bFGF) सक्रियण 49 के रूप में बाह्य मैट्रिक्स द्वारा प्रदान की जाती हैं. बफर एकाग्रता और संस्कृति मीडिया के पीएच paracellular तंगी 50 पर सकारात्मक प्रभाव को वर्णित किया गया है और हम 5 मिमी HEPES बफर के अलावा के साथ संस्कृतियों के बीच एक बेहतर reproducibility मनाया.

सम्मिलित फिल्टर पर सह संस्कृति प्रतिष्ठान: RBEC का भेदभाव

मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं ख है एक बारeen शुद्ध और 6 दिनों के लिए प्रचुर मात्रा में है, वे फिल्टर पर चढ़ाया जा सकता है. उच्च घनत्व सेल चढ़ाना एक आदर्श monolayer प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. 12 अच्छी तरह से थाली फिल्टर प्रति 160x10 3 कोशिकाओं की एक बोने घनत्व बोने के बाद एक मिला हुआ monolayer 24 घंटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त था. हालांकि, अपने वातावरण से प्राथमिक मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं के अलगाव यह प्राथमिक कोशिकाओं, और विशेष रूप से मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं, दृढ़ता से अपने वातावरण द्वारा विनियमित और प्रेरक कारकों द्वारा उत्पादित कर रहे हैं कि जाना जाता है के रूप में एक बीबीबी में इन विट्रो मॉडल के निर्माण में एक विरोधाभास है विभिन्न आसपास के प्रकार की कोशिकाओं. ब्रेन केशिका endothelial कोशिकाओं अकेले तेजी से de-को अलग सुसंस्कृत और कुछ विशिष्ट मस्तिष्क endothelial मार्करों ढीला. इस प्रकार, प्राथमिक endothelial कोशिकाओं कम बीतने (P1) में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और फिर से जुड़ा हुआ है, कम से कम हिस्से में, astrocytes 47,51 से वातानुकूलित astrocytes या मध्यम साथ सह संस्कृति से अपने वातावरण के साथ. इस रखती हैमस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और astrocytes के रूप में astrocyte भेदभाव के लिए सच दो तरह से प्रेरण में शामिल रहे हैं. Astrocytes साथ RBEC संवर्धन interendothelial टी जे 52,23 के मजबूत प्रेरण का नेतृत्व किया. फिर से शामिल की आणविक तंत्र काफी हद तक अनजान रहते हैं, और अनुसंधान के इष्टतम endothelial सेल भेदभाव 53,54 को बढ़ावा देने सकता है जो astrocytes द्वारा स्रावित विशिष्ट modulating कारकों की पहचान करने के लिए कई प्रयोगशालाओं में चल रही है. ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (lif) सहित मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं द्वारा secreted कारक astrocytic भेदभाव 55,56 प्रेरित दिखाया गया है. सह संस्कृति स्थापना से पहले, astrocytes glucocorticoid रिसेप्टर agonist hydrocortisone युक्त भेदभाव मध्यम से अवगत कराया, और सह संस्कृति मध्यम वातानुकूलित थे. Hydrocortisone मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की जकड़न में सुधार करने के लिए जाना जाता है और विशेष रूप से चूहे 57 और माउस 58,59 endothelial कोशिकाओं से बीबीबी मॉडल में प्रयोग किया जाता है. वातानुकूलित मेडीउम 3 दिनों के बाद endothelial सेल / astrocyte सह संस्कृति प्रणाली के निचले डिब्बे से एकत्र की है और बाद में उपयोग के लिए जमे हुए है. सह संस्कृति वातानुकूलित माध्यम का उपयोग 2 अधिक दिनों के लिए इष्टतम paracellular पारगम्यता और संस्कृतियों के बीच में भी सुधार reproducibility के साथ 3 दिनों के लिए endothelial सेल भेदभाव का समय कम कर दिया.

कुल मिलाकर, हम वर्णन प्रोटोकॉल, 0.26 ± 0.11 x 10 -3 सेमी सर्वश्रेष्ठ प्राथमिक सेल आधारित बीबीबी मॉडल 22 के लिए इसी तरह / मिनट, 300 ओम पर एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तीर · 2 सेमी और एक औसत paracellular पारगम्यता गुणांक पीई (भंडारण) पैदावार 12. हम microvessel enzymatic पाचन की प्रस्तावित मॉडुलन के साथ मौजूद पांडुलिपि में वर्णन प्रोटोकॉल चूहे रीढ़ की हड्डी में 60 से और चूहों के मस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं को बढ़ाया जा सकता है.

आणविक और कार्यात्मक विशेषता

इसके अलावाटी जे प्रेरण के लिए, astrocytes भी इस तरह के मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं 61 में पी जीपी के रूप में तपका ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति के लिए योगदान करते हैं. हम वास्तव में बीबीबी मॉडल में तपका ट्रांसपोर्टर पी जीपी की अभिव्यक्ति दिखाने के लिए और हम जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग कर पी जीपी तपका पंप स्थानीयकरण की ध्रुवता का प्रदर्शन, और पी जीपी गतिविधि का एक कार्यात्मक परख का उपयोग कर. GLT -1 अभिव्यक्ति microvessels के बेसल झिल्ली अंश में खोजा गया था लेकिन सुसंस्कृत RBEC में पता नहीं था. हम GLT -1 नीचे में vivo परिस्थितियों और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा फलस्वरूप detectable नहीं की तुलना में हमारे RBEC संस्कृति में विनियमित किया गया था कि परिकल्पना है. अतिरिक्त ग्लूटामेट न्यूरोटौक्सिक है और इन विवो में, GLT -1 शिखर कम्पार्टमेंट (रक्त परिसंचरण) को बेसल कम्पार्टमेंट (पैरेन्काइमा) से ग्लूटामेट तपका के लिए जिम्मेदार है. Astrocyte संस्कृतियों में, GLT -1 अभिव्यक्ति बहुत कम रहता है और मध्यम 62,63 में ग्लूटामेट के अलावा द्वारा प्रेरित है.

हम भी confआईआरएम ऐसे LRP1, LDLR और टीएफआर रूप में शिखर झिल्ली में बाढ़ ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति. टीएफआर और LDLR की कार्यक्षमता पहले इन विट्रो बीबीबी मॉडल 64 में एक गोजातीय साथ दिखाया के रूप में monolayer के abluminal पक्ष को luminal से TF-Cy3 और DiLDL के प्रयोगों बंधन और परिवहन के साथ प्रदर्शन किया गया. दिलचस्प बात यह है कि astrocytes से कि लिपिड आवश्यकता 65,66 आगे विट्रो में शामिल है, astrocytes और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के बीच शारीरिक crosstalk की पुष्टि मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं पर LDLR की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है दिखाया गया है. हम फ्लोरोसेंट रंगों के साथ परिवहन उदाहरण देना करने के लिए चुना है ऐसे Cy3 और DiI spectrofluorimetric विश्लेषण सबसे प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है, और इन विट्रो बीबीबी मॉडल में मान्य करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है कि विचार के रूप में. हालांकि, प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव रेडियोधर्मिता से अब तक कम संवेदनशील है और महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोगों की संख्या में वृद्धि की आवश्यकता है.आदर्श रूप में, TF और एलडीएल ऐसे बंधन / तेज और परिवहन प्रयोगों के लिए आम तौर पर (आयोडीन 125) radiolabeled हैं.

हम यह भी प्रस्तावित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त विभेदित endothelial सेल monolayer CCL2 जारी है और बीबीबी खोलने से पता चला, TNF-α द्वारा प्रेरित सूजन का जवाब दिखाते हैं. CCL2 (MCP-1) और उसके रिसेप्टर CCR2 एकाधिक काठिन्य, प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) 67, सीएनएस आघात 68 और neuroinflammatory शर्तों 69,70 के तहत सीएनएस में ल्युकोसैट प्रवास के मध्यस्थों के रूप में जाना जाता है के रूप में सीएनएस विकृतियों में शामिल रहे हैं. बीबीबी उद्घाटन CCL2 एकाग्रता ऊपरी (शिखर) और कम (बेसल) डिब्बों दोनों के बीच संतुलित करने की अनुमति देता है क्योंकि परीक्षण किया प्रोटोकॉल के साथ, हम CCL2 की एक polarized स्राव पर समाप्त नहीं कर सकता. नतीजतन, हम स्पष्ट रूप से 24 घंटे (चित्रा 5A) में शिखर डिब्बे में RBEC द्वारा उत्पादित CCL2 की मात्रा कम.

सामान्य अवलोकन और इन विट्रो मॉडल में बीबीबी की सीमाएं: मैं n विवो बनाम इन विट्रो और कृंतक मानव तुलना बनाम

इन विट्रो में बीबीबी पारित होने में प्रभावी साबित कर दिया कि कई होनहार सीएनएस दवाओं अक्सर मानव के अलावा अन्य प्रजातियों से अलग कक्षों पर आधारित इन विट्रो बीबीबी मॉडल में से कारण predictability की कमी के चिकित्सीय परीक्षण में विफल रहा है. यह प्रोटीन नेटवर्क, संकेत पारगमन, ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स की यंत्रवत पहलुओं का अध्ययन करने के लिए आता है जब हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल शायद अधिक भविष्य कहनेवाला हैं. इन विट्रो में अध्ययन किया जा हर तंत्र, मार्ग या लक्ष्य एक ही जानवरों की प्रजातियों के साथ पूरक पर्यावरण cues (अन्य प्रकार की कोशिकाओं, रसायन, प्रोटीन) द्वारा अपने विनियमन के लिए विशेषता और सीटू के अध्ययन में संयुक्त करने के लिए किया जाना है, और प्रतिबंध और सावधानी के साथ, मनुष्य से अलग microvessels और endothelial कोशिकाओं के साथ, संभव नीचे पैदा की है.

इन विट्रो में बीबीबी मॉडल शरीर विनियमन से अलग स्वायत्त प्रणाली, के रूप में देखा जाना है, लेकिन अभी भी प्रमुख vivo में गुण और पर्यावरण cues द्वारा विनियमन के लिए एक क्षमता के साथ संपन्न. Endothelial सेल monolayers न्यूरो glia संवहनी इकाई (NGVU) के महत्वपूर्ण घटकों में से एक संख्या की कमी और रक्त और शरीर विनियमन से अलग कर रहे हैं क्योंकि कोई 'आदर्श' इन विट्रो बीबीबी मॉडल अभी तक 71,72,73 प्रस्ताव किया गया है. pericytes 74,16 या न्यूरॉन्स 17,18 या प्लास्टिक कोटिंग या endothelial पर आधारित सबसे आम है और "सबसे आसान बना दिया" इन विट्रो बीबीबी मॉडल में सेल के विकास के लिए इस्तेमाल संस्कृति मध्यम और सीरम के लिए इस्तेमाल बाह्य मैट्रिक्स के विभिन्न घटकों की कमी astrocytes के साथ भेदभाव कोशिकाओं प्रोटीन अभिव्यक्ति मैं मिलाना सकता हैएन vivo स्थिति 75 के साथ तुलना. इन मॉडलों को विवो में प्रदर्शित कई ट्रांसपोर्टरों व्यक्त नहीं, बल्कि सभी सकती है. कुछ मामलों में, परिवहन मापदंडों पहले पृथक microvessels (vivo स्थिति के लिए निकटतम) में सत्यापित किया गया, और फिर सेल संस्कृति प्रणालियों 76,61 में अध्ययन किया.

आण्विक जीव विज्ञान अनुसंधान की अनुमति दी है एक ही प्रजाति से अलग microvessels और कम बीतने endothelial सेल संस्कृतियों में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लक्षण, और विभिन्न प्रजातियों के बीच, सबसे अधिक बार इस तरह कृन्तकों (चूहों और चूहों) के रूप में या में गाय और सुअर से छोटे जानवरों से मनुष्य 77,78,75,15 की तुलना. Vivo में इन विट्रो मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं में बीच transcriptomic तुलना विभिन्न व्यक्त और सबसे अक्सर काफी विट्रो में downregulated थे कि कई जीन टेप दिखाया. ऐसे टीएफआर और जनसंपर्क के रूप में बाढ़ ट्रांसपोर्टरों एन्कोडिंग देखिएपुटिका तस्करी में फंसा oteins मुख्य रूप से इस तरह की कोशिकाओं में endocytosis और vesicular परिवहन में एक सामान्य कमी का सुझाव दे, सुसंस्कृत मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में downregulated रहे हैं. पवित्रता (puromycin उपचार) और hydrocortisone के साथ उपचार के संदर्भ में संस्कृति हेरफेर एक अधिक "vivo की तरह" जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल 77 बहाल करने में मदद कर सकते हैं. Transcriptomic पढ़ाई भी. मानव endothelial कोशिकाओं और astrocytes के सह संस्कृति से जुड़े इन विट्रो बीबीबी मॉडल 15 में वर्णित किया गया है आगे इन विट्रो बीबीबी मॉडल 75 में कृंतक पर आधारित मानव में दवा तेज पर भविष्यवाणियों उलझा कि प्रजातियों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता चला. प्रासंगिक हालांकि वे पोस्टमार्टम मानव ऊतकों को विनियमित उपयोग की आवश्यकता है और विविधता उम्र, रोगों, और संभवतः चिकित्सा के आधार पर मानव मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की गुणवत्ता / गुण में वहाँ के रूप में, इन मॉडलों के लिए एक नियमित आधार पर लागू करने के लिए और अधिक कठिन हैं treatmenदाताओं की टी. प्रयासों को बेहतर शारीरिक, शारीरिक और vivo में बीबीबी के कार्यात्मक विशेषताओं को पुन: उत्पन्न कि नए इन विट्रो मॉडल विकसित करने के लिए किया जाना है. तीन प्रकार की कोशिकाओं को शामिल सह संस्कृतियों अत्यधिक प्रतिबंधात्मक हैं और नियमित तौर पर लागू करना मुश्किल दिखाई देते हैं. तिथि करने के लिए, सबसे जटिल में इन विट्रो बीबीबी मॉडल, astrocytes के साथ पोत की तरह संगठन शामिल हैं और रक्त प्रवाह 75,79,80,81,82 कि mimics माध्यम की एक प्रवाह में शामिल हैं जो गतिशील इन विट्रो मॉडल (DIV-बीबीबी) कर रहे हैं 83,84,85. मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं एक प्रवाह के संपर्क में हैं, उत्पन्न कतरनी तनाव ऐसी कोशिका विभाजन, भेदभाव, प्रवास और apoptosis के रूप में 80 endothelial सेल फिजियोलॉजी में शामिल विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति मिलाना जो कोशिका की सतह पर mechanotransducers, सक्रिय. में vivo, कतरनी तनाव रक्त प्रवाह द्वारा उत्पन्न की स्थापना परमिट जो सेल से संपर्क करें, पर mitotic गिरफ्तारी के लिए जिम्मेदार हैरक्त वाहिकाओं 80 में endothelial सेल monolayer. सामान्य मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं के जीनोमिक और प्रोटिओमिक विश्लेषण बीबीबी endothelial फिजियोलॉजी 84 में कतरनी तनाव का प्रभाव दिखाया. कतरनी तनाव CYP450 द्वारा मध्यस्थता 75,86, ऑक्सीकरण 75 एंजाइमों और सेल अस्तित्व, endothelial सेल आसंजन के एक उच्च डिग्री, तपका पंप प्रेरण और ट्रांसपोर्टरों 75, ग्लूकोज चयापचय के नियमन की बेहतर ध्रुवीकरण के लिए जिम्मेदार है अभिव्यक्ति में वृद्धि से paracellular पारगम्यता के विनियमन occludin और ZO-1 87,75,80 और फलस्वरूप उच्च तीर की तरह कहनेवाला junctional तत्वों के लिए जीन एन्कोडिंग के चारों ओर 1,500 - 2,000 ओम · सेमी 2, विवो में जाना जाता करने के लिए करीब 79,80 पैरामीटर

जैव प्रौद्योगिकी और दवा उद्योग में, दवाओं या यहां तक ​​कि उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) और पशु प्रयोग कम करने के प्रयासों की नियमित जांच का नेतृत्व कियासेट अप करने के लिए नियमित तौर पर अधिक मुश्किल बने हुए हैं जो मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति के प्रतिस्थापन में प्रयोग की जाने वाली विभिन्न सेल लाइनों का विकास करने के लिए. ज्यादातर मामलों में, मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों रेट्रोवायरल वैक्टर 88,89,75 का उपयोग प्लास्मिड डीएनए के अभिकर्मक से या संक्रमण से या तो, एक immortalizing जीन (SV40 या polyoma वायरस बड़ी टी प्रतिजन या adenovirus E1A) के साथ transduced थे. मस्तिष्क मूल के कई endothelial सेल लाइनों ऐसे RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, टी.आर. BBBs या rBCEC4 चूहा सेल लाइनों 88,75, b.End3 माउस सेल लाइन 90,75, PBMEC/C1 के रूप में विकसित किया गया है - 2 सुअर का सेल लाइन 87,75, और hCMEC/D3 मानव कोशिका लाइन 89,75. अन्य मॉडल ऐसे Madin-डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) या Caco2 सेल लाइनों 12,75 के रूप में गैर मस्तिष्क मूल की कोशिकाओं पर आधारित हैं. विभिन्न मानव मस्तिष्क endothelial सेल लाइनों के बीच, hCMEC/D3 व्यापक रूप से अदालत में तलब किया गया हैडी और 2005 91,92 में अपनी स्थापना के बाद से बीबीबी की एक मॉडल के रूप में सुधार हुआ. प्राथमिक संस्कृतियों, सेल लाइनों वर्तमान फायदे और सीमाओं की तरह. वे प्राथमिक संस्कृतियों से संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं एक विस्तारित जीवन काल है, अच्छी तरह से विशेषता है और बड़े पैमाने पर प्रयोग के बीच reproducibility अनुमति देते हैं. हालांकि, सेल लाइनों, ऊतक विशेष कार्यों खो पर्यावरण विनियमन कम है और इन विवो 75, 89 में कोशिकाओं से काफी अलग एक आणविक फेनोटाइप प्राप्त कर सकते हैं. विशेष रूप से, सेल लाइनों उपस्थित कम जकड़न, कम तीर और शो ट्रांसपोर्टर प्रोफाइल भिन्नता 75,89 से उत्पन्न monolayers. इस प्रकार प्राथमिक कोशिकाओं में पशु प्रयोगों या पढ़ाई अक्सर उनके जोड़ा जटिलता के बावजूद पसंद कर रहे हैं.

Acknowledgments

VECT-HORUS को वित्तीय सहायता Fonds अद्वितीय Interministériel (Fui / MEDUL परियोजना) और करने के लिए VECT-HORUS और Agence Nationale डे ला Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, तदर्थ और PREVENTAD सहयोगी परियोजनाओं) से UMR7259 प्रयोगशाला से स्वीकार किया है . UMR7259 प्रयोगशाला भी CNRS से और ऐक्स मारसैल विश्वविद्यालयों से वित्तीय समर्थन मानता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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References

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Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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