Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Sette opp en Published: June 28, 2014 doi: 10.3791/51278
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Summary

Hensikten med foreliggende studie var å validere reproduserbarheten av en in vitro-modell BBB involverer en rotte syngene ko-kultur av endotelceller og astrocytter. Den endothelial cell monolayer frem teer høy og lav permeabilitet LY. Uttrykk for spesifikke TJ proteiner, ble funksjonelle svar på betennelse og funksjonalitet av transportører og reseptorer vurderes.

Abstract

Den blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​spesifikt regulerer molekylær og cellulær fluks mellom blodet og nervevev. Vårt mål var å utvikle og karakterisere en meget reproduserbar rotte syngene in vitro modell av BBB ved hjelp av ko-kulturer av primære rotte-hjerne endotel celler (RBEC) og astrocytter å studere reseptorer som er involvert i transcytosis tvers av endotelial cellemonolaget. Astrocytter ble isolert ved mekanisk disseksjon følgende trypsin fordøyelse og ble frosset for senere ko-kulturen. RBEC ble isolert fra 5-ukers gamle rotte cortices. Hjernene ble rengjort av hjernehinnene og hvit substans, og mekanisk dissosiert etter enzymatisk fordøyelse. Deretter ble vevet homogenatet sentrifugert i bovin-serum-albumin for å skille fartøy fragmenter fra nervevev. Fartøyet fragmenter gikk en andre enzymatiske fordøyelsen til gratis endotelceller fra sin ekstracellulære matrise. De resterende kontaminerende celler slik som pericytes ble further elimineres ved plating de microvessel fragmenter i puromycin-holdig medium. De ble deretter passaged til filtre for ko-kultur med astrocytter dyrket på bunnen av brønnene. RBEC uttrykte høye nivåer av tight junction (TJ) proteiner som occludin, claudin-5 og ZO-en med en typisk lokalisering på cellekantene. Den transendothelial elektrisk motstand (Teer) av hjernen endothelial monolayers, indikerer tetthet av TJs nådd 300 ohm · cm 2 i gjennomsnitt. De endothelial permeabilitet koeffisienter (PE) for lucifer gul (LY) var svært reproduserbare med et gjennomsnitt på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotelceller organisert i monolayers uttrykt effluks transportproteinet P-glykoprotein (P-gp), viste en polarisert transport av rhodamin 123, en ligand for P-gp, og viste konkret transport av transferrin-Cy3 og DiILDL over endothelial cellemonolag. I konklusjonen, gir vi en protokoll for å sette opp en in vitroBBB modell som er svært reproduserbare grunn av kvalitetssikringsmetoder, og som er egnet for forskning på BBB transportører og reseptorer.

Introduction

Mange legemidler utviklet for å behandle sentralnervesystemet (CNS) lidelser er ute av stand til å nå hjernen parenchyma i terapeutisk relevante konsentrasjoner. BBB beskytter hjerne nervevev fra svingninger i plasma sammensetning, fra sykdomsfremkallende midler, og opprettholder homeostase av hjernen parenchyma ved å begrense ikke-spesifikk forandring av ioner, peptider, proteiner og til og med celler inn i og ut av hjernen 1..

BBB egenskaper er indusert og vedlikeholdes av intim nærhet og krysstale mellom de spesialiserte klasse hjernen microvessel endotelceller og nabo elementer av nevro-gliaceller-vaskulær enhet (NGVU) som nevroner, gliaceller (mer presist astrocyte slutt fot), og pericytes ensheathed i basalmembranen, som består hovedsakelig av kollagen type IV, fibronektin, laminin og proteo-glykaner 2,3. Pericytes dekker ca 22 - 32% av endotelet i kapillær nivå og spiller en viktigrolle i reguleringen av endotel proliferasjon, angiogenese og inflammatoriske prosesser. Endoteliale celler danner et sammenhengende ark som dekker den indre overflate av kapillærene. De er innbyrdes forbundet ved TJs, som danner en belte-lignende struktur på den apikale område og som bidrar til celle polarisering. Astrocytter regulere BBB egenskaper og er kilder til viktige regulatoriske faktorer som TGF-β, GDNF, bFGF-og IL-6. Astrocytter mangelfull i GFAP med ufullstendig funksjonalitet er ikke i stand til å regulere BBB egenskaper fire. Neuroner er ikke direkte involvert strukturelt i dannelsen av BBB, men regulerer også viktige aspekter av proteinekspresjon og BBB-5 funksjon.

For ytterligere å studere strukturen, fysiologi og patologi av BBB, ble in vitro-modeller av BBB utviklet som forskningsverktøy. Brain endotelceller er hentet fra ulike arter å gjennomføre in vitro BBB modeller basertpå lav passasje primærkulturer fra storfe 6,7, svin 8,9, rotte 10,11,12, mus 13 og også menneskelig 14,15. Disse modellene er kjent for å etterligne in vivo BBB, spesielt når ko-dyrket med glial-celler fra rotte-eller muse-og / eller pericytes 16,12, og / eller nevrale stamceller avledet astrocytter 17 og / eller 18 nevroner. Den "in Lab"-modeller er ofte produsert fra gnagere, fordi de tillater in vitro / in vivo-eksperimenter og sammenligninger og / eller undersøkelse av hjernen endotelceller produsert fra transgene modeller 19.

Nyutviklet in vitro BBB modeller har også blitt utviklet for å hjelpe forutsi hjerne opptak av potensielle CNS narkotika kandidater før in vivo testing 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB modeller er vanligvis brukes til å sammenligne transport av stoffer som følger: i) kjent penetrasjon inn i CNS eller med low permeabilitet over BBB og ingen sentrale virkning, og ii) den tilsynelatende Pe av de samme stoffer, målt i dyremodeller av samme art. De medikamenter som lett passerer BBB er stort sett lipofilt og krysser hjerne endotel-cellemembraner ved lipid-mediert fri diffusjon (koffein, karbamazepin, etc.). De negativt transportert narkotika som digoksin, verapamil eller ciklosporin A er aktivt ekstrudert av hjernen endothelial frigivelshastigheter transportører som P-gp. Imidlertid er mange av de nylig utviklede terapeutiske molekyler er Biopharmaceuticals, slik som rekombinante proteiner, siRNAs eller monoklonale antistoffer. De fleste av dem ikke krysse BBB skyldes: i) fravær av spesifikke transportører, og ii) en tettpakket lag av endotelceller, som hindrer høymolekylære molekyler fra gjennomgår paracellular passasje. Med disse begrensningene, "trojansk hest" strategier har blitt gjennomført ved hjelp av vektorer (antistoffer, peptider) mot kjente reseptorer på BBB, involvert in reseptor-mediert transport eller transcytosis (RMT), slik som transferrin (Tf)-reseptor (TfR), insulinreseptor (IR), eller medlemmer av LDL-reseptoren (LDLR)-relaterte reseptor-familien (LDLR, LRP1). Slike reseptorer er blitt funnet på isolerte hjerne kapillarer og i BBB in vivo 24,25. Transkripsjons profiler for disse reseptorene, spesielt de av LDLR familien, ble analysert og sammenlignet mellom hjerne endotelceller og hjerne endotelceller co-kultivert med astrocytter eller i hjernen kapillærer direkte etter sin utvinning fra hjernen 26. Pardridge 24 åpnet feltet med OX-26 antistoff mot transferrin-reseptoren (TfR), etterfulgt av antistoffer mot insulin-reseptoren og insulinvekstfaktor-reseptor 27,28. Med disse antistoffbaserte vektorer, har ArmaGen Technologies utviklet en BBB molekylær trojansk hest plattform-teknologi for å levere narkotika, blant annet proteiner, over BBB 29. Denlitteratur er rik på data som viser LRP1 uttrykk i hjernen endotelceller og dens rolle som en kraftig endocytic / gatefeier reseptoren. Western blot analyse antydet at LRP1 er uttrykt i fraksjoner beriket i hjernen kapillærer og i rottehjerne kapillære endotelceller 30. Selskaper som Angiochem target LRP1 med peptid vektorer avledet fra aprotinin som fremmer effektiv narkotika tilstrømningen over BBB 31. Imidlertid er LRP1 også involvert i aktiv transport av Aβ og dens effluks / klarering fra hjernen parenchyma til blod 32. Slike data involvere LRP1 i en toveis transport over BBB avhengig av sine ligander. biOasis utvikler Transcend teknologien bruker et protein melanotransferrin for transport av biologiske som lysosomale enzymer og antistoffer over BBB 33 mens Vect-HORUS utvikler peptid vektorer som er rettet mot LDLR 34. Det er data som tyder på at LRP og LDLR kan brukes til å transportere different molekyler som lysosomale enzymer 35,36 eller nanopartikkel komplekser over BBB 37.

Vår felt av interesse er for levering av legemidler til CNS ved bruk av vektormolekyler og vektorisert medikamentkandidater for behandling av CNS-lidelser. Spesielt har levering av legemidler over BBB ansees å være innenfor rammen av nevroinflammasjon, en prosess som kan variere i sin utstrekning, men det er sannsynligvis felles for alle CNS-skader og sykdommer, inkludert encefalitt, multippel sklerose, Alzheimers sykdom osv. nevroinflammasjon er assosiert med BBB betennelse og potensielt med endringer i BBB fysiologi og permeabilitet vurderer at paracellular og transcellular transport kan bli forsterket i patologiske tilstander 38,39,40,41,42,43. For eksempel, TNF-α, tweak, og andre cytokiner modulere betennelse, og eksperimenter med in vitro BBB modeller har vist at de kan endre de paracellular egenskapene til the endothelial cell monolayer 38,39,40, og at TNF-α fører også til en økning i transcellular transport av LDL 41, holotransferrin 42 og 43 laktoferrin.

Vårt mål var å utvikle og prege en optimalisert og svært reproduserbare rotte syngene BBB-modellen ved hjelp av co-kulturer av primære hjerne endotelceller og astrocytter. Vi brukte fem uker gamle og neonatale Wistar rotter for hjernen endotelceller produksjon og astrocyte produksjon henholdsvis. En utfordring er å opprette en protokoll som tillater produksjon av "ukentlig reproduserbare" BBB-modeller. For å nå dette målet, ble hvert trinn i produksjons protokollen utføres på faste dager i uken, fra hjernen microvessel produksjon på onsdag av den første uken. Disseksjoner ble utført nesten hver uke i løpet av de siste tre årene. For ytterligere å forbedre reproduserbarhet av kulturer, ble et kvalitetssystem etablert. Alle Reagents og kjemikalier ble referert i en database (datoen for innreise, lager, utløps sikt, etc.).

Modellen var preget etter en rekke kriterier, som for eksempel endotelceller organisasjon og renhet, Teer, LY permeabilitet, respons på pro-inflammatorisk agenter, kvalitative og kvantitative uttrykk for TJ proteiner, funksjonaliteten frigivelshastigheter transportører som P-gp, og reseptorer involvert i transcytosis tvers av endotelial cellemonolaget som TfR eller LDLR.

Protocol

1. Produksjon av Rat Astrocytes

For hver forberedelse bruke 10 nyfødte Wistar rotter av begge kjønn.

  1. Sacrifice rottene ved å kutte hoder med en saks og overføre dem umiddelbart i en tørr petriskål under en laminær hette. Fjern hjernene fra skallen uten cerebellum og overføre dem umiddelbart inn i en petriskål inneholdende kald disseksjon buffer: HBSS supplert med 1% bovint serumalbumin (lavt nivå av endotoksin BSA), penicillin 100 enheter / ml og streptomycin 100 ug / ml.
  2. Skjær hjernen i to, for å skille de to hjernehalvkuler og overføre dem til en ren petriskål med disseksjon buffer på is. Skjær synsnerven og fjerne hjernehinnene under et stereomikroskop.
  3. Vask de kortikale deler omfattende i 50 ml kald buffer disseksjon.
  4. Plasser de kortikale stykker fra tre hjerner til en 15 ml Falcon rør og distansere ved pipettering opp og ned et kupple ganger med en 10 ml engangspipette utstyrt med et blått spiss inn i 6 ml av 0,05% trypsin - EDTA 0,02% i 5 min ved 37 ° C.
  5. Til 24 ml av DMEM supplert med 10% FBS og følgende antibiotika, penicillin 100 enheter / ml og streptomycin 100 ug / ml, en media heter glial cellemedium (GCM) og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved RT. FBS grupper ble valgt ut og validert for vekst og overlevelse av astrocyte cutures.
  6. Resuspender pelleten inneholdende de dissosierte cellene i 10 ml GCM og plate i en 75 cm to-T-kolbe (T75). Endre medium dagen etter for å fjerne celleavfall og DNA. Sett på kultur media to ganger i uken.
  7. Etter en uke med spredning, rister forsiktig på gliacellene med en orbital shaker på 60 rpm i løpet av 24 timer ved 37 ° C i GCM. Hvis T75 ikke kan plasseres i en inkubator med 5% CO 2/95% luft ved 37 ° C fuktet atmosfære, supplere media med 5 mM HEPES. Vask cellene to ganger for å rEDra ikke-adherente mikrogliale celler.
  8. Tre uker etter såing, vaskes cellene to ganger med DPBS uten kalsium og magnesium. Tilsett 3 ml varm 0,05% trypsin-EDTA 0,02%, inkuberes ved 37 ° C og vente til cellelaget er dispergert (vanligvis 5 minutter). Hemme trypsin-aktivitet ved tilsetning av 10 ml av GCM, overføre cellesuspensjonen til en 15 ml Falcon rør og sentrifuger ved 120 x g i 8 min.
  9. Resuspender astrocyte pellet i 90% FBS - 10% DMSO, overføre dem til cryovials (2 x 10 6 celler per cryovial) og lagrer i flytende nitrogen.

2. Isolering av rottehjerne microvessels

Våre eksperimentelle prosedyrer er godkjent av etikkomiteen ved det medisinske fakultet Marseille og i samsvar med nasjonale og europeiske bestemmelser (EUs direktiv nr. 86/609). Alle forsøk ble gjort for å minimalisere dyret lidelser og reduserer antall dyr benyttet.

  1. For hver forberedelse og for ett Experimenter, bruker tre fem uker gamle Wistar rotter.
  2. Mandag av den første uken, klar 2 T75-kolber ved å belegge med kollagen type IV og fibronektin, både på 1 mikrogram / ​​cm 2 i sterilt kulturvann (10 ml pr T75). Tillat å følge ved 37 ° C før microvessel seeding.
  3. Onsdag morgen av den første uken, avlive rottene under en økende strøm av CO 2 for å fremkalle søvnighet, tap av kroppsholdning og pusteavbrudd, deretter fulgt av en halshugging. Spray hodene med 70% etanol. Skjær hodene med en saks og overføre dem til en tørr petriskål under en laminær hette.
  4. Fjern hjernene fra skallen uten cerebellum og de optiske nerver og deretter overføre dem til en petriskål avkjølt på is og fylt med kaldt disseksjon buffer (HBSS supplert med 1% BSA, penicillin 100 enheter / ml og streptomycin 100 ug / ml) .
  5. Skjær hjernen i to for å skille de to hjernehalvkuler og separat midthjernen fra forebrain. Overfør forebrains i en ren petriskål på isen med disseksjon buffer.
  6. Ta et par halvkuler i en ny petriskål med kaldt disseksjon buffer for å forsiktig fjerne hjernehinnene fra forebrains under et stereomikroskop med N ° 5 buede tang. Deretter rengjøre innsiden av hjernen for å fjerne dyne av myelin og få et skall av cortex. Disse trinnene bør ikke ta mer enn to timer for vev bevaring og celle overlevelse.
  7. Dissosiere cortex fra 3 hjerner i 6 ml kald disseksjon buffer i et 7 ml Douce-homogenisator med 10 slag opp og ned med hver av to pestles av forskjellige klaringer, 71 mikrometer, etterfulgt av 20 mikrometer.
  8. Fordel suspensjonen for å oppnå den tilsvarende 1 cortex i 1 ml av en 50 ml Falcon rør og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min ved RT. Kast supernatanten.
  9. Fordøy suspensjonen fra en cortex med 1 ml av en enzymoppløsning inneholdende en blanding av kollagenaser / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase type I (35 mg / ml - 20 K enheter / ml) og gentamicin (50 pg / ml) i en ristemaskin i 30 min ved 37 ° C.
  10. Bland 1 ml fordøye fra en cortex med 10 ml 25% BSA / HBSS 1X og atskilt ved tetthetsavhengig sentrifugering ved 3600 xg i 15 min ved RT. Overføre forsiktig det øvre skiven (myelin og hjernen parenchyma) og supernatanten til et rent 50 ml Falcon rør og gjenta sentrifugering. Hold den resulterende pellet inneholdende hjerne microvessels ved 4 ° C.
  11. Forkaste nøye øvre disken og supernatanten. Resuspender begge resulterende pellets inneholdhjerne microvessels med 1 ml kald HBSS 1X og overfør til et rent 50 ml Falcon-røret.
  12. Vask microvessels ved tilsetning av 20 ml kald HBSS 1X og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min. Kast supernatanten.
  13. Ytterligere fordøye microvessels fra en cortex med 1 ml av den samme enzymatiske løsning som er beskrevet i trinn 2,9 i løpet av 1 time ved 37 ° C i en shaker.
  14. Deretter blandes de fordøyde microvessels fra hver av de tre cortices i ett rør og videre dele opp i to 50 ml Falcon-rør for å oppnå microvessels trukket ut fra tilsvarende ett og et halvt (1.5) cortex per rør. Tilsett 30 ml kald buffer disseksjon og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min ved RT.
  15. Resuspender microvessel pelleten i 10 ml DMEM/F12 supplert med 20% bovint blodplatefattig plasma-avledet serum, basic fibroblast vekstfaktor (bFGF, 2 ng / ml), heparin (100 ug / ml), gentamicin (50 pg / ml) og HEPES (2,5 mM), oppkalt endotelial cellemateriale (ECM) supplert med puromycin ved 4 ug / ml.
  16. Ta de to belagte T75 kolber fra inkubatoren, aspirer overkant av belegg og plate microvessels fra hvert rør i en T75 kolbe (microvessels utvunnet fra 1,5 cortex per T75 kolbe).

Tre. Rensing og spredning av RBEC Primocultures

  1. Rensing: Onsdag til fredag, legge puromycin ved 4 ug / ml i kulturmediene. Endre medium på torsdag. På fredag, vaske cellene og legge puromycin på 2 mikrogram / ml før mandag.
  2. Spredning: på mandag av den andre uken, vaske cellene og legge insulin, transferrin og natriumselenitt supplement til kultur media før de kulturene nå 90% samløpet på onsdag av den andre uken.

. 4 Differensiering: Sette opp In Vitro BBB Model

  1. Mandag av den andre uken, klar filtre (polyetylen, 12 brønner, porestørrelse 1,0 mm) ved å belegge med en blanding av kollagen type IV og fibronektin både ved 0.5μg/cm 2 i sterilt kulturvann (500 mL av blandingen i det øvre kammer og 1,5 ml sterilt kulturvann i det nedre kammer). Tillat å følge ved 37 ° C før RBEC seeding.
  2. Mandag av den andre uken, fem dager før etableringen av co-kultur, tine astrocytter fra cryovials ved 37 ° C og overføringi en 15 ml Falcon med 10 ml GCM. Sentrifuger suspensjonen ved 120 x g i 8 min ved RT.
  3. Resuspender pellet i astrocyte GCM og plate ved en tetthet på 30 x 10 3 celler per cm2 i 12-brønns plater.
  4. Onsdag av den andre uken, like før dissosiasjon av RBEC med trypsin, vaskes to ganger det forhåndsbelagt filter med DMEM/F12 medium. Pre-fylle kamrene med ECM: 1,5 ml i det nedre rom og 0,5 ml i det øvre kammer.
  5. Onsdag av den andre uken, vask to ganger i RBEC med DPBS uten kalsium og magnesium. Tilsett 4 ml varmt trypsin 0,05% - 0,02% EDTA-løsning ved 37 ° C pr T75 kolbe i løpet av 30 sek nøyaktig. Deretter fjernes 3,5 ml av trypsin-løsning og observere under mikroskopet. Når celleskiktet begynner å løsne fra matrisen, hjelpe dem ved å banke forsiktig på kanten av T75 kolbe inntil alle celler er flytende.
  6. Legg 9 ml ECM per T75 kolbe og overfør til en 15 ml Falcon rør. Veldig forsiktig distansere cellensuspensjonen ved å pipettere opp og ned fire ganger med en 10 ml pipette utstyrt med en gul spiss (unngå produksjon av bobler i løsningen). Tell cellene i suspensjonen (ca. 3 x 10 6 cells/T75) og umiddelbart plate på pre-belagte og ferdigfylte filtre ved en høy tetthet (160 x 10 tre celler / filter derav ca 18 filters/T75) (figur 8 ). Den følgende dag (torsdag), endrer det dobbelte av mediet i det øvre kammeret for å fjerne celleavfall.
  7. Torsdag av den andre uken, dagen før etableringen av co-kulturen, erstatte astrocyte kultur media med 1,5 ml av differensiering media (ECM med hydrokortison på 500 nM) som kan bli supplert med 1/3 aircondition medium fra basal rommet av en tidligere co-kultur (3 dager for kontakt mellom endotelceller og astrocytter).
  8. Fredag ​​av den andre uken er definert som dag 0 av differensiering; erstatte kultur media fra filtre Containing den RBEC med differensiering media. Overfør RBEC filtre i brønnene inneholder astrocytter. Under disse forholdene, in vitro-modeller differensiere og uttrykke koblingsrelaterte proteiner innen tre dager.
  9. Modellene holde optimal differensiering i løpet av tre dager, mellom mandag og onsdag i den tredje uken.

Representative Results

Produksjons Protocol
Protokollen kan deles inn i tre faser svarende til store endringer i vekstmedium sammensetning: (a) rensing av endotelceller fra microvessels, (b) spredning, og (c) differensiering av filtre (12-brønns plater av polyetylen med en porøsitet 1 mikrometer) i co-kultur med astrocytter. De forskjellige trinn i fremstillings-forskriften ble tildelt bestemte dager i uken for å øke reproduserbarheten av de primære cellekulturer (fig. 1). På onsdag av den første uken, derav 9 dager før etablering av den ko-kultur-system, ble microvessels isolert (figur 2A). For å rense endotelceller ble kulturene holdt i nærvær av avtagende konsentrasjoner av puromycin i 5 dager. De kontaminerende celler (hovedsakelig pericytes) ble fjernet og vekst av endotel-celler var langsommere uten modifisering av deres fenotype. Spindel-shaped celler vokse ut av kapillære fragmenter isolert fra rottehjerne grå materie (figur 2B). På mandag av den andre uken ble rotte astrocytter belagt på undersiden av 12-brønners plater. Onsdag, RBEC ble tilsatt til den luminale rommet av filtrene. High density seeding ved 160 x 10 tre celler / cm 2 (figur 2C) bidrar til å unngå mellomrom på omkretsen av filter (fig. 2D) og genererer en homogen differensiering av endoteliale cellemonolaget. Cellene viser en typisk langstrakt spindel formet morfologi, justeres i lengderetningen og danne et ensartet monolag. Torsdag, astrocyte kultur medium ble endret for differensiering medium betinget med forrige co-kultur media (figur 2E). Fredag, RBEC på filtrene ble dyrket i kulturmedium inneholdende 500 nM hydrokortison, og filtrene ble overført til 12-brønners plater inneholdende astrocytter. På den tredje uke, eksperimenter were utført mellom mandag og onsdag.

RBEC Karakterisering og bestemme Elementer av ett lag Permeabilitet
Den RBEC ble preget av farging av endotelceller og BBB markører samt ved målinger av Teer, permeabilitet av LY og funksjonalitet av effluks transportører som P-gp.

RBEC oppnådd ved puromycin rensemetode (figur 1 og 2) ble i ikke-overlappende sammenhengende monolag som viste vekst inhibisjon ved sammenløpet og vist tett apposed, fusiform og spindelformet morfologi. RBEC kulturer uttrykt typiske markører for endotelceller: de viste positiv farging for blodplate endothelial celleadhesjonsmolekylet (figur 3A; CD31/PECAM) og uttrykk for von Willebrand faktor (Figur 3B). Uten puromycin behandling, er RBECs raskt invadert av pericytes oppdaget av desmin immunosholdende (Figur 3C). Glial fibrillary surt protein (GFAP) uttrykt ved astrocytter (Figur 3D) er en viktig differensiering markør for astrocytter. Med høy passasje nummer, astrocytter mister sin evne til å indusere differensieringen av de endotelcellene. Av denne grunn ble astrocyte kulturer standardisert for sin tid av kultur og bare gjennomgikk en passasje.

Dyrking RBEC med media supplert med hydrokortison, fulgt av ko-kultur med astrocytter og med kondisjonert medium fra det nedre rom av tidligere ko-kulturer førte til sterk induksjon av interendothelial TJs i forhold til RBEC dyrket alene. Cellene uttrykt claudin-5 ZO-1 og occludin proteiner, som ble lokalisert ved celle-celle kryss, som vist ved immunfluorescens (figur 4B-D), og som viser seg ved western blot analyse for ZO-1 og occludin proteiner (figur 4E ). Den morfologiske fordeling på cell-til-celle-kontakter i en glidelås-lignende konfigurasjon reflekterer (a) tettheten av de monolaget, (b) den cerebrale opprinnelsen av de kapillære endotelceller, og (c) er karakteristisk for sterkt differensierte cerebrale endotelceller. Paracellular permeabilitet av endotelial laget ble overvåket ved å måle teer og hastigheten av tilstrømningen av LY (457 Da) fra det øvre til det nedre rom av filtrene. Teer ble målt ved hjelp av en ENDOHM-12 for 12 mm kultur kopper koblet til en EVOM voltohmmeter. Den teer av hjerne endoteliale monolag, som indikerer tettheten av TJs nådde 300 ohm · cm 2 i snitt (filtre av 12 brønners plater, data ikke vist). Den Pe for LY (Pe (LY), benyttes som en integritetskontroll av barrieren og co-inkubert med testede forbindelser) nådde et gjennomsnitt på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (figur 4F) i løpet av 1 år.

For å indusere betennelse i RBEC brukte vi pro-inflammatoriske cytokiner TNF-α på 5 ng / ml til 24 timer, og etterfulgt inflammatorisk respons ved å måle CCL2 (MCP-1) sekresjon av RBEC i det øvre kammer av kultursystemet som ble doblet fra 120 ng / ml (ikke- behandlet kontroll) til 250 ng / ml (figur 5A). TNF-α behandling på 5 ng / ml eller 50 ng / ml for 24 hr også åpnet BBB som åpenbart av Pe (LY) målingen (Figur 5B).

P-gp ble visualisert i differensiert RBEC etter immunocytochemistry (Figur 6A). P-gp lokalisering er kjent for å være sterkt polarisert og uttrykt i det vesentlige i den apikale membran av endotelceller 44 mens Glutamat transportør-en (GLT-1) er i hovedsak funnet i basolateral fraksjon 45.. For å vurdere omfanget av polarisering av vår kultivert RBEC, ble apikale og basolateral proteiner skilles fra forberedelsene plasma membran ved hjelp av sukrose tetthetsgradienter 46. Western blot analyse varutført for å vurdere uttrykk nivåer av P-gp og GLT-1 i plasma, apikale og basale forberedelser membran. Microvessels ferskt ekstrahert fra rottehjerne ble brukt som positive kontroller det nærmeste til in vivo-fordelingen av disse proteinene (figur 6B). I begge microvessels og differensierte preparater RBEC membran, ble P-gp uttrykt som et bånd på 170 kD, lokalisert hovedsakelig i F1 apikale membran fraksjon (figur 6B, C). GLT-1 uttrykk ble faktisk uttrykt i F3 basalmembranen brøkdel av microvessels som et band av 65-70 kDa, men ble ikke oppdaget i den kultiverte RBEC.

I parallelle forsøk ble den funksjonelle aktiviteten av P-gp i det endoteliale cellemonolaget ble testet med rhodamin 123 (R123) som en ligand. Den abluminal til luminal (B til A) effluks av R123 var 1,7 ganger høyere enn i den motsatte retningen (figur 6D). For å bevise P-gp engasjement, brukte vi bestemte P-gp-hemmere, verapamil (25 mM, 30 min preinkubering) og cyklosporin A (1 uM, 30 min preinkubering). Med verapamil og cyklosporin-behandling, ble R123 akkumulering i RBEC økt 1,6 ganger og to ganger med henholdsvis, sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe (fig. 6E).

Reseptorer involvert i reseptormedierte transcytosis (RMT) Mekanismer
Modellen ble videre karakterisert for ekspresjon av forskjellige reseptorer potensielt er involvert i transcytosis mekanismer ved BBB, slik som LRP1, LDLR eller TfR (figur 7A).

Funksjonelle transportstudier ble gjennomført med ligander for TfR og LDLR. Lever RBEC ble inkubert med rotte transferrin merket med Cy3 (Tf-Cy3) på 180 min ved 37 ° C (figur 7B, C). Kvantifisering av Tf-Cy3 opptak og transport hos rotte in vitro BBB-modellen viste at hellingen av kurvene litt redusert utover 2,400 picomols (figur 7B), noe som tyder på at binding / opptak var mettet. Videre ble metning av binding / opptak korrelert med akkumulering av Tf i det nedre rom. For å bekrefte denne observasjonen, ble Tf-Cy3 inkuberes ved 1200 picomol (stigende delen av kurven) med et overskudd av ikke-fluorescerende Tf på 4800 picomol (platå / saturation) (figur 7C). Disse eksperimenter viste en reduksjon av Tf-Cy3 akkumulering i det nedre rom og bekreftet en mettbar mekanisme som er typisk for ligand-reseptor-interaksjon i våre in vitro BBB-modellen.

På samme måte ble LDLR funksjonalitet demonstrert ved opptak og transport av sin ligand DiILDL tvers av endotelial cellemonolaget (figur 7D, E). Levende RBEC ble inkubert med DiILDL i 30 min ved 37 ° C. Bindingen / opptaket ble ikke korrelert med akkumulering av DiILDL i det nedre rom (figur 7D). Kvantifisering av DiILDL transport viste at helningen på kurvene sank utover 2 mikrogram, noe som tyder på at transporten var mettet og reseptor-relatert i vår modell. Natriumazid ble tilsatt i 0,05%, 15 min før DiILDL inkubasjon (figur 7E). Mangelen på toksisitet av natriumazid inkubering ved 0,05% ble vurdert av Pe (LY) måling (data ikke vist). Disse eksperimenter viste redusert DiILDL opphopning i det nedre rom. Overall, våre resultater tyder på RMT for DiILDL i vår in vitro BBB modell.

Andre In Vitro BBB modeller basert på endotelceller fra Rat ryggmargen eller mus Brain
Enzymatisk nedbryting med en blanding av kollagenaser / dispase er en av de viktigste parametre for å kontrollere med hensyn til cellenes levedyktighet og produksjonen utbytte av cerebrale microvessels. Konsentrasjonen av enzym og mer viktig at forholdet mellom mengden av enzym i forhold til vevet, needs kalibreres nøyaktig mellom rottehjerne, rotte ryggmarg og hjerne mus. Microvessel seeding tetthet og antall av endotelceller til å nå 90% sammenløpet (9 dager etter microvessel seeding) ble koblet sammen, og er viktige parametre for å forbedre cellevekst, begrenser antallet av populasjons-fordoblings og kvaliteten av modellene. Rotte ryggmargs microvessels ble fremstilt med den samme protokoll som den som er beskrevet her for rottehjerne microvessels (i form av vev beløp, to ryggmargen svarende omtrent til en hjerne) for å oppnå den samme mengde celler pr T75 kolbe innenfor samme tidsskala . Hjernehinnene fra 5 uker gamle C57Bl6 mus hjernen var vanskelig å fjerne fordi de holde seg til hjernebarken. En kort behandling av hjernen med dispase ser ut til å lette fjerning av hjernehinnene. De viktigste parametrene som bidrar til produksjon av reproduserbare endotelcelle monolayers fra rottehjerne, rotte ryggmarg og mus hjernen er uthevet og oppsummert iFigur 8.

Figur 1
Figur 1. Flytskjema som oppsummerer hovedtrinnene i den in vitro-modell BBB preparat. De forskjellige trinn i fremstillings-forskriften ble tildelt bestemte dager i uken for å øke reproduserbarheten av de primære endoteliale cellekulturer. Protokollen starter på onsdag av den første uke, med microvessel produksjon fra 5 uker gamle Wistar-rotter.

Fig. 2
Figur 2. Fase kontrast photomicrographs av RBEC, astrocytter og co-kultur system. (A) 5 uker gamle Wistar-rotte microvessel fragmenter på tidspunktet for pletteringen.(B) Tre dagers gamle RBEC kulturer behandlet for to dager med P-gp substrat puromycin på 4 mikrogram / ​​ml. (C) Pure konfluente endothelial monolayers på dag 1 etter plating på Millipore filtre av en 12 brønners plate belagt med kollagen type IV og fibronektin. (D) Homogenitet av cellemonolaget ved periferien av innsatsen filteret. (E) Sammenflytende astrocyte kultur på dagen for etablering av ko-kultur som viser karakterisert honeycomb morfologi. (F) Reaksjonsskjema som representerer ko-kulturen systemet med lokaliseringen av mikrofotografiene i C, D og E.

Figur 3
Fig. 3. Karakterisering av RBEC kulturer ved immunfluorescens mikroskopi. (A) Brain endoteliale celler uttrykker blodplate endotelcelleadhesjonsmolekyl PECAM/CD31 ved cellekanten, (B), von Willebrand faktor (VWF), viser et forholdsvis punktformet flekk, lysere og mer aggregert i enkelte celler enn andre, og konsentrert i oppklaring rundt kjernen sonen. (C) Uten puromycin behandling av RBEC kulturer, er pericytes oppdaget med en positiv farging for desmin (i grønt) og har karakteristiske små runde kjerner. (D) Astrocytes uttrykke glial fibrillary surt protein (GFAP). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4 Immunocytochemical karakterisering av rotte in vitro BBB modellen og paracellular permeabilitet.LY tvers av endotelial monolag Den cellemonosjikt ble immunostained med (A) vimentin for å avdekke en konfluent hjerne endotelial cellemonolaget med ikke-overlappende morfologi og typisk spindelformede celler med endotelial morfologi og ekspresjon av stramme koblings proteiner. (B) claudin-5 , (C) ZO-1, og (D) occludin, også påvises ved western blot for ZO-1 og occludin proteiner (E). (F) med ett lag tetthet i 12-brønns BBB-modellen ble vurdert ved å måle transport av Lucifer gult (LY-CH, dilitium-salt), en liten hydrofilt molekyl (MW 457 Da) kjent for å bli beholdt av BBB. Kort, LY ble inkubert i den øvre avdeling av kultursystemet i kontakt med cerebral endotelceller i 60 min ved 37 ° C. Etter denne tid, ble mediet i det nedre kammeret samles opp og fluorescens ble kvantifisert ved fluorimetrisk analyse med en spectrofluorimeteh med eksitasjon ved 430 nm, og utslipp på 535 nm. Resultatene er uttrykt i permeabiliteten eller Pe i 10 -3 cm / min. Barrieren er ansett permeable eller åpen når Pe av LY er over 0.6x10 -3 cm / min. I løpet av hvert eksperiment 1 time, ble den gjennomsnittlige erte volum plottet mot tid, og helningen beregnet ved lineær regresjonsanalyse. Helningen på klaring kurve for kontroll filtre med kollagen type IV-fibronek belegg ble betegnet PSF og helningen på klaring kurve for filtre med hjernen endothelial cellemonolagene ble betegnet PST. PS verdi for endothelial monolayer (PSE) ble beregnet fra: Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ligning 1

PSE-verdiene ble dividert med arealet av den porlige membran (1.1 cm 2 for Millipore filter av 12-brønners plater), og resultatet var permeabiliteten koeffisient (Pe) med et gjennomsnitt på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Resultatene er presentert med en vertikal spredningsdiagram representasjon for n = 90 analyser (gjennomsnitt n = 3 til n = 6 monolayers per assay).

Figur 5
Figur 5. In vitro BBB modell respons på behandling med pro-inflammatorisk middel TNF-α. Kulturen mediet fra kultursystemet ble erstattet like før TNF-α-behandling på 5 ng / ml i det øvre kammer i 6 timer, 12 hr og 24 timer. CCL2 frigjøring av RBEC ble kvantifisert i det øvre kammer ved hjelp av ELISA-analysen sammenlignet med ikke-behandlet kontroll. Legg merke til at MCP-1 nivåene øker svakt som en funksjon av tiden, Selv i de ikke-behandlede brønner. Integriteten til endotelial cellebarrieren målt ved endotelial Pe for LY Pe (LY) viste en økning i monolag permeabilitet etter 24 timers behandling med TNF-α ved 5 ng / ml eller 50 ng / ml i området fra 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 cm / min, og 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min henholdsvis, sammenlignet med kontrollen på 0,33 ± 0,03 x 10 -3 cm / min (Student t-test, p <0,05).

Figur 6
Figur 6. Funksjonalitet av P-gp effluks transportør og RBEC polarisering. Expression av effluks transportproteinet P-gp i hjerne endotelceller co-dyrkede med astrocytter etter immunocytochemistry (A) og western blot (B & C). Cellemembran proteiner ble ekstrahert med en mobil protein fractionasjon kit. Plasma-membraner ble fremstilt ved hypotoniske lysis og differensialsentrifugering for å eliminere organeller og kjerner. Separasjon av apikal-og basolateral proteiner fra plasmamembraner ble oppnådd ved sukrose-densitets-gradient. P-gp var hovedsakelig lokalisert i den apikale fraksjonen (F1), mens Glutamat transporter-1 (GLT-1) var hovedsakelig lokalisert i basolateral fraksjonen (F3). Rensede microvessels før pletteringen ble anvendt som kontroll for den in vivo lokalisering av disse proteinene. Aktiviteten av P-gp ble bestemt ved å måle transport polariteten til R123, en P-gp ligand. Fluksen av 1 uM R123 ble målt i 1 time ved 37 ° C i luminal-til-abluminal (A til B) og i de motsatte abluminal-til-luminal (B til A) retninger. Det samme eksperiment ble realisert uten RBEC å vurdere passiv diffusjon over innsatsens filteret og data ble normalisert relativt til denne verdi for Pe (R123) beregning (se Figur 5 (R123) (A til B). Verapamil (25 uM, 30 min preinkubering) og cyklosporin A (1 uM, 30 min preinkubering) ble anvendt som referanse P-gp-inhibitorer. R123 opphopning i RBEC ble målt etter 2 timer med eller uten preinkubasjon med P-gp-hemmere (Student t test, p <0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Karakterisering av reseptorene som er involvert i Receptor Mediated Transcytosis (RMT). (A) Den differensierte RBEC monolag ble immunostained med antistoffer mot den lave densitet relatert lipoprotein reseptor 1 (LRP1) og low density lipoprotein receptor (LDLR). Confocal bilde av RBEC analysert for opptak av DiILDL, et fluorescerende ligand av LDLR og for opptak av rotte Transferrin-Cy3, et fluorescerende ligand av TfR showet punctate flekker over celleoverflaten, med noen clustering i oppklaring rundt kjernen regionen. (B) Rotte Tf-Cy3 ble tilsatt til det øvre kammer som inneholder differensierte RBEC monolag ved 75, 150, 300, 600, 1200, 2400 og 4800 picomol /-innsats for 180 min ved 37 ° C (200 mL i det øvre kammer og 1,200 mL in det nedre rom). Etter dette tidsrom ble Cy3 fluorescens kvantifisert i cellelysat (200 mL PBS 0,1% Triton X100), og i det nedre kammer ved fluorimetrisk analyse med en spectrofluorimeter med eksitasjon ved 550 nm og emisjon ved 570 nm. Fluorescens enheter ble transformert i picomol ved hjelp av et lineært arbeidsområde. (C) For metningseksperimenter ble rotte Tf-Cy3 tilsatt til det øvre kammer som inneholder differensierte RBEC monolaget på 1,200 picomol /-innsats for 180 min ved 37 ° C med eller uten 15 min pre-inkubasjon med 4800 picomol / sette av ikke-fluorescerende Tf. Transporten i det nedre kammer ble kvantifisert som i (B) (Students t-test, p <0,05). (D) DiILDL ble innført i det øvre kammer som inneholder differensierte RBEC monolaget ved 1, 2, 4 og 8 pg / innsatsfiltre i 30 min ved 37 ° C (200 pl i det øvre kammer og 1,200 mL i det nedre kammer). Etter dette tidsrom ble DII fluorescens kvantifisert i cellelysat (200 ul av PBS 0,1% Triton X100), og i det nedre kammer ved fluorimetrisk analyse med en spectrofluorimeter med eksitasjon ved 554 nm og emisjon ved 571 nm. FluorescenskanalerCence enheter ble transformert i mikrogram ved hjelp av et lineært arbeidsområde. (E) For transport blokkerende forsøk ble natriumazid tilsatt ved 0,05% 15 min før inkubering av DiILDL ved 2 ug / sette i 30 minutter ved 37 ° C. Transporten i det nedre kammer ble kvantifisert som i (D) (Students t-test, p <0,05). Fraværet av toksisitet av natriumazid inkubasjon ved 0,05% ble vurdert av Pe (LY) målingen (data ikke vist). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. In vitro BBB modeller fra rotte ryggmarg endotelceller eller fra mus hjernen. Tabellen høylyser viktige parametere for microvessel utvinning fra rottehjerne, rotte ryggmarg og mus hjernen. Photomicrographs vise farging for ZO1 og occludin i endotelcelle monolayers forberedt fra rottehjerne, rotte ryggmarg og mus hjernen.

Discussion

Vi beskriver gjennomføringen av et ukentlig reproduserbar protokoll for isolering og plating av hjerne microvessels, etter rensing og kultur av RBEC og videre etablering av co-kulturer med primære rotte astrocytter å generere en in vitro BBB modell med karakteristiske BBB egenskaper.

Vellykket etablere standardisert in vitro BBB kulturer krever optimale forhold i de flere etterfølgende trinn i prosessen. Modellen var (a) optimalisert for å få lavest paracellular permeabilitet, som fortsatt er den "hellige gral" av in vitro BBB modeller, og (b) validert for effluks og RMT mekanismer.

Produksjon, Rensing og spredning av RBEC

Den største utfordringen når dyrke RBEC er å oppnå reproduserbarhet mellom ulike kulturer. Standardisering av protokollen krever høy kvalitet verktøy for disseksjon, høy kvalitet reagenser og respekt reagenser utløpsdatoer. Eksperimentator må være dyktige i mikro-disseksjon henhold stereo for rask fjerning av hjernehinnene og store fartøyer fra cortex overflaten. Når hjerner er isolert og mekanisk dissosiert, en av de største utfordringene er den optimale enzymatiske fordøyelse av de nylig isolerte hjerne microvessels. Den typen og kvaliteten på de enzymene som brukes er avgjørende. En blanding av kollagenaser av type I og II, og dispase ved høy konsentrasjon og en lav variasjon mellom batcher ble brukt. Også viktig er varigheten av den enzymatiske fordøyelse og forholdet mellom enzym-konsentrasjon / vev vekt / volum av fordøyelsen. Det beste utbytte av hjernen microvessel produksjon ble oppnådd med tilsvarende kortekser fra en hjerne i 1 ml kollagenaser / dispase blande 60 ug / ml i begge digereringer, henholdsvis 30 minutter og 1 time.

Også kritisk er eliminering av forurensende celles (astrocytes og hovedsakelig pericytes). Disse celler sprer ved høyere hastighet enn endotelceller og ikke etablere tett veikryss med sistnevnte, og dermed hindrer etablering av en homogen cellemonosjikt med god paracellular restrictiveness. Med tanke på at hjerne endotel-celler uttrykker mye høyere nivåer av efflux pumper, spesielt P-gp, sammenlignet med de andre celletyper som finnes i microvessels, de tåler bedre de ellers toksiske konsentrasjoner av P-gp ligand medikamenter, mens ikke-endotelceller er eliminert. Puromycin behandling på 4 mikrogram / ml for de første to dagene ble etterfulgt av to dager ved 2 ug / ml for å oppnå god endotelcelle renhet. Dette utvalget kan også favorisere kapillære endotelceller versus de fra venules, pre-kapillære arterioler eller større microvessels, og føre til strammere monolayers. I tillegg er bruken av fattig plasma-avledet bovint serum absolutt nødvendige for å oppnå rene kulturer av endotelceller 47,48. Plasma-derived serum mangler blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), som er mitogent for fibroblaster, for glatte muskelceller, og derfor til pericytes.

Vi har observert at behandlingen av plast og filtre med en blanding av kollagen type IV fra mus og human fibronectin gir en betydelig fordel, med en 2-gangers økning i proliferasjon utbytte i sammenligning med den tradisjonelle anbefalte kollagen type I fra rottehale. Viktige signaler for celleproliferasjon er gitt av den ekstracellulære matriks som integrin-og vekstfaktor (bFGF) aktivering 49.. Buffer-konsentrasjon og pH-verdien i dyrkningsmedium, er beskrevet å virke positivt på paracellular tetthet 50 og vi har observert en bedre reproduserbarhet mellom kulturer med tillegg av HEPES-buffer ved 5 mM.

Differensiering av RBEC: Co-kultur Establishment Sett Filters

Når hjernen endotelceller har been renset og har proliferated i 6 dager, kan de bli sådd ut på filtere. Cell plettering ved høy tetthet er kritisk for å oppnå en perfekt monolag. En seeding tetthet på 160x10 tre celler per 12 brønn plate filtre var nødvendig og tilstrekkelig for å oppnå et konfluent monolag 24 timer etter tilsetningen. Imidlertid isolering av primære hjerne kapillær endotel celler fra deres miljø er et paradoks i konstruksjonen av en BBB in vitro-modell slik det er kjent at primære celler, og spesielt hjernekapillære endotelceller, er sterkt regulert av deres miljø og induktive faktorer produsert av de forskjellige omliggende celletyper. Brain kapillære endotelceller dyrket alene raskt de-differentiate og miste noen spesifikke hjerne endothelial markører. Således bør primære endotelceller brukes ved lav passasje (P1) og re-koplet, i det minste delvis, med sine omgivelser ved ko-kultur med astrocytter eller medium betinget av astrocytter 47,51. Dette gjeldersant for astrocyte differensiering som hjernen endotelceller og astrocytter er involvert i to-veis induksjon. Dyrking RBEC med astrocytter førte til sterk induksjon av interendothelial TJ 52,23. De molekylære mekanismene for re-induksjon fortsatt i stor grad ukjent, og forskning pågår i flere laboratorier for å identifisere spesifikke stimulerende faktorer utskilt av astrocytter, som kan fremme optimal endothelial celledifferensiering 53,54. Faktorer utskilt av hjerne endotelceller inkludert leukemi-inhiberende faktor (LIF) er blitt vist å indusere differensiering astrocytic 55,56. Før co-kultur etablering, ble astrocytter utsatt for differensiering medium som inneholder glukokortikoid reseptor agonist hydrokortison, og co-kultur betinget medium. Hydrokortison er kjent for å forbedre tettheten av hjerne endotel-celler og brukes i BBB modeller spesielt fra rotte 57 og muse 58,59 endotelceller. Den betingede medium samles opp fra det nedre rom av endotelcelle / astrocyte ko-kultur-system etter 3 dager, og frosset for senere bruk. Bruken av ko-kultur kondisjonerte medium reduseres tiden for endotelial celledifferensiering til 3 dager med optimal paracellular permeabilitet i 2 dager, og også forbedret reproduserbarhet mellom kulturer.

Totalt sett protokollen vi beskriver gir en reproduserbar Teer over 300 ohm · cm 2 og en gjennomsnittlig paracellular permeabilitetskoeffisient Pe (LY) på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, lik de beste primære cellebasert BBB modellene 22, 12. Protokollen beskriver vi i den foreliggende manuskript med den foreslåtte modulering av microvessel enzymatisk fordøyelse kan utvides til endotelceller fra rotteryggmarg 60 og fra mus i hjernen.

Molekylær og funksjonell karakterisering

I tilleggi TJ induksjon, astrocytter bidrar også til uttrykk av effluks-transportører som P-gp i hjernen endotelceller 61. Vi har faktisk viser ekspresjon av effluks transportør-P-gp i BBB-modellen og demonstrerer vi polariteten av P-gp efflukspumpe lokalisering ved hjelp av biokjemiske metoder, og av P-gp-aktivitet ved bruk av en funksjonell analyse. GLT-1 uttrykk ble oppdaget i basalmembranen brøkdel av microvessels men ble ikke oppdaget i kultivert RBEC. Vi hypotese at GLT-en ble nedregulert i vår RBEC kultur i sammenligning med in vivo-forhold og dermed ikke oppdages ved Western blot analyse. Overskudd av glutamat er nevrotoksisk og in vivo, er GLT-1 er ansvarlig for glutamat-utstrømning fra den basale rommet (parenchyma) til den apikale rommet (blodsirkulasjonen). I astrocyte kulturer forblir GLT-1-ekspresjon svært lav, og induseres ved tilsetning av glutamat i mediet 62,63.

Vi har også confIRM uttrykk for tilstrømningen transportører på den apikale membran som LRP1, LDLR og TfR. Funksjonalitet av TfR og LDLR ble demonstrert med binding og transport eksperimenter av Tf-Cy3 og DiLDL fra luminal til abluminal side av monolaget som tidligere vist med en storfe in vitro BBB modell 64. Interessant nok har det vist seg at lipid kravet fra astrocytter øker ekspresjonen av LDLR på hjerne kapillær endotel celler 65,66 ytterligere bekrefter den fysiologiske krysstale mellom astrocytter og hjerne endotel celler, inklusive in vitro. Vi har valgt å eksemplifisere transport med fluorescerende fargestoffer f.eks som Cy3 og DII med tanke på at spectrofluorimetric analyse er tilgjengelig i de fleste laboratorier, og kan vise seg nyttig å validere in vitro BBB-modeller. Imidlertid er kvantifisering av fluorescens langt mindre følsom enn radioaktiviteten, og krever en økning i antall eksperimenter for å oppnå signifikante data.Ideelt sett Tf og LDL er vanligvis radiomerket (Jod 125) for slike bindende / opptak og transport eksperimenter.

Vi viser også at den differensierte endothelial cellemonolag oppnådd med den foreslåtte protokollen reagerer på betennelse indusert av TNF-α, som avslørt av CCL2 utgivelse og BBB åpning. CCL2 (MCP-1) og dens reseptor CCR2 er involvert i CNS-sykdommer slik som multippel sklerose, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) 67, CNS traume 68 og er kjent som mediatorer av leukocytt-migrering inn i CNS etter neuroinflammatory betingelser 69,70. Med testet protokollen, kan vi ikke konkludere på en polarisert sekresjon av CCL2 fordi BBB åpning gjør at CCL2 konsentrasjon for å stabilisere seg mellom både øvre (apikale) og nedre (basal) avdelinger. Derfor vi tydelig undervurdere hvor mye CCL2 produsert av RBEC i den apikale rommet på 24-timers (figur 5A).

Generelt Oversikt og begrensninger av BBB In Vitro modeller: I n Vivo versus In Vitro og Rodent versus menneske Sammenligninger

Mange lovende CNS stoffer som viste seg å være effektive i BBB passasje in vitro mislyktes i kliniske studier på grunn av mangel på forutsigbarhet fra in vitro-modeller BBB ofte basert på celler isolert fra andre arter enn mennesker. Så langt vi kjenner til, er in vitro BBB modeller er trolig mer intelligent når det gjelder å studere mekanistiske aspekter ved protein nettverk, signaltransduksjon, transportører og reseptorer. Hver mekanisme, gangsti eller mål å bli studert in vitro må karakteriseres for sin regulering av komplementære miljømessige signaler (andre celletyper, kjemikalier, proteiner) og kombinert til in situ studier med samme dyreart, Og når det er mulig, med microvessels og endotelceller isolert fra mennesker, med de restriksjoner og forsiktighet fremkalt under.

In vitro BBB modellene har å bli sett på som autonome systemer, isolert fra kroppen regulering, men fortsatt utrustet med store in vivo egenskaper og et potensial for regulering av miljø-signaler. Ingen "ideal" in vitro BBB-modellen har vært foreslått enda 71,72,73 fordi endotelcelle-monolag mangler en rekke viktige bestanddeler av neuro-glia vaskulær enhet (NGVU) og er isolert fra blod-og organ-regulering. Mangelen på pericytes 74,16 eller nevroner 17,18 eller de forskjellige bestanddeler av den ekstracellulære matriks anvendes for plastbelegg eller kulturmediet og serum som brukes for cellevekst i de mest vanlige og "letteste laget" in vitro BBB-modeller basert på endotelial cellene differensiert med astrocytter kan modulere protein uttrykk in sammenligning med in vivo situasjonen 75. Disse modellene kan uttrykke mange transportører som vises in vivo, men ikke alle. I noen tilfeller ble transportparametere først bekreftet i isolerte microvessels (nærmest in vivo situasjon), og deretter studert i cellekultursystemer 76,61.

Molekylærbiologi forskning har tillatt karakterisering av gen-og protein uttrykk i isolerte microvessels og lave passasje endothelial cellekulturer fra samme art og mellom ulike arter, oftest fra små dyr som gnagere (mus og rotter) eller fra ku og gris i forhold til mennesker 77,78,75,15. Transcriptomic sammenligning mellom in vivo og in vitro hjernen mikrovaskulære endotelceller viste tallrike gentranskriptene som ble differensielt uttrykte og oftest betydelig downregulated in vitro. Transkripsjoner som koder tilstrømningen transportører som TfR og proteins innblandet i vesikkel menneskehandel er i hovedsak downregulated i dyrkede hjerne endotelceller, som tyder på en generell nedgang i endocytose og vesikulært transport i slike celler. Kultur manipulasjon i form av renhet (puromycin behandling) og behandling med hydrokortison kan bidra til å gjenopprette en mer "in vivo-lignende" genuttrykk profil 77. Transcriptomic studier avdekket også viktige forskjeller mellom arter som ytterligere komplisere spådommer om narkotika opptak hos mennesker basert på gnager i vitro BBB modeller 75. In vitro BBB modeller som involverer co-kultur av humane endotelceller og astrocytter har blitt beskrevet 15. Selv om relevant, disse modellene er mer vanskelig å gjennomføre på en jevnlig basis som de krever regulert tilgang til post-mortem menneskelig vev, og det er heterogenitet i kvalitet / egenskaper av den menneskelige hjerne endotelceller avhengig av alder, sykdommer, og eventuelt medisinsk treatment av givere. Innsatsen må gjøres for å utvikle nye in vitro-modeller som bedre gjengi den fysiologiske, anatomiske og funksjonelle egenskaper ved in vivo BBB. Co-kulturer som involverer tre celletyper er svært restriktive og synes vanskelig å gjennomføre rutinemessig. Til dags dato, de mest komplekse in vitro BBB-modellene er de dynamiske in vitro modeller (DIV-BBB) som inkluderer fartøy lignende organisasjon med astrocytter og inkluderer en strøm av medium som etterligner blodstrømmen 75,79,80,81,82, 83,84,85. Når cerebrale endotelceller blir utsatt for en strøm, den genererte skjærspenningen aktiverer mechanotransducers på celleoverflaten, som modulerer ekspresjonen av forskjellige gener som er involvert i endotelial cellefysiologi, for eksempel celledeling, differensiering, migrasjon og apoptose 80. In vivo, skjærspenning generert av blodstrømmen er ansvarlig for mitotisk stopp i cellekontakt, som tillater opprettelse av enendothelial cellemonolag i blodkar 80. Genomisk og proteomikk analyser av normale menneskelige hjerne mikrovaskulær endotelceller viste virkningen av skjærspenning i BBB endothelial fysiologi 84. Skjærspenning er ansvarlig for celle overlevelse, en høyere grad av endotelceller vedheft, efflukspumpe induksjon og bedre polarisering av transportører 75, regulering av glukosemetabolismen 75,86, oksidasjon mediert av CYP450-enzymer 75 og regulering av paracellular permeabilitet ved å øke uttrykket av gener som koder for intercellulær junctional elementer som occludin og ZO-en 87,75,80 og følgelig høy Teer rundt 1500 - 2000 ohm · cm 2, det som ligger nærmest kjent in vivo Parametere 79,80

I bioteknologi og farmasøytisk industri, rutinemessig screening av narkotika eller enda high throughput screening (HTS) og arbeidet med å redusere dyreforsøk, ledettil utvikling av forskjellige cellelinjer som kan benyttes som erstatning for den primære kultur av cerebrale endotelceller som forblir vanskeligere å sette opp rutinemessig. I de fleste tilfeller, ble primærkulturer av cerebral endoteliale celler transduseres med en immortalizing genet (SV40 eller polyomavirus stort T-antigen og adenovirus E1A), enten ved transfeksjon av plasmid-DNA eller ved hjelp av retrovirus-infeksjoner vektorer 88,89,75. Flere endothelial cellelinjer av cerebral opprinnelse har blitt utviklet som RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs eller rBCEC4 rottecellelinjer 88,75, den b.End3 musecellelinje 90,75, den PBMEC/C1 - 2 porcine cellelinjen 87,75 og hCMEC/D3 human cellelinje 89,75. Andre modeller er basert på celler av ikke-hjerne-opprinnelse slik som Madin-Darby kaninnyre (MDCK) eller Caco2-cellelinjer 12,75. Blant de forskjellige humane hjerne endotel-cellelinjer, har hCMEC/D3 blitt aner sitered og forbedret som en modell av BBB siden etableringen i 2005 91,92. Som primærkulturer, cellelinjer presentere fordeler og begrensninger. De er lettere å håndtere enn primærkulturer, har en lengre levetid, er godt karakterisert og tillater reproduserbarhet mellom storskalaforsøk. Men, kan cellelinjer miste vev-spesifikke funksjoner, mister miljøregulering og få en molekylær fenotype ganske forskjellig fra celler in vivo 75, 89. Spesielt monolayers generert fra cellelinjer stede redusert tetthet, lav Teer og vis transporter profil variasjon 75,89. Dermed dyreforsøk eller studier i primærceller blir ofte foretrukket til tross for deres ekstra kompleksitet.

Acknowledgments

Økonomisk støtte til Vect-HORUS er erkjent fra Fonds Unik Interministériel (FUI / MEDUL prosjekt) og til Vect-HORUS og UMR7259 laboratorium fra Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, Adhoc og PREVENTAD samarbeidsprosjekter) . Den UMR7259 laboratoriet erkjenner også økonomisk støtte fra CNRS og fra Aix-Marseille Université.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
  2. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
  3. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  4. Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22 (4), 390-400 (1998).
  5. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  6. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  7. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34 (11), 1935-1943 (2006).
  9. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
  10. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  11. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85 (6), 734-746 (2005).
  14. Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316 (1), 79-86 (2006).
  15. Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8 (3), 651-663 (2011).
  16. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  17. Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119 (3), 507-520 (2011).
  18. Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  19. Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 3 (2013).
  20. Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42 (1-2), 148-155 (2011).
  21. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  22. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  23. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
  24. Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259 (1), 66-70 (1991).
  25. Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53 (2), 340-345 (1989).
  26. Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
  27. Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 299-321 (1999).
  28. Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
  29. Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110 (5), 1456-1465 (2013).
  30. Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56 (3), 246-252 (2006).
  31. Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324 (3), 1064-1072 (2008).
  32. Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283 (50), 34554-34562 (2008).
  33. Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206 (3), 191-203 (2012).
  34. Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55 (5), 2227-2241 (2012).
  35. Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (8), 2999-3004 (2013).
  36. Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7594-7599 (2007).
  37. Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10 (4), 317-325 (2002).
  38. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to 'open' the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6 (3), 179-192 (2008).
  39. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  40. Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10 (9), (2013).
  41. Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74 (1-2), 173-184 (1997).
  42. Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22 (4), 835-844 (2005).
  43. Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73 (6), 2491-2500 (1999).
  44. Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311 (2), 449-455 (2004).
  45. Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  46. Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73 (1), 390-399 (1999).
  47. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (1), 23-37 (1992).
  48. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  49. Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224 (1-2), 81-89 (2001).
  50. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12 (4), 759-770 (2010).
  51. Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6 (5), 573-575 (1996).
  52. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  53. Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13 (7), 1185-1199 (2013).
  54. Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 25-39 (2005).
  55. Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21 (5), 1538-1547 (2001).
  56. Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200 (6), 629-638 (2002).
  57. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97 (4), 922-933 (2006).
  58. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
  59. Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
  60. Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 209-214 (2006).
  61. Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018 (1), 1-9 (2004).
  62. Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19 (23), 10193-10200 (1999).
  63. Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37 (2-3), 163-170 (2000).
  64. Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15 (5-6), 254-264 (2008).
  65. Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126 (2), 465-473 (1994).
  66. Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138 (4), 877-889 (1997).
  67. Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15 (1), 23-32 (2003).
  68. Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5 (1), 3-12 (1999).
  69. Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (5), 593-606 (2005).
  70. Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (3), 459-473 (2010).
  71. Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6 (2), 107-118 (2011).
  72. Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40 (6), 335-338 (2012).
  73. Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17 (26), 2755-2761 (2011).
  74. Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8 (4), 258-269 (2011).
  75. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14 (1), 120-136 (2013).
  76. Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
  77. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (1), 135-148 (2008).
  78. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339 (2), 579-588 (2011).
  79. Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8 (1), 89-99 (2005).
  80. Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  81. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  82. Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  83. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  84. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12 (40), (2011).
  85. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. , (2013).
  86. Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49 (3), 595-617 (2005).
  87. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 41-58 (2005).
  89. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  90. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 995-112 (2003).
  91. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  92. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 312-328 (2008).

Tags

Medisin rottehjernen endotelceller (RBEC) mus ryggmarg tight junction (TJ) reseptor-mediert transport (RMT) low density lipoprotein (LDL) LDLR transferrin TfR P-glykoprotein (P -gp) transendothelial elektrisk motstand (Teer),
Sette opp en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Rat blod-hjerne barrieren (BBB): Et fokus på BBB Ugjennomtrengelighet og Receptor-mediert transport
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Molino, Y., Jabès, F.,… More

Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter