Summary
Her beskriver vi en arbejdsgang for hurtigt at analysere og udforske samlinger af fluorescens mikroskopi billeder ved hjælp PhenoRipper, et nyligt udviklet image-analyse platform.
Abstract
Trods hurtige fremskridt i high-throughput mikroskopi, kvantitative billedbaserede assays stadig store udfordringer. Mens en række specialiserede billede analyseværktøjer er til rådighed, de fleste traditionelle image-analyse-baserede arbejdsgange har stejle læringskurver (til finjustering af analyseparametre), og resultere i lange ekspeditionstider mellem billedbehandling og analyse. Især celle segmentering, processen med at identificere de enkelte celler i et billede, er en stor flaskehals i denne henseende.
Her præsenterer vi en suppleant, celle-segmentering-fri workflow baseret på PhenoRipper, en open source-software platform designet til en hurtig analyse og udforskning af mikroskopi billeder. Rørledningen, der præsenteres her er optimeret til immunfluorescensmikroskopi billeder af cellekulturer og kræver minimal indgriben fra brugeren. Inden for en halv time, kan PhenoRipper analysere data fra en typisk 96-brønds eksperiment og generere billede profiler. Brugerne kanså visuelt udforske deres data, udføre kvalitetskontrol på deres eksperiment, sikre et svar på perturbationer og kontrollere reproducerbarhed gentagelser. Dette muliggør en hurtig feedback cyklus mellem analyse og forsøg, som er afgørende under analyse optimering. Denne protokol er nyttig ikke blot som en first-pass-analyse til kvalitetskontrol, men også kan bruges som en end-to-end løsning, især for screening. Den her beskrevne arbejdsgang skaleres store datasæt, såsom dem der genereres af high-throughput skærme, og har vist sig at gruppere eksperimentelle betingelser ved fænotype nøjagtigt over et bredt område af biologiske systemer. Den PhenoBrowser interface giver en intuitiv rammer for at udforske den fænotypiske plads og relatere billedegenskaber for biologiske anmærkninger. Tilsammen vil protokollen beskrevet her sænke barriererne for vedtagelsen af kvantitativ analyse af billede baseret skærme.
Introduction
Gennem det seneste årti, har hurtige fremskridt i tænkelig teknologi givet mange laboratorier evnen til at udføre high-throughput mikroskopi. Nu har udfordringen flyttet fra en af billedbehandling til en analyse. Hvordan kan vi karakterisere, sammenligne og udforske den syndflod af komplekse endnu subtile fænotyper genereret af en typisk high-throughput imaging skærm?
En række image-analyse-og edb-platforme har givet brugere sofistikerede værktøjskasser 1-3 for at udtrække biologisk information fra store samlinger af billeder. Alligevel er der mange væsentlige hindringer fortsat analysere data fra high-throughput billedbaserede skærme. Vanskeligheder forbundet med at vælge en passende beskrivelser af de billeder og finjustering af algoritmiske parametre (til systemet af interesse) resulterer ofte i lange opsætningstider, især for brugere uden image-analyse ekspertise. Især segmentering celle, processen med at identificere de enkelte celler i enn billede, er en stor flaskehals i denne henseende. Segmentering kan være meget følsomme over for eksperimentelle parametre såsom celletype celle tæthed og bio-markører, og ofte kræver gentagne justering for et stort datasæt. Af disse grunde billedanalyse er ofte en uafhængig terminal trin udføres af specialister snarere end en integreret del af den eksperimentelle arbejdsgang. Dette udelukker hurtig feedback cyklus mellem analyse og eksperiment, en afgørende del af assay udvikling.
Her beskriver vi en alternativ arbejdsproces, der er optimeret til high-throughput fluorescensmikroskopi og undgår mange af de førnævnte problemer. Til dette formål, gør vi brug af PhenoRipper 4, en open source-software platform for hurtig efterforskning og analyse af mikroskopi billeder. Betydeligt, PhenoRipper undgår mange af de udfordringer, der er forbundet med celle segmentering ved ikke at forsøge at identificere enkelte celler. I stedet PhenoRipper inddeler billederne i pixelblokke af subcellulære størrelse og karakteriserer billeder i form af blokke, de indeholder. Konkret PhenoRipper profiler blokke i form af markør-co-lokaliseringstoppe-baserede funktioner og automatisk identificerer 4 de mest repræsentative blok typer i uddannelsen billeder. PhenoRipper tildeler derefter til hver blok den mest lignende repræsentative blok typen, og endelig karakteriserer billeder baseret på de typer af blokke, de indeholder.
Sammenlignet med mere traditionelle single-celle-baserede tilgange, denne tilgang kræver minimal finjustering og ekspertise. Som sådan, kun brugere nødt til at indstille to parametre: blokken størrelse og en tærskel intensitet (for at kassere ikke-cellulære dele af et billede), som begge er sat med grafisk feedback. Vigtigere er det, har arbejdsgangen beskrevet her vist 4 nemt at skalere til meget større datasæt, hvor hastighed og minimal finjustering giver stor tid og pålidelighed gevinster. I praksis finder vi, at denne appskalle reducerer den tid, der kræves både for opsætning og kører af flere størrelsesordener 4.
Den primære produktion af PhenoRipper er en visuel repræsentation af billedet lighed, som gør det muligt for brugeren at identificere grupper af eksperimentelle betingelser, der forårsager celler til at vise lignende fænotyper. De grupperinger PhenoRipper finder typisk sammenlignelige "biologisk interpretability" til dem, der genereres af mere tidskrævende, celle-baserede metoder 4. I praksis betyder dette, at ofte, inden for en halv time for at udføre en typisk 96-brønds fluorescens mikroskopi eksperiment, en eksperimentator uden forudgående image-analyse erfaring kan få en pålidelig udlæsning om udførelsen af hans eller hendes eksperiment. Forsøgslederen kan derefter begynde at udforske relationerne mellem forskellige eksperimentelle betingelser, og som vedrører disse relationer til billede fænotyper.
Vi viser denne arbejdsgang her ved at analysere virkningenaf narkotika i distinkte mekanistiske klasser på HeLa-celler farvet for DNA-og cytoskeletal markører. Billeder af celler behandlet med den samme klasse af lægemidler blev samlet og dårlige kvalitet billeder (farvningsprocedurer artefakter, ude af fokus celler og så videre), optrådte som outliers, hvilket gør dem lette at identificere og eventuelt kassere.
Mens denne arbejdsgang er nyttig til en lang række billed-baserede assays, der er tydeligvis mange situationer, hvor en anden tilgang kunne potentielt være mere informative. For eksempel output fra PhenoRipper er primært en relativ sammenligning af fluorescens mønstre tværs eksperimentelle betingelser. Hvis en absolut karakterisering af en specifik enkelt celle træk blev i stedet kræves (for eksempel antallet af prikker i en celle), vil en enkelt celle-baseret analyse være påkrævet. Men selv i denne type situation, PhenoRipper er sandsynligt at konstatere ændringer i disse encellede fænotyper og derfor være et nyttigt redskab for analyse opticessorens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse Prøver og Imaging
- Cellekultur
- Split kulturer rutinemæssigt og vedligeholde på 20-70% konfluens. En dag inden forsøget, vokser HeLa-celler i DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, se tabel Materialer) og suppleret med 10% FBS (føtalt bovint serum) og 1x penicillin / streptomycin.
- På dagen for eksperimentet opdele celler vokser i kultur (ca. 50% konfluerende).
- Vask cellerne med PBS (fosfatbufferet salt), udsættes for cirka 2 ml trypsin / EDTA (Ethylendiamintetraeddikesyre) for et par sekunder. Aspirer overskydende trypsin / EDTA og holde celler badet i en tynd film af trypsin / EDTA i hætten ved stuetemperatur i ~ 3 minutter.
- Mekanisk ryste kolber to gange og tag cellerne med serum suppleret medier. Tæl celler og fortyndes til 5000 cells/50 pi medier og straks plade 50 gl / brønd på en 384-godt glas bundplade ved hjælp af en automatiseret væske håndteringsrobot (kun 30 godts af pladen anvendes her).
- Inkubér pladen ved stuetemperatur i 30 min for at minimere kanteffekter i brøndene 5. Efter RT inkubation sted plader i et 37 ° C / 5% CO2-inkubator natten over.
- Hvert lægemiddel vil blive analyseret i to eksemplarer. Tilsæt 25 gl af lægemiddel til de tilsvarende brønde på pladen, der allerede indeholder medier.
- Lave plade med 4% paraformaldehyd i PBS ved 24 timer efter lægemiddelbehandling.
- Farvning
De specifikke primære antistoffer, fluorescens-mærkede sekundære antistoffer og andre fluorescerende pletter, der blev anvendt her, er anført i tabel of Materials.- Permeabilisere fikserede celler med 0,2% Triton X-100-opløsning i TBS (Tris-bufret saltopløsning) i 3 minutter, og der vaskes med TBST (Tris-pufret saltopløsning + Tween 20) 3x. Tilsæt 5% BSA (bovint serumalbumin)-opløsning i TBST for blokering.
- Inkubér pladen ved stuetemperatur i 2 timer og derefter vaske med TBST 3x.
- Sørg primære antistof fortynderenioner i 5% BSA i TBST (se tabel of Materials), og der tilsættes 10 gl / brønd. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 2 timer, og derefter vaske 3 gange med TBST.
- Sørg sekundært antistof dilutionin 5% BSA i TBST (se tabel of Materials) og tilsættes 10 gl / brønd.
- Inkubér pladen i mørke ved stuetemperatur i 2 timer og derefter vaske to gange med TBST.
- Der tilberedes fortyndinger for Hoechst og phalloidin (se tabel of Materials) i PBS og tilsættes 10 gl / brønd.
- Inkubér pladen i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Efter 2 TBST vasker, dækplader i folie og opbevares ved 4 ° CO / N.
- Imaging
Anskaf billeder ved hjælp af et epifluorescensmikroskop ved hjælp af en 20X objektiv med 1x1 kamera binning. Anskaf seksten billeder til hver brønd, for i alt 480 billeder (x3 kanaler).
2. Analyse af billeder
Download og installer PhenoRipper fra phenoripper.org, og starte PhenoRipper at begynde analysen af imaGES. PhenoRipper øjeblikket understøtter TIFF, PNG og JPEG og alle andre formater understøttes af MATLAB (mikroskop software typisk understøtter eksport i TIFF).
2.1 indlæsning af data
- Ingen standard navngivning / organisation konvention eksisterer for mikroskopi billeder, som kan gøre indlæsning af billeder og knytte metadata (dvs. eksperimenterende annotation såsom behandling typen, godt nummer og så videre) den mest udfordrende del af arbejdsprocessen. Vælge en af de præsenterede metoder (beskrevet nedenfor).
- PhenoLoader: Vælg denne mulighed for semi-automatisk at indlæse data, når filnavnet og / eller mappestruktur indeholde tilstrækkelige oplysninger til at gruppere billeder som ønsket (f.eks B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kunne indikere, at billedet er fra godt B16, behandles celler med stoffet, hvis id er 5, og billedet indfanger den nukleare DAPI pletten - med denne navnekonvention kunne alle billederne fra godt A1 eller behandlet med medicin 5 let grupperes). Guiden vilguide brugeren trin for trin at knytte metadata med billed-grupper og definere de mærker således:
- Klik på "File Structure" for at få adgang til PhenoLoader vinduet.
- Klik på "Define Root Directory" for at vælge den mappe, der indeholder billedet datasættet. Derefter filtrere filer, der ikke benyttes (ubrugte filer) for analysen (valgfri, kan efterlades tomme).
- Klik på "Define Markers" for at præcisere de biomarkører, der anvendes i forsøget, og knytte dem til billederne. Konkret skal du klikke på et billede fil og vælg derefter en del af filnavnet, der entydigt identificerer biomarkører. Endelig skal du indtaste et navn for hver biomarkør.
- Klik på "Define Metadata" til at associere oplysninger med hvert billede. Konkret skal du klikke på en billedfil, og vælg derefter en del af filnavnet identificerer billedinformation (fx "B16" til godt navn). Et vindue beder om en gruppe navn (fx "Vill "), vil poppe op, skal du indtaste et navn. Medlemmerne af gruppen udvundet fra filnavnet vil blive vist på gruppens bordet (fx den fulde liste over såvel navne). Hvis du vil tilføje yderligere oplysninger, ikke er til stede i filnavnet, skal du klikke på" (valgfrit) Næste "knappen. Klik på" Tilføj Metadata Group ", indtast yderligere gruppe navn (fx" Drug "), og for hver værdi af den foruddefineret gruppe (fx" Well "), skal du indtaste dens værdi (fx" Taxol ") . Der er ingen grænse for antallet af yderligere grupper, der kan tilføjes.
- Endelig skal du klikke på "Opret Metadatafile" for at generere metadata filen og fortsætte analysen. Hvis en metadata fil tidligere er blevet genereret, kan de ovennævnte trin undgås ved direkte at indlæse filen ved hjælp af indstillingen "Metadata File" (beskrevet i 3 nedenfor).
- Regulært udtryk baserede skabeloner: Regulære udtryk er en standard tilgang til at matche mønstrei teksten. Vælg denne indstilling, når filnavnet og / eller mappestruktur indeholde tilstrækkelige oplysninger til gruppebilleder og navngivningskonventionen matcher en af de allerede eksisterende skabeloner. Brugerdefinerede skabeloner baseret på regulære udtryk kan også manuelt defineret og genbruges. Denne avancerede indstilling anbefales kun til brugere er fortrolige med regulære udtryk.
- Metadata Fil: Vælg denne indstilling for ultimativ customizability. Definere og indlæse en kommasepareret (CSV) fil, der indeholder filnavne og metadata, der er forbundet med hvert billede. Et eksempel på filformatet er tilgængelig på download-del af webstedet (phenoripper.org). Du skal blot indlæse filen via den grænseflade til at vise oplysninger, den indeholder.
- PhenoLoader: Vælg denne mulighed for semi-automatisk at indlæse data, når filnavnet og / eller mappestruktur indeholde tilstrækkelige oplysninger til at gruppere billeder som ønsket (f.eks B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kunne indikere, at billedet er fra godt B16, behandles celler med stoffet, hvis id er 5, og billedet indfanger den nukleare DAPI pletten - med denne navnekonvention kunne alle billederne fra godt A1 eller behandlet med medicin 5 let grupperes). Guiden vilguide brugeren trin for trin at knytte metadata med billed-grupper og definere de mærker således:
- Vælg det felt med metadata, der definerer gentagelser i forsøget på at undgå overflødig prøveudtagning. For datasæt, som indeholder gentagelser (f.eks alle billeder i en brønd bør være ens), gruppere dem sammen (fx ved godt), kan Visnove ydeevne. I de fleste tilfælde er det rimeligt at vælge standardindstillingen "Random (ikke kender)", som vælger en tilfældig delmængde.
2.2 Indstilling analyseparametre
Klik på "Set-parametre" at definere de parametre, der kræves for at behandle datasættet. De parametre, der definerer er på venstre panel. Den rigtige panelet viser en fusioneret prøve af datasættet. Klik på venstre / højre pile for at skifte mellem forskellige billeder.
- Threshold Intensitet: Vælg en passende tærskelværdi for groft at identificere de cellulære dele (snarere end baggrunden, ikke-cellulære regioner) billeder. En tærskel er forudberegnede af PhenoRipper, men kan justeres for at forbedre fremhævelse af cellulære regioner at bruge rullepanelet til rådighed på toppen af billedet. Hvis en valgt tærskel ikke virker på tværs af alle billeder, sænke tærsklen til også at omfatte ikke-cellulære regioner snarere end at droppe cellulære regioner.
- Blok Size: Vælg en passende blok størrelse (i pixels) til gitter billedet. Blokke af specificeret størrelse vil være overlejret på billedet. Juster blok størrelse for at opnå et gennemsnit på 20-30 blokke / celle. At overlejre gitteret over billedet Klik på afkrydsningsfeltet foran feltet "Block Size".
- Valgfrie parametre: Hvis auto-skaleret billederne ikke vise markører med ønskede relative intensiteter (fx én farve er mættet), eller hvis markører skal droppet fra analysen, bruge "Juster Channel Intensitet" valgmulighed. For at identificere cellulære regioner på en delmængde af markører bruge "kanaler, der anvendes til Threshold" valgmulighed. Standard valg af andre parametre er normalt tilstrækkelig, men om nødvendigt justere dem ved hjælp af "Advanced Analysis Options".
- Kør analyse ved at trykke på "PhenoRip" i hovedsagen panelet. PhenoRipper vil automatisk identificere tilbagevendende bloktyper i billederne. Fænotypiske profiler vil blive genereret forhvert billede baseret på de dele af de forskellige bloktyper i det.
3. Udforskning Resultater
- Udforsk forholdet mellem de fænotypiske profiler af billeder ved hjælp af PhenoBrowser (Figur 1). Den PhenoBrowser interfacet består af fire paneler: øverste venstre panel er en grafisk repræsentation (scatter plot) for den relative lighed mellem forskellige billeder / forhold, de to paneler på højre display prøve billeder af udvalgte forhold, og det endelige panel (søjlediagram ) sammenligner deres fænotypiske profiler.
- "Kassér tomme rammer" ved hjælp af "Data Processing"-menuen.
- Fjern dårlig kvalitet billeder: For det første at studere de enkelte billeder slukke gruppering fra "Data Processing"-menuen. Klik derefter gennem outlier punkter i scatter plot og kassere lav kvalitet billeder (f.eks ude af fokus, farvning artefakt).
- Udforsk dataene: Beslut hvilke metadata felt definereren grundlæggende enhed i sammenligning (f.eks at sammenligne narkotika, billeder med den samme værdi af metadata feltet "lægemiddel" skal samles). Skjul alle billeder med den samme værdi af denne metadata felt i en enkelt datapunkt med "Group By". For eksempel vil gruppering af narkotika gennemsnit billederne inden for hver stof til at give et point per lægemiddel. I punktplottet nærheden (eller fjerne) punkter afspejle de forhold, som udløser lignende (eller uens) cellefænotyper. Farve eller etiketten points (data display menu) baseret på tilgængelige metadata til støtte interpretability. 3D plot kan drejes ved at klikke på "drejes" afkrydsningsfelt og ved at klikke på den venstre knap og trække musen hen over det.
- Vælg to forskellige punkter at sammenligne dem direkte. De billede paneler vil vise billedeksempler for hvert punkt, og søjlediagram panelet vil vise bloktyper hvis forekomst frekvenser er mest forskellig mellem de to punkter.
- Start clustergram fra "menu Clustergram" for at give et mere globalt syn på forholdet mellem blok typer og eksperimentelle betingelser. Ved at gruppere både blok typer og betingelser, fremhæver denne repræsentation de cellefænotyper der bedst kendetegner grupper af betingelser (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her testede vi mulighed for denne arbejdsproces for at gruppere lægemidler baseret på deres virkningsmekanisme. HeLa-celler blev podet i 30 brønde i en plade med 384 brønde og farves for DNA / actin / α-tubulin. De specifikke primære antistoffer, fluorescens-mærkede sekundære antistoffer, og andre fluorescerende pletter, der blev anvendt, er anført i tabel Materialer. Brønde blev behandlet med 15 lægemidler, der tilhører tre mekanistiske klasser (histondeacetylase inhibering mikrotubulus målretning og DNA-ødelæggende) i 24 timer og afbildet under anvendelse af et epifluorescensmikroskop ved 20X objektiv forstørrelse. Seksten billeder blev erhvervet for hver brønd, for i alt 480 billeder (x3 kanaler). De her beskrevne data kan downloades fra www.phenoripper.org.
Som beskrevet ovenfor blev PhenoRipper anvendt til at analysere disse billeder. Den forgrunden tærskel blev sat til 5% (dvs. 5% af det maksimalt mulige intensitet) og blokken størrelse til 20 pixel (Figur e 2). Analyse af dette datasæt tog cirka 10 minutter på en standard stationær computer (en 64 bit, 8 core maskine på 3,2 GHz, med 16 GB RAM). Den PhenoBrowser interface (figur 3) blev anvendt til at undersøge resultaterne. Imaging artefakter såsom dårlig farvning og tomme rammer var let at identificere, da de stod ud som klare outliers (Figur 4). De relative fænotypiske ligheder mellem billeder er visualiseret i øverste venstre panel i figur 3 ved hjælp af multidimensionel skalering. Hvert punkt repræsenterer et enkelt billede farvet af lægemiddelkandidaten virkningsmekanisme. Dette plot viser, at fænotypiske profiler kan anvendes til grupper lægemidler ved deres virkningsmekanisme. En clustergram af data (figur 5), vedrører denne gruppering de fænotypiske profiler.
s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Arbejdsgang for fluorescens mikroskopi PhenoRipper. Cellelinjer podet i en plade, så perturbationer tilsættes til hver brønd, og pladen inkuberes. Billeder er erhvervet ved hjælp af en automatiseret mikroskop og derefter hurtigt analyseret ved hjælp PhenoRipper. Således er resultaterne af det nuværende eksperiment kendt kort efter billeddannelse og kan, hvis det er nødvendigt, blive anvendt til at forfine opsætningen for fremtidige gentagelser. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Indstilling PhenoRipper parametre: Blok størrelse og tærskel intensitet indstilles ved hjælp af en grafisk brugerflade med realtids visuel feedbac k.. Klik her for at se større billede .
Figur 3. PhenoBrowser Interface til at udforske PhenoRipper resultater: PhenoBrowser interface er opdelt i fire paneler: øverste venstre panel er et scatter plot viser de relative ligheder mellem forskellige billeder / forhold, de to paneler på højre display prøve billeder af udvalgte forhold, og den nederste venstre panel sammenligner deres fænotypiske profiler. Klik her for at se større billede .
load/51280/51280fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg "width =" 600px "/>
Figur 4.. Eksempel på en outlier i punktplottet (fremhævet), der viser en farvning artefakt (se video). Klik her for at se større billede .
Figur 5. Clustergram repræsentation af PhenoRipper profiler: Hver række repræsenterer et enkelt lægemiddel, og hver kolonne en blok type. De gråtoner værdier afspejler de fænotypiske profiler, dvs den del af de forskellige typer blok for hvert lægemiddel. En lettere værdi angiver højere brøkdel af bloktype. Hierarkisk klyngedannelse i høj grad adskiller de forskellige lægemiddel ved stof klasse (rød / blå / green farve til højre). Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne arbejdsgang giver hurtig og nem karakterisering og sammenligning af mikroskopi billeder. Vi først viste, hvordan denne arbejdsproces kan hjælpe eksperiment optimering, for eksempel ved hurtigt at udføre kvalitetskontrol på mikroskopi billeder. Dernæst viste vi dens potentiale til at analysere high-throughput screening data: vi var i stand til at gruppere lægemidler baseret på deres virkningsmekanisme. Grupperingen af lægemidler var sammenlignelig med den, der findes ved hjælp af mere komplekse metoder 6, selvom PhenoRipper var størrelsesordener hurtigere.
Selvom vi har fundet denne tilgang robuste over sporadiske eksperimentelle udsving, som med et billede tilgang vil udlæsninger blive påvirket af systematiske ikke-biologiske effekter. For eksempel kan plade-til-plade variation i markør intensitet maskere de biologiske virkninger af interesse. Virkningen af sådanne artefakter kunne reduceres med passende korrektioner 7, 8, såsom psent til plade normalisering og baggrundssubtraktion. Profilerne genereret af PhenoRipper kunne også blive påvirket af variationer i celle tæthed. Mens denne adfærd er normalt ønskeligt (reflekterende overlevelse eller vækst), kan dens virkning blive reduceret med FN-vælge "Use Background Information" i "Advanced parametre".
I valget af egnede metode til analyse, skal brugerne til at overveje afvejning mellem hastighed, brugervenlighed og niveauet af analytiske detaljer. Segmentering-fri metoder 9-11 såsom PhenoRipper er typisk hurtigere og nemmere at bruge end en enkelt celle-baserede metoder såsom CellProfiler 2. Ulempen ved segmentering-fri metoder er den manglende evne til at kvantificere specifikke encellede egenskaber. Brugeren har således brug for at træffe beslutning om den rette fremgangsmåde baseret på hans eller hendes behov. Når nøjagtig sammenligning eller gruppering af eksperimentelle forhold er det vigtigste mål, har vi fundet, at niveauet afdetalje fanget af PhenoRipper er mere end tilstrækkeligt. Især forskerne fokuseret på high-throughput eksperimenter vil drage stor nytte evnen til hurtigt og nemt at udforske billeddata. Som konklusion vil arbejdsgangen præsenteres her tillade bænk videnskabsfolk for nemt at udforske deres fluorescens mikroskopi billeder hurtigt efter køb og lette en hurtig turn-around mellem analyser og billeddannelse. Vi mener, at denne arbejdsgang vil sænke barrieren til at udføre kvantitativ billedanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Adam Coster og alle andre medlemmer af Altschuler og Wu Labs for nyttige tilbagemeldinger og diskussioner. Denne forskning blev støttet af National Institute of Health tilskud R01 GM085442 og CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW) CPRIT RP10900 (LFW) og Welch Foundation I 1619 (SJA) og I-1644 (LFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
