Summary
Hier beschrijven we een workflow voor het snel analyseren en verkennen van collecties van fluorescentie microscopie beelden met behulp PhenoRipper, een recent ontwikkelde beeldanalyse platform.
Abstract
Ondanks de snelle ontwikkelingen in de high-throughput microscopie, kwantitatieve-image-gebaseerde testen vormen nog steeds belangrijke uitdagingen. Terwijl een verscheidenheid aan gespecialiseerde beeldanalyse tools zijn beschikbaar, de meeste traditionele beeld-analyse-gebaseerde workflows hebben steile leercurve (voor fijnafstelling van analyse parameters) en leiden tot lange doorlooptijden tussen beeldvorming en analyse. In het bijzonder cel segmentatie, het proces van identificatie van afzonderlijke cellen in een beeld, is een belangrijk knelpunt in dit verband.
Hier presenteren we een alternatieve, cel-segmentatieloze workflow op basis van PhenoRipper, een open-source software platform dat is ontworpen voor de snelle analyse en verkenning van microscopie beelden. De hier gepresenteerde pijpleiding is geoptimaliseerd voor immunofluorescentie microscopie beelden van celculturen en vereist een minimale tussenkomst van de gebruiker. Binnen een half uur, kan PhenoRipper analyseren van een typische 96-well experiment en het genereren afbeelding profielen. Gebruikers kunnenvervolgens visueel hun gegevens te verkennen, uit te voeren kwaliteitscontrole op hun experiment, verzekeren reactie op verstoringen en check reproduceerbaarheid van herhalingen. Dit vergemakkelijkt een snelle feedback cyclus tussen analyse en experiment, wat cruciaal is tijdens test optimalisatie. Dit protocol is niet alleen nuttig als een eerste doorgang analyse kwaliteitscontrole, maar ook kan worden gebruikt als een end-to-end oplossing, vooral voor screening. De hier beschreven workflow schalen naar grote datasets zoals die gegenereerd worden door high-throughput-schermen, en is aan de groep experimentele omstandigheden aangetoond door fenotype nauwkeurig over een breed scala van biologische systemen. De PhenoBrowser interface biedt een intuïtieve kader om de fenotypische ruimte te verkennen en hebben betrekking beeld eigenschappen aan biologische annotaties. Samen genomen, zal de hier beschreven protocol verlagen de barrières op de aanneming van een kwantitatieve analyse van image-based schermen.
Introduction
In de afgelopen tien jaar hebben snelle ontwikkelingen in de imaging-technologie veel labs krijgt de mogelijkheid om high-throughput microscopie. De uitdaging is nu verschoven van een van beeldvorming om een analyse. Hoe kunnen we karakteriseren, vergelijken, en verken de stortvloed van complexe maar subtiele fenotypes die door een typische high-throughput imaging scherm?
Een aantal imago-analyse en informatica platforms hebben gebruikers geavanceerde gereedschapskisten gegeven 1-3 voor de extractie van biologische informatie uit grote verzamelingen van afbeeldingen. Toch blijven er nog vele belangrijke hindernissen in het analyseren van gegevens van high-throughput-image-based schermen. Problemen in verband met het kiezen van geschikte karakteriseringen van de beelden en fijnafstelling van algoritmische parameters (het systeem van rente) leiden vaak tot lange insteltijden, vooral voor gebruikers zonder beeldanalyse expertise. Vooral cel segmentatie, het identificeren individuele cellen in eenafbeelding n, is een belangrijk knelpunt in dit verband. Segmentatie kunnen zeer gevoelig zijn voor experimentele parameters zoals het type cel, dichtheid en bio-markers, en vereist vaak herhaalde aanpassing voor een grote dataset. Daarom beeldanalyse vaak een onafhankelijke terminal stap uitgevoerd door deskundigen plaats van een integraal deel van het experimentele workflow. Dit voorkomt de snelle feedback cyclus tussen analyse en experiment, een cruciaal onderdeel van assay ontwikkeling.
Hier beschrijven we een alternatieve workflow die is geoptimaliseerd voor high-throughput fluorescentiemicroscopie en vermijdt vele van de bovengenoemde problemen. Hiervoor maken we gebruik van PhenoRipper 4, een open-source softwareplatform voor snelle verkenning en analyse van microscopie beelden. Aanzienlijk, PhenoRipper vermijdt veel van de uitdagingen die betrokken zijn bij cel segmentatie door niet te proberen om enkele cellen te identificeren. In plaats daarvan verdeelt PhenoRipper afbeeldingen in pixelblokken subcellulaire grootte en kenmerkt afbeeldingen in termen van de blokken die ze bevatten. Concreet PhenoRipper profielen blokken in termen van marker-colocalization gebaseerde functies en identificeert automatisch 4 de meest representatieve soorten blok in de training beelden. PhenoRipper dan toekent aan elk blok het meest vergelijkbaar type representatieve blok, en tenslotte kenmerkt Afbeeldingen op basis van de aard van de blokken die ze bevatten.
Vergelijking met de meer traditionele single-cel-gebaseerde benaderingen, deze aanpak vereist een minimale fine tuning en expertise. Als zodanig, gebruikers hoeven slechts twee parameters: de blokgrootte en een drempel intensiteit (op niet-cellulaire delen van een beeld ontdoen), beide zijn ingesteld met grafische feedback. Belangrijk is dat de hier beschreven workflow aangetoond 4 gemakkelijk schalen naar veel grotere datasets, waarbij de snelheid en de minimale fine tuning biedt grote tijd en betrouwbaarheid winsten. In de praktijk zien we dat deze appvoorn reduceert de tijd die nodig is, zowel voor de installatie en actief door meerdere ordes van grootte 4.
De primaire uitvoer van PhenoRipper is een visuele weergave van beeld gelijkenis, waarmee de gebruiker groepen experimentele omstandigheden die veroorzaken cellen vergelijkbare fenotypen laten identificeren. De groeperingen PhenoRipper Typisch voelt hebben vergelijkbare "biologische uitlegbaarheid" die gegenereerd door tijdrovender, cel-gebaseerde methoden 4. In de praktijk betekent dit dat vaak, binnen een half uur van het uitvoeren van een typische 96-well fluorescentie microscopie experiment, een experimentator zonder voorafgaande beeldanalyse ervaring kan een goede weergave over de prestaties van zijn of haar experiment te krijgen. De onderzoeker kan dan beginnen met het verkennen van de relaties tussen de verschillende experimentele condities en in verband deze relaties op de foto fenotypes.
We tonen deze workflow hier door het analyseren van de effectenvan drugs in verschillende mechanistische lessen op HeLa-cellen gekleurd voor DNA en cytoskelet markers. Beelden van cellen behandeld met dezelfde klasse van drugs werden gegroepeerd, en slechte kwaliteit beelden (kleuring artefacten, onscherp cellen enzovoort) verscheen als uitschieters, waardoor ze gemakkelijk te identificeren en wellicht gooi.
Hoewel deze werkstroom is nuttig voor een groot aantal beeld-gebaseerde testen zijn duidelijk veel situaties waarin een andere aanpak potentieel informatief zijn. Bijvoorbeeld, de uitvoer van PhenoRipper vooral een relatieve vergelijking van fluorescentie patronen in experimentele omstandigheden. Indien een absolute karakterisering van specifieke cel trait plaats is vereist (bijvoorbeeld het aantal spikkels in een cel), wordt een enkele-cel gebaseerde analyse vereist. Niettemin, zelfs in dergelijke situatie PhenoRipper waarschijnlijk veranderingen in deze eencellige fenotypes detecteren en daarom een nuttig instrument voor analyse optimaalmization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiden van monsters en Imaging
- Celcultuur
- Split culturen routinematig en bij 20-70% confluentie handhaven. Een dag voor het experiment groeien HeLa cellen in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, zie tabel Materials) en aangevuld met 10% FBS (foetaal runderserum) en 1 x penicilline / streptomycine.
- Op de dag van het experiment, split cellen groeien in cultuur (ongeveer 50% confluent).
- Was de cellen met PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), blootgesteld aan ongeveer 2 ml trypsine / EDTA (Ethyleendiaminetetra-azijnzuur) gedurende enkele seconden. Verstuif overmaat trypsine / EDTA en bewaar cellen gebaad in een dunne film van trypsine / EDTA in de kap bij KT ~ 3 minuten.
- Mechanisch schudflessen tweemaal en los cellen met serum aangevuld media. Tellen cellen en verdun tot 5000 cellen/50 ul van media en direct plaat 50 ul / putje op een 384-wells glazen bodemplaat met behulp van een geautomatiseerde vloeibare handlingrobot (slechts 30 goeds van de plaat worden hier gebruikt).
- Incubeer plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om randeffecten in putten 5 minimaliseren. Na RT incubatie plaats platen in een 37 ° C / 5% CO 2 incubator 's nachts.
- Elk geneesmiddel wordt in tweevoud onderzocht. Voeg 25 ul van geneesmiddel tot de overeenkomstige putjes van de plaat reeds media die.
- Fix plaat met 4% paraformaldehyde oplossing in PBS bij 24 uur na de behandeling met geneesmiddelen.
- Kleuring
De specifieke primaire antilichamen, fluorescent gelabelde secundaire antilichamen en andere fluorescerende vlekken die hier werden gebruikt zijn vermeld in Tabel Materials.- Permeabilize gefixeerde cellen met 0,2% Triton X-100 oplossing in TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing) gedurende 3 minuten en wassen met TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing + Tween 20) 3x. Voeg 5% BSA (Bovine Serum Albumine) oplossing in TBST voor het blokkeren.
- Incubeer plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en daarna wassen met TBST 3x.
- Maak primair antilichaam verwaterdeionen in 5% BSA in TBST (zie tabel van Materialen) en voeg 10 ul / putje. Incubeer plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, en daarna wassen 3x met TBST.
- Maak secundair antilichaam dilutionin 5% BSA in TBST (zie tabel van Materialen) en voeg 10 ul / putje.
- Incubeer plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en vervolgens tweemaal wassen met TBST.
- Bereid verdunningen van Hoechst en phalloidin (zie tabel van Materialen) in PBS en voeg 10 ul / putje.
- Incubeer de plaat in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Na 2 TBST wast, afdekplaten in folie en bewaar bij 4 ° CO / N.
- Imaging
Acquire beelden met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een 20X objectief met 1x1 camera binning. Acquire zestien beelden voor elk putje, voor een totaal van 480 beelden (x3 kanalen).
2. Het analyseren van afbeeldingen
Download en installeer PhenoRipper uit phenoripper.org, en start PhenoRipper analyse van ima beginnenges. PhenoRipper ondersteunt momenteel TIFF, PNG en JPEG en alle andere formaten worden ondersteund door MATLAB (microscoop software te ondersteunen meestal exporteren naar TIFF).
2.1 laden van gegevens
- Geen standaard naamgeving / organisatie conventie bestaat voor microscopie beelden, die laden van afbeeldingen en het associëren van metadata kan maken (dat wil zeggen experimentele annotatie zoals type behandeling, goed nummer en ga zo maar door) de meest uitdagende deel van de workflow. Kies een van de gepresenteerde methoden (hieronder beschreven).
- PhenoLoader: Kies deze optie om semi-automatisch te laden gegevens wanneer de bestandsnaam en / of directory-structuur bevatten genoeg informatie om groepsfoto's als gewenst (bijvoorbeeld B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kunnen wijzen dat het beeld is van goed B16, worden cellen behandeld met het geneesmiddel waarvan de id is 5, en het beeld vangt de nucleaire DAPI vlek - met deze naam conventie konden alle beelden van zowel A1 of behandeld met Drug 5 gemakkelijk worden gegroepeerd). De wizard zalbegeleiden de gebruiker stap voor stap naar metadata associëren met afbeelding groepen en definieer de markeerders als volgt:
- Klik op "Bestand Structuur" om toegang te krijgen tot het venster PhenoLoader.
- Klik op "Definieer Root Directory" naar de map met de afbeelding dataset te selecteren. Vervolgens filteren de bestanden die niet worden gebruikt (ongebruikte bestanden) voor de analyse (optioneel, kan leeg gelaten worden).
- Klik op "Definieer Markers" om de biomarkers gebruikt in het experiment specificeren en associëren ze met de beelden. Specifiek, klik op de afbeelding te selecteren vervolgens een deel van de bestandsnaam die uniek identificeert de biomarkers. Tot slot voert u een naam voor elke biomarker.
- Klik op "Definieer Metadata" om informatie te koppelen aan elke afbeelding. Specifiek, klik op een beeldbestand en selecteer vervolgens een deel van de bestandsnaam identificeren beeldinformatie (bv. "B16" voor de goed naam). Een venster met de vraag voor een groepsnaam (bv "Wijll ") verschijnt, voert u een naam. Leden van de groep gewonnen uit de bestandsnaam wordt getoond op de groep tafel (bijvoorbeeld de volledige lijst van goed namen). Als u aanvullende informatie niet in de bestandsnaam toe te voegen, klikt u op de" (optioneel) Volgende ". Klik op" Add Metadata Group ", voer de extra groep naam (bijv." Drug ") en voor elke waarde van de vooraf gedefinieerde groep (bv." Well "), voert u de waarde (bv." Taxol ") . Er is geen limiet aan het aantal extra groepen die kunnen worden toegevoegd.
- Klik ten slotte op "Create Metadatafile" om de metadata bestand te genereren en voer de analyse. Als een bestand met metagegevens eerder is gegenereerd, kan de bovenstaande stappen worden voorkomen door direct laden van het bestand met de optie "Metadata File" (in 3 hieronder beschreven).
- Regular Expression gebaseerde sjablonen: Reguliere expressies zijn een standaard aanpak voor het matchen van patronenin tekst. Kies deze optie wanneer de bestandsnaam en / of directory-structuur bevatten genoeg informatie om groepsfoto's en de naamgeving overeenkomt met een van de reeds bestaande sjablonen. Aangepaste sjablonen op basis van reguliere expressies kan ook handmatig worden gedefinieerd en hergebruikt. Deze geavanceerde optie wordt alleen aanbevolen voor gebruikers die vertrouwd zijn met reguliere expressies.
- Metadata File: Kies deze optie voor ultieme aanpasbaarheid. Definieer en plaats een door komma's gescheiden waarden bestand met bestandsnamen en metadata gekoppeld aan elke afbeelding (CSV). Een voorbeeld van het bestandsformaat is beschikbaar op de download gedeelte van de website (phenoripper.org). U laadt het bestand via de interface om de informatie die het bevat.
- PhenoLoader: Kies deze optie om semi-automatisch te laden gegevens wanneer de bestandsnaam en / of directory-structuur bevatten genoeg informatie om groepsfoto's als gewenst (bijvoorbeeld B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kunnen wijzen dat het beeld is van goed B16, worden cellen behandeld met het geneesmiddel waarvan de id is 5, en het beeld vangt de nucleaire DAPI vlek - met deze naam conventie konden alle beelden van zowel A1 of behandeld met Drug 5 gemakkelijk worden gegroepeerd). De wizard zalbegeleiden de gebruiker stap voor stap naar metadata associëren met afbeelding groepen en definieer de markeerders als volgt:
- Selecteer het metadata veld dat herhalingen definieert in het experiment om overbodige bemonstering te voorkomen. Voor datasets die herhalingen (bijvoorbeeld alle afbeeldingen in een goed gelijk te zijn) bevatten, ze te groeperen (bijvoorbeeld door ook) kan improve prestaties. In de meeste gevallen is het redelijk om de standaard optie "Random (weet niet)", die een willekeurig setje selecteert kiezen.
2.2 Instellen Analyse Parameters
Klik op "Parameters instellen" om de parameters die nodig zijn om de dataset te verwerken definiëren. De parameters te definiëren zijn op het linkerpaneel. Het rechter paneel toont een samengevoegde steekproef van de dataset. Klik op de links / rechts pijlen om te schakelen tussen verschillende beelden.
- Drempel Intensiteit: Kies een geschikte drempelwaarde ruwweg identificeren cellulaire delen (in plaats van de achtergrond, niet-cellulaire gebieden) beelden. Een drempel wordt vooraf berekend door PhenoRipper, maar kan worden aangepast om accentuering van cellulaire regio's te verbeteren met behulp van de schuifbalk beschikbaar op de top van het beeld. Als een gekozen drempel werkt niet in alle beelden, verlaagt de drempel om niet-cellulaire regio's in plaats van het laten vallen van cellulaire regio's omvatten.
- Blok Size: Kies een geschikte blok grootte (in pixels) om net het beeld. Blokken van opgegeven grootte zal worden gelegd op de afbeelding. Pas blokgrootte tot gemiddeld 20-30 blokken / cel te verkrijgen. Om het raster superimpose over de afbeelding klikt u op het vakje aan de voorkant van het veld "Block Size".
- Optioneel Parameters: Als de auto-geschaalde afbeeldingen niet markers met de gewenste relatieve intensiteiten (bijvoorbeeld een kleur verzadigd) weergeven of als markers moeten worden geschrapt uit de analyse, gebruik dan de "Adjust Channel Intensity" optie. Om cellulaire gebieden op een subset van markers de "Channels gebruikt voor Threshold" optie. Standaard keuzes van andere parameters zijn meestal voldoende, maar indien nodig, aan te passen ze met behulp van de "Advanced Analysis Options".
- Voer de analyse door op "PhenoRip" op de belangrijkste toepassing paneel. PhenoRipper automatisch terugkerende types blok herkennen in de beelden. Fenotypische profielen worden gegenereerd voorelk beeld op de fracties van de verschillende blokken in.
3. Exploring Resultaten
- Bekijk de relatie tussen de fenotypische profielen van de beelden met de PhenoBrowser (figuur 1). De PhenoBrowser interface bestaat uit vier panelen: de linker bovenpaneel is een grafische weergave (spreidingsdiagram) van de relatieve gelijkenis tussen verschillende beelden / omstandigheden, de twee panelen op de rechter display steekproef beelden van geselecteerde voorwaarden, en de uiteindelijke paneel (staafdiagram ) vergelijkt hun fenotypische profielen.
- "Gooi Lege Frames" met behulp van het menu "Data Processing".
- Verwijder afbeeldingen van slechte kwaliteit: Ten eerste, om te studeren individuele afbeeldingen wilt uitschakelen groepering in het menu "Data Processing". Vervolgens klikt u door de uitschieter punten in de scatterplot en gooi lage kwaliteit beelden (bijvoorbeeld onscherp, kleuring artefact).
- Ontdek de gegevens: Beslis welk veld definieert metadataeen basiseenheid van vergelijking (bijvoorbeeld om te vergelijken drugs, beelden met dezelfde waarde van het veld metadata "drug" moeten worden gegroepeerd). Alles samenvouwen beelden met dezelfde waarde van deze metadata veld een datapunt met "Group By". Zo zal groeperen door middel gemiddelde van de beelden in elk geneesmiddel een punt per geneesmiddel opleveren. In de buurt (of verre) punten in de scatterplot weerspiegelen omstandigheden die vergelijkbaar (of ongelijksoortige) cellulaire fenotypes ontlokken. Kleur of etiket punten (menu data display) op basis van beschikbare metadata te helpen interpreteerbaarheid. De 3D-plot is draaibaar door te klikken op de "draaibare" vakje en door te klikken op de linker knop en slepen met de muis overheen.
- Kies twee verschillende plaatsen om ze direct te vergelijken. Het beeld panelen zullen monster beelden weer voor elk punt, en het staafdiagram panel zal het blok soorten wier optreden frequenties zijn het meest verschillend tussen de twee punten te tonen.
- Start de clustergram uit de "Clustergram menu" naar een meer globale visie op de relatie tussen de soorten blok en experimentele omstandigheden. Door het groeperen van beide soorten blok en voorwaarden, deze voorstelling belicht de cellulaire fenotypes die beste groepen van omstandigheden (figuur 5) te onderscheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier testten we de mogelijkheid van deze werkstroom groep geneesmiddelen op basis van hun werkingsmechanisme. HeLa-cellen werden uitgezaaid in 30 putjes van een 384-wells plaat en gekleurd voor DNA / actine / α-tubuline. De specifieke primaire antilichamen, fluorescent gelabelde secundaire antilichamen, en andere fluorescerende vlekken die werden gebruikt zijn vermeld in Tabel Materials. Putjes werden behandeld met 15 geneesmiddelen behoren tot drie klassen mechanistische (histon deacetylase remmende, microtubuli targeting en DNA beschadigende) gedurende 24 uur en afgebeeld met een epifluorescentie microscoop bij 20X objectiefvergroting. Zestien beelden werden verkregen voor elk putje, voor een totaal van 480 beelden (x3 kanalen). De hier beschreven gegevens kunnen worden gedownload van www.phenoripper.org.
Zoals hierboven beschreven, werd PhenoRipper gebruikt om deze beelden te analyseren. De voorgrond drempel werd ingesteld op 5% (bijvoorbeeld 5% van de maximale intensiteit) en de blokgrootte tot 20 pixels (Figur e 2). Analyse van deze data set duurde ongeveer 10 minuten op een standaard desktop computer (een 64 bit, 8 core machine op 3,2 GHz, met 16 GB RAM). De PhenoBrowser interface (Figuur 3) werd gebruikt om de resultaten te verkennen. Beeldvormingsartefacten zoals slechte kleuring en lege frames waren gemakkelijk te herkennen omdat ze stond als duidelijke uitschieters (figuur 4). De relatieve fenotypische gelijkenissen tussen beelden worden gevisualiseerd in de linker paneel van figuur 3 met behulp van multidimensionale schaling. Elk punt staat voor een enkel beeld gekleurd door werkingsmechanisme haar drug. Deze grafiek toont dat fenotypische profielen kunnen worden gebruikt om groepen geneesmiddelen hun werkingsmechanisme. Een clustergram van de gegevens (figuur 5) gaat deze groep op de fenotypische profielen.
s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 1. Workflow voor fluorescentie microscopie met behulp PhenoRipper. Worden Cell lijnen uitgezet in een plaat, dan verstoringen worden toegevoegd aan elk putje en de plaat wordt geïncubeerd. Beelden worden verkregen met behulp van een geautomatiseerde microscoop en vervolgens snel geanalyseerd met behulp PhenoRipper. Zo worden de resultaten van het huidige experiment bekend kort na beeldvorming en kan, indien nodig, worden gebruikt om de setup voor toekomstige iteraties verfijnen. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Instellen PhenoRipper parameters: Blok grootte en drempel intensiteit worden ingesteld met behulp van een grafische interface met real-time visuele feedbac k. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. PhenoBrowser Interface voor het verkennen PhenoRipper resultaten: PhenoBrowser interface is verdeeld in vier panelen: de linker bovenpaneel is een scatterplot weergave van de relatieve overeenkomsten tussen verschillende beelden / omstandigheden, de twee panelen op de rechter display steekproef beelden van geselecteerde voorwaarden, en de linker panel vergelijkt hun fenotypische profielen. Klik hier voor grotere afbeelding .
load/51280/51280fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 4. Voorbeeld van een uitschieter in de scatter plot (gemarkeerd) met een kleuring artefact (zie video). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 5. Clustergram voorstelling van PhenoRipper profielen: Elke rij staat voor een enkele drug, en elke kolom een soort blok. De grijswaarden weerspiegelen de fenotypische profielen, di de fractie van de verschillende blokken voor elk geneesmiddel. Een lichtere waarde geeft een hogere fractie van dat type blok. Hiërarchische clustering grotendeels scheidt de verschillende geneesmiddelen door farmaceutische klasse (rood / blauw / grEEN kleur aan de rechterkant). Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven workflow zorgt voor een snelle en eenvoudige karakterisering en vergelijking van microscopie beelden. We eerst aangetoond hoe deze workflow experiment optimalisatie, bijvoorbeeld kan helpen door snel uitvoeren van kwaliteitscontrole op microscopie beelden. Vervolgens toonden we het potentieel voor het analyseren hoog-gegevens: we konden groep geneesmiddelen op basis van hun werkingsmechanisme. De groepering van geneesmiddelen was vergelijkbaar met die gevonden met complexere 6, hoewel PhenoRipper was ordes van grootte sneller.
Hoewel we deze aanpak robuust tegen sporadische experimentele schommelingen hebben gevonden, net als bij elke afbeelding aanpak, zal uitlezing beïnvloed worden door systematische niet-biologische effecten. Bijvoorbeeld, kan plaat-to-plate variatie in marker intensiteit de biologische effecten van belang te maskeren. Het effect van dergelijke voorwerpen kan worden verminderd door geschikte correcties 7, 8 zoals plaat om plaat normalisatie en achtergrond aftrekken. De door PhenoRipper profielen kunnen ook worden beïnvloed door variaties in celdichtheid. Hoewel dit gedrag veelal wenselijk is (als gevolg van overleving of groei), kan het effect worden verminderd door niet-selecteren van de optie "informatie" in het "Geavanceerde parameters".
Bij het kiezen van de juiste methode voor analyse, moeten gebruikers de afweging tussen snelheid, gebruiksgemak en niveau van analytische detail beschouwen. Segmentatieloze methoden 9-11 zoals PhenoRipper zijn meestal sneller en gemakkelijker te gebruiken dan een enkele cel-gebaseerde methoden zoals CellProfiler 2. Het nadeel van segmentatieloze methoden is het onvermogen om specifieke eencellige eigenschappen kwantificeren. De gebruiker moet dus om te beslissen over de juiste aanpak, gebaseerd op zijn of haar behoeften. Bij nauwkeurige vergelijking of groepering van experimentele omstandigheden is de belangrijkste doelstelling, hebben wij geconstateerd dat het niveau vandetail vastgelegd door PhenoRipper is meer dan voldoende. In het bijzonder, onderzoekers gericht op high-throughput experimenten zal sterk profiteren van de mogelijkheid om snel en eenvoudig de beeldgegevens te verkennen. Tot slot zal de hier gepresenteerde workflow mogelijk bankje wetenschappers gemakkelijk snel verkennen hun fluorescentie microscopie beelden na de overname en een snelle turn-around te vergemakkelijken tussen analyses en beeldvorming. Wij geloven dat deze workflow zal de drempel te verlagen tot het uitvoeren van kwantitatieve beeldanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Adam Coster en alle andere leden van de Altschuler en Wu labs voor nuttige feedback en discussies. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institute of Health verleent R01 GM085442 en CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) en de Welch Stichting I-1619 (SJA) en I-1644 (LFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
