Summary
यहाँ हम तेजी से PhenoRipper, एक हाल ही में विकसित छवि विश्लेषण मंच का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का संग्रह, विश्लेषण और खोज के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन.
Abstract
उच्च throughput माइक्रोस्कोपी में तेजी से प्रगति के बावजूद, मात्रात्मक छवि आधारित assays अभी भी महत्वपूर्ण चुनौतियों मुद्रा. विशेष छवि विश्लेषण उपकरणों की एक किस्म उपलब्ध हैं, ज्यादातर परंपरागत छवि विश्लेषण आधारित workflows (विश्लेषण मापदंडों के ठीक ट्यूनिंग के लिए) तेजी से सीखने से घटता है और इमेजिंग और विश्लेषण के बीच लंबे समय से बदलाव के समय में परिणाम. विशेष रूप से, सेल विभाजन, एक छवि में व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान करने की प्रक्रिया, इस संबंध में एक बड़ी अड़चन है.
यहाँ हम PhenoRipper, तेजी से विश्लेषण और माइक्रोस्कोपी छवियों के अन्वेषण के लिए बनाया गया एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म पर आधारित एक वैकल्पिक, सेल विभाजन से मुक्त कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं. यहाँ प्रस्तुत पाइपलाइन सेल संस्कृतियों के immunofluorescence माइक्रोस्कोपी छवियों के लिए अनुकूलित और न्यूनतम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप की आवश्यकता है. आधे घंटे के भीतर, PhenoRipper एक ठेठ 96 अच्छी तरह से प्रयोग से डेटा का विश्लेषण और छवि प्रोफाइल उत्पन्न कर सकते हैं. उपयोगकर्ताओं कर सकते हैंतो नेत्रहीन, अपने डेटा का पता लगाने के उनके प्रयोग पर गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रदर्शन, perturbations के जवाब सुनिश्चित करने और प्रतिकृति के reproducibility की जाँच करें. इस विश्लेषण और परख अनुकूलन के दौरान महत्वपूर्ण है जो प्रयोग के बीच एक तीव्र प्रतिक्रिया चक्र की सुविधा. इस प्रोटोकॉल में ही नहीं, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक पहली पास विश्लेषण के रूप में उपयोगी है, लेकिन यह भी एक को समाप्त करने के लिए अंत समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से स्क्रीनिंग के लिए. यहाँ वर्णित कार्यप्रवाह इस तरह के उच्च throughput स्क्रीन द्वारा उत्पन्न उन के रूप में बड़े डेटा सेट करने के लिए तराजू, और सही ढंग से जैविक प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर phenotype द्वारा समूह प्रयोगात्मक शर्तों को दिखाया गया है. PhenoBrowser इंटरफ़ेस प्ररूपी अंतरिक्ष की खोज और जैविक एनोटेशन के लिए छवि गुण संबंधित करने के लिए एक सहज ज्ञान युक्त रूपरेखा प्रदान करता है. साथ में ले ली, यहां वर्णित प्रोटोकॉल छवि आधारित स्क्रीन की मात्रात्मक विश्लेषण को गोद लेने के लिए बाधाओं को कम करेगा.
Introduction
पिछले दशक के दौरान, इमेजिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में तेजी से प्रगति के कई प्रयोगशालाओं उच्च throughput माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने की क्षमता दे दिया है. अब चुनौती विश्लेषण से एक के लिए इमेजिंग में से एक से स्थानांतरित कर दिया गया है. कैसे हम तुलना, विशेषताएँ, और एक ठेठ उच्च throughput इमेजिंग स्क्रीन द्वारा उत्पन्न जटिल अभी तक सूक्ष्म phenotypes की धार तलाश कर सकते हैं?
छवि विश्लेषण और सूचना विज्ञान प्लेटफार्मों के एक नंबर छवियों के बड़े संग्रह से जैविक जानकारी निकालने के लिए उपयोगकर्ताओं को परिष्कृत toolboxes 1-3 दे दिया है. फिर भी कई महत्वपूर्ण बाधाओं उच्च throughput छवि आधारित स्क्रीन से डेटा का विश्लेषण करने में रहते हैं. (ब्याज की व्यवस्था करने के लिए) छवियों और एल्गोरिथम मापदंडों के ठीक ट्यूनिंग की उचित अभिलक्षण चुनने के साथ कठिनाइयों अक्सर विशेष रूप से छवि विश्लेषण विशेषज्ञता के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए लंबे समय सेटअप समय में परिणाम. विशेष रूप से, सेल विभाजन, एक में व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान करने की प्रक्रियाn छवि, इस संबंध में एक बड़ी अड़चन है. विभाजन इस तरह के सेल प्रकार, सेल घनत्व और जैव मार्कर के रूप में प्रयोगात्मक मापदंडों को अत्यधिक संवेदनशील हो, और अक्सर एक बड़े डेटा सेट के लिए दोहराया समायोजन की आवश्यकता कर सकते हैं. इन कारणों के लिए, छवि विश्लेषण अक्सर बल्कि प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह का एक एकीकृत हिस्सा से विशेषज्ञों द्वारा निष्पादित एक स्वतंत्र, टर्मिनल कदम है. इस विश्लेषण और प्रयोग, परख विकास का एक महत्वपूर्ण भाग के बीच तेजी से प्रतिक्रिया चक्र precludes.
यहाँ हम उच्च throughput प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए अनुकूलित और aforementioned कठिनाइयों के कई टाल रहा है कि एक वैकल्पिक कार्यप्रवाह वर्णन. यह अंत करने के लिए, हम PhenoRipper 4, तेजी से अन्वेषण और माइक्रोस्कोपी छवियों के विश्लेषण के लिए एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म का इस्तेमाल करते हैं. गौरतलब है कि PhenoRipper एकल कक्षों की पहचान करने का प्रयास नहीं द्वारा सेल विभाजन के साथ शामिल चुनौतियों के कई बचा जाता है. इसके बजाय, PhenoRipper पिक्सेल में छवियों को विभाजित करता हैsubcellular आकार के ब्लॉक और वे होते ब्लॉकों के मामले में छवियों की विशेषता है. विशेष रूप से, PhenoRipper मार्कर colocalization आधारित सुविधाओं के मामले में ब्लॉक प्रोफाइल और स्वचालित रूप से प्रशिक्षण छवियों में सबसे अधिक प्रतिनिधि ब्लॉक प्रकार 4 पहचानती है. PhenoRipper तो प्रत्येक ब्लॉक ज्यादा समान प्रतिनिधि ब्लॉक का प्रकार देता है, और अंत में वे शामिल ब्लॉकों के प्रकार के आधार पर छवियों की विशेषता है.
अधिक पारंपरिक एकल कोशिका आधारित दृष्टिकोण की तुलना में, इस दृष्टिकोण न्यूनतम ठीक ट्यूनिंग और विशेषज्ञता की आवश्यकता है. ब्लॉक आकार और ग्राफिकल राय के साथ स्थापित कर रहे हैं, जो दोनों के एक दहलीज तीव्रता (एक छवि के noncellular अंश त्यागने के लिए), जैसे:, उपयोगकर्ताओं को केवल दो मानकों सेट करने की जरूरत है. महत्वपूर्ण बात है, यहाँ वर्णित कार्यप्रवाह गति और कम से कम ठीक ट्यूनिंग बड़ी समय और विश्वसनीयता लाभ प्रदान करता है जहां बहुत बड़ा डेटा सेट, को आसानी से पैमाने पर करने के लिए 4 दिखाया गया है. अभ्यास में, हम पाते हैं कि इस एप्लिकेशनरोच दोनों परिमाण 4 के कई आदेशों द्वारा सेटअप और चलाने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है.
PhenoRipper के प्राथमिक उत्पादन कोशिकाओं समान phenotypes प्रदर्शित करने का कारण है कि प्रयोगात्मक शर्तों के समूहों की पहचान करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है, जो छवि समानता का एक दृश्य प्रतिनिधित्व है. आम तौर पर पाता PhenoRipper समूहों और अधिक समय लेने वाली है, सेल आधारित विधियों 4 द्वारा उत्पन्न उन लोगों के बराबर "जैविक विवेचनीयता" है. व्यवहार में, यह अक्सर एक ठेठ 96 अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोग का प्रदर्शन करने के आधे घंटे के भीतर, पूर्व छवि विश्लेषण अनुभव के बिना एक प्रयोगकर्ता अपने या अपने प्रयोग के प्रदर्शन के बारे में एक विश्वसनीय readout मिल सकता है. प्रयोगकर्ता तो विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के बीच संबंधों की खोज और छवि phenotypes करने के लिए इन रिश्तों से संबंधित शुरू कर सकते हैं.
हम प्रभाव का विश्लेषण करके यहाँ इस कार्यप्रवाह का प्रदर्शनडीएनए और cytoskeletal मार्करों के लिए दाग HELA कोशिकाओं पर अलग यंत्रवत कक्षाओं में दवाओं की. दवाओं की एक ही वर्ग के साथ इलाज किया कोशिकाओं की छवियों को एक साथ समूहीकृत, और (इतने पर ध्यान केंद्रित करने और कोशिकाओं के बाहर धुंधला कलाकृतियों) गरीब गुणवत्ता के चित्र की पहचान करने और संभावित त्यागने के लिए उन्हें आसान बनाने, outliers के रूप में प्रकट हुए थे.
इस कार्यप्रवाह छवि आधारित assays की एक बड़ी संख्या के लिए उपयोगी है, एक अलग दृष्टिकोण संभवतः अधिक जानकारीपूर्ण हो सकता है, जहां स्पष्ट रूप से कई स्थितियों रहे हैं. उदाहरण के लिए, PhenoRipper से उत्पादन मुख्य रूप से प्रयोगात्मक शर्तों के पार प्रतिदीप्ति पैटर्न के एक रिश्तेदार की तुलना है. एक विशिष्ट एकल कक्ष विशेषता का एक निरपेक्ष लक्षण वर्णन (एक सेल में speckles के उदाहरण के लिए संख्या) के बजाय आवश्यक था, तो एक एकल कोशिका आधारित विश्लेषण की आवश्यकता होगी. फिर भी, यहां तक कि इस प्रकार की स्थिति में, PhenoRipper इन एकल कक्ष phenotypes में परिवर्तन का पता लगाने की संभावना है और इसलिए परख OPTI के लिए एक उपयोगी उपकरण होmization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. तैयारी नमूने और इमेजिंग
- सेल संस्कृति
- नियमित संस्कृतियों भाजित और 20-70% संगम पर बनाए रखें. प्रयोग करने से पहले एक दिन, (, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम सामग्री की तालिका देखें) DMEM में HELA कोशिकाओं के बढ़ने और 10% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
- प्रयोग के दिन, विभाजित कोशिकाओं संस्कृति (लगभग 50% मिला हुआ) में बढ़ रही है.
- कुछ सेकंड के लिए trypsin / EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड) के लगभग 2 मिलीलीटर का पर्दाफाश, पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) के साथ कोशिकाओं को धो लें. अतिरिक्त trypsin / EDTA Aspirate और ~ 3 मिनट के लिए आरटी पर हुड में trypsin / EDTA की एक पतली फिल्म में नहाया कोशिकाओं रहते हैं.
- यंत्रवत् दो बार बोतल मिलाने और सीरम पूरक मीडिया के साथ कोशिकाओं को अलग. कक्षों की गणना और मीडिया की 5,000 cells/50 μl को पतला और तुरंत अच्छी तरह से एक स्वचालित तरल से निपटने रोबोट (केवल 30 का उपयोग करते हुए एक 384 अच्छी तरह से गिलास नीचे थाली पर 50 μl / अच्छी तरह से थालीथाली का ओं) का यहां इस्तेमाल किया जाता है.
- कुओं 5 में बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए 30 मिनट के लिए आरटी पर थाली सेते हैं. रात भर एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में आर टी ऊष्मायन, जगह प्लेटों के बाद.
- प्रत्येक दवा के दो प्रतियों में assayed किया जाएगा. थाली पहले से ही मीडिया वाले पर इसी वेल्स को दवा के 25 μl जोड़ें.
- 24 घंटे बाद दवा इलाज में पीबीएस में 4% paraformaldehyde समाधान के साथ प्लेट को ठीक करें.
- धुंधला हो जाना
यहां इस्तेमाल किया गया है कि विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी, fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी और अन्य फ्लोरोसेंट दाग सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं.- Permeabilize 3 मिनट के लिए टीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 समाधान (Tris बफर खारा) के साथ कोशिकाओं को ठीक किया, और TBST (Tris बफर खारा + बीच 20) 3x से धो लें. रोकने के लिए TBST में 5% BSA (गोजातीय सीरम albumin) समाधान जोड़ें.
- 2 घंटे के लिए आरटी पर थाली सेते हैं और फिर TBST 3x से धो लें.
- प्राथमिक एंटीबॉडी dilut बनाओTBST में 5% BSA में आयनों (सामग्री की तालिका देखें) और अच्छी तरह से 10 μl / जोड़ें. 2 घंटे के लिए आरटी पर थाली सेते हैं, और फिर TBST के साथ 3x धो लो.
- TBST में माध्यमिक एंटीबॉडी dilutionin 5% BSA (सामग्री की तालिका देखें) बनाने के लिए और अच्छी तरह से 10 μl / जोड़ें.
- 2 घंटे के लिए आरटी पर अंधेरे में थाली सेते हैं और फिर TBST के साथ दो बार धोने.
- पीबीएस में (सामग्री की तालिका देखें) Hoechst और phalloidin के लिए dilutions तैयार है और अच्छी तरह से 10 μl / जोड़ें.
- आरटी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में थाली सेते हैं.
- बाद 2 TBST washes, 4 डिग्री सीओ / एन पर पन्नी और दुकान में कवर प्लेटें
- इमेजिंग
1x1 कैमरा binning साथ एक 20x उद्देश्य का उपयोग एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों मोल. 480 छवियों (X3 चैनल) की कुल के लिए, प्रत्येक के लिए अच्छी तरह सोलह छवियों मोल.
2. छवियों का विश्लेषण
डाउनलोड करें और phenoripper.org से PhenoRipper स्थापित करें, और आईएमए का विश्लेषण शुरू करने के लिए PhenoRipper लांचGES. PhenoRipper वर्तमान में झगड़ा का समर्थन करता है, पीएनजी, और जेपीईजी और MATLAB द्वारा समर्थित अन्य सभी प्रारूपों (माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर आम तौर पर झगड़ा में निर्यात का समर्थन).
2.1 डेटा लोड
- कोई मानक नामकरण / संगठन सम्मेलन लोड हो रहा है छवियों और जोड़ मेटाडाटा बना सकते हैं जो माइक्रोस्कोपी छवियों, के लिए मौजूद है (इस तरह के उपचार प्रकार के रूप में यानी प्रयोगात्मक एनोटेशन, अच्छी तरह से संख्या और इतने पर) कार्यप्रवाह की सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है. (नीचे वर्णित) प्रस्तुत तरीकों में से एक का चयन करें.
- PhenoLoader: के रूप में वांछित फ़ाइल नाम और / या निर्देशिका संरचना (जैसे B16 HeLa_Drug5-DAPI.png छवि अच्छी तरह B16 से संकेत मिलता है कि हो सकता है समूह छवियों को पर्याप्त जानकारी होती है जब डेटा लोड अर्द्ध स्वचालित रूप से करने के लिए इस विकल्प को चुनें, कोशिकाओं का इलाज कर रहे हैं इस नामकरण परंपरा के साथ, अच्छी तरह से A1 या ड्रग 5 के साथ व्यवहार से सभी छवियों को आसानी से बांटा जा सकता है) - जिसका आईडी 5 है, और छवि परमाणु DAPI दाग कब्जा दवा के साथ. जादूगर होगाछवि समूहों के साथ मेटाडेटा सहयोगी है और इस प्रकार के रूप मार्कर को परिभाषित करने के लिए कदम से उपयोगकर्ता कदम गाइड:
- PhenoLoader खिड़की तक पहुंचने के लिए "फ़ाइल संरचना" पर क्लिक करें.
- छवि डाटासेट वाली निर्देशिका का चयन करने के लिए "को परिभाषित रूट निर्देशिका" पर क्लिक करें. फिर विश्लेषण (वैकल्पिक, खाली छोड़ा जा सकता है) के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं कि फ़ाइलें (अप्रयुक्त फ़ाइलें) फिल्टर.
- प्रयोग में इस्तेमाल किया बायोमार्कर निर्दिष्ट और छवियों के साथ उन्हें संबद्ध करने के लिए "को परिभाषित मार्करों" पर क्लिक करें. विशेष रूप से, तो अनोखे बायोमार्कर की पहचान करता है कि फ़ाइल नाम के एक हिस्से का चयन एक छवि फ़ाइल पर क्लिक करें. अंत में, प्रत्येक biomarker के लिए एक नाम दर्ज करें.
- प्रत्येक छवि के साथ जानकारी संबद्ध करने के लिए "परिभाषित करें मेटाडेटा" पर क्लिक करें. विशेष रूप से, एक छवि फ़ाइल पर क्लिक करें और फिर छवि जानकारी (अच्छी तरह से नाम के लिए उदाहरण के लिए "B16") की पहचान फ़ाइल नाम के एक हिस्से का चयन करें. एक विंडो एक समूह का नाम (उदाहरण के लिए "के लिए पूछ हमकरूँगा ") एक नाम दर्ज, पॉप जाएगा. फ़ाइल नाम से निकाली समूह के सदस्य) जैसे अच्छी तरह से नामों की पूरी सूची (समूह मेज पर दिखाया जाएगा. फ़ाइल नाम में उपस्थित नहीं अतिरिक्त जानकारी जोड़ने के लिए, पर क्लिक करें" (वैकल्पिक) अगला ", अतिरिक्त समूह का नाम (उदाहरण के लिए दर्ज करें" मेटाडाटा समूह जोड़ें "बटन. पर क्लिक करें" दवा ") और पूर्वनिर्धारित समूह के प्रत्येक मान के लिए (उदाहरण के लिए" ठीक है "), अपने मूल्य दर्ज करें (उदाहरण के लिए" Taxol ") . जोड़ा जा सकता है कि अतिरिक्त समूहों की संख्या की कोई सीमा नहीं है.
- अंत में, मेटाडाटा फ़ाइल उत्पन्न करने और विश्लेषण जारी रखने के लिए "बनाएँ Metadatafile" पर क्लिक करें. एक मेटाडाटा फ़ाइल पहले से उत्पन्न किया गया है, तो ऊपर के चरणों को सीधे विकल्प (नीचे 3 में वर्णित) "मेटाडाटा फ़ाइल" का उपयोग कर फ़ाइल को लोड करने से बचा जा सकता है.
- नियमित अभिव्यक्ति आधारित टेम्पलेट्स: नियमित अभिव्यक्ति पैटर्न से मेल खाते के लिए एक मानक दृष्टिकोण हैंपाठ में. फ़ाइल का नाम और / या निर्देशिका संरचना समूह छवियों को पर्याप्त जानकारी होती है और सम्मेलन नामकरण पूर्व मौजूदा टेम्पलेट्स में से एक से मेल खाता है, तो इस विकल्प चुनें. नियमित अभिव्यक्ति के आधार पर कस्टम टेम्पलेट भी मैन्युअल रूप में परिभाषित किया और पुन: उपयोग किया जा सकता है. यह उन्नत विकल्प केवल नियमित अभिव्यक्ति के साथ परिचित उपयोगकर्ताओं के लिए सिफारिश की है.
- मेटाडाटा फ़ाइल: परम customizability के लिए इस विकल्प को चुनें. परिभाषित करें और एक अल्पविराम से अलग मान प्रत्येक छवि के साथ जुड़े filenames और मेटाडाटा युक्त (सीएसवी) फाइल लोड. फ़ाइल स्वरूप का एक उदाहरण वेब साइट (phenoripper.org) के भाग पर उपलब्ध है. बस इसमें दी गई जानकारी प्रदर्शित करने के लिए इंटरफेस के माध्यम से फाइल लोड.
- PhenoLoader: के रूप में वांछित फ़ाइल नाम और / या निर्देशिका संरचना (जैसे B16 HeLa_Drug5-DAPI.png छवि अच्छी तरह B16 से संकेत मिलता है कि हो सकता है समूह छवियों को पर्याप्त जानकारी होती है जब डेटा लोड अर्द्ध स्वचालित रूप से करने के लिए इस विकल्प को चुनें, कोशिकाओं का इलाज कर रहे हैं इस नामकरण परंपरा के साथ, अच्छी तरह से A1 या ड्रग 5 के साथ व्यवहार से सभी छवियों को आसानी से बांटा जा सकता है) - जिसका आईडी 5 है, और छवि परमाणु DAPI दाग कब्जा दवा के साथ. जादूगर होगाछवि समूहों के साथ मेटाडेटा सहयोगी है और इस प्रकार के रूप मार्कर को परिभाषित करने के लिए कदम से उपयोगकर्ता कदम गाइड:
- निरर्थक नमूने से बचने के लिए प्रयोग में replicates को परिभाषित करता है कि मेटाडाटा क्षेत्र का चयन करें. छापें सकते हैं (अच्छी तरह से उदा) एक साथ उनका समूह, प्रतिकृति (एक कुएं में जैसे सभी छवियों समान होना चाहिए) होते हैं कि डेटा सेट के लिएove प्रदर्शन. ज्यादातर मामलों में यह एक यादृच्छिक सबसेट का चयन करता है जो डिफॉल्ट विकल्प "रैंडम (पता नहीं)" का चयन करने के लिए उचित है.
2.2 विश्लेषण मानकों की स्थापना
डाटासेट प्रक्रिया के लिए आवश्यक मानकों को परिभाषित करने के लिए "निर्धारित मापदंडों" पर क्लिक करें. परिभाषित करने के लिए मापदंडों के बाईं पैनल पर हैं. सही पैनल डाटासेट के किसी मर्ज किए गए नमूना प्रदर्शित करता है. विभिन्न छवियों के बीच स्विच करने के लिए छोड़ दिया / सही तीर पर क्लिक करें.
- तीव्रता सीमा: मोटे तौर पर छवियों के सेलुलर भाग (बजाय पृष्ठभूमि, noncellular क्षेत्रों) की पहचान करने के लिए एक उचित मूल्य सीमा चुनें. एक सीमा PhenoRipper द्वारा precalculated है, लेकिन इस छवि के शीर्ष पर उपलब्ध स्क्रॉलबार का उपयोग सेलुलर क्षेत्रों की हाइलाइटिंग सुधार करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. एक चुने हुए सीमा सभी छवियों भर में काम नहीं करता है, noncellular क्षेत्रों के बजाय सेलुलर क्षेत्रों छोड़ने शामिल करने के लिए इतनी के रूप में सीमा कम.
- ब्लॉक एसize: ग्रिड के लिए छवि (पिक्सेल में) एक उपयुक्त ब्लॉक आकार चुनें. निर्दिष्ट आकार के ब्लॉक छवि पर आरोपित किया जाएगा. 20-30 ब्लॉक / सेल के एक औसत प्राप्त करने के लिए ब्लॉक आकार समायोजित करें. "ब्लॉक आकार" क्षेत्र के सामने चेक बॉक्स पर क्लिक करें छवि पर ग्रिड को ऊपर रखना.
- वैकल्पिक पैरामीटर्स: ऑटो स्केल छवियों वांछित रिश्तेदार तीव्रता के साथ मार्कर (जैसे एक रंग संतृप्त है) प्रदर्शित करने या मार्कर के विश्लेषण से छोड़ा जा करने की आवश्यकता है, "चैनल तीव्रता को समायोजित" विकल्प का उपयोग नहीं करते हैं. मार्करों के एक सबसेट पर सेलुलर क्षेत्रों की पहचान करने के लिए विकल्प "सीमा के लिए इस्तेमाल किया चैनल" का उपयोग करें. अन्य मानकों के डिफ़ॉल्ट विकल्प आमतौर पर पर्याप्त हैं, लेकिन यदि आवश्यक हो, "उन्नत विश्लेषण विकल्प 'का उपयोग कर उन्हें समायोजित.
- मुख्य आवेदन पैनल पर "PhenoRip" दबाकर विश्लेषण चला. PhenoRipper स्वतः छवियों में बारम्बार ब्लॉक प्रकार की पहचान करेगा. प्ररूपी प्रोफाइल के लिए उत्पन्न हो जाएगाइसमें विभिन्न प्रकार के खंड अंशों के आधार पर प्रत्येक छवि.
3. तलाश परिणाम
- PhenoBrowser (चित्रा 1) का उपयोग कर छवियों का प्ररूपी प्रोफाइल के बीच संबंधों का पता लगाने. PhenoBrowser इंटरफ़ेस चार पैनलों के होते हैं: ऊपरी बाएँ पैनल अलग छवियों / स्थितियों के बीच सापेक्ष समानता का एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व (तितर बितर साजिश) है, चयनित स्थितियों का सही प्रदर्शन नमूना छवियों, और अंतिम पैनल (बार चार्ट पर दो पैनलों ) उनके प्ररूपी प्रोफाइल के मुकाबले बेहतर है.
- "डाटा प्रोसेसिंग" मेनू का उपयोग "खाली फ्रेम त्यागें".
- गरीब गुणवत्ता छवियों निकालें: पहले, व्यक्तिगत छवियों "डाटा प्रोसेसिंग" मेनू से समूहीकरण को बंद कर अध्ययन करने के लिए. अगला, तितर बितर साजिश में ग़ैर अंक के माध्यम से क्लिक करें और (जैसे ध्यान से बाहर, धुंधला विरूपण साक्ष्य) कम गुणवत्ता छवियों को त्यागें.
- डेटा का अन्वेषण: क्षेत्र परिभाषित करता है मेटाडाटा तय है जोतुलना की एक बुनियादी इकाई (जैसे दवाओं की तुलना करने, मेटाडाटा क्षेत्र के एक ही मूल्य "दवा" के साथ छवियों को एक साथ बांटा जा करने की जरूरत है). "समूह द्वारा" के साथ एक एकल डेटा बिंदु में इस मेटाडाटा क्षेत्र के एक ही मूल्य के साथ सभी छवियों को संकुचित करें. उदाहरण के लिए, दवा से समूहीकरण दवा प्रति एक बिंदु उपज के लिए प्रत्येक दवा के भीतर छवियों औसत जाएगा. तितर बितर साजिश में आसपास के (या दूर) अंक समान (या भिन्न) सेलुलर phenotypes प्रकाश में लाना है कि स्थितियों को दर्शाते हैं. विवेचनीयता सहायता करने के लिए उपलब्ध मेटाडाटा के आधार पर रंग या लेबल अंक (डेटा प्रदर्शन मेनू). 3 डी साजिश "rotatable" चेक बॉक्स पर और बाएँ बटन पर क्लिक करके और इस पर माउस खींचकर क्लिक करके rotatable है.
- सीधे उनकी तुलना करने के लिए दो अलग अलग अंक का चयन करें. छवि पैनलों प्रत्येक बिंदु के लिए नमूना छवियों को प्रदर्शित करेगा, और बार चार्ट पैनल जिसका घटना आवृत्तियों दो अंक के बीच सबसे अलग हैं ब्लॉक प्रकार दिखाएगा.
- सी लांचब्लॉक प्रकार और प्रयोगात्मक शर्तों के बीच संबंधों का एक और अधिक वैश्विक दृष्टि प्रदान करने के लिए "Clustergram मेनू" से lustergram. ब्लॉक प्रकार और शर्तों दोनों समूह द्वारा, इस प्रतिनिधित्व सबसे अच्छी स्थिति के समूह (चित्रा 5) भेद कि सेलुलर phenotypes पर प्रकाश डाला गया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यहाँ हम कार्रवाई के अपने तंत्र पर आधारित समूह दवाओं के लिए इस कार्यप्रवाह की क्षमता का परीक्षण किया. HELA कोशिकाओं 384 अच्छी तरह से थाली के 30 कुओं में वरीयता प्राप्त और डीएनए / actin / α-ट्यूबिलिन के लिए दाग रहे थे. प्रयोग किया गया है कि विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी, fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी, और अन्य फ्लोरोसेंट दाग सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं. वेल्स तीन यंत्रवत शिक्षा (histone deacetylase बाधा microtubule को निशाना बनाने और डीएनए हानिकारक) 24 घंटे के लिए और 20X उद्देश्य बढ़ाई एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged से संबंधित 15 दवाओं के साथ इलाज किया गया. सोलह छवियों 480 छवियों (X3 चैनल) की कुल के लिए, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए हासिल किया गया. यहाँ वर्णित डेटा www.phenoripper.org से डाउनलोड किया जा सकता है.
ऊपर वर्णित है, PhenoRipper इन छवियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. अग्रभूमि सीमा 5% (अधिकतम संभव तीव्रता का यानी 5%) और 20 पिक्सल को ब्लॉक आकार (Figur के लिए स्थापित किया गया था ई 2). इस डेटा सेट का विश्लेषण (16 जीबी रैम के साथ 3.2 गीगा में एक 64 बिट, 8 कोर मशीन) एक मानक डेस्कटॉप कंप्यूटर पर लगभग 10 मिनट लग गए. PhenoBrowser इंटरफेस (चित्रा 3) के परिणामों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. वे के रूप में स्पष्ट outliers (चित्रा 4) के बाहर खड़ा था के बाद से ऐसे गरीब धुंधला और खाली फ्रेम के रूप में इमेजिंग कलाकृतियों की पहचान करने के लिए आसान थे. छवियों के बीच सापेक्ष प्ररूपी समानता बहुआयामी स्केलिंग का उपयोग चित्रा 3 के शीर्ष बाएं पैनल में कल्पना कर रहे हैं. प्रत्येक बिंदु कार्रवाई की अपनी दवा के तंत्र द्वारा एकल रंगीन छवि का प्रतिनिधित्व करता है. इस साजिश प्ररूपी प्रोफाइल को कार्रवाई के अपने तंत्र द्वारा समूहों दवाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखाता है. डेटा की एक clustergram (चित्रा 5) प्ररूपी प्रोफाइल के लिए इस समूह से संबंधित है.
s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg "चौड़ाई =" 600px "/>
चित्रा 1. PhenoRipper का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए कार्यप्रवाह. सेल लाइनों, एक थाली में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं तो perturbations प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं और थाली incubated है. छवियाँ एक स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त कर लिया और फिर तेजी से PhenoRipper का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. इस प्रकार, वर्तमान प्रयोग के परिणाम शीघ्र ही इमेजिंग के बाद से जाना जाता है और, अगर जरूरत है, भविष्य iterations के लिए सेटअप को परिष्कृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. स्थापना PhenoRipper पैरामीटर: ब्लॉक आकार और सीमा तीव्रता वास्तविक समय दृश्य feedbac साथ एक ग्राफिकल इंटरफ़ेस का उपयोग कर सेट कर रहे हैं कश्मीर. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. PhenoBrowser इंटरफ़ेस चार पैनलों में बांटा गया है: ऊपर छोड़ दिया पैनल अलग छवियों / शर्तों, चयनित स्थितियों का सही प्रदर्शन नमूना छवियों पर दो पैनलों, और निचले बाएँ रिश्तेदार के बीच समानताएं प्रदर्शित एक तितर बितर साजिश है PhenoRipper का भ्रमण करने के लिए PhenoBrowser इंटरफ़ेस पैनल उनके प्ररूपी प्रोफाइल के मुकाबले बेहतर है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
load/51280/51280fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg "चौड़ाई =" 600px "/>
चित्रा 4. एक धुंधला विरूपण साक्ष्य (वीडियो देखें) दिखा रहा है (डाला) तितर बितर साजिश में एक ग़ैर का उदाहरण है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5. PhenoRipper प्रोफाइल के Clustergram प्रतिनिधित्व: प्रत्येक पंक्ति एक ही दवा है, और प्रत्येक स्तंभ एक ब्लॉक प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है. ग्रे पैमाने पर मान प्रत्येक दवा के लिए विभिन्न प्रकार के खंड अंश यानी प्ररूपी प्रोफाइल, दर्शाते हैं. एक लाइटर मूल्य कि ब्लॉक प्रकार का उच्च अंश इंगित करता है. पदानुक्रमित क्लस्टरिंग बड़े पैमाने पर दवा वर्ग द्वारा विभिन्न दवा (लाल / नीले / जीआर अलग करती हैसही पर een रंग). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ वर्णित कार्यप्रवाह तेज और आसान लक्षण वर्णन और माइक्रोस्कोपी छवियों की तुलना की अनुमति देता है. हम पहली बार इस कार्यप्रवाह जल्दी माइक्रोस्कोपी छवियों पर गुणवत्ता नियंत्रण के प्रदर्शन से उदाहरण के लिए प्रयोग अनुकूलन, कैसे मदद कर सकता का प्रदर्शन किया. इसके बाद, हम उच्च throughput स्क्रीनिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन: हम कार्रवाई के अपने तंत्र पर आधारित समूह दवाओं के लिए सक्षम थे. दवाओं के समूह PhenoRipper तेजी परिमाण के आदेश था, भले ही अधिक जटिल तरीकों 6 का उपयोग कर पाया है कि के बराबर था.
हम किसी भी छवि आधारित दृष्टिकोण के साथ के रूप में, छिटपुट प्रयोगात्मक उतार चढ़ाव के खिलाफ मजबूत इस दृष्टिकोण मिल गया है हालांकि, readouts व्यवस्थित nonbiological प्रभाव से प्रभावित हो जाएगा. उदाहरण के लिए, मार्कर तीव्रता में थाली से थाली भिन्नता ब्याज का जैविक प्रभाव मुखौटा हो सकता है. ऐसी कलाकृतियों का प्रभाव उपयुक्त सुधार 7, द्वारा कम किया जा सकता है इस तरह के रूप में पी 8थाली सामान्य बनाने और पृष्ठभूमि घटाव करने के लिए देर हो गई. PhenoRipper द्वारा उत्पन्न प्रोफाइल भी सेल घनत्व में बदलाव से प्रभावित हो सकता है. इस व्यवहार (दर्शाती अस्तित्व या विकास) आमतौर पर वांछनीय है, उसके प्रभाव "उन्नत मापदंडों" में "का उपयोग पृष्ठभूमि जानकारी" विकल्प संयुक्त राष्ट्र का चयन करके कम किया जा सकता है.
विश्लेषण के लिए उपयुक्त विधि को चुनने में, उपयोगकर्ताओं को गति, उपयोग की आसानी और विश्लेषणात्मक विस्तार के स्तर के बीच tradeoff पर विचार करने की जरूरत है. ऐसे PhenoRipper के रूप में विभाजन से मुक्त तरीकों 9-11 आमतौर पर तेजी से और ऐसे CellProfiler 2 के रूप में एक सेल आधारित विधियों से अधिक का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं. विभाजन से मुक्त तरीकों का नुकसान विशिष्ट एकल कक्ष गुण यों की अक्षमता है. उपयोगकर्ता इस प्रकार उसके या उसकी जरूरत के आधार पर उचित दृष्टिकोण के बारे में फैसला करने की जरूरत है. प्रयोगात्मक शर्तों के सटीक तुलना या समूहीकरण मुख्य उद्देश्य होता है, तो हमने पाया है कि का स्तरPhenoRipper द्वारा कब्जा विस्तार पर्याप्त से अधिक है. विशेष रूप से, शोधकर्ताओं जल्दी और आसानी से छवि डेटा पता लगाने की क्षमता से लाभ होगा उच्च throughput प्रयोगों पर जोर दिया. अंत में, यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह बेंच वैज्ञानिकों आसानी से अधिग्रहण के बाद जल्द ही उनके प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का पता लगाने और विश्लेषण और इमेजिंग के बीच एक त्वरित बारी के आसपास की सुविधा के लिए अनुमति देगा. हम इस कार्यप्रवाह मात्रात्मक छवि विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए बाधा कम होगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम एडम कोस्टर और उपयोगी प्रतिक्रिया और विचार विमर्श के लिए Altschuler और वू लैब्स के अन्य सभी सदस्यों को धन्यवाद. इस शोध स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया R01 GM085442 और CA133253 (SJA), R01 GM081549 (एलएफडब्ल्यू), CPRIT RP10900 (एलएफडब्ल्यू), और वेल्श फाउंडेशन मैं-1619 (SJA) अनुदान और मैं-1644 (एलएफडब्ल्यू).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
