Summary
Здесь мы опишем рабочий процесс для быстрого анализа и изучения коллекций флуоресцентной микроскопии изображений с помощью PhenoRipper, недавно разработанной анализа изображений платформу.
Abstract
Несмотря быстрого прогресса в высокой пропускной микроскопии, количественные изображений на основе анализов по-прежнему представляют значительные трудности. В то время как множество специализированных инструментов анализа изображений доступны, большинство традиционных рабочие процессы анализа изображений на основе иметь крутых кривых обучения (для тонкой настройки параметров анализа) и привести к увеличению времени оборота между визуализации и анализа. В частности, сотовый сегментация, процесс идентификации отдельных клеток в изображении, является серьезной проблемой в этом отношении.
Здесь мы представляем альтернативное, сотовый сегментации без рабочего процесса на основе PhenoRipper, в программной платформы с открытым исходным кодом, предназначенный для экспресс-анализа и исследования микроскопии изображений. Трубопровод, представленные здесь оптимизирован для иммунофлюоресценции микроскопии изображений клеточных культур и требует минимального вмешательства пользователя. В течение получаса, PhenoRipper может анализировать данные из типичного эксперимента 96-луночный и генерации профилей изображения. Пользователи могутзатем визуально исследовать свои данные, осуществлять контроль качества на их опыте, обеспечить реакцию на возмущения и проверить воспроизводимость повторах. Это облегчает быстрый цикл обратной связи между анализом и эксперимента, которая имеет решающее значение в процессе оптимизации анализа. Этот протокол полезен не только как первый проход анализа для контроля качества, но также может быть использован в качестве раствора из конца в конец, особенно для скрининга. Рабочий процесс, описанный здесь масштабируется для больших объемов данных, таких, как генерируемых экранов высокой пропускной, и было показано, что группы экспериментальных условиях по фенотипу точно в широком диапазоне биологических систем. Интерфейс PhenoBrowser обеспечивает интуитивный рамки для изучения фенотипическую пространство и относятся изображения свойства биологических аннотации. Взятые вместе, протокол, описанный здесь снизит барьеры для принятия количественный анализ изображений на основе экранов.
Introduction
За последние десять лет, быстрое развитие технологий визуализации дали много лабораторий способность выполнять с высокой пропускной микроскопии. Задача теперь переместился из одного из изображений к одному из анализа. Как мы можем охарактеризовать, сравнивать и исследовать поток сложных еще тонких фенотипов порожденных типичной экране изображения с высокой пропускной?
Ряд изображений анализ и информатика платформ дали пользователям искушенным Ящики для инструментов 1-3 для извлечения биологическую информацию от больших коллекций изображений. Тем не менее многие значительные препятствия остаются в анализе данных с картинки основе экранов высокой пропускной. Трудности, связанные с выбором соответствующих характеризации изображений и тонкой настройки алгоритмических параметров (к системе интереса) часто приводят к увеличению времени настройки, особенно для пользователей без анализа изображений экспертизы. В частности, сотовый сегментация, процесс идентификации отдельных клеток вн изображение, является серьезной проблемой в этом отношении. Сегментация может быть очень чувствительны к экспериментальных параметров, таких как тип клеток, клеточной плотности и биомаркеров, и часто требуется повторную регулировку для большого набора данных. По этим причинам, анализ изображений часто независимый, терминал шаг осуществляется специалистами, а не составной части экспериментальной рабочего процесса. Это исключает быстрый цикл обратной связи между анализом и эксперимента, важнейшей частью развития анализа.
Здесь мы опишем альтернативный рабочий процесс, который оптимизирован для высокой пропускной флуоресцентной микроскопии и позволяет избежать многих из вышеупомянутых трудностей. С этой целью мы используем PhenoRipper 4, в программной платформы с открытым исходным кодом для быстрого разведки и анализа микроскопических изображений. Важно отметить, что PhenoRipper позволяет избежать многих проблем, связанных с сотового сегментации, не пытаясь определить отдельные клетки. Вместо этого, PhenoRipper изображение разбивается на пиксельблоки субклеточном размера и характеризует изображения в терминах блоков, которые они содержат. В частности, PhenoRipper профили блоки с точки зрения маркеров-колокализации основе особенностей и автоматически определяет 4 самых представительных типов блоков в тренировочных образов. PhenoRipper затем присваивает каждому блоку наиболее близки типа представитель блока, и, наконец, характеризует изображений на основе типов блоков, которые они содержат.
По сравнению с более традиционными одноклеточные подходов, этот подход требует минимального тонкой настройки и опыт. Таким образом, пользователям необходимо только установить два параметра: размер блока и порог интенсивности (для отмены неклеточного частей изображения), оба из которых устанавливаются с графическим обратной связи. Важно отметить, что рабочий процесс, описанный здесь, как было показано 4 легко масштабировать, чтобы значительно большими объемами данных, где скорость и минимальная подстройка обеспечивает большое время и прибыль надежности. На практике мы видим, что это приложениеплотва сокращает время, необходимое как для настройки и запуска по нескольким порядков 4.
Основной выход из PhenoRipper это визуальное представление сходства изображения, что позволяет пользователю определить группы экспериментальных условиях, которые вызывают клетки для отображения сходные фенотипы. Группировки PhenoRipper находит обычно имеют сравнимую «биологический интерпретируемость" для тех, порожденная наиболее трудоемких, методов на основе клеток 4. На практике это означает, что часто, в течение получаса выполнения типичный эксперимент флуоресцентной микроскопии 96-а, экспериментатор без предварительного опыта анализа изображений может получить надежный отсчет о производительности его или ее опыта. Экспериментатор может начать исследовать отношения между различных экспериментальных условиях, касающийся этих отношений, чтобы изображения фенотипов.
Мы демонстрируем этот рабочий процесс здесь, анализируя последствиянаркотиков в различных механических занятий по HeLa клеток, окрашенных для ДНК и цитоскелета маркеров. Изображения клеток, обработанных с тем же классу препаратов были сгруппированы вместе, и качество изображения бедные (окрашивания артефакты, из фокус-клеток и так далее) появились как выбросы, что делает их легко идентифицировать и потенциально отбросить.
В то время как этот рабочий процесс полезен для большого количества изображений на основе анализов, существует четко много ситуаций, когда другой подход потенциально может быть более информативным. Например, выход из PhenoRipper это прежде всего относительное сравнение шаблонов флуоресценции через экспериментальных условиях. Если абсолютный характеристика конкретного одной чертой клетки вместо требовалось (например количество пятен в клетке), одноклеточного на основе анализа потребуется. Тем не менее, даже в такой ситуации, PhenoRipper, вероятно, обнаружить изменения в этих одноклеточных фенотипов и поэтому быть полезным инструментом для анализа Optiзацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка проб и обработки изображений
- Клеточные культуры
- Сплит культур в плановом порядке и поддерживать на 20-70% слияния. За один день до эксперимента клетки HeLa расти в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко, см. таблицу материалов) и с добавлением 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 1x пенициллина / стрептомицина.
- В день эксперимента, сплит клетки растут в культуре (около 50% сливной).
- Промыть клетки с PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), подвергать его воздействию приблизительно 2 мл трипсина / EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в течение нескольких секунд. Аспирируйте избыток трипсина / EDTA и сохранить клетки купались в тонкой пленке трипсина / EDTA в шкафу при комнатной температуре в течение ~ 3 мин.
- Механически встряхнуть колбы дважды и отделить клетки с сыворотки дополнена СМИ. Граф клеток и разбавляют до 5000 клеток/50 мкл среды и сразу же пластине 50 мкл / лунку на 384-а со стеклянным дном пластины с использованием автоматического дозирования жидкости робота (только 30 хорошос пластины здесь используются).
- Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы минимизировать краевые эффекты в скважинах 5. После RT инкубация, место пластин в 37 ° C / 5% СО 2 инкубатора в течение ночи.
- Каждый препарат будет в дубликатах. Добавить 25 мкл препарата в соответствующие лунки на пластину, уже содержащий СМИ.
- Fix тарелку с 4%-ным раствором параформальдегида в PBS при 24 ч после медикаментозного лечения.
- Окрашивание
Конкретные первичные антитела, флуоресцентно-меченого вторичного антитела и другие флуоресцентные пятна, которые были использованы здесь, приведены в табл материалов.- Фиксированные клетки проницаемыми с 0,2% Тритон Х-100 в растворе TBS (трис-забуференный физиологический раствор) в течение 3 мин и промывают TBST (трис-буферном растворе + Твин 20) 3x. Добавить 5% раствора БСА (бычий сывороточный альбумин) в TBST для блокирования.
- Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем промывают TBST 3x.
- Сделать первичный разбавлять антителионы в 5% БСА в TBST (см. Таблицу материалов) и добавить 10 мкл / лунку. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем промывают 3 раза TBST с.
- Сделать dilutionin вторичные антитела 5% BSA в TBST (см. таблицу материалов) и добавить 10 мкл / лунку.
- Инкубируйте пластины в темноте при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем дважды промывали TBST.
- Приготовить разведения для Hoechst и фаллоидином (см. Таблицу материалов) в PBS и добавить 10 мкл / лунку.
- Инкубировать в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.
- После 2 TBST моет, накладки в фольге и хранить при 4 ° СО / Н.
- Изображений
Получение изображений с помощью эпифлюорисцентной микроскоп с использованием объектива 20X с 1x1 камеры биннинга. Приобретать шестнадцать изображений для каждой лунки, в общей сложности 480 изображений (x3 каналов).
2. Анализ изображений
Скачать и установить PhenoRipper от phenoripper.org, и запустить PhenoRipper начать анализ ИМАГЭС. PhenoRipper в настоящее время поддерживает TIFF, PNG и JPEG, а все остальные форматы, поддерживаемые MATLAB (микроскоп программное обеспечение, как правило, поддерживают экспорт в TIFF).
2.1 Загрузка данных
- Нет стандарт именования / организация существует для микроскопии изображений, которые могут сделать загрузку изображений и связывающую метаданные (т.е. экспериментальная аннотации, такие как тип лечения, а число и так далее), наиболее сложной частью рабочего процесса. Выберите один из представленных методов (см. ниже).
- PhenoLoader: Выберите этот вариант, к полу-автоматически загружать данные, когда имя файла и / или структура каталога содержат достаточно информации, чтобы изображениями групп по желанию (например, В16 HeLa_Drug5-DAPI.png может означать, что изображение из скважины В16, клетки обрабатывают с наркотиками с идентификатором 5, а изображение захватывает ядерной DAPI пятно - с этого именования, все изображения от лунки A1 или обрабатывали наркотиками 5 может быть легко сгруппированы). Мастернаправлять пользователя шаг за шагом, чтобы связать метаданные со снимком групп и определить маркеры следующим образом:
- Нажмите на "File Structure", чтобы получить доступ к окну PhenoLoader.
- Нажмите на кнопку "Определить корневой каталог", чтобы выбрать каталог, содержащий изображения набора данных. Тогда фильтрации файлов, которые не используются (неиспользуемых файлов) для анализа (опционально, можно оставить пустым).
- Нажмите на кнопку "Определить маркеры" указание биомаркеров, используемые в эксперименте и связать их с изображениями. В частности, нажмите на файле изображения выберите часть имени файла, который однозначно идентифицирует биомаркеров. Наконец, введите имя для каждого биомаркера.
- Нажмите на кнопку "определяющие метаданные", чтобы связать информацию с каждого изображения. В частности, нажмите на файле изображения, а затем выберите часть имени файла идентифицирующую информацию изображения (например, "B16" для имени а). Окно с запросом на имя группы (например, «МыLL ") появится, введите имя. Члены группы, извлеченной из файла будет показан на таблице группы (например, с полным списком имен также). Чтобы добавить дополнительную информацию, не присутствующий в имени файла, нажмите кнопку" (опционально) Далее ". Нажмите на кнопку" Добавить группу метаданных ", введите дополнительный имя группы (например," Друг ") и для каждого значения предопределенного группы (например," Ну "), введите его значение (например," Таксол ") . Там нет ограничений на количество дополнительных групп, которые могут быть добавлены.
- Наконец, нажмите на кнопку "Создать Metadatafile" для создания файла метаданных и продолжить анализ. Если файл метаданных был ранее создан, вышеупомянутые шаги можно избежать, непосредственно загрузке файла с помощью опции "Файл метаданных" (описано в 3 ниже).
- На основании регулярных выражений Шаблоны: Регулярные выражения стандартный подход для сопоставления моделейв тексте. Выберите этот вариант, если имя файла и / или структура каталога содержат достаточно информации, чтобы группы изображений и именования совпадает с одним из уже существующих шаблонов. Пользовательские шаблоны на основе регулярных выражений также могут быть определены и использованы повторно вручную. Это расширенный вариант рекомендуется только для пользователей, знакомых с регулярными выражениями.
- Метаданные Файл: Выберите эту опцию для конечной возможности настройки. Определение и загрузить значения, разделенные запятыми файлов (CSV), содержащий имена файлов и метаданные, связанные с каждым изображением. Пример формата файла доступно на загрузки части веб-сайта (phenoripper.org). Просто загрузите файл через интерфейс для отображения содержащейся в нем информации.
- PhenoLoader: Выберите этот вариант, к полу-автоматически загружать данные, когда имя файла и / или структура каталога содержат достаточно информации, чтобы изображениями групп по желанию (например, В16 HeLa_Drug5-DAPI.png может означать, что изображение из скважины В16, клетки обрабатывают с наркотиками с идентификатором 5, а изображение захватывает ядерной DAPI пятно - с этого именования, все изображения от лунки A1 или обрабатывали наркотиками 5 может быть легко сгруппированы). Мастернаправлять пользователя шаг за шагом, чтобы связать метаданные со снимком групп и определить маркеры следующим образом:
- Выберите поле метаданных, который определяет повторов в эксперименте, чтобы избежать избыточной выборки. Для наборов данных, содержащих повторов (например, все изображения в яме должен быть похож), группируя их вместе (например, хорошо) может показыОве производительность. В большинстве случаев это разумно выбрать опцию по умолчанию "Случайная (не знаю)", которая выбирает случайное подмножество.
2.2 Установка параметров анализа
Нажмите на кнопку "Установить параметры", чтобы определить параметры, необходимые для обработки набора данных. Параметры, определяющие находятся на левой панели. Правая панель отображает объединенный образец набора данных. Нажмите на стрелки влево / вправо для переключения между различными изображениями.
- Порог Интенсивность: Выберите подходящий пороговое значение, примерно определить клеточные части (а не фон, неклеточного регионы) изображений. Порог предварительно вычисленные по PhenoRipper, но может регулироваться для улучшения выделение клеточных областей с использованием полосы прокрутки доступно на верхней части изображения. Если выбранный порог не работает во всех изображений, снизить порог с тем чтобы включить неклеточного регионы, а не падать сотовой регионы.
- Блок SИзе: Выберите подходящий размер блока (в пикселях) к сетке изображения. Блоки указанного размера будет накладываться на изображение. Отрегулируйте размер блока для получения в среднем 20-30 блоков / клетку. Для наложения сетки на изображение нажмите на флажок перед поле "Block Size".
- Необязательные параметры: Если авто-масштабирование картинки не отображаются маркеры с заданными относительные интенсивности (например, один цвет насыщен), или если маркеры должны быть исключены из анализа, использовать опцию "Регулировка яркости каналов". Для идентификации сотовой регионы на подмножестве маркеров использовать "каналов, используемых для Threshold" вариант. Выбор по умолчанию других параметров, как правило, достаточно, но в случае необходимости, корректировать их с помощью «Расширенный анализ Options".
- Запустите анализ, нажав кнопку "PhenoRip" на главной панели приложения. PhenoRipper автоматически определит текущие типы блоков в изображениях. Фенотипические профили будут созданы длякаждое изображение на основе фракций различных типов блоков в нем.
3. Изучение Результаты
- Исследуйте отношения между фенотипическими профилей изображений с помощью PhenoBrowser (рис. 1). Интерфейс PhenoBrowser состоит из четырех панелей: верхний левый панель представляет собой графическое представление (точечный график) относительного сходства между различными изображений / условий, обе панели на правой выборочных дисплей изображений выбранных условий и окончательного панели (гистограммы ) сравнивает их фенотипические профили.
- "Отказаться от пустые рамки" с помощью меню «Обработка данных».
- Удалить качество изображения бедных: Во-первых, изучить отдельные изображения выключить группировку из меню «Обработка данных». Затем, щелкните через выброс точек в точечной диаграммы и отбросить низкие качество изображения (например, не в фокусе, окрашивания артефакт).
- Исследуйте данные: Решите, какие метаданные поле определяетОсновной единицей сравнения (например, сравнить наркотики, изображения с одинаковым значением поля метаданных "наркотиков" должны быть сгруппированы вместе). Свернуть все изображения с тем же значением этого поля метаданных в одну точку данных с "Group By». Например, группировка по препарата в среднем изображения в пределах каждого препарата, чтобы получить одно очко за лекарства. Объектов (или отдаленные) очков в точечной диаграммы отражают условия, которые вызывают подобные (или разнородных) клеточные фенотипы. Цвет или этикетку точки (меню отображения данных) на основе имеющихся метаданных, чтобы помочь интерпретируемость. 3D Сюжет вращается, нажав на "поворотной" флажок и нажав на левую кнопку и перемещая мышь над ним.
- Выберите две различные точки, чтобы сравнить их непосредственно. Образ панели будет отображаться примеры изображений для каждой точки, и гистограмма панели отображаются типы блоков, чьи появление частоты самые разные между двумя точками.
- Запустите Clustergram в меню "Clustergram" для обеспечения более глобальный взгляд на отношения между типами блоков и условий эксперимента. Группировка обоих типов блоков и условия, это представление подчеркивает клеточные фенотипы, которые лучше всего отличают группы условий (рис. 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы проверили способность этого рабочего процесса группировать препаратов на основе механизма их действия. HeLa клетки высевали в 30 лунки 384-луночный планшет и окрашивают для ДНК / актина / α-тубулина. Конкретные первичные антитела, флуоресцентно меченные вторичные антитела, и другие флуоресцентные пятна, которые были использованы, перечислены в таблице материалов. Лунки обрабатывают 15 лекарств, относящихся к трем классам (механистических гистондеацетилазы ингибирования, ориентированных микротрубочек и ДНК повреждающий) в течение 24 ч и отображаемого с помощью микроскопа эпифлюорисцентной на 20-кратным увеличением объективной. Шестнадцать изображения были получены для каждой лунки, в общей сложности 480 изображений (x3 каналов). Данные, описанные здесь, могут быть скачаны с www.phenoripper.org.
Как описано выше, PhenoRipper был использован для анализа этих изображений. Передний план порог был установлен в размере 5% (т.е. 5% от максимально возможного интенсивности) и размер блока в 20 пикселей (Figur е 2). Анализ этого набора данных заняло примерно 10 минут на стандартном настольном компьютере (64 бит, 8 ядро машины на 3,2 ГГц, с 16 Гб оперативной памяти). Интерфейс PhenoBrowser (рис. 3) был использован для изучения результатов. Визуализации артефакты, такие как плохой окрашивания и пустые рамки были легко определить, так как они выделялись четкие выбросов (рис. 4). Относительные фенотипические сходство между изображениями визуализируются в верхней левой части панели рисунке 3 с использованием многомерного шкалирования. Каждая точка представляет единый образ цветной механизмом своего препарата действий. Этот график показывает, что фенотипические профили могут быть использованы для групп препаратов по механизму действия. Clustergram данных (рис. 5) относится эту группировку в фенотипических профилей.
s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 1. Последовательность действий для флуоресцентной микроскопии с использованием PhenoRipper. Клеточные линии высевают в пластине, а затем возмущения добавляют в каждую лунку и планшет инкубируют. Изображения получены с помощью автоматизированной микроскоп, а затем быстро проанализированы с использованием PhenoRipper. Таким образом, результаты текущего эксперимента известны вскоре после визуализации и может, при необходимости, можно использовать для уточнения установки для будущих итераций. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Настройка параметров PhenoRipper: размер блока и порог интенсивности устанавливаются с помощью графического интерфейса в режиме реального времени визуальную Feedbac к. Щелкните здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. PhenoBrowser Интерфейс для изучения результатов PhenoRipper: интерфейс PhenoBrowser разделена на четыре секции: верхняя левая панель представляет собой точечный график отображения относительных сходство между различными изображений / условий, двух панелей на правильных образцов дисплей изображений выбранных условий, и в левом нижнем углу Панель сравнивает их фенотипические профили. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
load/51280/51280fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 4. Пример выброса в точечной диаграммы (выделено), показывая окрашивания артефакт (см. видео). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 5. Clustergram представление PhenoRipper профилей: каждая строка представляет одно лекарство, и каждый столбец тип блока. В серо-значения шкалы отражают фенотипические профили, то есть доли различных типов блоков для каждого препарата. Легче значение указывает на более высокую долю этого типа блока. Иерархическая кластеризация в основном разделяет другое лекарство по классам наркотиков (красный / синий / грееп цвет справа). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рабочий процесс, описанный здесь позволяет быстро и легко характеристику и сравнение микроскопии изображений. Мы впервые продемонстрировали, как это рабочий процесс может помочь оптимизации эксперимента, например, быстро обеспечения контроля качества на микроскопии изображений. Далее, мы показали свой потенциал для анализа скрининга данных с высокой пропускной: мы смогли группы препаратов на основе механизма их действия. Группировка препаратов был сопоставим с использованием найдено более сложные методы 6, хотя PhenoRipper была на несколько порядков быстрее.
Хотя мы нашли этот подход надежную против спорадических экспериментальных колебаний, как и в любом изображении на основе подхода, показания будут затронуты систематических небиологических эффектов. Например, пластина к пластине изменение интенсивности маркера может маскировать биологические эффекты интерес. Воздействие таких артефактов может быть снижен на соответствующих поправок 7, 8, таким как ппоздно, чтобы пластины нормализации и вычитания фона. Профили, полученные путем PhenoRipper также может зависеть от различий в плотности клеток. Хотя такое поведение, как правило, желательно (отражая выживание или рост), его эффект может быть уменьшен, убрав выбрав опцию "Использовать Справочная информация" в "Дополнительные параметры".
При выборе подходящего метода для анализа, пользователи должны рассмотреть компромисс между скоростью, простотой использования и уровня аналитической подробно. Сегментирование без методы 9-11, такие как PhenoRipper, как правило, быстрее и проще в использовании, чем отдельные методы на основе клеток, таких как CellProfiler 2. Недостаток сегментации без методов является невозможность количественного специфические свойства одноклеточных. Таким образом, пользователь должен принять решение о соответствующем подходе, основанном на его или ее потребностей. Когда точное сравнение или группировка экспериментальных условиях является главной целью, мы обнаружили, что уровеньподробнее захвачен PhenoRipper более чем достаточно. В частности, исследователи сосредоточены на высокой пропускной экспериментов принесет большую пользу от способности быстро и легко изучить данные изображения. В заключение, рабочий процесс, представленный здесь позволит ученым скамейка легко изучить их флуоресцентной микроскопии изображений вскоре после приобретения и облегчить быстрый поворот вокруг между анализом и визуализации. Мы считаем, что это рабочий процесс позволит снизить барьер для выполнения количественного анализа изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Адам Костера и всех других членов лабораториях Альтшулер и Ву для полезных советов и дискуссий. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения предоставляет R01 GM085442 и CA133253 (ся), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), и Welch Foundation I-1619 (SJA), и я-1644 (LFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
