Summary
Aprender novas associações estímulo-resposta envolve uma ampla gama de processos neurais que são em última análise, refletem na mudança de pico de saída de neurônios individuais. Aqui nós descrevemos um protocolo de comportamento que permite o registro contínuo da atividade de um único neurônio enquanto que os animais adquirem, extinguir, e readquirir uma resposta condicionada em uma única sessão experimental.
Abstract
Enquanto o sujeito da aprendizagem atraiu imenso interesse dos cientistas, tanto comportamentais e neurais, apenas relativamente poucos pesquisadores observaram a atividade de um único neurônio enquanto os animais estão adquirindo uma resposta operantly condicionado, ou quando essa resposta é extinto. Mas, mesmo nestes casos, períodos de observação geralmente abrangem apenas uma única fase de aprendizagem, ou seja, aquisição ou extinção, mas não ambos (exceções incluem protocolos que empregam aprendizagem reversa; ver Bingman et al 1 para um exemplo.). No entanto, a aquisição e extinção implicam diferentes mecanismos de aprendizagem e, portanto, deverão ser acompanhados por diferentes tipos e / ou loci de plasticidade neural.
Nesse sentido, desenvolvemos um paradigma comportamental que institui três estágios de aprendizagem em uma única sessão comportamental e que é bem adequado para a gravação simultânea de potenciais de ação dos neurônios individuais. Animais umre treinados em uma tarefa de escolha forçada intervalo único que requer mapeamento cada uma das duas respostas de escolha possíveis para a apresentação de diferentes estímulos visuais inovadores (aquisição). Depois de ter atingido um critério de desempenho pré-definida, uma das duas respostas de escolha já não é reforçada (extinção). Após um certo decréscimo no nível de desempenho, respostas corretas são reforçadas novamente (reaquisição). Ao utilizar um novo conjunto de estímulos em cada sessão, os animais podem sofrer o processo de aquisição de extinção-reaquisição repetidamente. Porque todas as três fases de aprendizagem ocorrem numa única sessão de comportamento, o paradigma é ideal para a observação simultânea da saída de cravação de múltiplos neurónios individuais. Usamos pombos como sistemas modelo, mas a tarefa pode ser facilmente adaptada para outras espécies capazes de aprendizagem discriminação condicionado.
Introduction
Aprender novas associações estímulo-resposta para os resultados envolve uma ampla gama de processos de plasticidade neural. Estes processos são, em última análise reflete na saída pico mudando de neurônios individuais. Indiscutivelmente, um dos paradigmas mais utilizadas de aprendizagem é o medo condicionamento pavloviano realizado com roedores. Neste cenário, a aquisição e extinção de uma resposta condicionada ocorrer dentro de algumas dezenas de ensaios 2. O desenvolvimento rápido de medo condicionado pode ser vantajoso porque permite que a execução de um grande número de animais dentro de um curto espaço de tempo. Além disso, a aquisição ea extinção pode ser observado dentro de algumas dezenas de ensaios em um único dia em animais ingênuos 3,4 ou espalhados por 2 ou 3 dias 2,5-8. No entanto, os conhecimentos adquiridos sobre as mudanças de atividade neural durante a aprendizagem nesses experimentos não se aplicam necessariamente fora do domínio do medo condicionado. Por exemplo, o comportamento alvo-dirigida impulsionado pela posiçãoreforço tiva é mais adequadamente modelada por operante em vez de procedimentos de Pavlov condicionado, e pode, em parte, dependem de diferentes substratos neurais 9,10. Além disso, o condicionamento do medo se desenvolve tão rapidamente que as respostas neurais para o CS só pode ser observado por algumas dezenas de ensaios, colocando limites severos na análise das mudanças de atividade neural durante a aprendizagem.
Infelizmente, a aquisição e extinção do responder operante normalmente leva vários dias. Isto é prejudicial para as investigações neurofisiológicos, porque é notoriamente difícil de gravar a actividade de células individuais ao longo de mais do que algumas horas. Devido à alta similaridade das formas de onda de potenciais de ação extracelular gravados, é problemático afirmar que picos registrados no primeiro dia são gerados a partir da mesma célula como picos com ondas semelhantes gravado no próximo 11,12, especialmente em áreas com alta densidade de células, tais como o hipocampo.
(Columbia livia domestica forma) são organismos modelo clássicos em psicologia experimental 13-17. Estas aves são capazes de realizar discriminações visuais complexas 18, pode se adaptar com flexibilidade às mudanças de comportamento contingências de reforçamento 19,20, e são trabalhadores exclusivamente ávidos, realizando 1.000 ensaios com uma quantidade mínima de reforço. Estas características tornam especialmente adequado para as experiências descritas abaixo.
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Protocol
Declaração de Ética
Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Alemanha para o cuidado e uso de animais na ciência. Os procedimentos foram aprovados por um comitê nacional de ética do estado da Renânia do Norte-Vestfália, Alemanha.
Visão geral do sistema
Operante Testing Câmara
A câmara operante (Figura 1) mede 34 centímetros x 34 cm x 50 cm. Três chaves translúcidas de resposta (4 cm x 4 cm, localizada a aproximadamente 20 cm acima do nível do chão) são embutido na parede de trás da câmara. Os estímulos são apresentados através de uma tela plana LCD montado atrás as chaves de resposta. Duas lâmpadas de 2 watts localizados nas paredes laterais proporcionam fraca iluminação. A câmara encontra-se num cubículo atenuantes de som para mascarar sons estranhos. Altifalantes fornecer ruído branco em todos os momentos. Alimentação (grão) é fornecido por uma tremonha comida localizada abaixo da centochave er. Hardware Experimental é controlado por código MATLAB escrito sob encomenda 21. Os animais são constantemente monitorizados por meio de uma câmara digital ligado à parede frontal da câmara.
Microdrives custom-built
Microdrives abrigam 16 fios de eletrodos são construídas em nosso laboratório; o projeto é baseado no trabalho de Bilkey e colegas 22,23, eo leitor é remetido para estes artigos para uma descrição detalhada. Nós modificamos o seu projeto para permitir a um maior número de eletrodos (16 em vez de 8, 25 mM fios nicromo), e ligar os fios de eletrodo através de cola de prata condutora à tomada headstage. Além disso, usamos-regulamentação das dicas de eletrodos para reduzir a impedância e para alcançar melhores relações sinal-ruído (aplicar -3 V para ~ 3 seg; impedâncias deve cair para <100 kW).
Uma vez que o microdrive é montado, os eléctrodos são cortados com o comprimento desejado, dicas são cleaned num banho de ultra-sons (Tergazyme em água destilada) durante 20 min e lavado mais 20 minutos em água destilada. Com banho de ouro de pontas de eletrodo deve ser realizada imediatamente antes da implantação. Para o aterramento, utilizamos um eletrodo de prata bola colocada acima do cerebelo lateral. Especificação de materiais é fornecida na tabela de materiais que acompanha este artigo.
Uma questão importante quando se trabalha com animais que se movem livremente é artefatos de movimento. Descobrimos que artefatos de movimento em nossas instalações são em grande parte devido a uma alta impedância) eletrodo (> 500 kW) e b) fixação imperfeita dos contactos entre o plugue (implante) e do soquete (andar), enquanto o animal está se movendo. Uma variedade de microconnectors comercialmente disponíveis não executar satisfatoriamente para a gravação de aves movimentando-se livremente, pois o contato mecânico entre plugue e tomada deteriora-se rapidamente através de movimentos vigorosos dos pombos (cabeça balançando, chave-pecking). A melhor conexão mecânica entre o implante eo headstage foi conseguido com montagens headplug de Ginder Científica. Estes conjuntos de plug-soquete com 18 contatos e estão solidamente fixado entre si por uma porca.
Configuração de gravação eletrofisiológico
A configuração eletrofisiologia compreende os seguintes componentes: 1) um headstage custom-built com ganho unitário (amplificador operacional) 2) módulos amplificadores de 15 diferencial alojados em duas unidades de rack de montagem (DPA-2fs e EPMS-07, respectivamente; npi electronic GmbH, Alemanha ), 3) um conversor analógico-digital de conversor de 16 canais (1401 poder marca I). Sinais são amplificados primas 1.000 x e passa-banda filtrada (500-5.000 Hz, 1 º filtro de ordem), digitalizados com uma taxa de amostragem de 16-20 kHz e armazenados com Spike2 versão 7.06a para processamento offline. O horário dos eventos (tais como início do estímulo ou bicadas chave individuais do animal) são capturados através de uma caixa porta IO paralelo construído em laboratório (ver Rose, Et al 21) e encaminhado para o conversor AD de armazenamento, juntamente com os dados neurofisiológicos (ver Figura 1).. Processamento off-line é descrito mais adiante.
Visão geral do sistema Figura 1.. Fluxo de informação é simbolizado por setas coloridas. Computador 1 controla hardware referentes a saída comportamental (visualização estímulo através do monitor de tela plana, casa clara, comedouro, luz de alimentação, chaves de resposta) e envia timestamps de eventos para o conversor AD. Computador 2 armazena sinais neurofisiológicos obtidos a partir do conversor A / D e timestamps de eventos recebidos de computador 1. A fotografia da esquerda mostra a câmara de condicionamento dentro do cubículo atenuantes de som. Seus elementos são: 1) shell-atenuando Sound, 2-4) chave de respostas, 5) funil de alimentos, 6) luz alimentador 7) casa de luz, 8) câmera de observação.
Single-de intervalos da escolha forçada (SIFC) Discriminação Task
Para maior clareza, vamos descrever a tarefa final SIFC aqui e, em seguida, explicar os passos necessários para treinar animais nessa tarefa a seguir.
A tarefa SIFC está delineado na Figura 2. Após o intervalo inter (ITI) tiver decorrido, a tecla central é transiluminou verde para até 5 seg ("fase de inicialização '). Imediatamente após a terceira resposta do animal dentro de 5 segundos, de um em vários estímulos de amostra é apresentado na tecla central durante 2 segundos ("fase de amostra '; exemplo estímulos são apresentados na inserção à Figura 2). Após 2 segundos, a tecla central é novamente transiluminou verde, e se o animal tem de responder mais uma vez antes de as duas teclas laterais são transiluminou ('fase de confirmação). Dependendo da identidade do estímulo mostradona fase de amostra, o animal é necessário para dirigir uma resposta única para a esquerda ou a tecla direita ('fase escolha "). Se ele escolhe o destino correto, acesso a recompensa (grão) é concedida por 2 seg. Assim, o núcleo da tarefa consiste em responder à chave de escolha deixada após a apresentação de um estímulo particular na tecla central, e respondendo à chave escolha certa após a apresentação de um outro estímulo. A razão por que a fase de amostra é delimitada por uma inicialização e uma fase de confirmação é a de manter a cabeça dos animais em frente a tecla central, enquanto o estímulo modelo é apresentado.
Uma vez que os mestres de animais esta tarefa para um único par de estímulos (doravante, os estímulos "familiares", FS), apresenta-se com um novo estímulo (NS) par em cada nova sessão, e tem que aprender qual dos dois novos estímulos é para ser seguido por uma resposta para a esquerda ou a escolha certa chave. A dupla FS continua a ser apresentado durante ªose experimentos para servir como condição de controle adequado. Desempenho adequado na tarefa final depende de modo crucial a disposição dos animais para realizar> 1.000 ensaios em probabilidades globais de reforço <0,5. Os parágrafos seguintes descrevem um procedimento de formação em que a complexidade da tarefa é gradualmente aumentada até que o animal atinge o nível do SIFC; ao mesmo tempo, a probabilidade de reforço e do número de ensaios por sessão necessitar de ser aumentada para assegurar consistentemente elevado desempenho na tarefa final.
1. Formação Animais
- Restrição alimentar
- Pesar os animais depois de pelo menos duas semanas de livre acesso aos alimentos. Tome este peso como o peso-alimentação livre. Restringir o acesso de alimentos ao longo dos próximos 1-2 semanas até animais chegar a 85% do seu peso-alimentação livre.
- É crítico que os pombos manter uma aparência saudável física e actividade normal durante a duração de todo o experimento. ParaNesse sentido, acompanhar atentamente aparência e peso dos animais ao longo de toda a duração do treinamento comportamental e testes. Pesar animais antes e depois de cada sessão experimental para avaliar a ingestão diária de alimentos. Fornecer alimento adicional se necessário, para evitar mais perda de peso. Proporcionar o acesso irrestrito a comida no fim de semana.
- Autoshaping
Autoshaping serve para habituar o animal para a câmara experimental e estabelecer resposta condicionada.- Apresentar um estímulo visual 5-sec (doravante, a inicialização de estímulo, IS) na tecla central. Imediatamente após o término da IS ou um único beijo para a chave de resposta (o que vier primeiro), desligar iluminação das teclas e do presente recompensa alimentar (2 seg ativação do funil de alimentos).
- Mantenha o ITI consideravelmente mais longo do que o tempo de apresentação de amostra para facilitar a aprendizagem 24. Use valores de 120 segundos para ITI e correr 40 ensaios por dia. Mais tarde reutilizar o IScomo o estímulo chave de inicialização, confirmação, e escolha na tarefa final (ver Figura 2). Esta fase de formação terá os animais aproximadamente uma semana.
- Uma vez que o animal responde de forma confiável (em> 85% dos ensaios), diminua o passo a passo ITI até 10 seg e o tempo de apresentação de amostra para 2 seg. Ao mesmo tempo, aumentar o número de respostas necessárias para o reforço de 3 (razão fixa de 3, FR 3). Além disso, aumentar o número total de ensaios por dia. Escolha os parâmetros de tal modo que o animal é treinados diariamente durante aproximadamente 1 hora. Esta fase do treinamento vai durar cerca de 2 semanas.
- Repita os passos 1.2.1 - 1.2.3 para as chaves de resposta esquerda e direita até sujeitos respondem de forma confiável para o IS em todas as 3 chaves. Ensaios alternativos com a ativação da esquerda, direita e centro-chave de forma aleatória.
- Agora apresentamos o é o primeiro no centro e, em seguida, condicionada a uma resposta, em cada tecla lateral (omitir reforço para aResponse Center key). Chaves alternativas ativados colaterais aleatoriamente de julgamento a julgamento. Terminar ensaios em que o sujeito não respondem às principais centro após 5 seg. Repita até que o animal executa de forma confiável (~ 3 dias).
- Apresente dois novos estímulos que depois servem de FS na tarefa final (ver figura 2, inserir, por exemplos). Repita os passos 1.2.1 - 1.2.3 com esses estímulos. Respondendo será estabelecido mais rapidamente do que com o primeiro estímulo, geralmente dentro de 4 dias.
Figura 2. Ilustração do paradigma comportamental. Depois de um ITI de 5 segundos, a tecla central é transiluminou verde para até 5 seg (inicialização). Se o animal responde 3x dentro destes 5 seg, 1 dos 4; Estímulo modelo é apresentado na mesma posição. Depois de um tempo de apresentação de amostra fixa de 2 segundos durante o qual o animal tem que responder pelo menos uma vez, a chave de hierarquia central é transiluminou verde novamente (confirmação). Depois de mais um beijo, as teclas laterais 2 são transiluminou verde. O sujeito indica a sua escolha, respondendo assim a uma das teclas laterais. Durante a aquisição e reaquisição, as respostas corretas são seguidas por 2 seg acesso aos alimentos acompanhada pela ativação da luz de alimentação, ou ativação de somente a luz de alimentação. Se incorreto, luzes da casa estão desligados por 3 segundos. Durante a extinção, ambas as respostas corretas e incorretas ao estímulo extinção permanecem inconseqüente. Inset mostra exemplo novas e estímulo familiarizado pares.
- Formação de um único intervalo da escolha forçada (SIFC) Tarefa para Familiar Estímulos
- Estabelecer a sequência completa de inicialização, amostra, confirmação, e escolha: em cada tentativa, presente first a IS (FR 3), então qualquer um dos dois FS (duração fixa de 2 seg), em seguida, novamente o IS (FR 1). Use um projeto solicitado escolha: em cada julgamento, transilluminate apenas a chave escolha que é correto para o FS dado. Esta fase de formação deverá ter cerca de 1 semana.
- Uma vez que o sujeito realiza de forma confiável (> 85% de respostas para a respectiva tecla lateral), introduzir testes de livre escolha (as duas teclas laterais transiluminou durante a fase de escolha). Se o animal responde para o lado correto, proporcionar acesso aos alimentos por 2 seg. Respostas incorretas são seguidos por time-out punição (houselights fora por 2 segundos). Se nenhuma resposta é dada dentro de 3 segundos, terminar tentativa e re-iniciar ITI. Animais geralmente aprender essas subcomponentes da tarefa dentro de 2 semanas.
- Gradualmente aumentar a fração de ensaios de livre escolha durante as sessões subseqüentes de 20% a 100%.
- Se o sujeito realiza> 90% de acerto em testes de livre escolha, diminuir a probabilidade de recompensa para as respostas corretas para 0,5enquanto que, paralelamente, aumenta o número de ensaios por sessão de 1000. Não altere os parâmetros a cada dia / sessão, mas escolhê-los de forma flexível, dependendo do nível do assunto sobre omissões de inicialização e porcentagem de acertos desempenho. Esta fase do treinamento vai durar cerca de 4 semanas.
- Pombos tendem a recusar a responder a estímulos desconhecidos. Portanto, uma vez que o animal executa confiável> 1.000 testes, as respostas forma automática para um grande conjunto de estímulos visuais (ver secção 1.2). No entanto, não preexpose os estímulos visuais destinados para uso posterior como novos estímulos no paradigma final, mas exposições de cor uniformes.
- Final Single-Interval da escolha forçada de tarefas com novos estímulos em diferentes condições de reforço
- Esquentar
Deixe o sujeito realizar 50 ensaios apenas com os FS. Definir probabilidade recompensa por esses estímulos a <1 (digamos, 0,5-0,8) durante todas as fases para evitar a saciedade precoce e,portanto, a falta de motivação para responder. - Aquisição Stage
Ensaios aleatoriamente alternados com apresentação de FS e NS. Atribuir diferentes chaves de resposta como correta para os dois NS e reforçar cada resposta correta. Calcule porcentagem de acertos como uma média contínua ao longo dos últimos 120 testes. Aquisição é considerada completa quando o desempenho de cada um dos NS excede 85%, mas não antes de um mínimo de 150 ensaios foram executados. - Extinção Stage
Pare reforçando respostas incorretas corretas e punir a um NS aleatório (extinção estímulo). Comece a fase reaquisição quando de respostas correctas para o estímulo extinção cai abaixo de 60% e o animal sofreu pelo menos 150 ensaios nesta fase no total. - Fase Reacquisition
Mais uma vez reforçar correto e punir respostas incorretas ao estímulo extinção, como durante a fase de aquisição. Encerrar a sessão quando o desempenho para este estímulo, exceder 85% e animals realizado pelo menos 150 estudos nesta fase no total.
- Esquentar
2. Eletrofisiologia
- Eletrodo Implantação
Cirurgia de implante tem lugar após os animais repetidamente (3-4x) completado toda a sequência de aquisição-extinção-reaquisição e está descrito em mais pormenor noutro local 25.- Coloque 5-6 microsrews aço inoxidável no crânio para ancorar montar uma cabeça cimento dental incluindo o microdrive.
- Realize uma craniotomia logo acima a região do cérebro de interesse; em seguida, dissecar cuidadosamente a dura-máter e diminuir os eléctrodos para a posição desejada.
- Antes de ancorar o microdrive ao suporte de cabeças, aplicar vaselina em torno da cânula guia; isto irá impedir que o cimento dentário a partir envolvendo o tubo de guia.
- Use um eletrodo de prata bola de isolamento colocado debaixo do crânio que recobre o cerebelo como chão.
- Fornecer animais com analgésicos (carprofeno, 10 mg / kg, injectado duas vezes por dia), durante três dias após a cirurgia. Permitir que os animais recuperar durante pelo menos 2 semanas.
- Gravações Enquanto Animais executar a tarefa
- Use um novo par de novos estímulos para cada sessão e avançar eletrodos pelo menos 125 mM (meia revolução do parafuso unidade) antes de começar. Se forem observados potenciais de relação sinal-ruído suficiente de ação, abortar a sessão, coloque o animal na gaiola e tente novamente no dia seguinte.
- Organizar a cabo headstage tal que não interfere com bicar normal do animal e de comportamento de alimentação. Isto pode ser conseguido ligando o cabo com várias tiras elásticas para o topo da câmara de condicionamento e habituar as aves para o cabo ligado para algumas horas.
- Se estiver disponível, fazer uso de um comutador para proporcionar mais liberdade de movimento para os pássaros.
- Análises de sinal Desconectado
- Band-pass-filtro todos os canais de 500 a 5.000 Hz com íngreme roll-offs off-line utilizando Spike2. Extrato de picos com os limites de amplitude e classificá-los manualmente empregando análise de componentes principais.
- Examine triagem resultados com código MATLAB escrito por encomenda (disponível em MATLAB Central File Exchange, ID Arquivo n º 37339). A única unidade bem isolado (Figura 3) deve atender a todos os seguintes critérios: a) um conjunto claramente separados no espaço do componente principal, b) nenhum sinal de múltiplas unidades, quando todas as formas de onda gravadas são sobrepostas e plotados como mapa de calor (Figura 3A ), c) simetricamente distribuídos amplitudes de pico da forma de onda (Figura 3B), d) a gravação estável durante toda a sessão como evidenciado pela amplitude imutável pico (Figura 3C), e) nenhum ou muito poucos eventos de pico que ocorrem durante o período refratário do pico anterior (Figura 3D), e uma relação de sinal-para-ruído (SNR) de, pelo menos, 2 (SNR é aqui defined como a diferença entre os valores mínimo e máximo da forma de onda de pico média dividida pela largura recortada da faixa de ruído (2,5 ° e 97,5 percentis da distribuição de valores a partir da primeira caixa de todas as formas de onda)). SNR da unidade mostrada na Figura 3 é de 3,9.
- Inspecionar canais crua offline por artefatos relacionados ao movimento. Descarte canais quando indicado.
- Artefatos elétricos que ocorrem durante bicando chave pode, em casos raros ser confundida com as formas de onda de pico adequadas. Teste para a contaminação das gravações através da análise do histograma do tempo de pico de conta relativa a cada tecla beijinho (histograma peri-peck tempo, PPTH, Figura 3E) registrado. Artefatos induzida por Bicar mostrar-se como um pico no próximo histograma (± 50 ms) para tempo 0. Como um cheque extra, traçar as formas de onda de todos os eventos de pico putativos registradas dentro de ± 20 ms de um beijinho chave separadamente e compará-lo a espiga formas de onda detectado outside esta janela (Figura 3F).
Métricas Figura 3. Qualidade para isolamento unidade. A) mapa de calor de valores de tempo de tensão de todos os formas de onda. B) Distribuição de (azul) valores de tensão de todas as formas de onda máximo (vermelho), mínimo (verde), e ruído. As distribuições são bem separados, indicando excelente isolamento unidade. C) taxa espontânea de queima (vermelho, calculado a partir de segmentos de 2-sec em todos os intervalos entre tentativas) e as amplitudes de pico (pico-a-pico) como uma função do tempo em sessão. Ambas as curvas foram suavizadas com uma função de vagão (largura: 50 pontos de dados) D) distribuição Interspike-interval para esta unidade.. Largura Bin, 10 ms (Detalhe: 1 ms). Intervalos muito curtos são praticamente ausente (<0,1% de intervalos inferiores a 4 milisegundos). <strong> E) psth acionado para bica-chave. Contagens de eventos perto da chave beijinho (± 20 ms) são destaque vermelho. F) Todas as 157 formas de onda gravadas dentro de ± 20 ms de eventos-chave Peck. As formas de onda mais favoráveis do que a forma de onda geral mostrado no painel A.
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Representative Results
Comportamento
A Figura 4A mostra o desempenho comportamental de um animal em uma sessão de exemplo. O nível do desempenho animal atinge critério para NS 2 em 180 tentativas (45 apresentações de estímulo) e está perto de 100% para o NS 1 desde o início. Esta estratégia - a primeira resposta para a mesma chave tanto para novos estímulos, e, em seguida, ajustar as respostas para um dos estímulos - é quase tão freqüentemente observada como inicial aleatória respondendo a ambos os NS. Nesta sessão, o NS 2 foi escolhido aleatoriamente para submeter-se a extinção, o que significa que todas as escolhas seguintes esse estímulo permanecer inconseqüente (transição entre as fases de aprendizagem são indicados por linhas pontilhadas pretas verticais). Durante a extinção, o desempenho diminui para o estímulo extinção, mas permanece elevada para o outro NS. Critério é atingido em julgamento 370. Respostas corretas e incorretas são agora reforçados e punidos novamente (reaquisição) e nível de desempenho atinge critério. ensaio 402 para o nível de desempenho FS é consistentemente elevado (> 95%, os dados não mostrados). b) número de tentativas necessárias para completar cada estágio de aprendizagem média (média de mais de 5 animais e 44 sessões no total). Em média, os animais necessários ~ 700 ensaios para responder consistentemente responder corretamente. Extinção levou ~ 900 ensaios, e reaquisição apenas cerca de 60 ensaios, substancialmente menor do que o de aquisição original (Figura 4B).
Figura 4. Resultados comportamentais Exemplo. A) desempenho Um pássaro para os 2 novos estímulos em todas as três fases de aprendizagem. Curvas retratam cento escolhas corretas (média ao longo dos últimos 120 ensaios, correspondentes a 30 apresentações do respectivo estímulo) em função do número total de julgamentos, separadamente para a novela stimulnos 1, novo estímulo 2 e média entre ambos os estímulos. Desempenho para estímulos familiares foi consistentemente acima de 95% correto (dados não mostrados) B) número de ensaios necessários para alcançar um desempenho critério em cada uma das três fases de aprendizagem média.; barras de erro, SEM.
Dados Neural
A Figura 5 mostra o padrão de resposta de duas unidades no caudolaterale nidopallium (NCL) gravados, enquanto um animal foi realizar a tarefa SIFC. Modulação da resposta durante a apresentação do NS é mostrado na Figura 5A. Na fase de aquisição, as unidades responde fortemente ao NS 2 (designada por extinção), com as respostas a diminuir no final da fase de aquisição e poucas alterações no aquecimento durante os outros dois estágios da aprendizagem. Há pouca respondendo a NS 1 ao longo de toda a sessão. O aumento de resposta em torno de 3-4 seg após o início do estímulo modelo é devido ao premiar a entrega. Os níveis de atividaderelativas estímulos familiares não foram moduladas (dados não mostrados).
Figura 5B mostra o padrão de resposta de outra unidade NCL gravado durante SIFC. Este neurônio responde durante direita para a esquerda, mas não movimentos (superior esquerdo), sugestivos de codificação sensório-motor. No entanto, a força da resposta mudado ao longo dos estágios de aprendizagem: os dois painéis mostram ínfimos funções de densidade de pico (SDFS) desencadeou a escolhas rightward por um conhecido (esquerda) e um novo estímulo (à direita), divididos em quartis sucessivas para ilustrar o desenvolvimento em todo a sessão experimental. As respostas foram menores para o estímulo familiares durante toda a sessão, mesmo que o tempo médio de movimento para as duas condições de estímulo foram muito semelhantes (canto superior direito). Além disso, as respostas durante escolhas infraversão após apresentação da novela mas não o estímulo familiarizados diminuiu durante o decurso da sessão experimental (não acompanhado por uma diminuição do abeto basaltaxa ing). Assim, ambos os neurónios diminuiu queima como um novo estímulo particular, tornou-se cada vez mais comuns, com o neurónio na Figura 5B que codifica para um determinado movimento para além da novidade do estímulo que precede o movimento.
Figura 5. Padrões de resposta de duas unidades de exemplo gravadas durante a tarefa SFIC. A) de Spike densidade funções acionado para início da novela 2 estímulos NS 1 e NS 2 (linha superior e inferior, respectivamente), dividido por 3 fases de aprendizagem (colunas ), com respostas em cada fase de aprendizagem dividir novamente em 3 partes iguais (início, meio e final). NS 2 foi designado para a extinção. PSTHs (largura bin 1 ms) foram suavizadas com um kernel gaussiano exponencialmente modificado (σ = 100 ms e τ = 100 ms). B)
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Discussion
Este protocolo descreve uma tarefa comportamental complexa adequada para gravações a única unidade simultâneas. Descrevemos a tarefa SIFC para pombos, mas pode ser facilmente adaptado para roedores, exigindo puxões nariz ou a pressão da alavanca, em vez de chave bica, e substituindo visual olfativo, auditivo, ou estímulos tácteis.
Talvez os passos mais críticos durante o processo de formação são: 1) redução gradual da probabilidade de recompensa e 2) aumento no número de julgamento. Quanto reforço intermitente para os estímulos familiares, decidimos em probabilidades recompensa variando de 0,5 a 0,8; estes são altos o suficiente para produzir um desempenho estável, mas baixa o suficiente para evitar a saciedade precoce. Dito isto, muitas aves estão dispostos a ter um bom desempenho para as probabilidades de recompensa para baixo a 0.2.
É necessário o grande número de ensaios por sessão (500-1,500), porque a aquisição, extinção e reaquisição da condicionado responder siMPLY exige isso muitas provações, e porque a estimativa precisa das taxas de disparo é difícil com menos de, digamos, 25 ensaios, especialmente durante a gravação de neurônios com taxas de disparo baixas (no NCL, taxas de disparo de linha de base são <1 Hz). Dessa forma, definir o número mínimo de tentativas necessárias para completar uma fase de aprendizagem, de tal modo que cada estímulo é apresentado, pelo menos, 35 vezes.
Para um animal ingênuo, o treinamento na tarefa SIFC leva aproximadamente 4 meses, mas a duração exata depende muito do indivíduo. Devido às altas exigências da tarefa, é bastante provável que nem todos os animais vão acabar saindo bem no paradigma final. Se um pássaro indivíduo salta muitas provações ou produz altos índices de erro durante o treinamento, não hesite em substituir este assunto. Em nossa experiência, é altamente provável que este animal nunca vai executar corretamente a tarefa final.
A maioria dos estudos anteriores que realizam gravações unitárias empombos que se movem livremente falhou ao registrar corretamente saída do motor durante a gravação. Isso complica a interpretação das respostas neuronais durante períodos críticos dos ensaios, como apresentação de amostra ou fases de atraso 25. Este problema é inerente go / no-go tarefas em que o pesquisador geralmente não sabe que o sujeito está fazendo em não-go ensaios; a mesma advertência se aplica a trabalhar tarefas de memória incorporando um período de atraso prolongado. Para conseguir o controle sobre o movimento dos animais sem o emprego de chefe de fixação, nós projetamos uma tarefa em que os animais têm de executar a mesma ação (bicando key) a mudança, mesmo que as condições (estímulos amostra). Em nosso paradigma SIFC, tanto de entrada visual, bem como de saída do motor é bem controlado e constantemente monitorados. Dado que os animais são obrigados a bicar cada estímulo modelo ao longo de sua apresentação, mantemos constante de saída do motor enquanto os animais estão vendo estímulos com diferentes histórias de aprendizagem. Estamos atualmente explorando metodods para conseguir ainda melhor controle de saída do motor, tais como a atribuição de um acelerômetro para o headstage para o registro contínuo de movimentos da cabeça. Além disso, estamos desenvolvendo métodos para medir a força de cada chave bicada por meio de um transdutor de mechanoelectric.
Nosso paradigma permite desembaraçar as contribuições de sensorial, motor e variáveis cognitivas para taxas de disparo neural através da identificação de padrões típicos de resposta neural. Por exemplo, um neurónio pré-motor para respostas leftward seria esperado um aumento de disparo, durante a fase de amostragem, sempre que o animal vai fazer uma resposta para a esquerda, independentemente da identidade do estímulo. Da mesma forma, os neurónios motores simples seria de esperar que o fogo durante bicadas chave, ou movimentos para a esquerda ou para a direita. Um neurônio representando recompensa expectativa, por outro lado, seria acionado durante a fase de amostra, e mais ainda para os FS do que os NS durante a aquisição precoce (porque a probabilidade de recompensa subjetiva é maior do que em FS NS trIALS antes NS são aprendidas), mas isso deve reverter mais tarde, quando as NS são consistentemente classificada corretamente (porque a probabilidade de recompensa objetivo é maior em ensaios NS corretas). Finalmente, neurónios que respondem a estímulos características específicas são esperados para disparar consistentemente para um dos estímulos de exemplo, sem qualquer mudança através estágios da aprendizagem.
Porque gravação unidade extracelular é propenso a picos recordes de várias unidades de uma vez 11,26, inspecionando uma série de métricas de qualidade é importante para classificar adequadamente picos como provenientes de um único ou de vários neurônios 27. Usando tetrodes em vez de eletrodos individuais certamente produzir um aumento adicional na classificação de qualidade 11. Isto deve ser considerado quando as gravações em regiões do cérebro com uma elevada densidade celular (por exemplo, hipocampo) ou actividade muito elevada espontânea (tal como o entopallium) são destinados. No entanto, os microplugs usamos só estão disponíveis para até 18 conexões que por enquanto constituem um limite máximo para o número total de canais de gravação.
Em suma, nós desenvolvemos uma tarefa de alta complexidade para os animais experimentais não primatas. Esta tarefa foi adaptado para permitir a investigação de fenômenos de aprendizagem com as gravações de um único neurônio, mas ao mesmo tempo é adequado para lidar com temas como a categorização, tomada de decisão, e codificação recompensa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por doações da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) a MCS (FOR 1581, STU 544/1-1) e OG (FOR 1581, SFB 874). O site da DFG é http://www.dfg.de/en/index.jsp. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação dos autores manuscript.The agradecer Thomas Seidenbecher por nos fornecer o protocolo sobre-regulamentação, bem como Tobias Otto para obter ajuda com a configuração do eletrofisiológico equipamento de gravação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resistance wire (for use as electrodes) | California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA | Stablohm 675; formvar-coated nichrome wires (outer diameter 25 µm) | |
| Microconnectors | Ginder Scientific, Nepean, Ontario, Canada | GS18PLG-220 (plug) & GS18SKT-220 (socket to build headstage) | |
| Cannulae | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 0.4 x 20 mm/ 27 Gx3/4" | |
| Gold solution for plating | Neuralynx, Bozeman, MT, USA | SIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355 | |
| Solution for ultrasonic bath | Alconox, Inc., New York, USA | 1304 | Tergazyme |
| Conductive glue | Henkel Loctite | LOCTITE 3888 Silver filled, conductive, adhesive | |
| Stainless steel screws | J.I. Morris, Southbridge, MA, USA | F0CE125 self-tapping miniature screws, body length 1/8 inches | |
| Light-curing dental cement | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Omniceram Evo Flow A2 | |
| Light-curing unit | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Jovident Excelled 215 Curing Light (wireless LED light curing unit) | |
| Filter amplifiers | npi electronic GmbH, Germany | DPA-2FS | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | power 1401 | |
| Spike2 software | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Version 7.06a | |
| MATLAB | The Mathworks, Natick, MA, USA | R2012a |
References
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