Summary
למידת עמותות בתגובה לגירוי חדשות עוסקת במגוון רחב של תהליכים עצביים המשתקפים סופו של דבר בשינוי תפוקת ספייק של נוירונים בודדים. כאן אנו מתארים פרוטוקול התנהגותי מאפשר רישום הרציף של פעילות היחיד נוירון ואילו בעלי חיים לרכוש, לכבות, ולרכוש מחדש תגובה מותנית בהפעלה ניסיונית אחת.
Abstract
בעוד הנושא של למידה משך עניין עצום ממדענים הן התנהגותיות ועצביים, רק מעטים יחסית חוקרים הבחינו בפעילות היחיד נוירון ואילו בעלי החיים רוכשים תגובה מותנית operantly, או כאשר התגובה כי הוא כבה. אבל גם במקרים אלה, תקופות תצפית בדרך כלל להקיף שלב אחד בלבד של למידה, כלומר רכישה או הכחדה, אך לא את שניהם (החריגים כוללים פרוטוקולי העסקת למידת היפוך; לראות Bingman אח' 1 לירושלים.). עם זאת, רכישה והכחדה כרוכה במנגנונים למידה שונים ולכן הם צפויות להיות מלווה בסוגים ו / או לוקוסים של פלסטיות עצבית שונים.
בהתאם לכך, פיתחנו פרדיגמה התנהגותיות שמכונים שלושה שלבים של לימוד בישיבה התנהגותיות יחידה ושהוא גם מתאים להקלטה בו זמנית של פוטנציאל הפעולה בתאי העצב בודד. בעלי חייםמחדש מאומן במשימה בחירה כפויה יחיד מרווח אשר דורשת מיפוי כל אחת משתי תגובות אפשריות לבחירת ההצגה של גירויים שונים רומן חזותי (רכישה). לאחר שהגיע לקריטריון ביצועים מוגדר מראש, אחד משתי תגובות הבחירה הוא כבר לא מחוזק (הכחדה). בעקבות מפחית מסוים ברמת ביצועים, תשובות נכונות חזקו שוב (רכישה מחדש). באמצעות סט חדש של גירויים בכל פגישה, בעלי חיים יכולים לעבור את תהליך רכישת הכחדה-הרכישה מחדש שוב ושוב. כי כל שלושת השלבים של למידה מתרחשים בפגישה התנהגותיות יחידה, פרדיגמה היא אידיאלית לתצפית בו זמנית של פלט spiking של נוירונים בודדים מרובים. אנו משתמשים ביונים כמערכות מודל, אך המשימה יכולה בקלות להיות מותאמת לכל מין אחר מסוגל ללמוד אפליה מותנית.
Introduction
למידת עמותות בתגובה לגירוי-תוצאה חדשות עוסקת במגוון רחב של תהליכי פלסטיות עצביים. תהליכים אלה באים לידי הביטוי בסופו בפלט ספייק המשתנה של נוירונים בודדים. ניתן לטעון, אחת מפרדיגמות הלמידה המועסקות בתדירות הגבוהה ביותר הוא אוויר פחד הפבלובית שנערך עם מכרסמים. בהגדרה זו, הרכישה והכחדה של תגובה מותנית יתקיימו בתוך כמה עשרות ניסויים 2. ההתפתחות המהירה של פחד מותנה יכולה להיות יתרון, כי זה מאפשר הפעלת מספר רב של בעלי חיים בתוך זמן קצר. כמו כן, רכישה והכחדה ניתן לצפות בתוך כמה עשרות ניסויים ביום אחד בבעלי חיים תמימים 3,4 או התפשטו על פני 2 עד 3 ימים 2,5-8. עם זאת, התובנות שנרכשו על השינויים בפעילות עצבית במהלך הלמידה בניסויים אלה לא בהכרח יחולו מחוץ לתחום של מיזוג פחד. לדוגמא, התנהגות מכוונת מטרה מונעת על ידי חיובי חיזוק מופרז הוא מודל בצורה נכונה יותר על ידי אופרנטית ולא נהלי אוויר הפבלובית, ועשוי בחלק תלוי על מצעים עצביים שונים 9,10. כמו כן, מיזוג פחד מתפתח במהירות כה רב שתגובות עצביות לCS ניתן לצפות רק לכמה עשרות ניסויים, הצבת מגבלות חמורות על הניתוח של שינויים בפעילות עצבית במהלך למידה.
למרבה הצער, הרכישה והכחדה של אופרנטית להגיב בדרך כלל לוקח ימים רבים. זה מזיק לחקירות נוירופיזיולוגיות, כי זה קשה לשמצה כדי להקליט את הפעילות של תאים בודדים על פני יותר מכמה שעות. בשל הדמיון הגבוה של צורות הגל של פוטנציאל פעולה נרשם extracellularly, זה בעייתי לטעון שקוצים רשמו ביום אחד הם נוצרים מאותו התא כמו קוצים עם גל דומה נרשם ב11,12 הבא, במיוחד באזורים עם גבוה צפיפות תאים כגון ההיפוקמפוס.
"Jove_content"> כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו פרדיגמה התנהגותיות רומן ניצול 3 תנאי למידה בתוך מושב ניסיוני אחד ביום אחד. זה דורש שבעלי החיים הניסיוניים הוא מוכנים לבצע מאות ניסויים בתנאים משתנים בלוח זמנים דק של חיזוק. יוני דואר (domestica פורם ליוויה קולומביה) הם אורגניזמים מודל קלאסיים בפסיכולוגיה ניסויית 13-17. ציפורים אלו הן מסוגלים לבצע הבחנות חזותיות מורכבות 18, גמיש יכול להתאים את התנהגות למקרי חיזוק שינוי 19,20, והם עובדים באופן ייחודי נלהב, ביצוע 1,000 ניסויים עם כמות מינימאלית של חיזוק. תכונות אלו הופכות אותם מתאימות במיוחד לניסויים מתוארים להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה
כל הניסויים שנערכו בהתאם להנחיות הגרמנים לטיפול ושימוש בבעלי החיים במדע. הליכים אושרו על ידי ועדת אתיקה ארצית של מדינת צפון ריין ווסטפליה, גרמניה.
סקירת מערכת
אופרנטית בדיקת הלשכה
קאמרי אופרנטית (איור 1) מודד 34 סנטימטר x 34 סנטימטר x 50 סנטימטר. שלושה מפתחות שקופים תגובה (4 ס"מ X 4 סנטימטר, הממוקמים כ 20 ס"מ מעל פני רצפה) הם שקועים בקיר האחורי של החדר. גירויים מוצגים באמצעות מסך שטוח LCD רכוב מאחורי מפתחות התגובה. שתי נורות 2 ואט ממוקמות בקירות הצדדיים לספק תאורה עמומה. החדר שוכן בחדרון הפחתת צליל כדי להסוות צלילים זרים. רמקולים מספקים רעש לבן בכל העת. מזון (דגנים) מסופק על ידי הופר מזון הממוקם מתחת לאגורהמפתח אה. החומרה ניסיונית נשלטת על ידי קוד MATLAB אישית בכתב 21. בעלי חיים נמצאים תחת פיקוח מתמיד באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברת לקיר הקדמי של החדר.
Microdrives מותאם אישית שנבנה
Microdrives דיור 16 חוטי האלקטרודה הוא מותאם אישית שנבנה במעבדה שלנו; העיצוב מבוסס על עבודה של Bilkey ועמיתי 22,23, והקורא מופנה למאמרים האלה לתיאור מפורט. שינינו את העיצוב שלהם, כדי לאפשר למספר גדול יותר של אלקטרודות (16 במקום 8; 25 מיקרומטר חוטי nichrome), ואנחנו לחבר את חוטי האלקטרודה באמצעות דבק כסף מוליך לשקע headstage. בנוסף, אנו משתמשים בזהב, ציפוי של האלקטרודה הטיפים לצמצום עכבה וכדי להשיג יחס אות לרעש טוב יותר (להחיל -3 V ל~ 3 שניות; עכבות צריכה לרדת ל <100 kΩ).
ברגע שהדיסק הקשיח הזעיר מורכב, האלקטרודות לחתוך באורך הרצוי, טיפים הם cleaneד באמבטיה קולי (Tergazyme במים מזוקקים) עבור 20 דקות ושטפה עוד 20 דקות במים מזוקקים. זהב ציפוי של טיפים אלקטרודה צריכה להתבצע מייד לפני ההשתלה. להארקה, אנו משתמשים באלקטרודה כדור כסף להציב מעל המוח הקטן לרוחב. מפרט של חומרים מסופק בטבלת החומרים המלווה את המאמר הזה.
נושא חשוב בעבודה עם בעלי חיים לנוע בחופשיות הוא חפצי תנועה. מצאנו כי חפצי תנועה בהגדרות שלנו הם במידה רבה בשל) עכבות הגבוהה אלקטרודה (> 500 kΩ) ו ב) קובץ מצורף לא מושלם של אנשי הקשר בין התקע (שתל) והשקע (headstage) ואילו בעלי החיים נמצאים בתנועה. מגוון של microconnectors זמין מסחרי אינו מבצע באופן משביע רצון להקלטה לנוע ציפורים בחופשיות, משום שהקשר המכני בין התקע ושקע במהירות מתדרדר באמצעות תנועות נמרצות של היונים (ראש לקיצוץ, מפתח ניקור). החיבור המכני הטוב ביותר בין השתל וheadstage הושג עם מכלולי headplug מGinder מדעי. מכלולי התוספת שקע אלה כוללים 18 אנשי קשר והם מודבק בחוזקה זה לזה על ידי אגוז טבעת.
הגדרת הקלטת אלקטרו
התקנת אלקטרופיזיולוגיה כוללת את המרכיבים הבאים: 1) headstage שהותקן עם רווח אחדות (מגבר מבצעי) 2) מודולים מגבר 15 ההפרש שוכנו בשני במעמד הר יחידות (DPA-2FS וEPMS-07, בהתאמה; NPI GmbH האלקטרוני, גרמניה ), 3) ממיר 16 ערוצים אנלוגיים לדיגיטלי (כוח 1401 סימן). אותות גלם הם מוגברים 1,000 x ולהקה לעבור סינון (Hz 500-5,000, 1 מסנן כדי st), דיגיטציה בקצב דגימה של 16-20 קילוהרץ ומאוחסן עם 7.06a Spike2 הגרסה לעיבוד מקוון. פעמים אירוע (כגון הופעת גירוי או מנקר מפתח בודד של בעלי החיים) נלכדות באמצעות תיבת IO יציאת מקבילית שנבנתה במעבדה (ראה רוז; אח' 21) ומועבר לממיר AD לאחסון, יחד עם נתונים נוירופיזיולוגיות (ראה איור 1).. עיבוד מנותק מתואר בהמשך.
איור 1. סקירת מערכת. זרימת מידע מסומלת על ידי חיצים צבעוניים. חומרת 1 בקרות מחשב הנוגעת לפלט התנהגותיות (תצוגת גירוי באמצעות המסך השטוח, אור בבית, הופר מזון, מזין אור, מפתחות תגובה) ושולחת את חותמות זמן אירוע לממיר לספירה. אותות נוירופיזיולוגיות 2 חנויות מחשבים המתקבלים מממיר D / וחותמות זמן אירוע קיבלו מ1 מחשב. התמונה משמאל מראה את תא האוויר בתוך תא הפחתה-הצליל. מרכיביה הם: 1) קליפת הפחתת צליל, 2-4) מפתח תגובהים, 5) הופר מזון, 6) מזין אור 7) אור בבית, מצלמת 8 תצפית).
כפייה חד מרווח ברירה (SIFC) אפליה משימה
לשם בהירות, נתאר את משימת SIFC הסופית כאן ולאחר מכן נסביר את הצעדים הדרושים כדי להכשיר את בעלי החיים במשימה זו בהמשך.
משימת SIFC מתוארת באיור 2. לאחר מרווח intertrial (ITI) חלף, מפתח מרכז transilluminated ירוק לתקופה של עד 5 שניות ('שלב אתחול'). מייד לאחר התגובה השלישית של בעלי החיים תוך 5 שניות, אחד מתוך כמה גירויי מדגם מוצג על מפתח המרכז עבור 2 שניות ('שלב מדגם'; גירויי דוגמא מוצגים בהבלעת איור 2). לאחר 2 שניות, מפתח המרכז transilluminated שוב ירוק, ובעלי החיים יש להגיב פעם נוספת לפני שני מקשי צדם transilluminated ('שלב אישור "). בהתאם לזהותו של הגירוי מוצגבשלב הדגימה, נדרש בעלי החיים לכוון תגובה אחת לשמאל או המפתח הנכון ("שלב בחירה"). אם היא בוחרת את היעד הנכון, לגשת ללתגמל (תבואה) אושר על 2 שניות. לכן, הליבה של המשימה מורכבת מלהגיב למפתח הבחירה עזב לאחר ההצגה של גירוי מסוים אחת על מקש המרכז, ולהגיב אל מקש הבחירה הנכון לאחר ההצגה של גירוי אחר. הסיבה כי בשלב הדגימה הוא בסוגריים על ידי אתחול ושלב אישור היא לשמור על ראשם של בעלי החיים בחזית המרכזית במרכז בזמן גירוי המדגם מוצג.
ברגע שהאדונים של בעלי החיים משימה זו לזוג אחד של גירויים (להלן, גירויים 'מוכרים', FS), הוא מוצג עם גירוי רומן זוג (NS) בכל פגישה חדשה, ויש לו ללמוד איזו משני גירויי הרומן הוא להיות אחריו על ידי תגובה לשמאלית או על מקש הבחירה הנכון. צמד FS ממשיך יוצג במהלך הOSE ניסויים כדי לשרת את מצב שליטה מתאים. ביצועים נאותים במשימה הסופית צירים מכריע בנכונותם של בעלי החיים כדי לבצע> 1,000 ניסויים בהסתברויות חיזוק כללי <0.5. בפסקאות הבאות יתארו הליך הכשרה בו מורכבות משימה היא גדל בהדרגה עד שהחיה מגיעה לרמה של SIFC; באותו הזמן, הסתברות חיזוק ומספר הניסויים בכל הפעלה צריכים להיות מוגברת כדי להבטיח ביצועים גבוהים באופן עקבי במשימה הסופית.
1. הדרכה בעלי חיים
- הגבלת מזון
- לשקול את בעלי החיים לאחר לפחות שבועיים של גישה חופשית למזון. קח את זה במשקל כמו המשקל חופשי ההאכלה. להגביל את גישת מזון על 1-2 השבועות הקרובים עד שבעלי חיים להגיע 85% מהמשקל חופשי ההאכלה שלהם.
- זה קריטי, כי יונים לשמור על מראה בריא פיזי ופעילות רגילה לאורך כל תקופת הניסוי כולו. אלכך, בזהירות לפקח על המראה של החיות ומשקל על פני כל תקופת אימונים ובדיקות התנהגותיות. שוקל בעלי חיים לפני ואחרי כל טיפול ניסיוני על מנת להעריך את צריכת מזון יומית. אספקת מזון נוסף במידת צורך, כדי למנוע ירידה במשקל עוד יותר. לספק גישה בלתי מוגבלת למזון במהלך סוף השבוע.
- Autoshaping
Autoshaping משמש כדי להרגיל את בעל החיים לתא הניסוי ולהקים להגיב מותנה.- להציג גירוי חזותי 5-sec (להלן, גירוי אתחול, IS) על מפתח המרכז. מייד עם סיום IS או נשיקה אחת למפתח התגובה (מה שיבוא קודם), כבה את תאורה מרכזית וגמול נוכחי אוכל (2 הפעלת שניות של הופר מזון).
- שמור ITI במידה ניכרת יותר מהזמן המצגת לדוגמא כדי להקל על למידת 24. השתמש בערכים של 120 שניות לITI ולהפעיל 40 ניסויים ליום. לאחר מכן לעשות שימוש חוזר ISכגירוי מפתח אתחול, אישור, ובחירה במשימה האחרונה (ראה איור 2). שלב זה של אימון ייקח את החיות כשבוע.
- ברגע שבעלי החיים מגיבים באופן אמין (ב> 85% מניסויים), ירידה בשלבים ITI עד 10 שניות וזמן מצגת לדוגמא עד 2 שניות. באותו הזמן, להגדיל את מספר התגובות הנדרשות לחיזוק ל3 (יחס קבוע של 3, FR 3). בנוסף, להגדיל את המספר הכולל של ניסויים ליום. בחר פרמטרים כגון שהחיה היא אימן בכל יום במשך כ 1 שעה. שלב זה של אימונים יימשך בערך 2 שבועות.
- חזור על הצעדים 1.2.1 - 1.2.3 למפתחות תגובת ימין ועל שמאל, עד נושאים באופן מהימן להגיב להוא על כל 3 המפתחות. ניסויים חלופי עם הפעלה של השמאל, ימין, ומרכז המפתח באופן אקראי.
- עכשיו מציג הם ראשונה במרכז ולאחר מכן, מותנה בתגובה, באחד ממקשי הצד (להשמיט חיזוק עבורתגובת מרכז מפתח). מפתחות חלופי מופעלים צד באופן אקראי ממשפט למשפט. לסיים את הניסויים שבנושא אינו מגיב למפתח המרכז לאחר 5 שניות. חזור על פעולה עד שהחיה מבצעת באופן אמין (~ 3 ימים).
- מציג 2 גירויים חדשים שמאוחר יותר ישמשו כFS במשימה האחרונה (ראו איור 2, הבלעה, לדוגמאות). חזור על שלבי 1.2.1 - 1.2.3 עם גירויים אלה. בתגובה תוקם במהירות רבה יותר מאשר עם הגירוי הראשון, בדרך כלל בתוך 4 ימים.
איור 2. איור של הפרדיגמה התנהגותיות. לאחר ITI של 5 שניות, מפתח מרכז transilluminated ירוק לתקופה של עד 5 שניות (אתחול). אם החיה מגיבה 3x בתוך 5 שניות הללו, 1 מתוך 4; גירויי מדגם שהוצגו באותה התנוחה. לאחר זמן מצגת לדוגמא קבועה של 2 שניות שבמהלכו בעלי החיים יש להגיב לפחות פעם אחת, מפתח הניקור המרכזי transilluminated ירוק שוב (אישור). אחרי עוד נשיקה, 2 מקשי צדם transilluminated ירוקים. הנושא מצביע על בחירתה על ידי להגיב פעם אחת לאחד ממקשי הצד. במהלך רכישה ורכישה מחדש, תשובות נכונות ואחריו 2 גישת מזון שניות מלווה בהפעלה של אור המזין, או הפעלה של אור המזין לבד. אם שגוי, אורות בית כבויים למשך 3 שניות. במהלך הכחדה, שתי התשובות הנכונות ולא נכונות לגירוי ההכחדה יישארו חסרות חשיבות. הבלעה מראה זוגות דוגמא רומן וגירוי מוכר.
- הדרכה של יחיד מרווח כפייה ברירה (SIFC) משימה לגירויים מוכרים
- לקבוע את הרצף המלא של אתחול, מדגם, אישור, ובחירה: בכל ניסוי, Fi הווהRST IS (FR 3), ולאחר מכן אחד משני FS (משך קבוע 2 שניות), ואז שוב הוא (FR 1). השתמש בעיצוב תתבקש בחירה: בכל ניסוי, transilluminate רק את מפתח הבחירה שהיא נכונה עבור FS נתון. שלב זה של אימון צריך לקחת כ 1 שבוע.
- ברגע שהנושא מבצע באופן אמין (> תגובות 85% לצד המפתח בהתאמה), להציג את מחקריהם חופשיים (שני מקשי צד transilluminated בשלב בחירה). אם החיה מגיבה לצד הנכון, לספק גישה לאוכל 2 שניות. תגובות שגויות ואחריו עונש פסק זמן (אורות אולם מחוץ ל2 שניות). אם אין תגובה היא נתון בתוך 3 שניות, לסיים ניסוי ולהתחיל מחדש ITI. בעלי חיים בדרך כלל ללמוד רכיבי משנה של המשימה הבאות בתוך 2 שבועות.
- בהדרגה להגדיל את החלק היחסי של ניסויים מרצונם חופשי במהלך פגישות שלאחר מכן מ20% ל100%.
- אם הנושא מבצע> 90% נכונים בניסויים מרצונם חופשיים, להקטין הסתברות פרס על תשובות נכונות ל0.5ואילו במקביל להגדיל את מספר הניסויים בכל הפעלה ל1,000. אין לשנות פרמטרים בכל יום / ישיבה, אבל לבחור אותם באופן גמיש בהתאם לרמת הביצועים של הנושא הנוגע למחדלי אתחול ואחוז התשובות נכונות. שלב זה של אימונים יימשך כ -4 שבועות.
- יונים נוטים לסרב להגיב לגירויים לא מוכרים. לכן, ברגע שבעלי החיים באופן מהימן מבצע> 1,000 ניסויים, תגובות צורה אוטומטית לקבוצה גדולה של גירויים חזותיים (ראו סעיף 1.2). עם זאת, לא preexpose הגירויים החזותיים המיועדים לשימוש מאוחר יותר כגירויים חדשים בפרדיגמה הסופית אלא מציג צבע אחיד.
- כפיית בחירה חד מרווח סופי משימה עם רומן גירויים בתנאי חיזוק שונים
- חימום
תן את הנושא לבצע 50 ניסויים עם FS בלבד. הגדרת הסתברות פרס על גירויים אלה כדי <1 (נניח, 0.5-.8) במהלך כל השלבים כדי למנוע שובע ומוקדם,לכן, חוסר המוטיבציה להגיב. - רכישת שלב
ניסויים אקראיים חלופיים עם מצגת של FS וNS. להקצות מקשי תגובה שונים כנכונים עבור שני NS ולחזק את כל תשובה נכונה. חישוב אחוז התשובות נכונות כממוצע דריסת 120 הניסויים האחרונים. רכישה נחשבת שלמה פעם אחת ביצועים עבור כל אחד מNS עולה 85%, אך לא לפני מינימום של 150 ניסויים הוצאו להורג. - שלב הכחדה
תפסיק חיזוק תגובות שגויות נכונות ומענישות לNS אקראי (גירוי הכחדה). בגין שלב רכישה מחדש כאשר נכון להגיב לגירוי ההכחדה יורד מתחת 60% ובעלי החיים חוו לפחות 150 ניסויים בשלב זה בסך הכל. - שלב רכישה מחדש
שוב לחזק נכון ולהעניש תגובות שגויות לגירוי ההכחדה, כמו בשלב הרכישה. לסיים את פגישת כשביצועים לגירוי זה עולה 85% והאנימהls מתבצע לפחות 150 ניסויים בשלב זה בסך הכל.
- חימום
2. אלקטרופיזיולוגיה
- השתלת האלקטרודה
ניתוח השתלה מתבצע לאחר שבעלי החיים שוב ושוב (3-4x) השלים את רצף רכישת הכחדה-רכישה מחדש כל והוא מתואר בפירוט רב יותר במקומות אחרים 25.- הנח 5-6 microsrews נירוסטה בגולגולת לעיגון ראש מלט שיניים הר כולל הדיסק הקשיח הזעיר.
- לבצע פתיחת גולגולת בדיוק מעל האזור במוח של עניין; לאחר מכן לנתח בזהירות את הדורה ולהפחית את האלקטרודות למיקום הרצוי.
- לפני עיגון הדיסק הקשיח הזעירה לראש הר, חלים וזלין סביב צינורית המדריך; זה ימנע מלט שיניים מעוטף את צינור המדריך.
- השתמש באלקטרודה כסף כדור מבודדת ממוקמת מתחת לגולגולת שמעל המוח הקטן כקרקע.
- לספק חיות עם משככי כאבים (Carprofen, 10 מ"ג / kגרם, הוזרק פעמיים ביום) במשך שלושה ימים לאחר ניתוח. אפשר לבעלי חיים כדי לשחזר לפחות 2 שבועות.
- הקלטות בעוד בעלי חיים לבצע את המשימה
- השתמש זוג גירויים חדשים חדש לכל אלקטרודות פגישה ומראש לפחות 125 מיקרומטר (חצי מהפכה של בורג הכונן) לפני שמתחיל. אם אין פוטנציאל פעולה של יחס אות לרעש מספק הם נצפו, לבטל את הפגישה, המקום חי בכלוב בבית ולנסות שוב למחרת.
- מסדרים את כבל headstage כאלה שזה לא מפריע לניקור הנורמלי של בעלי החיים והתנהגות אכילה. זו יכולה להיות מושגת על ידי הצמדת בכבלים עם כמה רצועות אלסטיות לחלק העליון של חדר האוויר והרגלת ציפורים את הכבל מחובר לכמה שעות.
- אם זמין, לעשות שימוש במחלף לספק חופש נוסף של תנועה לציפורים.
- ניתוחי אות מנותק
- Band-pהתחת של מסנן כל ערוצי 500 עד 5,000 Hz עם מחובר רול-offs תלול באמצעות Spike2. לחלץ קוצים עם ספים משרעת ולמיין אותם מעסיקים ניתוח מרכיבים ראשי באופן ידני.
- בחן מיון תוצאות עם קוד MATLAB אישית בכתב (זמינות ב MATLAB המרכזי קובץ Exchange, קובץ זיהוי # 37339). יחידה אחת מבודדת היטב (איור 3) צריכה לעמוד בכל הקריטריונים הבאים: א) אשכול יופרד בצורה ברורה בשטח מרכיב עיקרי, ב) שום סימן של יחידות מרובות, כאשר כל הגל שנרשם הם כיסו וזמם כמפת חום (איור 3A ), ג) אמפליטודות גל השיא מופץ באופן סימטרי (איור 3 ב), ד) הקלטה יציבה לאורך כל הפגישה כפי שמעיד משרעת משתנות ספייק (איור 3 ג), ה) לא או מעט מאוד אירועי ספייק המתרחשים בתקופה עקשן של ספייק שקדמו (איור 3D), ויחס אות לרעש (SNR) של לפחות 2 (יחס אות לרעש הוא כאן דefined כהפרש בין המינימום והמקסימום של גל העלייה החדה בממוצע, מחולק ברוחב הגזוז של להקת הרעש (2.5 ה ו97.5 עשירונים ה של התפלגות ערכים מהסל הראשון של כל צורות הגל)). יחס אות לרעש של היחידה שמוצגת באיור 3 היא 3.9.
- בדוק מנותק ערוצי גלם לחפצים הקשורים לתנועה. בטל ערוצים במקרה צורך.
- חפצי חשמל שאירעו במהלך ניקור מפתח יכולים במקרים נדירים להתבלבל עם גל ספייק נכון. מבחן לזיהום של ההקלטות על ידי בחינת היסטוגרמה של ספייק הזמן סופר יחסית זה לזה לנקר (היסטוגרמה פרי לנקר זמן, PPTH, איור 3E) רשום מפתח. חפצים מושרה ניקור להופיע כשיא בקרבת היסטוגרמה (± msec 50) לזמן 0. כצק נוסף, להתוות את צורות הגל של כל אירועי ספייק המשוערים הרשומים ב± 20 אלפיות של פק מפתח בנפרד ולהשוות אותו לספייק גל זוהה outsidדואר חלון זה (איור 3F).
מדדי איור 3. איכות לבידוד יחידה. א) מפת חום של הערכים בזמן המתח של כל צורות הגל. ב ') הפצות של מקסימום (אדום), מינימאלי (ירוק), ורעש (ערכי מתח) הכחול של כל צורות הגל. ההפצות מופרדות היטב, המציין שיעור בידוד יחידה מצוין. C) ספונטני ירי (אדום, מחושב מ2 מקטעים של שנייה בכל מרווחי intertrial) ואמפליטודות ספייק (שיא לשיא) כפונקציה של זמן בישיבה. שני העקומות הוחלקו עם פונקצית קרון (רוחב: 50 נקודות נתונים) ד) הפצת Interspike מרווח ליחידה זו.. רוחב סל, 10 אלפיות שני (הבלעה: msec 1). בפרקי זמן קצרים מאוד כמעט נעדר (<0.1% ממרווחים מתחת ל -4 אלפיות שני). <PSTH strong> E) מופעלת מנקרים מפתח. ספירת אירוע קרובה ללנקר מפתח (± 20 אלפיות שני) מודגשות באדום. F) כל 157 הגל רשם בתוך ± 20 msec אירועים לנקר מפתח. הגל להשוות בחיוב צורת גל כולל שמוצגת בפנל א
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התנהגות
איור 4 א מציג את הביצועים ההתנהגותיים של בעלי חיים במושב דוגמא אחת. רמת הביצועים של בעלי החיים מגיעה לקריטריון לNS 2 בתוך 180 ניסויים (45 מצגות גירוי) והוא קרוב לNS 1 100% מההתחלה. אסטרטגיה זו - מגיב ראשון אותו המפתח עבור שני הגירויים החדשים, ולאחר מכן התאמת תגובות לאחד מהגירויים - הוא כ נצפה לעתים קרובות כאקראי ראשוני להגיב לשני NS. בפגישה זו, NS 2 נבחר באופן אקראי לעבור הכחדה, כלומר את כל האפשרויות הבאות גירוי זה יישארו חסרות חשיבות (מעבר בין שלבי למידה מסומן על ידי קווים מקווקווים שחורים אנכיים). במהלך הכחדה, ביצועים יורד לגירוי ההכחדה אבל נשארים גבוה לNS האחר. הוא הגיע קריטריון במשפט 370. תשובות נכונות ולא נכונות עכשיו חיזקו ונענשו שוב (רכישה מחדש) ורמת ביצועים מגיעה לקריטריון ב. משפט 402 רמת ביצועים לFS היא גבוהה באופן עקבי (> 95%; מידע לא מוצג). ב) ממוצע מספר הניסויים הדרושים כדי להשלים כל שלב של למידה (בממוצע לכל 5 בעלי חיים ו44 פגישות בסך הכל). בממוצע, בעלי חיים זקוקים ~ 700 ניסויים להגיב באופן עקבי להגיב בצורה נכונה. הכחדה לקחה ~ 900 ניסויים, ורכישה מחדש רק על 60 ניסויים, באופן משמעותי פחות מהרכישה המקורית (איור 4).
איור 4. תוצאות התנהגותיות דוגמא.) ביצועים של ציפור אחת עבור 2 גירויים חדשים על פני כל שלושת השלבים של למידה. עקומות מתארות בחירות אחוזים נכונות (כלומר מעל 120 הניסויים האחרונים, המקביל ל 30 מצגות של גירוי בהתאמה) כפונקציה של המספר הכולל של ניסויים, בנפרד עבור Stimul הרומןשלנו 1, רומן גירוי 2, וממוצע על פני שני הגירויים. ביצועים לגירויים מוכרים היו באופן עקבי מעל 95% נכונים (מידע לא מוצג) B) ממוצע מספר הניסויים הדרושים כדי להשיג ביצועי קריטריון בכל אחת משלושת השלבים של למידה.; ברים שגיאה, SEM.
עצבי נתונים
איור 5 מראה את דפוס התגובה של שתי יחידות בcaudolaterale nidopallium (NCL) נרשם בזמן שבעלי חיים היה לבצע את משימת SIFC. אפנון תגובה במהלך המצגת של NS מוצג באיור 5 א '. בשלב הרכישה, היחידות מגיבה בחריפות לNS 2 (מיועד להכחדה), עם תגובות ירידה לקראת סיום שלב הרכישה והשינוי קטן בירי בשני שלבים האחרים של למידה. יש מעט מגיב ל1 NS בכל הפגישה. עליית התגובה סביב 3-4 שניות לאחר הופעת גירוי המדגם נובעת לתגמל את המסירה. רמות פעילותגירויים מוכרים הנוגעים לא מווסת (מידע לא מוצג).
איור 5 מציג את דפוס התגובה של יחידה אחרת NCL נרשמה במהלך SIFC. תא עצב זה מגיב בזמן נכון, אבל לא שמאלה תנועות (למעלה משמאל), המעידים על קידוד הסנסורית. עם זאת, עוצמת התגובה השתנתה במהלך השלבים של למידה: שני הפנלים התחתונים ביותר להראות פונקציות צפיפות ספייק (sdfs) מופעלות לבחירות ימינה לאחד מוכר (משמאל) וגירוי אחד רומן (מימין), התפצלו לרבעונים רצופים כדי להמחיש את הפיתוח על פני ההפעלה הניסיונית. תגובות היו נמוכות יותר עבור הגירוי המוכר לאורך כל הפגישה, למרות שפעמי תנועה ממוצעת לשני תנאי הגירוי היו דומות מאוד (למעלה מימין). יתר על כן, תגובות בבחירות ימינה לאחר מצגת של הרומן, אבל לא הגירוי המוכר ירד במהלך ההפעלה הניסיונית (לא במקביל על ידי ירידה באשוח בסיסing שיעור). לפיכך, שני הנוירונים ירד ירי כגירוי רומן בפרט הפך למוכר יותר ויותר, עם תא העצב באיור 5 ב קידוד לתנועה ספציפית, בנוסף לחידוש של הגירוי שקדמו לאותה תנועה.
איור 5. דפוסי תגובה משתי יחידות דוגמא שנרשמו במהלך משימת SFIC.) ספייק צפיפות פונקציות מופעלות לתחילתו של הרומן 2 גירויים NS 1 וNS 2 (שורה העליונה ותחתונה, בהתאמה), להתפצל ל3 שלבי למידה (עמודות ), עם תשובות בכל שלב למידה ניפרד שוב ב 3 חלקים שווים (מוקדם, אמצע, סוף). NS 2 היה מיועד להכחדה. PSTHs (ms 1 רוחב סל) הוחלק עם הקרנל גאוס הותאם באופן אקספוננציאלי (אלפיות שני σ = 100 וτ = 100 אלפיות שני). ב ')
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר משימה התנהגותיות מורכבת מתאימה להקלטות יחידה אחת בו זמנית. שתארנו את משימת SIFC ליונים, אבל זה יכול להתאים בקלות למכרסמים ידי דרישה תדחף את האף או מנקר מפתח מנוף לחיצה ולא, והחלפה חזותית על ידי חוש הריח, שמיעה, מישוש או גירויים.
אולי השלבים הקריטיים ביותר במהלך הליך ההכשרה הם 1) הפחתה הדרגתית של שכר והסתברות 2) עלייה במספר משפט. לגבי חיזוק לסירוגין לגירויים המוכרים, החלטנו על הסתברויות גמול החל .5-0.8; אלה הם גבוהים מספיק כדי לייצר ביצועים יציבים אך נמוכים מספיק כדי למנוע שובע המוקדם. עם זאת, ציפורים רבות מוכנות לבצע גם להסתברויות גמול עד 0.2.
המספר רב של מחקרים בכל הפעלה (500-1,500) הוא הכרחי, כי הרכישה, הכחדה, והרכישה מחדש של si להגיב המותנהmply דורש ניסויים רבים זה, וכי להערכת המדויקת של שיעורי ירי קשה עם פחות מאשר, למשל, 25 ניסויים, במיוחד בעת הקלטה מתא עצב עם שיעורים נמוכים ירי (בNCL, שיעורי ירי בסיסיים הם <1 הרץ). בהתאם לכך, אנו קובעים את המספר המינימאלי של ניסויים נחוצים להשלמת שלב למידה באופן שכל גירוי מוצג לפחות 35 פעמים.
לבעלי חיים תמימים, הדרכה על משימת SIFC לוקחת כ -4 חודשים, אך משך הזמן המדויק תלוי בכבדות על הפרט. בשל הדרישות גבוהות של המשימה, זה די סביר להניח כי לא כל בעלי החיים יהיו בסופו של דבר ביצועים טוב על הפרדיגמה הסופית. אם ציפור בודדת מדלגת ניסויים רבים מדי או מייצרת שיעורי שגיאה גבוהים במהלך אימון, אל תהססו להחליף את הנושא הזה. מניסיוננו, קיימת סבירות גבוהה כי בעל חיים זה לעולם לא לבצע כראוי במשימה הסופית.
מחקרים הקודמים רוב ביצוע הקלטות יחידה אחת ביונים המסתובבים באופן חופשי לא הצליחו לרשום כראוי פלט מוטורי במהלך הקלטה. זה מסבך את הפרשנות של תגובות עצביות בתקופות קריטיות של הניסויים, כמו מצגת לדוגמא או שלבי עיכוב 25. בעיה זו טמונה בדרכים / משימות לא ללכת שבהנסיין בדרך כלל לא יודע מה הנושא הוא עושה על ניסויים לא ללכת; אותה הערת האזהרה חלה על עובד משימות זיכרון בשילוב תקופת עיכוב ממושכת. כדי להשיג שליטה על תנועתם של בעלי החיים ללא העסקת ראש קיבעון, עיצבנו משימה שבה בעלי חיים צריכים לבצע את אותה הפעולה (ניקור מפתח) שינוי למרות שתנאים (גירויים לדוגמא). בפרדיגמה SIFC, שניהם קלט חזותי, כמו גם תפוקת מנוע הוא מבוקר היטב ופיקוח מתמיד. מאז בעלי החיים נדרשים ללנקר בכל גירוי מדגם לאורך המצגת שלו, אנחנו שומרים קבועים תפוקת מנוע תוך חיות צופים גירויים עם היסטוריה למידה שונה. כרגע אנחנו בוחנים methods כדי להשיג שליטה טובה יותר של תפוקת מנוע, כגון הצמדת תאוצה לheadstage לרישום הרציף של תנועות ראש. כמו כן, אנו מפתחים שיטות למדידת הכוח של כל לנקר מפתח באמצעות מתמר mechanoelectric.
הפרדיגמה שלנו מאפשרת למחלצים את תרומתם של חושי, מוטורי, ומשתנים קוגניטיביים לשיעורי ירי עצביים על ידי זיהוי דפוסי תגובה עצביים טיפוסיים. לדוגמא, תא עצב premotor לתגובות שמאלה יהיה צפוי להגביר את הירי בשלב הדגימה בכל פעם שבעלי החיים הוא הולך לעשות את תגובה שמאלה, ללא קשר לזהותו גירוי. בדומה לכך, הנוירונים מוטוריים פשוטים יהיו צפויים לפטר במהלך ניקור מפתח, או תנועה שמאלה או ימינה. נוירון מייצג ציפייה הפרס, לעומת זאת, היה יורה בשלב הדגימה, ויותר מכך לFS מ NS במהלך רכישה מוקדמת (כי הסתברות הסובייקטיבית היא גמול גבוהה יותר על FS מאשר TR NSials לפני NS נלמד), אבל זה צריך להפוך מאוחר יותר, כאשר NS מסווג באופן עקבי בצורה נכונה (כי הסתברות גמול מטרה היא גבוהה יותר על ניסויים NS נכונים). לבסוף, תאי עצב מגיבים לתכונות גירוי ספציפיות צפויים לפטר באופן עקבי לאחת מגירויי המדגם ללא כל שינוי על פני שלבים של למידה.
מכיוון שהקלטת יחידה תאית נוטה שיא קוצים מיחידות מרובות בו זמנית 11,26, בודקת מגוון רחב של מדדי איכות הוא חשוב לסווג כראוי קוצים כנובעים מאחד או מתא עצב רב 27. שימוש tetrodes במקום אלקטרודות בודדות בוודאי יניב עלייה נוספת במיון איכות 11. זה צריך להילקח בחשבון כאשר הקלטות באזורים במוח עם צפיפות גבוהה של תאים (לדוגמא היפוקמפוס) או פעילות גבוהה מאוד ספונטנית (כגון entopallium) מיועדות. עם זאת, microplugs אנו משתמשים הם זמינים רק לתקופה של עד 18 חיבורים אשר לעת עתה מהווים גבול עליון למספר הכולל של ערוצי הקלטה.
לסיכום, פיתחנו משימה של מורכבות גבוהה לחיות ניסוי שאינו הפרימטים. משימה זו הייתה מותאמת כדי לאפשר החקירה של לימוד תופעות עם הקלטות בודדים של תאי עצב, אבל באותו הזמן מתאים כדי להתמודד עם נושאים כגון סיווג, קבלת החלטות, וקידוד גמול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מקרן המחקר הגרמני (DFG) לMCS (ל1581, STU 544/1-1) ועוג (ל1581, SFB 874). האתר של DFG הוא http://www.dfg.de/en/index.jsp. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של המחברים manuscript.The תודה תומס סיידנבכר שספק לנו את פרוטוקול זהב ציפוי כמו גם טוביאס אוטו לעזרה עם הגדרת אלקטרו ציוד הקלטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resistance wire (for use as electrodes) | California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA | Stablohm 675; formvar-coated nichrome wires (outer diameter 25 µm) | |
| Microconnectors | Ginder Scientific, Nepean, Ontario, Canada | GS18PLG-220 (plug) & GS18SKT-220 (socket to build headstage) | |
| Cannulae | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 0.4 x 20 mm/ 27 Gx3/4" | |
| Gold solution for plating | Neuralynx, Bozeman, MT, USA | SIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355 | |
| Solution for ultrasonic bath | Alconox, Inc., New York, USA | 1304 | Tergazyme |
| Conductive glue | Henkel Loctite | LOCTITE 3888 Silver filled, conductive, adhesive | |
| Stainless steel screws | J.I. Morris, Southbridge, MA, USA | F0CE125 self-tapping miniature screws, body length 1/8 inches | |
| Light-curing dental cement | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Omniceram Evo Flow A2 | |
| Light-curing unit | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Jovident Excelled 215 Curing Light (wireless LED light curing unit) | |
| Filter amplifiers | npi electronic GmbH, Germany | DPA-2FS | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | power 1401 | |
| Spike2 software | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Version 7.06a | |
| MATLAB | The Mathworks, Natick, MA, USA | R2012a |
References
- Bingman, V. P., Gasser, B. A., Colombo, M. Responses of pigeon (Columba livia) wulst neurons during acquisition and reversal of a visual discrimination task. Behav Neurosci. 122, 1139-1147 (2008).
- Herry, C., Ciocchi, S., Senn, V., Demmou, L., Müller, C., Lüthi, A. Switching on and off fear by distinct neuronal circuits. Nature. 454, 600-606 (2008).
- Quirk, G. J., Repa, C., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances short-latency auditory responses of lateral amygdala neurons: parallel recordings in the freely behaving rat. Neuron. 15, 1029-1039 (1995).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., Ledoux, J. E. Components of Tone-Evoked Spike Trains in Auditory Cortex and Lateral Amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Maren, S. Auditory fear conditioning increases CS-elicited spike firing in lateral amygdala neurons even after extensive overtraining. Eur J Neurosci. 12, 4047-4054 (2000).
- Milad, M. R., Quirk, G. J. Neurons in medial prefrontal cortex signal memory for fear extinction. Nature. 420, 713-717 (2002).
- Hobin, J. A., Goosens, K. A., Maren, S. Context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala represents fear memories after extinction. J Neurosci. 23, 8410-8416 (2003).
- Maren, S., Hobin, J. A. Hippocampal regulation of context-dependent neuronal activity in the lateral amygdala. Learn Mem. 14, 318-324 (2007).
- Knapska, E., et al. Differential involvement of the central amygdala in appetitive versus aversive learning. Learn Mem. 13, 192-200 (2006).
- Harloe, J. P., Thorpe, A. J., Lichtman, A. H. Differential endocannabinoid regulation of extinction in appetitive and aversive Barnes maze tasks. Learn Mem. 15, 806-809 (2008).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63, 43-54 (1995).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, (1998).
- Skinner, B. F. 34;Superstition" in the pigeon. J Exp Psychol. 121, 273-274 (1948).
- Herrnstein, R. J. Relative and absolute strength of response as a function of frequency of reinforcement. J Exp Anal Behav. 4, 267-272 (1961).
- Brown, P. L., Jenkins, H. M. Auto-shaping of the pigeon's key-peck. J Exp Anal Behav. 11, 1-8 (1968).
- Epstein, R., Kirshnit, C. E., Lanza, R. P., Rubin, L. C. 34;Insight" in the pigeon: antecedents and determinants of an intelligent performance. Nature. 308, 61-62 (1984).
- Mazur, J. E. Varying initial-link and terminal-link durations in concurrent-chains schedules: a comparison of three models. Behav Processes. 66, 189-200 (2004).
- Herrnstein, R. J., Loveland, D. H. Complex visual concept in the pigeon. Science. 146, 549-551 (1964).
- Stüttgen, M. C., Yildiz, A., Güntürkün, O. Adaptive criterion setting in perceptual decision making. J Exp Anal Behav. 96, 155-176 (2011).
- Stüttgen, M. C., Kasties, N., Lengersdorf, D., Starosta, S., Güntürkün, O., Jäkel, F. Suboptimal criterion setting in a perceptual choice task with asymmetric reinforcement. Behav Processes. 96, 59-70 (2013).
- Rose, J., Otto, T., Dittrich, L. The Biopsychology-Toolbox: a free, open-source Matlab-toolbox for the control of behavioral experiments. J Neurosci Methods. 175, (2008).
- Bilkey, D. K., Muir, G. M. A low cost, high precision subminiature microdrive for extracellular unit recording in behaving animals. J Neurosci Methods. 92, 87-90 (1999).
- Bilkey, D. K., Russell, N., Colombo, M. A lightweight microdrive for single-unit recording in freely moving rats and pigeons. Methods. 30, 152-158 (2003).
- Gallistel, C. R., Gibbon, J. Time, rate, and conditioning. Psychol Rev. 107, 289-344 (1993).
- Starosta, S., Güntürkün, O., Stüttgen, M. C. Stimulus-response-outcome coding in the pigeon nidopallium caudolaterale. PLoS One. 8, (2013).
- McNaughton, B. L., O'Keefe, J., Barnes, C. A. The stereotrode: a new technique for simultaneous isolation of several single units in the central nervous system from multiple unit records. J Neurosci Methods. 8, 391-397 (1983).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. J Neurosci. 31, 8699-8705 (2011).
