Summary
Imparare nuove associazioni stimolo-risposta coinvolge una vasta gamma di processi neurali che sono in ultima analisi riflettono nel cambiare uscita picco dei singoli neuroni. Qui si descrive un protocollo comportamentale che consenta la registrazione continua di attività singolo neurone mentre gli animali acquisiscono, spegnere, e riacquistano una risposta condizionata all'interno di una singola sessione sperimentale.
Abstract
Mentre il tema della formazione ha suscitato grande interesse da parte degli scienziati sia comportamentali e neuronali, solo relativamente pochi ricercatori hanno osservato attività singolo neurone mentre gli animali stanno acquisendo una risposta operantly condizionata, o se quella risposta è estinta. Ma anche in questi casi, periodi di osservazione di solito comprendono solo una singola fase di apprendimento, vale a dire l'acquisizione o l'estinzione, ma non entrambi (eccezioni includono i protocolli di lavoro di apprendimento inversione, vedere Bingman et al 1 per un esempio.). Tuttavia, l'acquisizione e l'estinzione comportano diversi meccanismi di apprendimento e, pertanto, dovrebbero essere accompagnate da diversi tipi e / o loci di plasticità neurale.
Di conseguenza, abbiamo sviluppato un paradigma comportamentale che gli istituti di tre fasi di apprendimento in una singola sessione comportamentale e che è adatto per la registrazione simultanea dei potenziali d'azione singoli neuroni. Animali are addestrato su un unico intervallo compito scelta forzata che richiede la mappatura ciascuna delle due possibili risposte scelta per la presentazione dei vari stimoli visivi romanzo (acquisizione). Dopo aver raggiunto un criterio di prestazione predefinita, una delle due risposte scelta non è rinforzato (estinzione). A seguito di un certo decremento nel livello di prestazioni, le risposte corrette sono rafforzate nuovo (riacquisto). Utilizzando una nuova serie di stimoli in ogni sessione, gli animali possono subire il processo di acquisizione estinzione-riacquisizione ripetutamente. Poiché tutti e tre fasi di apprendimento si verificano in una singola sessione comportamentale, il paradigma è ideale per l'osservazione simultanea dell'uscita incurvamento multipli singoli neuroni. Usiamo i piccioni come sistemi modello, ma il compito può essere facilmente adattato ad altre specie in grado di apprendimento discriminazione condizionata.
Introduction
Imparare nuove associazioni stimolo-risposta-esito coinvolge una vasta gamma di processi di plasticità neurale. Questi processi sono in ultima analisi riflettono nel cambiare uscita picco dei singoli neuroni. Probabilmente, uno dei paradigmi più frequentemente impiegato di apprendimento è pavloviano condizionamento alla paura condotta con i roditori. In questo contesto, l'acquisizione e l'estinzione di una risposta condizionata si svolgono all'interno di poche decine di prove 2. Il rapido sviluppo di paura condizionata può essere vantaggioso perché consente l'esecuzione di un gran numero di animali in breve tempo. Inoltre, l'acquisizione e l'estinzione possono essere osservati entro poche decine di prove su un singolo giorno in animali naive 3,4 o distribuiti in 2 o 3 giorni 2,5-8. Tuttavia, le conoscenze acquisite sui cambiamenti dell'attività neurale durante l'apprendimento in questi esperimenti non necessariamente applicarsi fuori del dominio della paura condizionata. Ad esempio, il comportamento goal-directed guidato da posizionerinforzo tiva è più adeguatamente modellato da operante piuttosto che di Pavlov procedure di condizionamento, e può in parte dipendere da diversi substrati neurali 9,10. Inoltre, la paura condizionata sviluppa così rapidamente che le risposte neurali alla CS possono essere osservati solo per poche decine di prove, ponendo limiti severi sulla analisi delle variazioni di attività neurale durante l'apprendimento.
Purtroppo, l'acquisizione e l'estinzione dei operante rispondere di solito richiede molti giorni. Questo è dannoso per ricerche neurofisiologici, perché è notoriamente difficile da registrare l'attività di singole cellule su più di poche ore. A causa della elevata somiglianza delle forme d'onda dei potenziali d'azione extracellulare registrati, è problematico affermare che picchi registrati in un giorno sono generati dalla stessa cella come picchi con forme d'onda simili registrati sul successivo 11,12, soprattutto nelle zone ad alta densità cellulare come l'ippocampo.
(Columbia livia forma domestica) sono organismi modello classico in psicologia sperimentale 13-17. Questi uccelli sono in grado di eseguire complesse discriminazioni visive 18, in grado di adattarsi in modo flessibile comportamento al mutare delle contingenze di rinforzo 19,20, e sono unicamente lavoratori accaniti, l'esecuzione di 1.000 prove con quantità minima di rinforzo. Queste caratteristiche li rendono particolarmente adatti per gli esperimenti descritti di seguito.
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Protocol
Dichiarazione Etica
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida tedesche per la cura e l'uso degli animali nella scienza. Procedure sono state approvate da un comitato nazionale di etica dello stato del Nord Reno-Westfalia, in Germania.
Panoramica del sistema
Operante Test Chamber
La camera operante (Figura 1) misura 34 centimetri x 34 centimetri x 50 centimetri. Tre tasti traslucidi di risposta (4 cm x 4 cm, che si trova a circa 20 centimetri sopra il livello del pavimento) sono incassati nella parete posteriore della camera. Gli stimoli vengono visualizzate attraverso uno schermo piatto LCD montato dietro i tasti di risposta. Due lampadine 2-Watt situati in corrispondenza delle pareti laterali offrono una fioca illuminazione. La camera si trova in un cubicolo di attenuazione del suono per mascherare suoni estranei. Altoparlanti forniscono rumore bianco in ogni momento. Alimentare (cereali) è fornita da una tramoggia di cibo che si trova al di sotto del centesimochiave er. Hardware sperimentale è controllato da custom-written codice MATLAB 21. Gli animali vengono costantemente monitorate tramite una fotocamera digitale collegata alla parete frontale della camera.
Microdrive custom-built
Microdrive ospitano 16 fili elettrodi sono personalizzati realizzati nel nostro laboratorio; il progetto si basa sul lavoro di Bilkey e colleghi 22,23, e si rimanda il lettore a questi articoli per una descrizione dettagliata. Abbiamo modificato il loro design per consentire un maggior numero di elettrodi (16 invece di 8; 25 micron fili nichelcromo), e colleghiamo i cavi degli elettrodi tramite colla conduttiva d'argento alla presa headstage. Inoltre, utilizziamo doratura delle punte degli elettrodi per ridurre l'impedenza e ottenere migliori rapporti segnale-rumore (a -3 V per ~ 3 sec; impedenze dovrebbero scendere a <100 k).
Una volta che il microdrive è assemblato, gli elettrodi vengono tagliati alla lunghezza desiderata, le punte sono cleaned in un bagno ad ultrasuoni (Tergazyme in acqua distillata) per 20 min e sciacquati altri 20 min in acqua distillata. Doratura delle punte degli elettrodi deve avvenire immediatamente prima dell'impianto. Per la messa a terra, si usa un elettrodo palla d'argento posta sopra il cervelletto laterale. Specificazione dei materiali è riportata nella tabella I materiali che accompagna questo articolo.
Una questione importante quando si lavora con gli animali liberi di muoversi è artefatti da movimento. Abbiamo trovato che gli artefatti di movimento nelle nostre installazioni sono in gran parte a causa di a) impedenze alta elettrodi (> 500 kΩ) e b) attaccamento imperfetta dei contatti tra la spina (impianto) e la presa (headstage), mentre l'animale è in movimento. Una varietà di microconnettori disponibili in commercio non esegue in modo soddisfacente per la registrazione di muoversi liberamente uccelli, perché il contatto meccanico tra la spina e la presa deteriora rapidamente attraverso i movimenti vigorosi dei piccioni (testa-bobbing, key-beccata). Il miglior collegamento meccanico tra impianto e headstage è stato raggiunto con le assemblee headplug da Ginder scientifico. Queste assemblee presa-spina dispongono di 18 contatti e sono saldamente apposto tra loro da una ghiera.
Impostazione registrazione elettrofisiologica
Il setup di elettrofisiologia comprende i seguenti componenti: 1) un Headstage custom-built con guadagno unitario (amplificatore operazionale) 2) moduli amplificatori 15 differenziale alloggiati in due rack mount unità (DPA-2FS e EPMS-07, rispettivamente; npi GmbH elettronico, Germania ), 3) un convertitore analogico-digitale convertitore 16 canali (potenza 1401 mark I). Segnali grezzi vengono amplificati 1000 x e passa-banda filtrati (500-5,000 Hz, 1 filtro di ordine st), digitalizzata con una frequenza di campionamento di 16-20 kHz e memorizzati con Spike2 versione 7.06a per l'elaborazione offline. Gli orari degli eventi (come stimolo insorgenza o singoli beccate chiave del animale) vengono catturati tramite una scatola porta IO parallela-laboratorio di costruzione (cfr. Rose; Et al 21) e trasmessi al convertitore AD per immagazzinaggio insieme ai dati neurofisiologici (vedere Figura 1).. Elaborazione offline è descritto più avanti.
Figura 1. Panoramica del sistema. Flusso informativo è simboleggiato da frecce colorate. Computer 1 controlli hardware di pertinenza di uscita comportamentale (display stimolo attraverso il monitor a schermo piatto, casa di luce, cibo tramoggia, la luce di alimentazione, tasti di risposta) e invia timestamp di eventi al convertitore AD. Computer 2 negozi segnali neurofisiologici ottenuti dal convertitore A / D e timestamp degli eventi ricevuti dal computer 1. La foto a sinistra mostra la camera di condizionamento all'interno della cabina di attenuazione del suono. I suoi elementi sono: 1)-Sound attenuazione guscio, 2-4) chiave di rispostas, 5) cibo tramoggia, 6) luce alimentatore 7) casa di luce, 8) fotocamera osservazione.
Single-Interval-forzata-Choice (SIFC) Discriminazione Task
Per chiarezza, descriveremo il compito finale SIFC qui e poi spiegare i passi necessari per addestrare gli animali in questo compito qui sotto.
Il compito SIFC è delineato nella Figura 2. Trascorso l'intervallo tra le prove (ITI), il tasto centrale è transilluminated verde per un massimo di 5 sec ('fase di inizializzazione'). Immediatamente dopo la terza risposta dell'animale entro 5 secondi, uno su diversi stimoli campione viene sul tasto centrale per 2 sec ('fase campione'; esempio stimoli sono mostrati in inserto alla figura 2). Dopo 2 secondi, il tasto centrale è di nuovo transilluminated verde, e l'animale deve rispondere ancora una volta prima che i due tasti laterali sono transilluminated ('fase di conferma'). Seconda dell'identità dello stimolo mostratonella fase del campione, l'animale è tenuto a dirigere una singola risposta né al tasto destro ('fase di scelta') o sinistro. Se si sceglie la destinazione corretta, accedere a premiare (grano) è concesso per 2 sec. Così, il nucleo del compito consiste nel rispondere alla chiave scelta sinistra dopo presentazione di uno stimolo particolare sul tasto centrale, e rispondendo alla chiave scelta subito dopo la presentazione di un altro stimolo. La ragione per cui la fase campione viene variata da un'inizializzazione e una fase di conferma è quello di mantenere la testa degli animali di fronte al tasto centrale mentre lo stimolo campione è presentato.
Una volta che i padroni di animali questo compito per una singola coppia di stimoli (d'ora in poi, gli stimoli 'familiare', FS), si è presentato con un nuovo stimolo (NS) pair in ogni nuova sessione, e deve imparare quale dei due nuovi stimoli è essere seguita da una risposta alla chiave scelta sinistro o destro. La coppia FS continua ad essere presentata durante those esperimenti per servire condizione di controllo idoneo. Prestazioni adeguate al compito finale dipende in modo cruciale dalla volontà degli animali per eseguire> 1.000 studi presso probabilità rafforzamento globale <0,5. I seguenti paragrafi descrivono un procedimento di formazione in cui complessità compito viene gradualmente aumentata fino a che l'animale raggiunge il livello della SIFC; Allo stesso tempo, la probabilità di rinforzo e il numero di prove per sessione devono essere aumentati per garantire prestazioni sempre elevate sul compito finale.
1. Formazione animale
- Restrizione alimentare
- Pesare gli animali dopo almeno due settimane di libero accesso al cibo. Prendete questo peso come il peso libero al seno. Limitare l'accesso al cibo per i prossimi 1-2 settimane fino a quando gli animali raggiungono l'85% del loro peso libero al seno.
- E 'fondamentale che piccioni mantenere un aspetto fisico sano e normale attività per tutta la durata dell'intero esperimento. Atal fine, il controllo accurato aspetto e peso degli animali attraverso l'intera durata della formazione e test comportamentali. Pesare animali prima e dopo ogni sessione sperimentale per valutare l'alimentazione quotidiana. Fornire cibo supplementare, se necessario, per evitare ulteriori perdite di peso. Fornire accesso illimitato al cibo durante il fine settimana.
- Autoshaping
Autoshaping serve ad abituare l'animale alla camera sperimentale e stabilire la risposta condizionata.- Presentare uno stimolo visivo 5-sec (d'ora in poi, l'inizializzazione stimolo, IS) sul tasto centrale. Immediatamente al termine del IS o un singolo beccare al tasto di risposta (ciò che viene prima), spegnere illuminazione dei tasti e presente ricompensa alimentare (2 sec attivazione della tramoggia cibo).
- Mantenere l'ITI notevolmente più lungo rispetto al tempo presentazione di esempio per facilitare l'apprendimento 24. Utilizzare i valori di 120 sec per ITI ed eseguire 40 prove al giorno. Più tardi riutilizzare l'IScome l'inizializzazione, conferma, e la scelta stimolo chiave nel compito finale (vedi Figura 2). Questa fase di formazione avrà gli animali circa una settimana.
- Una volta che l'animale risponde in modo affidabile (in> 85% delle prove), diminuire la graduale ITI fino a 10 secondi e il tempo di presentazione di campionamento fino a 2 sec. Allo stesso tempo, aumentare il numero di risposte necessarie per il rinforzo a 3 (rapporto fisso di 3, FR 3). Inoltre, aumentare il numero totale di prove al giorno. Scegliere parametri tale che l'animale è addestrato ogni giorno per circa 1 ora. Questa fase di formazione durerà circa due settimane.
- Ripetere i punti 1.2.1 - 1.2.3 per i tasti di risposta destro e sinistro fino soggetti rispondono in modo affidabile alla IS su tutti e 3 chiavi. Sperimentazioni alternative, con l'attivazione del tasto centrale in modo casuale sinistra, destra, e.
- Ora presentare la IS prima al centro e poi, subordinata a una risposta, in entrambi i tasti laterali (omettere rinforzo per l'centrare la risposta chiave). Alternate tasti laterali attivati a caso da prova a prova. Terminate le prove in cui il soggetto non risponde al tasto centrale dopo 5 sec. Ripetere fino a quando l'animale esegue in modo affidabile (~ 3 giorni).
- Introdurre due nuovi stimoli che in seguito serviranno da FS nel compito finale (vedi figura 2, incasso, per gli esempi). Ripetere i punti 1.2.1 - 1.2.3 con questi stimoli. Rispondendo sarà istituito più rapidamente che con il primo stimolo, di solito entro 4 giorni.
Figura 2. Illustrazione del paradigma comportamentale. Dopo un ITI di 5 sec, il tasto centrale è transilluminated verde per un massimo di 5 sec (inizializzazione). Se l'animale risponde 3x entro questi 5 sec, 1 su 4; Stimoli campione è presentato nella stessa posizione. Dopo un tempo di presentazione campione fisso di 2 secondi in cui l'animale deve rispondere almeno una volta, la chiave becchettare centrale è transilluminated verde di nuovo (conferma). Dopo un altro Peck, i tasti laterali 2 sono transilluminated verde. Il soggetto indica la sua scelta rispondendo volta ad uno dei tasti laterali. Durante l'acquisizione e riacquisizione, risposte corrette sono seguiti da 2 sec accesso cibo accompagnato dall'attivazione della luce alimentatore, o l'attivazione della luce alimentatore solo. Se non corretto, le luci delle case sono spente per 3 sec. Durante l'estinzione, sia le risposte corrette e non corrette allo stimolo all'estinzione restano irrilevanti. Inserto mostra come i nuovi e stimolo familiare coppie.
- La formazione di un singolo intervallo a scelta forzata (SIFC) attività per Familiar stimoli
- Stabilire la sequenza completa di inizializzazione, campione, conferma, e la scelta: in ciascuna prova, presenti fiRST IS (FR 3), poi uno dei due FS (2 sec tempo determinato), poi di nuovo la IS (FR 1). Utilizzare un design spinto a scelta: in ogni prova, transilluminate solo la chiave scelta, che sia corretta per il FS data. Questa fase di formazione dovrebbe durare circa 1 settimana.
- Una volta che il soggetto esegue in modo affidabile (> 85% di risposte al rispettivo tasto laterale), introdurre prove di libera scelta (entrambi i tasti laterali transilluminated durante la fase di scelta). Se l'animale risponde al lato corretto, fornire accesso cibo per 2 sec. Le risposte errate sono seguiti da una punizione time-out (houselights off per 2 sec). Se nessuna risposta viene data entro 3 secondi, terminare processo e riavviare ITI. Animali solito imparano queste sottocomponenti del compito entro 2 settimane.
- Aumentare gradualmente la frazione di prove libera scelta durante le sessioni successive dal 20% al 100%.
- Se il soggetto esegue> 90% corrette nelle prove di libera scelta, diminuire la probabilità di ricompensa per le risposte corrette a 0,5mentre in parallelo aumentando il numero di prove per sessione a 1.000. Non modificare i parametri di ogni giorno / sessione, ma sceglierli in modo flessibile a seconda del livello di prestazioni del soggetto riguardante omissioni inizializzazione e la percentuale di risposte corrette. Questa fase di formazione avrà una durata di circa 4 settimane.
- Piccioni tendono a rifiutare di rispondere a stimoli sconosciuti. Pertanto, una volta che l'animale esegue in modo affidabile> 1.000 prove, le risposte forma in una vasta serie di stimoli visivi (vedere paragrafo 1.2). Tuttavia, non preexpose gli stimoli visivi destinati ad essere successivamente impiegato in qualità di nuovi stimoli nel paradigma finale, ma display a colori uniformi.
- Finale Singolo-Interval scelta forzata operativa con stimoli nuovi in diverse condizioni di rinforzo
- Riscaldamento
Lasciate che il soggetto esegue 50 trial con solo le FS. Impostare probabilità ricompensa per questi stimoli a <1 (per esempio, 0,5-0,8) durante tutte le fasi di prevenzione sazietà precoce e,Pertanto, la mancanza di motivazione a rispondere. - Acquisizione di scena
Prove a caso si alternano con la presentazione di FS e NS. Assegnare diverse chiavi di risposta come corretto per i due NS e rafforzare ogni risposta corretta. Calcola la percentuale di risposte corrette in media corrente negli ultimi 120 prove. L'acquisizione è considerata completa una volta le prestazioni per ciascuna delle NS supera l'85%, ma non prima di un minimo di 150 studi sono stati eseguiti. - Estinzione stage
Smettere di rafforzare le risposte errate corretti e punire un NS casuale (estinzione stimolo). Inizia fase di riacquisto quando corretta risposta allo stimolo all'estinzione scende al di sotto del 60% e l'animale ha sperimentato almeno 150 prove in questa fase in totale. - Fase di riacquisizione
Ancora rafforzare corretto e punire le risposte errate allo stimolo estinzione, come durante la fase di acquisizione. Termina la sessione quando le prestazioni di questo stimolo supera il 85% e l'animals eseguite almeno 150 prove in questa fase in totale.
- Riscaldamento
2. Elettrofisiologia
- Elettrodi impianto
Chirurgia impianto avviene dopo animali ripetutamente (3-4x) completato l'intera sequenza di acquisizione estinzione-riacquisizione ed è descritta più in dettaglio altrove 25.- Mettere 5-6 microsrews acciaio inossidabile sul cranio per l'ancoraggio di montare una testa cemento dentale compreso il microdrive.
- Eseguire una craniotomia appena sopra la regione del cervello di interesse; poi sezionare accuratamente la durata e abbassare gli elettrodi nella posizione desiderata.
- Prima di ancoraggio del microdrive alla testa montare, applicare vaselina intorno alla cannula guida; questo impedirà cemento dentale dal stringe il tubo di guida.
- Utilizzare un elettrodo palla d'argento isolato posizionato sotto il cranio sovrastante il cervelletto come terra.
- Fornire animali con antidolorifici (Carprofene, 10 mg / kg, iniettato due volte al giorno) per tre giorni dopo l'intervento. Consentire agli animali di recuperare per almeno 2 settimane.
- Registrazioni Mentre Animali svolgere il compito
- Utilizzare un nuovo paio di stimoli nuovi per ogni sessione e anticipo elettrodi di almeno 125 micron (mezzo giro della vite di azionamento) prima di iniziare. Se non vengono osservati potenziali d'azione di sufficiente rapporto segnale-rumore, interrompere la sessione, posizionare l'animale in gabbia a casa e provare nuovamente il giorno successivo.
- Disporre il cavo headstage tale che non interferisca con becchettare normale dell'animale e comportamento alimentare. Ciò può essere ottenuto collegando il cavo a più cinghie elastiche alla sommità della camera di condizionamento e abituare gli uccelli al cavo collegato per alcune ore.
- Se disponibile, utilizzare un commutatore per fornire libertà di movimento per gli uccelli.
- Analisi di segnali non in linea
- Band-pass-filtro di tutti i canali da 500 a 5.000 Hz con ripide roll-off non in linea con Spike2. Estrarre picchi con soglie di ampiezza e ordinare loro impiego manualmente analisi delle componenti principali.
- Esaminare l'ordinamento dei risultati con il codice MATLAB-personalizzato scritta (disponibili presso file MATLAB Central Exchange, ID File # 37339). A ben isolata singola unità (Figura 3) deve soddisfare tutti i seguenti criteri: a) un cluster chiaramente separato in conto capitale spazio componente, b) nessun segno di unità multiple quando tutte le forme d'onda registrate vengono sovrapposti e rappresentati come mappa di calore (figura 3A ), c) le ampiezze di picco della forma d'onda distribuiti simmetricamente (Figura 3B), d) la registrazione stabile per tutta la sessione, come evidenziato dal immutabile ampiezza picco (Figura 3C), e) nessuna o pochissime eventi picco che si verificano durante il periodo refrattario del picco precedente (Figura 3D), e un rapporto segnale-rumore (SNR) di almeno 2 (SNR è qui defined come differenza tra il valore minimo e massimo della forma d'onda di picco media, divisa per la larghezza ritagliata della banda rumore (2,5 ° e 97,5 ° percentile della distribuzione dei valori del primo raccoglitore di tutte le forme d'onda)). SNR dell'apparecchio mostrato in Figura 3 è 3.9.
- Ispezionare canali offline prima per manufatti legate al movimento. Eliminare i canali quando indicato.
- Manufatti elettrici che si verificano durante beccare chiave possono in rari casi essere confusi con forme d'onda spike adeguate. Test per la contaminazione delle registrazioni esaminando l'istogramma in tempo di picco conta relativamente ad ogni tasto beccare (istogramma in tempo peri-Peck, PPTH, Figura 3E) registrato. Beccare artefatti indotti appaiono come un picco dell'istogramma stretta (± 50 msec) per il tempo 0. Come un controllo supplementare, tracciare le forme d'onda di tutti gli eventi spike putativi registrati entro ± 20 msec di un bacetto chiave separatamente e confrontarlo con picco forme d'onda rilevate outside questa finestra (Figura 3F).
Metriche Figura 3. Qualità per l'isolamento dell'unità. A) mappa termica di tutti i valori forme d'onda 'di tempo-tensione. B) Distribuzioni di massimo (rosso), minimo (verde), e il rumore (blu) valori di tensione di tutte le forme d'onda. Le distribuzioni sono ben separati, indicando ottimo isolamento dell'unità. C) frequenza spontanea di cottura (rosso, calcolata da segmenti 2-sec in tutti gli intervalli tra le prove) e ampiezze picco (picco-picco) in funzione del tempo in sessione. Entrambe le curve sono state levigate con una funzione di carro merci (larghezza: 50 punti dati) D) La distribuzione Interspike intervallo per questa unità.. Larghezza Bin, 10 msec (incasso: 1 msec). Intervalli molto brevi sono quasi assenti (<0,1% di intervalli inferiori a 4 msec). <strong> E) psth innescato a beccate chiave. Conta evento vicino al tasto di beccare (± 20 msec) sono evidenziati F rosso.) Tutti i 157 forme d'onda registrate entro ± 20 msec di eventi chiave beccare. Le forme d'onda reggono bene il confronto a forma d'onda complessiva mostrato nel pannello A.
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Representative Results
Comportamento
Figura 4A mostra le prestazioni comportamentali di un animale in una sessione di esempio. Il livello di prestazioni dell'animale raggiunge criterio di NS 2 entro 180 prove (45 presentazioni di stimolo) ed è vicino al 100% per il NS 1 dall'inizio. Questa strategia - in primo luogo rispondere alla stessa chiave sia per i nuovi stimoli, e quindi regolando le risposte per uno degli stimoli - è quanto spesso osservato come iniziale casuale rispondere a entrambe le NS. In questa sessione, la NS 2 è stato scelto a caso per subire l'estinzione, il che significa che tutte le scelte che seguono questo stimolo restano irrilevanti (transizione tra le fasi di apprendimento sono indicati da linee verticali nere tratteggiate). Durante l'estinzione, prestazioni diminuisce lo stimolo di estinzione, ma rimane alta per l'altro NS. Criterion è raggiunto nella prova di 370. Risposte corrette e non corrette sono ora rafforzate e puniti di nuovo (riacquisto) e il livello di prestazione raggiunto criterio. prova 402 livello di performance per FS è costantemente elevato (> 95%; dati non riportati). b) Il numero medio di prove necessarie per completare ciascuna fase dell'apprendimento (una media di oltre 5 animali e 44 sessioni in totale). In media, gli animali necessari ~ 700 prove di rispondere in modo coerente rispondere correttamente. Estinzione prese ~ 900 prove, e riacquisizione solo circa 60 prove, sostanzialmente in meno rispetto all'acquisto originale (Figura 4B).
Figura 4. Risultati comportamentali Esempio. A) prestazioni Un uccello per i 2 nuovi stimoli in tutte le tre fasi di apprendimento. Curve raffigurano cento scelte corrette (media degli ultimi 120 prove, corrispondenti a 30 presentazioni dei rispettivi stimolo) in funzione del numero totale di prove, separatamente per romanzo Stimulnoi 1, romanzo stimolo 2, e la media di tutti gli stimoli. Prestazioni di stimoli familiari è stato costantemente superiore al 95% corretti (dati non riportati) B) Il numero medio di prove necessarie per ottenere prestazioni criterio in ciascuna delle tre fasi di apprendimento.; barre di errore, SEM.
Neural dati
La Figura 5 mostra il profilo di risposta di due unità nel caudolaterale nidopallium (NCL) registrato in un animale stava eseguendo il compito SIFC. Modulazione risposta durante la presentazione del NS è mostrato in Figura 5A. In fase di acquisizione, le unità risponde con forza a NS 2 (designato estinzione), con risposte calo verso la fine della fase di acquisizione e piccolo cambiamento nella cottura durante le altre due fasi di apprendimento. C'è poco rispondendo alle NS 1 tutta la sessione. L'aumento di risposta circa 3-4 secondi dopo lo stimolo campione esordio è dovuto premiare la consegna. I livelli di attivitàrelative stimoli familiari non erano modulati (dati non mostrati).
Figura 5B mostra il modello di risposta di un'altra unità NCL registrato durante SIFC. Questo neurone risponde durante-destra, ma non verso sinistra movimenti (in alto a sinistra), indicativi di codifica sensomotorio. Tuttavia, la forza di risposta cambiato nel corso delle fasi di apprendimento: i due pannelli più bassi al mostrano funzioni di densità spike (SDF), attivati per le scelte verso destra per un familiare (a sinistra) e un romanzo stimolo (a destra), divisi in quartili successivi per illustrare lo sviluppo di tutti la sessione sperimentale. Le risposte sono state inferiori per lo stimolo familiare per tutta la sessione, anche se i tempi medi di movimento per le due condizioni di stimolo sono stati molto simili (in alto a destra). Inoltre, le risposte durante scelte destrorsi dopo presentazione del romanzo ma non lo stimolo familiare diminuiti nel corso della sessione sperimentale (non parallelamente a una diminuzione abete basaletasso ing). Così, entrambi i neuroni diminuite sparare come un particolare romanzo stimolo diventato sempre più familiare, con il neurone in Figura 5B codifica per un movimento specifico, oltre alla novità dello stimolo precedente tale movimento.
Figura 5. Modelli di risposta da due unità di esempio registrato durante il compito SFIC. A) Spike densità di funzioni attivati per l'insorgenza del romanzo 2 stimoli NS NS 1 e 2 (fila superiore e inferiore, rispettivamente), suddivisi per 3 fasi di apprendimento (colonne ), con risposte in ogni fase di apprendimento di nuovo divisi in 3 parti uguali (inizio, metà, fine). NS 2 è stato designato per l'estinzione. PSTHs (larghezza bin 1 ms) sono state lisciate con un kernel gaussiano esponenziale modificata (σ = 100 msec e τ = 100 msec). B)
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Discussion
Questo protocollo descrive un compito comportamentale complesso adatto per le registrazioni simultanee singola unità. Abbiamo descritto il compito SIFC per i piccioni, ma può essere facilmente adattato a roditori richiedendo poke naso o la leva premendo piuttosto che becca chiave, e sostituendo visivo olfattivo, uditivo, o stimoli tattili.
Forse le fasi più critiche durante la procedura di formazione sono 1) la graduale riduzione della probabilità di ricompensa e 2) aumento del numero di prove. Per quanto riguarda il rinforzo intermittente per gli stimoli familiari, abbiamo deciso di probabilità di ricompensa che vanno 0,5-0,8; questi sono abbastanza alte per produrre la prestazione stabile, ma abbastanza basso per prevenire sazietà precoce. Detto questo, molti uccelli sono disposti a svolgere bene per le probabilità di ricompensa fino a 0,2.
Il gran numero di prove per sessione (500-1500) è necessaria perché l'acquisizione, l'estinzione, e riacquisizione dei condizionata SI risponderemply richiede questo molte prove, e perché la stima precisa dei tassi di cottura è difficile con meno rispetto, ad esempio, 25 prove, specialmente quando si registra da neuroni con tassi di cottura bassi (in NCL, i tassi di cottura di base sono <1 Hz). Di conseguenza, abbiamo impostato il numero minimo di prove necessarie per il completamento di una fase di apprendimento tale che ogni stimolo è mostrato almeno 35 volte.
Per un animale ingenuo, formazione sul compito SIFC dura circa 4 mesi, ma la durata esatta dipende molto dal singolo individuo. A causa delle elevate esigenze del compito, è molto probabile che non tutti gli animali finiranno un buon rendimento sul paradigma finale. Se un uccello individuo salta troppe prove o produce tassi di errore elevati durante l'allenamento, non esitate a sostituire questo argomento. Nella nostra esperienza, è molto probabile che questo animale non potrà mai svolgere correttamente il compito finale.
La maggior parte degli studi precedenti che effettuano registrazioni singola unità inpiccioni liberi di muoversi non è riuscito a registrare correttamente potenza del motore durante la registrazione. Questo complica l'interpretazione delle risposte neuronali durante i periodi critici delle prove, come la presentazione di esempio o fasi di ritardo 25. Questo problema è insito nel go / no-go compiti in cui lo sperimentatore di solito non sa ciò che il soggetto sta facendo sul no-go prove; la stessa avvertenza vale a lavorare compiti di memoria che incorpora un periodo di ritardo prolungato. Per ottenere il controllo sul movimento degli animali senza impiegare testa fissazione, abbiamo progettato un compito in cui gli animali devono eseguire la stessa azione (beccare chiave) anche se le condizioni (stimoli del campione) il cambiamento. Nel nostro paradigma SIFC, sia l'input visivo e di uscita del motore è ben controllato e costantemente monitorati. Poiché gli animali sono tenuti a beccare ogni stimolo campione in tutta la sua presentazione, manteniamo costante di uscita del motore mentre gli animali stanno consultanto stimoli con storie diverse di apprendimento. Attualmente stiamo esplorando metodologiads migliorare ulteriormente il controllo di uscita del motore, quali l'applicazione di un accelerometro per headstage per la registrazione continua dei movimenti della testa. Inoltre, stiamo sviluppando metodi per misurare la forza di ogni tasto beccata per mezzo di un trasduttore mechanoelectric.
Il nostro paradigma permette di districare i contributi di sensoriali, motorie, cognitive e le variabili ai tassi di cottura neurali identificando modelli di risposta neurale tipici. Ad esempio, un neurone premotorio risposte leftward sarebbe previsto un aumento di cottura durante la fase di campionamento quando l'animale sta per dare una risposta verso sinistra, indipendentemente dall'identità stimolo. Allo stesso modo, semplice motoneuroni saranno tenute a fuoco durante beccare chiave, o movimento di sinistra o destra. Un neurone rappresenta premio aspettativa, d'altra parte, sarebbe aziona durante la fase di campionamento, e più per le FS rispetto ai NS durante l'acquisizione precoce (perché probabilità premio personale è superiore a FS di NS trIALS prima NS sono apprese), ma questo dovrebbe invertire tardi, quando le NS sono costantemente classificati correttamente (perché la probabilità ricompensa obiettivo è alto sulla corretta prove NS). Infine, i neuroni che risponda alle caratteristiche specifiche di stimolo dovrebbero sparare costantemente per uno degli stimoli campione senza alcun cambiamento attraverso fasi di apprendimento.
Poiché la registrazione unità extracellulare è incline a registrare picchi da più unità alla volta 11,26, ispezionando una serie di metriche di qualità è importante per classificare correttamente i picchi che hanno origine da un singolo o da più neuroni 27. Utilizzando tetrodi invece di singoli elettrodi certamente produrrà un ulteriore aumento di smistamento di qualità 11. Questo dovrebbe essere considerato quando registrazioni nelle regioni del cervello con una elevata densità cellulare (per esempio ippocampo) o molto elevata attività spontanea (come il entopallium) sono destinati. Tuttavia, le microplugs che usiamo sono disponibili solo per un massimo di 18 connessioni che per ora costituiscono un limite superiore al numero complessivo di canali di registrazione.
In sintesi, abbiamo sviluppato un lavoro di elevata complessità per gli animali sperimentali non-primati. Questo compito è stato adattato per consentire lo studio di fenomeni di apprendimento con le registrazioni singolo neurone, ma allo stesso tempo è adatto per affrontare temi come la categorizzazione, il processo decisionale, e codifica ricompensa.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) a MCS (PER IL 1581, STU 544/1-1) e OG (PER IL 1581, SFB 874). Il sito web del DFG è http://www.dfg.de/en/index.jsp. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o la preparazione degli autori manuscript.The ringraziare Thomas Seidenbecher per averci fornito il protocollo di doratura così come Tobias Otto aiuto per impostare il elettrofisiologico apparecchi di registrazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resistance wire (for use as electrodes) | California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA | Stablohm 675; formvar-coated nichrome wires (outer diameter 25 µm) | |
| Microconnectors | Ginder Scientific, Nepean, Ontario, Canada | GS18PLG-220 (plug) & GS18SKT-220 (socket to build headstage) | |
| Cannulae | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 0.4 x 20 mm/ 27 Gx3/4" | |
| Gold solution for plating | Neuralynx, Bozeman, MT, USA | SIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355 | |
| Solution for ultrasonic bath | Alconox, Inc., New York, USA | 1304 | Tergazyme |
| Conductive glue | Henkel Loctite | LOCTITE 3888 Silver filled, conductive, adhesive | |
| Stainless steel screws | J.I. Morris, Southbridge, MA, USA | F0CE125 self-tapping miniature screws, body length 1/8 inches | |
| Light-curing dental cement | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Omniceram Evo Flow A2 | |
| Light-curing unit | van der Ven Dental, Duisburg, Germany | Jovident Excelled 215 Curing Light (wireless LED light curing unit) | |
| Filter amplifiers | npi electronic GmbH, Germany | DPA-2FS | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | power 1401 | |
| Spike2 software | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Version 7.06a | |
| MATLAB | The Mathworks, Natick, MA, USA | R2012a |
References
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