Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Профилирование Эстроген-регулируемых микроРНК в клетках рака молочной железы

doi: 10.3791/51285 Published: February 21, 2014

Summary

Молекулярная сигналов через эстрогена и микроРНК являются критическими в развитии рака молочной железы и роста. Эстроген активирует рецепторы эстрогена, которые транскрипционные факторы. Многие транскрипционные факторы могут регулировать экспрессию микроРНК, и эстроген-регулируется микроРНК можно профилировать с использованием различных методов масштабные.

Abstract

Эстроген играет жизненно важную роль в развитие молочных желез железы и прогрессирования рака молочной железы. Это посредником свою функцию путем связывания и активации рецепторов эстрогена (ERS), ERα и ER-. ERα часто активируется в рака молочной железы и приводит пролиферацию клеток рака молочной железы. ЭКР функционировать как факторы транскрипции и регулируют экспрессию генов. В то время как регулирование ERα в белок-кодирующих генов хорошо известна, ее регулирование некодирующих микроРНК (микроРНК) меньше изучены. микроРНК играют важную роль в пост-транскрипционной регуляции генов, подавляя их перевод или ухудшения качества их мРНК. микроРНК может функционировать в качестве онкогенов или опухолевых супрессоров и также подтверждаете биомаркеров. Среди микроРНК анализов имеющихся, микрочипов и количественный реальном времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) широко используется для обнаружения и количественного определения уровней микроРНК. Для идентификации микроРНК регулируются сигнализации эстрогена в рака молочной железы, тыс.EIR выражение в ERα-позитивных клеток рака молочной железы линий сравнивали до и после эстроген-активация с использованием как μParaflo-микрофлюидных микрочипов и Dual меченых зондов-низкой плотности массивы. Результаты были проверены с использованием конкретных КПЦР анализов, применения как органического красителя в основе и Dual меченых зондов на основе химии. Кроме того, временной точке анализа была использована для выявления положения с течением времени. Преимущества анализа подхода микроРНК, используемые в этом исследовании является то, что она позволяет быстрый скрининг правил зрелые микроРНК в многочисленных образцов, даже при ограниченных количествах образцов. Макет, в том числе конкретных условий для культивирования клеток и лечения эстроген, биологических и технических повторах, и крупномасштабного скрининга с последующим углубленные подтверждения с использованием отдельных методов, обеспечивает надежное обнаружение правил микроРНК, и устраняет ложные срабатывания и другие артефакты. Правда, мутировавший или неизвестных микроРНК или правилам, на первичном и предшественника транскриптов Левел, не будут обнаружены. Метод, представленный здесь представляет собой тщательное расследование эстроген-опосредованной регуляции микроРНК.

Introduction

Эстроген является гормоном, который важно при разработке молочной железы. Эстроген также играет важную роль в разработке, обслуживании, риска и лечения рака молочной железы 1. Эстроген оказывает свою функцию путем связывания с ЧН, которые транскрипционные факторы и регулируют конкретные гены-мишени. Из двух вариантов рецептора, ERα имеет важное значение для эстроген-зависимой пролиферации клеток рака молочной железы. Большинство рака молочной железы являются ERα-положительных и зависит от эстрогена для роста. Это сделало сигнализации эстрогена и ERα цель для лечения в гормон-рецепторного положительный рак молочной железы. Понимание основной механизм ERα важно улучшить результаты лечения, преодолеть сопротивление к лечению, и понять, как развивается рак молочной железы.

микроРНК играют важную роль в клеточных функций в связи с их большое влияние в регулировании посттранскрипционной генов. микроРНК являются 19-24 нуклеотидов короче говоря, одноцепочечной, Некодирующих РНК, которые сначала транскрибируются РНК-полимеразы II в первичных транскриптов микроРНК (PRI-микроРНК). Они обрабатываются в ядре по Drosha в короткие шпильки предшественников-микроРНК (предварительно микроРНК) и затем обрабатываются Dicer и сформировать отдельные пряди, чтобы сформировать зрелые микроРНК в цитоплазме. Одноцепочечной зрелые микроРНК передаются Argonaute белками с образованием RISC комплекс. Затем микроРНК может гибридизоваться с 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) от мРНК-мишени, что приводит к пост-транскрипционной регуляции путем блокирования или перевод деградации мРНК-мишени 2.

В связи с той важной роли, что и эстроген и микроРНК играют в опухолевой прогрессии, выявления микроРНК, связанных с нормальной или нарушенной сигнализации эстрогена важно в целях повышения наше понимание развития и улучшения лечения рака молочной железы. Хотя есть хорошее понимание того, как ERα регулирует белок-кодирующих генов, расширениеи подробная информация о некодирующих РНК правила еще предстоит тщательно расследованы. Первоначальные исследования, направленные на выяснение ERα регулирование микроРНК в рак молочной железы клеточных линий дали противоречивые результаты, даже когда тот же клеточная линия была проанализирована 3-6. Это может быть результатом различных методов лечения, биологические колебания, использования различных методов и на то, что небольшой размер микроРНК сделать их сложно анализировать. Здесь это протокол, который контролирует для вариаций и методов артефактов описывается.

Чтобы определить, какие микроРНК регулируются эстрогена, профилирование четко определенной модели рака молочной железы из ERα деятельности является первым шагом. Несколько клеточные линии были получены от опухолей молочной железы человека ERα-положительных, которые зависят от эстрогена, аналогичной большинства клинических случаев рака молочной железы. Молекулярные свойства двух из этих клеточных линий, T47D и MCF7, в том числе экспрессии ERα и ее ниже по потоку цели,рецептор гормона прогестерона (PR), отсутствие экспрессии мембранного рецептора HER2, наряду с выражением эстроген-чувствительных и просвета-эпителиальных генов дифференцировки, сделать их пригодными в качестве моделей для просвета подтипа опухолей молочной железы 7-10. 17β-эстрадиол (Е2) является доминирующей формой эстрогена, а концентрации и временные точки для оптимального активации транскрипции из ERα были охарактеризованы в нескольких исследованиях. В этом протокол 10 нМ E2 лечения в течение 24 ч используется и T47D и MCF7 в качестве моделей для ERα деятельности в клетках рака молочной железы 1. Кроме того, зависимые от времени правила микроРНК может быть специально анализировали в интервале времени, например 1-72 часов.

Во-вторых, анализ микроРНК имеет отдельные проблемы, отчасти из-за своих коротких размеров. микроРНК не очень хорошо сохраняются в общей подготовке РНК когда обычные гуанидиния thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol РНК осадков выполняются, или когда йAndard очищения столбцов используются. Особые меры предосторожности должны быть приняты для поддержания или обогатить для меньшего фракции РНК. При увеличении объема изопропанола, понижение температуры перед центрифугированием (-80 ° C) и опуская промывку в 70% этаноле, удерживающий микроРНК может быть повышена во время осаждения. Или, конкретные столбцы и буферы для высококачественной и надежной подготовке микроРНК-содержащих общей РНК могут быть использованы. Кроме того, для самого анализа, их короткие размеры создают проблемы. Для генома микроРНК скрининга, есть три общих микроРНК профилирования методов на выбор: микрочипы, КПЦР и следующего поколения секвенирования. Каждый метод может быть выполнена с использованием нескольких различных платформ, а также различные препараты образца требуется, каждый с различными рисков введения артефактов. В микроРНК микрочипов, слайд имеются пятна или синтезированы с тысячами олигонуклеотидов. Эти олигонуклеотиды использовали в качестве зондов, и каждый из зондас предназначен для гибридизации с определенной последовательности микроРНК. Подготовка образца для микрочипов, как в ходе данного исследования, в первую обогащает для микроРНК, а затем вводит Cy5 и Cy3 маркировку на микроРНК. Микрочипов дает возможность наблюдать относительные уровни экспрессии большого числа генов одновременно, быстро и подходит для скрининга большого количества образцов, но может только анализировать последовательности присутствует на микрочипе и например не обнаружить изменения в неизвестной или мутировал микроРНК. Микрочипов анализ проводили, как в данном протоколе также требует относительно больших количеств, около 5 мкг, из общей РНК в образце для анализа. Низкая плотность КПЦР микроРНК профилирования требуется меньше материала (700 нг / образец и повторить), и позволяет для обнаружения и количественного определения микроРНК. Уровни транскриптов может быть определен, а количество может быть абсолютным или количество относительное количество. Анализ КПЦР сначала требуется преобразование микроРНК в кДНК, здесь с помощью петельчатуюгрунт для каждого конкретного микроРНК, обеспечивающих анализ только зрелые микроРНК. Это создает более длинный шаблон, который может быть усилен с использованием конкретных микроРНК прямого праймера и универсальный обратного праймера, комплементарного последовательности петлей, и могут содержать включение двойной меченым зондом для специфичности. КПЦР могут быть использованы в формате низкой плотности, где сотни микроРНК могут быть обнаружены в параллель с использованием одного или нескольких пластин 384-луночный с отдельными пар праймеров в каждую лунку 11. Секвенирование следующего поколения, с другой стороны, это единственный из этих методов, что позволяет для открытия новых, мутированных или отредактированных микроРНК, поскольку все РНК в образце можно секвенировать 11. Этот метод, однако, требует нескольких шагов, помогут малые РНК и производят небольшую библиотеку РНК с помощью нескольких шагов компоновщика лигирования и операции очистки с последующими усовершенствованных рисков модуляции их относительные уровни экспрессии между образцами. Он также требует значительных bioinformatiCS анализ. Учитывая различные методы для микроРНК профилирования, наиболее подходящий метод зависит от приложений. Microarrays являются наиболее подходящими, когда материал является относительно изобилии, и интерес, чтобы определить дифференциальное выражение уже известных микроРНК. Низкая плотность КПЦР массивы являются наиболее подходящими, когда ограниченное количество образца доступен и высокая чувствительность с низким выразил микроРНК требуется. Секвенирование является наиболее подходящим, когда анализ неизвестных микроРНК, мутировавших или различных изоформ в микроРНК требуется.

При изучении регулируемых эстрогенами микроРНК при раке молочной железы, два модели клетки линии используются, T47D и MCF7, где большое количество РНК легко доступны. Каждая ячейка линия была проанализирована в культурах реплицированными клеток с использованием различных отрывков, каждый в технических повторах лечения. Это позволяет для надежной обнаружения воспроизводимо, ERα регулируемых микроРНК. Относительные уровни экспрессии микроРНК были сравнены с использованием как микроРНК микрочипов иДвойные меченых зондов - массивы низкой плотности (DLP-LDA) и подтверждено результаты с определенной количественной ПЦР с использованием как органического красителя и DLP химии. правила микроРНК были затем дополнительно проанализированы в временных рядов, чтобы определить их точное регулирование с течением времени, что может помочь дифференцировать случайные или циркадные вариации от эстроген-индуцированной правил, и указать первичные эффекты от вторичных эффектов. Bioinformatical сравнения с хроматин-связывания исследований ERα может способствовать помощь в дифференциации первичной против вторичных эффектов. Анализ привело к надежной оценки правил микроРНК, где он может быть установлено, что после 24 часов лечения E2 белок-кодирующих транскриптов легко регулируется, но зрелые микроРНК не были затронуты 1. Тем не менее, не исключено, что микроРНК регулируются на более поздних временных точках, как показано в порядке временной последовательности анализа выбранных микроРНК 1. Детали должны быть дополнительно изучены и протокол, представленные здесь обеспечивает Robusт способ изучения гормональной регуляции зрелых микроРНК в линиях клеток рака молочной железы.

Protocol

1. Подготовка среды для культивирования клеток

  1. Для T47D клеточной линии питательных сред:
    1. Смешайте 500 мл модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 500 мл F12 [DMEM/F12 (1:1)] в 1 л автоклаве бутылки.
    2. Добавьте 50 мл фетальной бычьей сыворотки (это делает 5% FBS) и затем 10 мл пенициллина стрептомицин (это делает 1% вредителей). Смешайте содержимое полностью.
    3. Хранить при 4 ° С.
  2. Для MCF7 клеточной линии питательных сред:
    1. Смешайте 500 мл DMEM с 25 мл ФБС (5% FBS), а затем 5 мл пенициллина стрептомицин (1% вредителей).
    2. Хранить при 4 ° С.
    3. Для питательных сред сниженной сыворотки:
      1. Для T47D: Смешать 500 мл фенолового красного DMEM с 500 мл F12 (1:1) в автоклаве 1 л бутылке, и добавить 50 мл декстрана покрытием обработанной углем (DCC) FBS в течение 5% DCC-FBS. Сделайте отдельный флакон с 5 мл DCC-FBS для 0,5% DCC-FBS. Затем добавьте 10 мл с вредителями (1% вредителей) в каждой бутылке. Смешайте содержимое полностью, Storэ при 4 ° С.
      2. Для MCF7: Смешать 500 мл фенолового красного DMEM с 5 мл 100x L-глутамина (200 мМ конечной концентрации). Добавить 25 мл DCC-FBS (5% ДКК-FBS). Сделайте отдельный бутылку с 2,5 мл DCC-FBS (0,5% ДКК-FBS). Затем добавьте 5 мл с вредителями (1% вредителей) в каждой бутылке. Смешайте содержимое полностью, хранить при температуре 4 ° C.
    4. Для физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS):
      1. Заполните 1 л в автоклаве стеклянную бутылку с особо чистой воды или дистиллированной водой.
      2. Добавить одну таблетку PBS и встряхните иногда до таблетка не растворится.
      3. Автоклав решение PBS и хранить при комнатной температуре.
    5. Подготовка лигандов запасов:
      1. Приготовьте 100 мМ маточного раствора Е2 путем растворения 2,72 мг 17β-эстрадиола в 100 мкл этанола или ДМСО в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки и осторожно перемешать содержимое. Кратко Спин и сделать серийные разведения (1:10) с получением 10 мм, 1 мм, и 0,1 мМ исходный концфлуктуации с использованием растворителя. Храните все растворы E2 при температуре -20 ° С.
      2. Приготовьте 100 мМ маточного раствора путем растворения ICI 6,07 мг ICI 182780 в 100 мкл этанола или ДМСО в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки и осторожно перемешать содержимое. Кратко Спин и сделать серийные разведения (1:10) с получением 10 мм, 1 мм, 0,1 мм концентрации акций с использованием растворителя. Храните все растворы ICI при температуре -20 ° С.
      3. Транспортное средство растворитель (этанол или ДМСО). Поместите 0,5-1 мл 100% этанола или ДМСО в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки, и хранить при -20 ° С.

2. Культура клеток и лечение

Выполняйте лечение в двойные или тройные пластин по техническим повторах. Повторите процедуру культуре клеток и лечение с использованием другого прохождение той же клеточной линии, который будет служить в качестве биологического репликации в этой клеточной линии. Повторите процедуру с другой клеточной линии к REPLicate данные более чем на одной клеточной линии. Все методы культивирования клеток должны проводиться в стерильных условиях в ламинарном боксе.

  1. Запуск Клеточная культура
    1. Теплый СМИ до 37 ° С в стерильной теплой водяной бане.
    2. Оттепель замороженных флакон T47D или MCF7 клеток.
    3. Очистите наружную пробирку и СМИ бутылку с 70% этанола, а затем поместить как флакон и бутылку в стерильной ламинаре.
    4. Этикетка стерильный Т-75 колбу соответственно (в капоте).
    5. Добавить 12-15 мл соответствующих средствах массовой информации в колбу с помощью стерильного серологические пипетки (убедитесь, что поверхность полностью покрыта СМИ).
    6. Передача клетки из флакона в колбу и перемешивают осторожно.
    7. Поместите колбу в инкубаторе 37 ° C, поставляемого с 5% CO 2.
  2. Получение клеток для лечения
    1. Возьмем клетки из инкубатора и наблюдать под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки являются по меньшей мере 80% соnfluent. Это делается для того, что есть достаточное количество клеток для эксперимента. Трансфер колбу стерильных капот.
    2. Удалить носитель из колбы с помощью стерильной пипетки Пастера, подключенный к вакууме. Осторожно промыть прикрепленные клетки дважды PBS.
    3. Добавить 1 мл теплой трипсина-ЭДТА в колбу, колбу и поместить в инкубаторе в течение 2 мин. Это, чтобы сделать клетки отделяются из колбы.
    4. Добавить 3-4 мл соответствующих теплых СМИ в колбу и растирают отсоединенных клетки, используя 5 мл серологические пипетки. Triturate, поднимая клеток в серологической пипетки и выпуская клетки с кончиком пипетки помещен на дно колбы, чтобы увеличить давление. Это нарушить клетки друг от друга на отдельные клетки.
    5. Граф клеток, например, с помощью мобильного счетчика, в соответствии с протоколом производителя.
    6. Этикетка 100 мм пластин (при необходимости) и добавить около 10 мл средства массовой информации к пластинам. Пластинчатые около 2,0 х 10 6 клеток / пластину. Распределить клетки, Gentle закрученной пластины.
    7. Инкубируйте клетки в течение 24-48 ч, примерно до 80% сливной.
    8. В 80% слияния, мыть клетки дважды PBS, и добавить соответствующие 5% ДКК-FBS СМИ. Тогда, инкубировать клетки в течение 24 часов.
    9. После 24 часов, мыть клетки дважды PBS, и добавить соответствующие 0,5% ДКК-FBS СМИ. Тогда, инкубировать клетки для дополнительной 48 часов.
  3. Обработка клеток
    1. Через 48 ч клетки дважды мыть с PBS. Будьте уверены, чтобы удалить как можно большую часть PBS, насколько это возможно.
    2. В 15 мл коническую трубку, добавить 10 мл соответствующих 0,5% ДКК-FBS СМИ. Затем добавляют 1 мкл 0,1 мМ лиганд складе (Е2 или ICI) до конечной концентрации 10 нМ. Кроме того, добавить 1 мкл транспортного средства до 10 мл среды в отдельной пробирке в течение контрольного эксперимента.
    3. Смешайте содержимое в трубе мягко и добавить к клеткам в пластине. Это должно быть одним лигандом за пластины.
    4. Инкубируйте клетки для выбранной точки времени (0-72 ч).
<р = класса "jove_title"> 3. Экстракция РНК и контроль качества

  1. Выделение РНК
    1. После окончания лечения для требуемого периода времени, мыть клетки дважды PBS, а затем добавить около 1-2 мл гуанидин тиоцианат-фенол решение клеток в пластине. ВНИМАНИЕ: гуанидиния Тиоцианат фенол решение является токсичным при контакте с кожей или глазами, при вдыхании или проглатывании. Носить соответствующую защитную одежду, перчатки и защиту для глаз / лица, а также использовать вытяжной шкаф.
    2. Убедитесь, что объем клеток составляет не более 10% от объема гуанидин тиоцианат-раствора фенола, и что пластина покрыта раствора и позволяют сидеть в течение 1 мин. Затем очистить клетки при помощи резинового скребка и трансфер в микроцентрифужных трубки. Клетки могут быть сохранены в этом растворе при -80 ° С в течение нескольких недель.
    3. Извлечение и очистить тотальной РНК из каждой обработки с использованием метода гуанидина тиоцианата фенол-хлороформ, затем спин очистки на колонке и ДНКазыСпособ уничтожения I ДНК клеток животных.
    4. После экстракции клетки элюировали в 60 мкл РНКазы без воды. Алиготе 1-2 мкл РНК для анализа количественного и хранить РНК при -80 ° С
    5. Измерения концентрации РНК с использованием 1 мкл РНК и aspectrophotometer. Убедитесь, что имеется пустой приняты до того, как он проводится. Кроме того, полностью уничтожить время спектрофотометр достичь измерения берется. Концентрации обычно показано на нг / мкл. Сохранить результаты, показывающие концентрации РНК.
  2. Контроль качества РНК
    1. Возьмите около 100 нг РНК каждого образца и места в микроцентрифужных трубки.
    2. Измерьте целостность РНК с использованием Bioanalyzer. Обычно 12 образцов могут быть запущены в одно время в Bioanalyzer. Запуск обычно занимает около 25 мин.
    3. Сравните результаты с РНК лестницы, чтобы гарантировать, что РНК хорошо для эксперимента. Сохранить и результаты печати.

4. Подтверждение Treatния: КПЦР из белок-кодирующих генов

  1. Синтез кДНК
    1. Возьмите 500 нг или 1 мкг общей РНК (каждого образца) и поставить в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Довести объем каждой пробирки до 10 мкл с использованием РНКазы свободной воды.
    2. Добавить 2 мкл 50 мкМ случайных праймеров гексамера и тепловых трубок до 70 ° С в течение 10 мин.
    3. Передача трубы, чтобы льду в течение 5 мин.
    4. Для каждого образца добавляют 4 мкл 5х буфера первой цепи 1 мкл 0,1 М ДТТ, 1 мкл 10 мМ дНТФ, 0,5 мкл индексом III, и 1,5 мкл РНКазы без воды.
    5. Место труб в 25 ° C тепла блока или водяной бане в течение 10 мин.
    6. Передача трубки, до 46 ° C тепла блока в течение 1 часа. Затем передача трубки, до 70 ° C тепла блока в течение 15 мин, чтобы остановить реакцию.
    7. Развести кДНК к 5 нг / мкл складе (рассчитывается с использованием общей входной РНК) с помощью РНКазы свободной воды для разведения и хранить при -20 ° С
  2. КПЦР
    1. Получить праймеров для генов интересов и справочных генов. Грунтовки могут быть легко разработаны с использованием праймера проектирование инструмент на программы Primer-BLAST NCBI в 12. Это обычно создает вперед и обратного праймера для каждого интересующего гена. Праймеры должны быть 18-22 п.н. в длину, имеют температуру плавления 52-58 ° C, имеют содержание GC 40-60%, а длина ампликона из 100-180 пар оснований.
    2. Для каждой реакции КПЦР хорошо, добавить 10 нг кДНК (2 мкл из концентрации фондовом начиная с шага 4.1.7), 1 пмоль каждого из прямого и обратного праймеров гена интереса (с шага 4.2.1), и 5 мкл 2x красителя в ПЦР мастер микс. Реакционную для каждой лунки должны иметь 10 мкл конечного объема реакции.
    3. Убедитесь, что есть три лунки для каждого образца для каждого гена (по техническим повторах). Реакция 96-луночный планшет можно использовать.
    4. На системного программного обеспечения Qrt-PCR, назначить репортеру и цель, введите реакционного объема, выберите сравнительныйМетод пороговый цикл (ΔΔCt), и определить типовые скважин.
    5. Убедитесь в том, чтобы выполнить анализ кривой плавления для всех трасс органического красителя, чтобы подтвердить усиление одного конкретного фрагмента. Запустите пластины, используя настройки по умолчанию для запуска.
    6. Сохранить результаты после запуска, а также экспортировать данные (особенно значения СТ на MS Excel).
  3. Анализ данных КПЦР по формуле ΔΔCT
    Изменение относительной экспрессии мРНК может быть рассчитана как кратное изменение по сравнению с контрольными на Excel для каждого образца, используя следующие шаги:
    1. Все экспортированные результаты выше кПЦР должны иметь значения Ct включены. Рассчитать значение ΔCT по следующей формуле:
      • ΔCT = КТ (ген-мишень) - КТ (ссылка ген)
      Это должно быть сделано для каждого образца. Целью является ген или микроРНК интерес.
    2. Затем рассчитать общее стандартное отклонение (SD) для каждого образца. Первый подсчетSD для контрольного гена, а затем рассчитать SD для гена-мишени (это можно сделать на Excel с помощью функции STD DEV от значений КТ). Тогда рассчитать общую SD для каждого образца, используя эту формулу:
      • Всего SD = (СД2 (цель) + СД2 (ссылка)) 1/2
    3. Рассчитайте ΔΔCT каждого образца в пределах гена (целевой) по:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (лечение / тестовый образец) - ΔΔCT (контроль / образец калибратор)
      Образец калибратор представляет собой необработанный образец.
    4. Наконец, вычислить раз-изменения (FC) значения каждого образца по формуле:
      • FC = 2-ΔΔCT
      Значение сгиба изменение каждого образца дает относительную экспрессию генного / миРНК, которая была нормированной на опорной гена и контрольного образца.
    5. Т-тест Стьюдента можно использовать для статистического анализа с помощью двустороннее распределение и двухвыборочный неравный дисперсиюПараметры: (P <0,001 (***), P <0,01 (**), и Р <0,05 (*)). Это может быть достигнуто на Excel. Убедитесь, что лечение привело регулирования известных целей, прежде чем приступить микроРНК профилирования.

5. микроРНК профилирования Анализ

  1. микроРНК микрочипов
    1. Возьмем 5 мкг выделенной РНК из клеток, обработанных либо транспортного средства или лигандом, и поместить в микроцентрифужных трубки. Регулировка громкости в трубке до 20 мкл. Каждый сравнение следует проводить в дубликатах или трех экземплярах.
    2. Выполните микрочипов микроРНК использовании примеров РНК выше. профили экспрессии микроРНК микрочипов должна определяться с использованием человеческих микроРНК микрочипов двойного цвета массив выборки по μParaflo микрофлюидных технологии биочипов (Сэнгер miRBase выпуска 14.0) 13.
    3. Результаты должны показать разному экспрессируются микроРНК. Рассмотрим существенные выражения микроРНК при р <0.05.p-значение <0,10 может также рассматриваться для дальнейшего сотрудничестваnfirmatory анализ с использованием КПЦР. Сохранить этот список микроРНК для дальнейшего подтверждения с кПЦР.
  2. микроРНК профилирования: DLP-LDA
    1. Каждый образец должен быть проанализирован в двух экземплярах или трех экземплярах. Возьмите 700 нг общей РНК из клеток, обработанных либо транспортного средства или лиганда, и поместите в микроцентрифужных трубки. Регулировка громкости в трубке до 3 мкл.
    2. Выполните синтез кДНК с использованием двойной меченых зондов микроРНК способ анализа и 10x RT праймеров. Общий объем на каждой реакции должна быть 7,5 мкл.
    3. Наведите реакционную трубку в системном Thermocycler ПЦР, и установить его в рекомендуемых параметров, как указано в двойной Маркированный способе анализа Зонды микроРНК. Запустите перспективе. Это создаст кДНК. Следует отметить, что кДНК можно хранить при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 недели.
    4. В то время как реакция RT работает, вынуть DLP-LDA пластины и позволяют сидеть при комнатной температуре. Каждый массив пластина содержит 384 скважин, которые содержат уникальные микроРНК праймеры и управления праймеров.
    5. Take 6 мкл кДНК (от 5.2.3) и место в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 450 мкл Двойной меченых зондов 2x Универсальный PCR Master смеси и добавить 444 мкл РНКазы без воды.
    6. Переверните трубку около шести раз, чтобы перемешать содержимое и центрифуги кратко.
    7. Когда DLP-LDA пластина остыл до комнатной температуры, нагрузки 100 мкл в каждую из восьми 'Заполните порт' пластины. Тогда, центрифуги массива пластину.
    8. Откройте систему Qrt-PCR и убедитесь, что блок является то, что для пластины 384-а. Настройка запуска с помощью программного обеспечения SDS. Выберите относительную количественную (Ct), выберите номер скважины и тип массива и введите образец описание определить скважин.
    9. Запустите массив, используя тепловые условия велосипедные по умолчанию. При запуске закончена, сохранить результаты и экспорт в MS Excel и сохранять для дальнейшего анализа с использованием формулы ΔΔCT (шаг 4.3).

6. Подтверждение микроРНК правил использования ОтдельныйАнализ КПЦР

  1. Красителя в анализ КПЦР
    1. Дизайн праймеров для желаемого анализа микроРНК. Последовательности зрелой миРНК, которая равна прямого праймера, могут быть получены из mirbase.org 14. Преобразование всех 'U', чтобы 'T'.
    2. Подготовка кДНК: Принимать по 1 мкг общей РНК и место в 1,5 мл трубки центрифуги. Следуйте инструкциям для поли хвостохранилища и первого прядь синтеза кДНК микроРНК из микроРНК первой цепи протокола кДНК Синтез и Qrt-PCR. Развести полученную в результате кДНК (1:10) и хранить при температуре -20 ° С.
    3. Получить один реакционный планшет 96-а.
    4. Для каждой реакции микроРНК КПЦР хорошо, добавьте 16 нг поли кДНК, полученной на стадии (6.1.2), 2 пмоль каждого конкретного прямого праймера (со стадии 6.1.1) и универсальный праймер (из комплекта со стадии 6.1.2 ), и 5 мкл 2x КПЦР мастер-микса. Конечный реакционный объем 10 мкл / лунку.
    5. Убедитесь, что есть три лунки для каждого образца для каждого микроРНК (для технических повторах). Также, Убедитесь, что ссылка ген (обычно U6 мяРНК) включен.
    6. На системного программного обеспечения Qrt-PCR, назначить репортеру и цель, введите реакционного объема, выберите сравнительный порогового цикла (ΔΔCT) метод, и определить типовые скважин.
    7. Запустите пластины, используя настройки по умолчанию для запуска. Убедитесь в том, чтобы выполнить анализ кривой плавления для всех трасс органического красителя. Каждая кривая плавления должна показывать только один специфический пик, чтобы подтвердить усиление одного конкретного фрагмента. Если наблюдается более чем один пик или нет четкого пика, праймеры не являются специфическими и данные не могут быть использованы.
    8. Сохранить результаты после запуска, а также экспортировать данные (особенно значения СТ на MS Excel).
  2. Двойной Маркированный анализ Зонды КПЦР
    1. Возьмите 10 нг каждого тотальной РНК, каждый в объеме 5 мкл и место в 0,2 мл трубки микроцентрифужных.
    2. Следуйте инструкциям из протокола на выполнение обратной транскрипции (RT) с помощью двойной меченых зондов MicroРНК обратной транскриптазы Комплект 15. Каждый Общий объем реакционной смеси должен быть 15 мкл. Обратите внимание, что для двойной меченых реакций зонды РТ, есть специфические праймеры для каждого быть изученных микроРНК.
    3. Место реакционную трубку в системе амплификатор ПЦР, и установить параметры в соответствии с протоколом указано на этапе 6.2.2 выше. Запустите перспективе. Это должно занять около 70-80 мин.
    4. После реакции RT, необходимо разбавить образец кДНК в соотношении 1:05, и хранить всю кДНК в темноте при -20 ° С.
    5. Получить один реакционный планшет 96-а.
    6. Для каждой реакции микроРНК КПЦР хорошо, добавить следующее: 10 мкл Двойной меченых зондов 2x Универсальный PCR Master Mix (же реагент как шаг 5.2.5), 7,67 мкл РНКазы свободной воды, 1 мкл 20 × реального времени анализа грунтовки (специфичны для каждого миРНК) и 1,33 мкл кДНК с этапа 6.2.4 выше. Это должно быть 20 мкл конечного объема реакции. Смешайте содержимое мягко, и центрифуги кратко.
    7. Убедитесь, что епрежде чем являются три лунки для каждого образца для каждого микроРНК (для технических повторах). Кроме того, убедитесь, что ссылка ген (обычно U6 мяРНК) включен.
    8. На системного программного обеспечения Qrt-PCR, назначить репортеру (FAM) и гаситель (NFQ-МГБ) для каждого микроРНК (целевой), представляющие интерес, введите реакционного объема, выберите сравнительный порогового цикла (ΔΔCt) метод, и определить типовые скважин.
    9. Следуйте инструкции по настройке параметров для количественной ПЦР работают с двойной Маркированный протокола анализа Зонды микроРНК. Затем запустите перспективе. Сохранить результаты после запуска, а также экспортировать данные (особенно значения СТ на MS Excel).

Representative Results

Обзор подхода представлен на рисунке 1 и сравнение различных образцов препаратов и модификаций нуклеиновых кислот, необходимых для каждого метода визуализируется на рисунке 2.

Состояние и окружающей среды из клеток перед лечением с гормона играет важную роль в определении фактических последствий гормона 16. Некоторые средние и сыворотки содержат факторы роста, которые могут повлиять на результаты, поэтому клетки сыворотки голодали, чтобы все гормональные эффекты были сведены к минимуму. Таким образом, при лечении с Е2, есть еще уверенность, что наблюдавшиеся эффекты E2-связаны. Важным фактором является конфлюентности клеток, который влияет контакт клетка-клетка и поведения, такие как сигнализации клеток и пролиферации клеток. Клеткам давали на 80% сливной (фиг.3А) и хорошо прикреплен к росту и позволит избежать потери клеток в процессе последующей промывкой и медиа-CHАнж.

Условия при добыче и хранении РНК важны для качества РНК и последующего анализа. Известно также, что число клеток, способ экстракции, а содержание GC в микроРНК может повлиять на урожайность и качество обеих мРНК и микроРНК 17. Таким образом, необходимо выполнять во время экстракции РНК РНКазы условиях и для проверки качества РНК, прежде чем приступить экспериментов. После экстракции количественное определение РНК содержит информацию о концентрации тотальной РНК (мРНК, содержащей как и микроРНК), что позволяет наблюдать выходом. Она также обеспечивает графическое представление результатов как показано на рисунке 3В, и это позволяет для наблюдения чистоты образца (как правило, указанном одним пиком, верхней панели). Плохо выход РНК не приведет удельное поглощение при 260 нм (рис. 3В, нижняя панель). Чтобы определить, является ли РНК из высококачественного, РНКцелостность измерялась. Ряд целостности РНК (РИН) в пределах от 9-10 гарантирует, что РНК не ухудшается и оптимального качества. Кроме того, графическое представление РНК должны быть соблюдены и 18S и 28S рРНК должны иметь пики, как показано на рисунке 4 (средняя панель). Сравнение с лестницы (рис. 4, верхней панели) определяет размер пиков. Деградировали РНК бы менее четкие пики и пониженную относительную сумму 18S и 28S рРНК (рис. 4, нижняя панель). Доля малых РНК может быть дополнительно обеспечена с помощью Agilent Небольшой РНК-Kit. Рекомендуется проверить реакцию эстрогена после лечения, при указанных условиях эксперимента, прежде чем приступить к микроРНК скрининга. КПЦР может быть выполнена на известном ER гена-мишени, такие как PS2 или SPINK4 18, с использованием кДНК-матрицы. Такие гены, как правило, активируется в течение 1-24 ч после лечения E2. После того, как качества РНК и реакции эстрогеновбыл оценен, далее эксперимент может быть проведен.

Микрочипов по-прежнему является широко используемым методом для крупномасштабного скрининга на микроРНК экспрессии в клетках. Например, микрочипов микроРНК когда-то содержал 894 зрелых микроРНК и 50 управления уникальные зонды в четырех близнецах 1. Гибридизации проводились в двух экземплярах с процедурой замены красителя. Результаты микроРНК микрочипов, как правило, графически представлены карты тепла. показан тепловой карты, представляющий данные из сравнения микроРНК микрочипов между автомобилем и E2 обработанных образцов. Красный указывает, что микроРНК активируется в E2-обработанного образца (выше выражение), в то время как зеленый указано отрицательная регуляция в микроРНК (нижняя выражение). Выбор микроРНК, обычно зависит от их значимости в выражении, и, как правило р-значение меньше 0,05 считается значимым. В микроРНК, которые указаны для дифференциально экспрессируются следует дополнительно подтверждена жIth КПЦР, чтобы отличить их от ложных срабатываний.

Массив DLP-LDA, с другой стороны, использует метод КПЦР основе для выявления регулируемых микроРНК в формате 384-а. Обычно два 384-луночные планшеты (карты) предоставляются, бассейны и B. Группа А обычно содержит лучше охарактеризовать и более высокий уровень экспрессии микроРНК, чем бассейн B. Относительный уровень каждого микроРНК определяются количественной ПЦР, где один микроРНК анализируется за а также (фиг. 5В). Выше Ct-величина указывает меньшую выражение микроРНК. Многое, как микрочипов микроРНК, результаты, полученные от DLP-LDA должны быть дополнительно подтверждена для обеспечения точности.

Проверки могут быть выполнены с использованием КПЦР. Здесь два метода обнаружения КПЦР описаны для предотвращения метод смещения и расширения возможностей для тщательного подтверждения и расследования правил микроРНК. На основе красителя химия обнаружения цианиновых работает иначе, чем DLP, что DLP-LDA профилирования основана на, и подходит для подтвержденияAtion целей. Это может быть менее определенным, как он обнаруживает все усиленный двухцепочечной ДНК, но однородность образца может быть оценена путем выполнения анализа плавления кривой. (слева) показывает анализ плавления кривой микроРНК, и четко определены равномерное пик можно увидеть. Несколько пики наблюдались бы, если грунтовка неспецифические или значительное количество грунтовки-димера образуется (рис. 6А, правая панель). DLP микроРНК анализы, с другой стороны, более специфичен как только амплификации мишени миРНК обнаружено. Амплификации участков каждой целевой микроРНК можно наблюдать, как проиллюстрировано в фиг.6В. Возможность контролировать для возникновения нескольких продуктов амплификации с помощью анализа кривых плавления, однако, не доступны с этой химии и органического красителя в КПЦР дешевле. Органического красителя и DLP КПЦР анализы могут иногда генерируется немного разные результаты. Для обоих КПЦР анализы, сравнения с REFEГен Rence требуется для определения относительной экспрессии генов между двумя образцами. Опорный ген, также называемый гена домашнего хозяйства, должен быть ген, экспрессия которого не изменилась и который экспрессируется на том же уровне, как интересующего гена. Примером подходящего контрольного гена в этих клеток рака молочной железы линий ARHGDIA, Rho ВВП диссоциации ингибитора, которая функционирует ВВП / GTP реакций обмена белков Rho. Как отмечено в фиг.6С (вверху), уровень мРНК ARHGDIA не изменяется между транспортным средством и лиганда, обработанных образцов. 18S рРНК также могут быть использованы, хотя его высокая экспрессия требует отдельного 1:500 разбавление кДНК складе и поэтому менее целесообразным. Для анализа микроРНК, есть еще дебаты по четко определенной контрольного гена. До сих пор, U6 мяРНК является ссылкой ген, который широко для анализа микроРНК. U6 мяРНК является ~ 110 нуклеотидов длиной, некодирующих небольшой ядерный РНК, которая функционирует в ядерной пре-мРНК SPLобледенение 19. Как отмечается в фиг.6С (внизу), уровни экспрессии U6 примерно одинаковы во всех образцов, показанных, что позволяет для расчетов переменных уровней микроРНК. Графическое представление результате микроРНК КПЦР для сравнения между автомобилем и E2-обработанных клеток, которые были нормализованы к опорному U6 можно наблюдать на рисунке 6D. Это иллюстрирует микроРНК, которые были обнаружены как нерегулируемым после лечения 24 часа в сутки E2, но который несет ER хроматина сайты связывания, близкие к его геномной месте, и анализ временных рядов определены значительное регулирование 72 часа после обработки.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обзор подхода, применяемого для обнаружения гормональной регуляции микроРНК в клетках рака молочной железы.

Рисунок 2
Рисунок 2. Сравнение различных образцов препаратов и манипуляций нуклеиновых кислот для каждого метода обнаружения микроРНК. (A) микроРНК микрочипов с использованием метода технологии μParaflo включает обогащение, поли-хвостохранилище и лигирования маркировки. (B) пробоподготовки DLP технологии и метод обнаружения включает в себя замкнутую Синтез кДНК грунтовку, которая проходит после стадии денатурации и обеспечивает более длительный фрагмент, несущий пробоподготовки технологии органического красителя в обратный праймер и последовательность зонда. (С)и метод обнаружения включает поли A-хвостохранилищ и синтез кДНК с олиго-DT праймеров в том числе универсальный 5 'последовательности.

Рисунок 3
Рисунок 3. Клеточная культура и добыча РНК. (A) Культивируемые клетки, чтобы проиллюстрировать 80% слияния, необходимой перед обработкой лиганда. (B) Графическое представление концентрации РНК и чистоты после экстракции. Каждый пик представляет собой образец и успешный процесс экстракции дает чистую РНК (верхняя панель). Плохо извлекаются РНК не показывает четкий пик поглощения при 260 нм (нижняя часть).

Рисунок 4
Рисунок 4. & #160; контроль качества РНК Результаты анализа целостности РНК показывая графическое представление для лестницы (вверху), хорошего качества РНК (в центре) и деградированных образца РНК (внизу)..

Рисунок 5
Рисунок 5. Иллюстрация микроРНК профилирования результатов. (А) Тепловая карта представление микроРНК результатов микрочипов для разному экспрессируются микроРНК. микроРНК-A, B, C являются активируется в E2-обработанного образца, как указано в красный цвет, в то время как микроРНК-D, E, F, G являются подавляется в E2-обработанного образца, как показано на зеленый. (B) амплификации участков для каждого микроРНК из результатов DLP-LDA. микроРНК обнаружены усиливаются как указано увеличения стоимости Rn.

Рисунок 6 Рисунок 6. КПЦР анализ правил микроРНК. (А) анализ плавления-кривая для микроРНК проанализированы с использованием обнаружения органического красителя, показывая однородность всех испытанных образцов (слева) и усиления нескольких фрагментов (справа). (B) амплификации участков для каждого образца для микроРНК. Это может быть либо от органического красителя или DLP методы обнаружения. (С) Гистограмма представление подходящих справочных генов мРНК анализа ARHGDIA (вверху) и для микроРНК анализа мяРНК U6 (внизу), не показывая никакого существенного дифференциальное выражение между образцами. (D) Результаты микроРНК КПЦР для иллюстрации сравнение относительного уровня экспрессии микроРНК-135а за время курса. Рисунок 6D перепечатана из Katchy др.. 1 с разрешения Elsevier. Значения, как правило, средний отдельного эксперитах, (биологические дубликатов) ± SD. Т-тест Стьюдента используется для демонстрации значение: * Р <0,05.

Discussion

Определение механизма гормональной регуляции микроРНК в клетках рака молочной железы может послужить платформой для понимания этой болезни и может обеспечить потенциальную обработку для рака молочной железы. Культивирование этих клеток, чтобы обеспечить оптимальные условия для действия гормонов является очень важным. Здесь это протокол, который гарантирует, что гормон интерес (эстроген) был исключен до лечения и что оптимальная доза Е2 был использован в течение соответствующего времени в процессе лечения было описано. Другие гормональные и роста эффекты факторов были сведены к минимуму путем постепенного снижения сывороточные уровни и с помощью DCC-FBS, который FBS, которые были лишены большей части своей гормона, цитокинов и факторов роста. Фенолового красного носители дополнительно используется, чтобы минимизировать другие негормональной эффектов, при условии, что фенол красный, как сообщается, имеют эстрогенной активностью и влиять на определенные функции в клеточных линиях 20,21. Время обработки клеток на гормон имеет большое значение. Для эстроген-связана регуляции генов, было ранее показали, что 24-hrexposure производить значительную реакцию прямых генов-мишеней в раковых клетках молочной железы 1,18. С микроРНК транскрибируются РНК-полимеразы II, как мРНК, можно предположить, что это подходящая точка времени, чтобы обнаружить прямое регулирование также микроРНК. Это еще предстоит определить, если и как эти микроРНК влияют на экспрессию этих известных целей ER в клетках рака молочной железы.

микроРНК выражение профилирование может быть сложным из-за относительной небольшой размер микроРНК, на то, что последовательность зрелого микроРНК можно найти также в PRI-микроРНК и предварительной микроРНК, и из-за неоднородности в их содержании 22 ГК. Несколько методов профилирования и химические были использованы для преодоления этой трудности. Среди них различные подходы микрочипов и анализа КПЦР (рис. 2). Хотя микрочипов широко принята для всей генома анальныйлиз, она может обеспечить ложные негативы и существуют различия между доступных платформах, начиная от химии к технологии печати 23. Также процесс нормализации представляет собой проблему при анализе сравнительно мало генов микроРНК, которые учитываются в тысячах сравнению с десятками тысяч транскриптов мРНК. КПЦР, с другой стороны, является более чувствительным, а лучше меньше применяется, когда гены должны быть рассмотрены. Однако, когда выполняется в больших пластин 384-а, только с одним технической репликации за тарелку, несколько плиты должны быть проанализированы для каждого образца, что делает анализ дорогостоящим. Кроме того, в наших руках, многие больше ложных отрицательных результатов были получены с использованием анализа DLP-LDA сравнению с микрочипом. Учитывая, что последовательность зрелого микроРНК присутствует в PRI-микроРНК и последовательностей предварительно микроРНК, представляет интерес для различения этих транскриптов с использованием методов ПЦР 24. DLP зонды доступны также для предварительного микроРНК и зрecific праймеры также могут быть разработаны, чтобы исключить различные зрелые или предшественник варианты использования органического красителя технологии КПЦР.

КПЦР является золотым стандартом для проверки дифференциального выражения от профилирования результаты. Эффективность кПЦР, однако, зависит от нескольких параметров, включая выделения РНК, целостности РНК (качество), синтеза кДНК, грунтовки дизайна, способа обнаружения (химия), и опорного гене данных нормализации 1,22,25. Опции для дизайна праймеров для анализа микроРНК очень ограничен, так как короткая длина последовательности микроРНК не дает места для большого альтернативной конструкции праймера, и только один праймер можно питал в этой короткой последовательности. Таким образом, потребность в альтернативных манипуляций, как показано на рисунке 2. Технические повторов важны для проверки надежности способа амплификации и используемого способа. Биологических повторяет требуются для представления общей биологической вариациейп, в том числе переменную ответ на лиганд лечение, и показать, что эффекты, наблюдаемые в клетке воспроизводимы. Основываясь на нашем опыте, изменения в микроРНК выражения между культурами клеток может произойти. Обычно эти различия меньше, чем в 1,3 раза, а средняя значений и соответствующих SD идентифицирует природных и техногенных изменений. Это изменение может быть результатом различных факторов, включая, плотности клеток и тем, что функции клетки может изменить от пассажа к пассажу. Для выявления статистически значимых выражений в результате лечения лиганда, широко распространенным значимость, когда значение р меньше 0,05. Здесь были использованы Т-тест студента на биологических и технических повторов с помощью двустороннее распределение и Двухвыборочная неравные параметры дисперсии. Другие параметры Т-тест существуют, и выбор зависит от экспериментальной установки 26.

Подробный протокол в оценке гормональные правила зрелой микроРНКН.А. в раковых клетках молочной железы была оказана. Важные технологии и химии в профилирования и подтверждение этих микроРНК выражения были четко объяснены. Выбранная технология для изучения микроРНК в клетках рака молочной железы в конечном счете зависит от того, что именно находится в стадии расследования.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарны доктору Xiaolian Гао, Университете Хьюстона, за консультирование микрочипов платформы LC наук микроРНК, доктора Карин Edvardsson, Каролинского института, Швеция, и д-р Eylem Aydogdu, Университете Хьюстона, для обмена своим опытом микроРНК . Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института рака из Национального института здоровья в рамках премии Количество R01CA172437. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения. Эта работа также была поддержана грантами от Техаса Emerging Technology Fund, в рамках Соглашения не. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128, (3-5), 145-153 (2012).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, (2), 281-297 (2004).
  3. Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37, (8), 2584-2595 (2009).
  4. Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37, (14), 4850-4861 (2009).
  5. Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23, (5), 223-233 (2012).
  6. Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40, (4), 752-758 (2012).
  7. Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4, (7), e6146 (2009).
  8. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83, (3), 249-289 (2004).
  9. Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17, (2), 99-109 (2001).
  10. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10, (6), 515-527 (2006).
  11. Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7, (9), 687-692 (2010).
  12. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  13. Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
  14. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
  15. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, (20), e179 (2005).
  16. Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37, (2), 195-200 (1990).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, (6), 893-895 (2012).
  18. Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27, (7), 1019-1032 (2008).
  19. Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1, (1), 46-54 (1995).
  20. Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12, (2), 280-293 (2007).
  21. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57, (3), 169-178 (1988).
  22. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, (4), 244-249 (2010).
  23. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, (5), 991-1006 (2010).
  24. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, (4), e43 (2004).
  25. Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
  26. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).
Профилирование Эстроген-регулируемых микроРНК в клетках рака молочной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter