Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Published: February 21, 2014 doi: 10.3791/51285
Automatic Translation
1, 1
1Center for Nuclear Receptors and Cell Signaling, Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Abstract

Oestrogeen speelt een belangrijke rol bij ontwikkeling van de borstklier en borstkanker progressie. Het bemiddelt zijn functie door te binden aan en activeren van de oestrogeenreceptoren (ERS), ERa en ERP. ERa wordt vaak opwaarts gereguleerd bij borstkanker en drijft de proliferatie van borstkankercellen. De ERs fungeren als transcriptiefactoren en genexpressie reguleren. Overwegende dat de regeling van proteïne-coderende genen ERa's goed ingeburgerd is, de regulering van niet-coderende microRNA (miRNA) is minder bestudeerd. miRNAs spelen een belangrijke rol in de post-transcriptionele regulatie van genen, remmen hun vertaling of vernederende hun mRNA. miRNAs kan functioneren als oncogenen of tumorontstoringsapparaten en belooft ook biomarkers. Onder de miRNA assays beschikbaar microarray en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) zijn uitgebreid gebruikt voor miRNA niveaus detecteren en kwantificeren. Om miRNAs gereguleerd door oestrogeen signalering bij borstkanker, th identificereneir expressie in ERa-positieve borstkanker cellijnen werden vergeleken voor en na de oestrogeen-activering met behulp van zowel de μParaflo-microfluïdische microarrays en Dual gelabelde probes-lage dichtheid arrays. De resultaten zijn gevalideerd met specifieke qPCR assays, het toepassen van zowel Cyanine dye-based en Dual gelabelde probes-gebaseerde chemie. Bovendien werd een time-point test gebruikt om regelgeving in de tijd te identificeren. Eigenschappen miRNA assay benadering in deze studie is dat het mogelijk maakt een snelle screening van rijpe miRNA voorschriften tal monsters, zelfs met beperkte monsterhoeveelheden. De lay-out, met inbegrip van de specifieke voorwaarden voor celcultuur en oestrogeen behandeling, biologische en technische herhalingen, en grootschalige screening gevolgd door een grondige bevestigingen gebruik van afzonderlijke technieken, zorgt voor een robuuste detectie van miRNA regelgeving, en elimineert valse positieven en andere artefacten. Echter, gemuteerd of onbekende miRNAs, of regelgeving op de primaire en voorloper transcript leveIk zal niet worden gedetecteerd. De hier gepresenteerde methode is een grondig onderzoek van oestrogeen-gemedieerde miRNA regelgeving.

Introduction

Oestrogeen is een hormoon dat belangrijk tijdens ontwikkeling van de borstklier. Oestrogeen speelt ook een belangrijke rol in de ontwikkeling, het onderhoud, risico's en behandeling van borstkanker 1. Oestrogeen oefent zijn functie door te binden aan ERs, die transcriptiefactoren zijn en reguleren specifieke doelgroepen genen. Van de twee receptor varianten ERa essentieel is voor oestrogeen-afhankelijke proliferatie van borstkankercellen. De meeste borstkankers zijn ERa-positief en is afhankelijk van oestrogeen voor groei. Dit heeft oestrogeen signalering gemaakt en ERa een doelwit voor de behandeling van hormoon-receptor positieve borstkanker. Inzicht in het onderliggende mechanisme van ERa is belangrijk om behandelingsresultaten te verbeteren, te overwinnen weerstand tegen de behandeling, en te begrijpen hoe borstkanker ontwikkelt.

miRNAs spelen cruciale rol in cel functies als gevolg van hun grote invloed in post-transcriptionele genregulatie. miRNAs zijn 19-24 nucleotiden kort enkelstrengs, Niet-coderende RNA's die eerst worden getranscribeerd door RNA polymerase II in primaire miRNA transcripten (pri-miRNA). Ze worden verwerkt in de kern door Drosha in korte haarspeld precursor-miRNAs (pre-miRNA) en vervolgens verwerkt door Dicer en gescheiden in enkele strengen te rijpen miRNAs in het cytoplasma te vormen. De enkelstrengs mature miRNAs worden overgebracht naar Argonaute eiwitten RISC complex. Vervolgens kan de miRNAs hybridiseren met het 3'-ongetranslateerde gebieden (3'-UTR) van een doel-mRNA, wat leidt tot post-transcriptionele regulatie blokkeert translatie of verslechtering van de doel-mRNA 2.

Vanwege de belangrijke rol die zowel oestrogeen als miRNAs bij tumorprogressie, identificeren miRNAs geassocieerd met normale of verstoord oestrogeen signalering is belangrijk om ons inzicht in de ontwikkeling verhogen en behandeling van borstkanker. Hoewel er een goed begrip van hoe ERa regelt eiwit-coderende genen, de uitbreidingen gegevens van niet-coderende RNA regelgeving moet nog grondig worden onderzocht. Eerste studies gericht op ERa regulering van miRNA in borstkanker cellijnen helderen hebben tegenstrijdige resultaten opgeleverd, zelfs wanneer dezelfde cellijn is geanalyseerd 3-6. Dit kan een gevolg van verschillende behandelingen, biologische variaties, het gebruik van verschillende technieken, en het feit dat de kleine omvang van miRNAs ze moeilijk te analyseren. Hier wordt een protocol dat regelt voor variaties en methode artefacten beschreven.

Om te bepalen welke miRNAs worden gereguleerd door oestrogeen, profilering van een goed gedefinieerde borstkanker model van ERa activiteit is een eerste stap. Verscheidene cellijnen werden gegenereerd uit humane ERa-positieve borstkanker tumoren, die afhankelijk oestrogeen vergelijkbaar met de meeste klinische borstkanker zijn. De moleculaire eigenschappen van twee van deze cellijnen, T47D en MCF7 en het uiten van ERa en de downstream-doel,het hormoon progesteron receptor (PR), een gebrek aan expressie van membraan receptor HER2, samen met expressie van oestrogeen-responsieve en-luminale epitheliale differentiatie genen, ze geschikt als modellen voor de luminale subtype van borsttumoren 7-10. 17β-oestradiol (E2) is de overheersende vorm van oestrogeen en de concentraties en tijdstippen voor optimale transcriptionele activering van ERa zijn gekarakteriseerd in meerdere studies. In dit protocol 10 nM E2 behandeling van 24 uur gebruikt waarbij T47D en MCF7 als modellen voor ERa activiteit in borstkankercellen 1. Bovendien tijdsafhankelijk miRNA bepalingen kunnen worden bepaald in een tijdsinterval van bijvoorbeeld 1-72 uur geanalyseerd.

Ten tweede, het analyseren van miRNA heeft aparte uitdagingen, mede door hun korte maten. miRNA's zijn niet goed behouden in de totale RNA-bereiding bij reguliere Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA neerslag worden uitgevoerd, of wanneer stAndard kolom zuiveringen worden gebruikt. Speciale voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen handhaven of te verrijken voor de kleinere fractie van RNA. Door verhoging van isopropanol, verlagen van de temperatuur vóór centrifugatie (-80 ° C), en weglaten van de wassen in 70% ethanol, kan het behoud van miRNAs worden versterkt tijdens neerslag. Of kunnen specifieke kolommen en buffers voor een hoogwaardige en robuuste bereiding van miRNA bevattende totaal RNA worden gebruikt. Ook voor de analyse zelf, hun korte maten creëren uitdagingen. Voor genoom-brede miRNA screening, zijn er drie gemeenschappelijke miRNA profilering technieken om uit te kiezen: microarrays, qPCR, en next-generation sequencing. Elke techniek kan worden uitgevoerd met meerdere verschillende platforms en verschillende monster preparaten vereist, elk met verschillende risico introduceren artefacten. In miRNA microarray, wordt een dia gespot of gesynthetiseerd met duizenden oligonucleotiden. Deze oligonucleotiden worden gebruikt als probes, en elk van de probes is ontworpen om te hybridiseren met een bepaalde miRNA sequentie. De monstervoorbereiding voor microarrays, zoals uitgevoerd in deze studie, eerst verrijkt voor miRNAs en introduceert dan Cy5 en Cy3 etikettering op de miRNAs. Microarray geeft de mogelijkheid om de relatieve expressieniveaus van een groot aantal genen gelijktijdig waar te nemen, is snel en geschikt voor het screenen van grote aantallen monsters, maar kan alleen analyseren van de sequenties aanwezig op de microarray en bijvoorbeeld geen veranderingen detecteren onbekende of gemuteerde miRNAs. Microarray analyse zoals uitgevoerd in dit protocol vereist ook relatief grote hoeveelheden, ongeveer 5 ug totaal RNA per monster voor analyse. Lage dichtheid qPCR miRNA profilering vereist minder materiaal (700 ng / monster en repliceren), en zorgt voor de detectie en kwantificering van miRNAs. Transcriptniveaus kan worden bepaald, en de hoeveelheid kan een absoluut bedrag of een relatieve hoeveelheid zijn. qPCR analyse eerste vereist omzetting van miRNA in cDNA, hier met behulp van een lusprimer voor elke specifieke miRNA zorgen voor de analyse van slechts volwassen miRNA. Dit genereert een langere sjabloon dat kan worden geamplificeerd onder toepassing van een miRNA-specifieke voorwaartse primer en een reverse universele primer complementair aan de lus sequentie en kan de opname van een Dual Gelabelde Probe voor specificiteit haven. qPCR kan worden gebruikt in een lage dichtheid format waar honderden miRNAs kan worden gedetecteerd in parallel via een of meer 384-puts platen met individuele primerparen in elk putje 11. Nieuwe generatie sequencing, daarentegen, is de enige van deze technieken maakt de ontdekking van nieuwe, gemuteerde of bewerkt miRNAs, aangezien alle RNA in een monster kan worden gesequenced 11. Deze techniek vereist echter meerdere stappen te kleine RNA verrijken en produceren een klein RNA bibliotheek met meerdere stappen linker ligaties en zuiveringen latere verhoogde risico moduleren hun relatieve expressieniveaus tussen monsters. Het vereist ook aanzienlijke bioinformatics analyse. Gezien de verschillende technieken voor miRNA profilering, de meest geschikte techniek is afhankelijk van de toepassingen. Microarrays zijn het meest geschikt als materiaal is relatief overvloedig en de rente is om differentiële expressie van reeds bekende miRNAs definiëren. Low-density qPCR arrays meest geschikt wanneer er een beperkte hoeveelheid monster beschikbaar is en een hoge gevoeligheid van laag expressie miRNAs vereist. Sequencing is het meest geschikt wanneer het analyseren van onbekende miRNAs, gemuteerd of verschillende isovormen van een miRNA vereist.

In de studie van oestrogeen-gereguleerde miRNAs bij borstkanker, zijn twee model cellijnen gebruikt, T47D en MCF7, waar grote hoeveelheden RNA zijn direct beschikbaar. Elke cellijn werd geanalyseerd in gerepliceerde celculturen met behulp van verschillende passages, elk in technische replica van de behandeling. Dit zorgt voor een robuuste detectie van reproduceerbaar, ERa-gereguleerde miRNAs. Relatieve miRNA expressie niveaus werden vergeleken met behulp van zowel miRNA microarray enDual gelabelde probes - lage dichtheid arrays (DLP-LDA) en gevalideerd de resultaten met specifieke qPCR met behulp van zowel cyaninekleurstof en DLP chemie. miRNA reglementen werden vervolgens verder geanalyseerd in tijdreeksen om hun exacte regelgeving na verloop van tijd, die kunnen helpen differentiëren willekeurige of circadiane variaties van oestrogeen-geïnduceerde regelgeving, en geven aan primaire effecten van secundaire effecten te definiëren. Bioinformatical vergelijkingen met chromatine-bindende studies van ERa steun kunnen verder in de differentiatie van primaire versus secundaire effecten. De test resulteerde in een betrouwbare beoordeling van miRNA regelgeving waar het kon worden vastgesteld dat na 24 uur E2 behandeling eiwit-coderende transcripten werden gemakkelijk geregeld, maar volwassen miRNAs werden niet beïnvloed 1. Het is echter mogelijk dat miRNAs worden geregeld op latere tijdstippen, zoals in de tijdreeksanalyse geselecteerde miRNAs 1. De gegevens moeten verder worden verkend en het protocol hier gepresenteerde biedt een Robust manier om hormonale regulatie van de volwassen miRNAs bij borstkanker cellijnen te bestuderen.

Protocol

1. Bereiding van celkweekmedia

  1. Voor T47D cellijn cultuur media:
    1. Meng 500 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 500 ml F12 [DMEM/F12 (1:1)] in een autoclaaf 1 L fles.
    2. Voeg 50 ml foetaal bovine serum (dit maakt 5% FBS) en vervolgens 10 ml penicilline streptomycine (dit maakt 1% PEST). Volledig wordt gemengd inhoud.
    3. Bewaren bij 4 ° C.
  2. Voor MCF7 cellijn cultuur media:
    1. Meng 500 ml DMEM met 25 ml van de FBS (5% FBS), en vervolgens 5 ml penicilline streptomycine (1% PEST).
    2. Bewaren bij 4 ° C.
    3. Voor verlaagde serum cultuur media:
      1. Voor T47D: Meng 500 ml fenol rood-vrij DMEM met 500 ml F12 (01:01) in een autoclaaf 1 L fles, en voeg 50 ml van de-dextran beklede houtskool behandeld (DCC) FBS voor 5% DCC-FBS. Maak een aparte fles met 5 ml DCC-FBS 0,5% DCC-FBS. Voeg vervolgens 10 ml van PEST (1% PEST) aan elke fles. Volledig wordt gemengd inhoud, store bij 4 ° C.
      2. Voor MCF7: Meng 500 ml fenol rood-vrij DMEM met 5 ml 100x L-glutamine (200 mM eindconcentratie). Voeg 25 ml DCC-FBS (5% DCC-FBS). Maak een aparte fles met 2,5 ml DCC-FBS (0,5% DCC-FBS). Voeg vervolgens 5 ml PEST (1% PEST) aan elke fles. Meng inhoud volledig, bewaren bij 4 ° C.
    4. Voor fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing:
      1. Vul een 1 L geautoclaveerde glazen fles met ultrapuur water of gedestilleerd water.
      2. Voeg een PBS tablet en schud af en toe totdat de tablet is opgelost.
      3. Autoclaveer PBS-oplossing en bewaar bij kamertemperatuur.
    5. Voorbereiding van de ligand voorraden:
      1. Bereid een 100 mM voorraadoplossing van E2 door het oplossen van 2,72 mg 17β-oestradiol in 100 pl ethanol of DMSO in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng de inhoud voorzichtig. Spin kort maken seriële verdunningen (1:10) waardoor 10 mM, 1 mM en 0,1 mM stock concentrties met behulp van het oplosmiddel. Bewaar alle E2 voorraad oplossingen bij -20 ° C.
      2. Bereid een 100 mM voorraadoplossing van ICI door het oplossen van 6,07 mg ICI 182.780 in 100 gl EtOH of DMSO in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng de inhoud voorzichtig. Spin kort maken seriële verdunningen (1:10) waardoor 10 mM, 1 mM, 0,1 mM voorraad concentratie van het oplosmiddel. Bewaar alle ICI voorraad oplossingen bij -20 ° C.
      3. Het voertuig is het oplosmiddel (ethanol of DMSO). Breng 0,5-1 ml 100% ethanol of DMSO in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar bij -20 ° C.

2. Celkweek en behandeling

Voer elke behandeling in twee-of drievoud platen voor technische repliceert. Herhaal celkweek behandeling en behandeling met een andere doorgang van dezelfde cellijn, die als biologische kopie van deze cellijn zou dienen. Herhaal de procedure met een andere cellijn te replcaat op bevindingen in meer dan een cellijn. Alle celkweek technieken moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap.

  1. Celcultuur opstarten
    1. Verwarm de media tot 37 ° C in een steriel warmwaterbad.
    2. Ontdooi een bevroren flacon T47D of MCF7-cellen.
    3. Reinig de buitenkant van de flacon en media fles met 70% ethanol, en plaats vervolgens beide flacon en fles in steriele laminaire stroming kap.
    4. Label een steriele T-75 kolf dienovereenkomstig (in de kap).
    5. Voeg 12-15 ml van de juiste media in de kolf met een steriele serologische pipet (ervoor zorgen dat het oppervlak wordt volledig bedekt met media).
    6. Breng de cellen van de flacon aan de kolf, en meng voorzichtig.
    7. Plaats kolf in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 geleverd.
  2. Bereiding van cellen voor de behandeling
    1. Neem cellen uit de incubator waarnemen onder de microscoop dat de cellen ten minste 80% confluent. Dit om te verzekeren dat er voldoende cellen voor experiment. Transfer kolf steriele kap.
    2. Verwijder media uit kolf met een steriele Pasteur pipet verbonden met een vacuüm. Voorzichtig wassen gehechte cellen tweemaal met PBS.
    3. Voeg 1 ml warm trypsine-EDTA op de kolf en plaats kolf in de incubator gedurende 2 minuten. Dit is om de cellen los van de fles.
    4. Voeg ongeveer 3-4 ml van passende warm media om de kolf en vermaal de vrijstaande cellen met behulp van een 5 ml serologische pipet. Vermaal door het nemen van de cellen in de serologische pipet en loslaten van de cellen met de punt van de pipet gebracht tegen de bodem van de kolf om de druk. Dit is om de cellen te splitsen in afzonderlijke cellen.
    5. Tel de cellen, bijvoorbeeld met behulp van een cel teller, volgens het protocol van de fabrikant.
    6. Label 100 mm platen (zo nodig) en voeg hieraan 10 ml medium aan de platen. Plaat ongeveer 2,0 x 10 6 cellen / plaat. Verdeel cellen door gentle wervelende de platen.
    7. Incubeer de cellen gedurende 24-48 uur, tot ongeveer 80% samenvloeiing.
    8. Bij 80% confluentie, wassen cellen tweemaal met PBS, en voeg de juiste 5% DCC-FBS media. Dan, incubeer cellen voor 24 uur.
    9. Na 24 uur was de cellen tweemaal met PBS en voeg het juiste DCC 0,5% FBS-media. Dan, incubeer cellen voor nog eens 48 uur.
  3. Celbehandeling
    1. Na 48 uur was de cellen tweemaal met PBS. Zorg ervoor dat zoveel mogelijk van de PBS als mogelijk te verwijderen.
    2. In een 15 ml conische buis, voeg 10 ml van de geschikte 0,5% DCC-FBS media. Vervolgens voeg 1 pl van het 0,1 mM ligand voorraad (E2 of ICI) voor een uiteindelijke concentratie van 10 nM. Ook, voeg 1 pl voertuig 10 ml medium in een afzonderlijke buis voor het controle-experiment.
    3. Meng de inhoud in buis voorzichtig toevoegen aan cellen in de plaat. Dit moet een ligand per plaat zijn.
    4. Incubeer cellen voor het gekozen tijdstip (0-72 uur).
<p class = "jove_title"> 3. RNA-extractie en Quality Control

  1. RNA-extractie
    1. Na behandeling is voltooid voor de gewenste tijdsperiode, wassen cellen tweemaal met PBS, voeg ongeveer 1-2 ml Guanidinium thiocyanaat-fenol oplossing voor de cellen in de plaat. LET OP: guanidiniumthiocyanaat-fenol oplossing is giftig bij contact met de huid of de ogen, door inademing of opname door de mond. Draag geschikte beschermende kleding, handschoenen en een beschermingsmiddel voor de ogen / het gezicht en gebruik zuurkast.
    2. Zorg ervoor dat het volume van cellen niet meer dan 10% van het volume van Guanidinium thiocyanaat-fenol oplossing en dat de plaat is bedekt met de oplossing en laat zitten gedurende 1 minuut. Dan schraap cellen met behulp van een rubberen schraper en over te dragen aan een microcentrifugebuis. Cellen worden in deze oplossing bij -80 ° C gedurende weken.
    3. Extraheren en zuiveren totaal RNA uit elke behandeling met de guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform methode die rotatie kolomzuivering en DNaseIk DNA methode degradatie voor dierlijke cellen.
    4. Na extractie worden de cellen geëlueerd in 60 pi RNase vrij water. Aliquot 1-2 ul RNA voor kwantificatieanalyse en bewaar RNA bij -80 ° C.
    5. Meet de RNA-concentraties met 1 pl RNA en aspectrophotometer. Zorg ervoor dat er een leeg gemaakt voordat een meting wordt gedaan. Ook volledig veeg de spectrofotometer bereik tijd een meting wordt genomen. Concentraties worden meestal weergegeven in ng / ul. Resultaten waaruit blijkt RNA concentraties redden.
  2. RNA kwaliteitscontrole
    1. Neem ongeveer 100 ng RNA van elk monster en plaats in een microcentrifugebuis.
    2. Meet RNA integriteit met behulp van een bioanalyzer. Meestal 12 monsters kan worden uitgevoerd op een bepaald moment in een bioanalyzer. Run duurt meestal ongeveer 25 minuten.
    3. Vergelijk resultaten met de RNA ladder zodat het RNA is goed voor experiment. Opslaan en afdrukken resultaten.

4. Bevestiging van Treatment: qPCR van eiwit-coderende genen

  1. cDNA-synthese
    1. Neem 500 ng of 1 ug van het totaal RNA (van elk monster) en in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Breng de inhoud van elke buis tot 10 ul met RNAse-vrij water.
    2. Voeg 2 pl 50 pM willekeurige hexameerprimers en warmte buizen 70 ° C gedurende 10 minuten.
    3. Transfer buizen om ijs voor 5min.
    4. Voor elk monster wordt 4 pl 5x eerste streng buffer, 1 ui 0,1 M DTT, 1 ui 10 mM dNTP, 0,5 pi superscript III en 1,5 ul RNase-free water.
    5. Plaats de buisjes in een 25 ° C warmte of waterbad gedurende 10 minuten.
    6. Overdrachtsbuizen een 46 ° C warmteblok gedurende 1 uur. Dan, overdracht buizen tot een 70 ° C warmte blok gedurende 15 minuten om de reactie te stoppen.
    7. Verdun het cDNA een 5 ng / pl voorraad (berekend met totaal RNA ingang) met RNase-vrij water verdunningen en bewaar bij -20 ° C.
  2. qPCR
    1. Verkrijgen primers voor genen van belang en referentie-genen. Primers kunnen eenvoudig worden ontworpen met behulp van de primer ontwerpen tool op NCBI Primer-BLAST-programma 12. Dit genereert meestal een voorwaartse en achterwaartse primer voor elk gen van belang. Primers 18-22 bp in lengte, hebben een smeltpunt van 52-58 ° C, hebben een GC-gehalte van 40-60% en een amplicon lengte van 100-180 bp.
    2. Voor elke qPCR reactie well 10 ng cDNA (2 pi van voorraadconcentratie van stap 4.1.7), 1 pmol van elk van de voorwaartse en achterwaartse primers van het gen van belang (uit stap 4.2.1) en 5 gl 2x cyaninekleurstof PCR master mix. De reactie voor elk putje zou een 10 pl uiteindelijk reactievolume hebben.
    3. Zorg ervoor dat er putjes in drievoud voor elk monster voor elk gen (voor technische herhalingen). Een 96-well plaat reactie worden gebruikt.
    4. Op de qRT-PCR-systeem software, wijst de verslaggever en doel, voer reactie volume, selecteert u de vergelijkendemethode drempelcyclus (ΔΔCt), en definieer monsterputjes.
    5. Zorg ervoor dat u smeltcurveanalyse uit te voeren voor alle cyaninekleurstof loopt naar de amplificatie van een specifiek fragment bevestigen. Run platen met de standaardinstellingen voor de run.
    6. Resultaten na run, en exporteren van gegevens (met name de CT-waarden naar MS Excel) besparen.
  3. qPCR data-analyse met behulp van de ΔΔCT formule
    De verandering in relatieve mRNA-expressie kan worden berekend als voudige verandering ten opzichte van controle op Excel voor elk monster met behulp van de volgende stappen uit:
    1. Alle geëxporteerde resultaten van de qPCR boven moeten de Ct-waarden opgenomen. Bereken de OCT-waarde met behulp van de onderstaande formule:
      • AC T = CT (target-gen) - CT (referentie-gen)
      Dit moet gebeuren voor elk monster. Het doel is het gen of miRNA van belang.
    2. Vervolgens berekent het totale standaardafwijking (SD) voor elk monster. Eerste berekenende SD voor de referentie-gen en bereken dan de SD voor het doelwitgen (dit kan op Excel met de standaarddeviatie functie op de CT-waarden). Bereken dan de totale SD voor elk monster met behulp van deze formule:
      • Totaal SD = (SD2 (doel) + SD2 (referentie)) 1/2
    3. Bereken de ΔΔCT van elk monster in een gen (doel) door:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (behandeld / monster) - ΔΔCT (controle / calibrator monster)
      De kalibrator monster is het onbehandelde monster.
    4. Bereken tenslotte de vouw-change (FC)-waarden van elk monster met behulp van de formule:
      • FC = 2-ΔΔCT
      De veelvoudverandering waarde van elk monster geeft de relatieve expressie van het gen / miRNA die is genormaliseerd naar het referentie-gen en het controlemonster.
    5. Student's t-test kan worden gebruikt voor statistische analyse met behulp van tweezijdige distributie en twee steekproeven ongelijke variantieparameters: (P <0,001 (***), P <0,01 (**), en P <0,05 (*)). Dit kan op Excel. Bevestigen dat de behandeling resulteerde in regulering van bekende doelen alvorens miRNA profilering.

5. miRNA profielanalyse

  1. miRNA microarray
    1. Neem 5 ug geïsoleerde RNA uit cellen behandeld met ofwel voertuig of ligand, en plaats in een microcentrifugebuis. Stel het volume in de buis tot 20 ul. Elke vergelijking moet worden uitgevoerd in duplo of triplo.
    2. Voer de miRNA microarray met behulp van boven de RNA-monsters. miRNA microarray expressie profielen moeten worden bepaald met behulp van de menselijke miRNA microarray tweekleurige monsterarray door μParaflo Microfluidic Biochip Technology (Sanger miRBase release 14.0) 13.
    3. Resultaten moeten differentieel tot expressie miRNA's tonen. Overweeg significante miRNA uitdrukkingen als p <0.05.p-waarde <0.10 kan ook worden beschouwd voor verdere samenwerkingnfirmatory analyse met behulp van qPCR. Bewaar deze miRNA lijst voor verdere validatie met qPCR.
  2. miRNA profilering: DLP-LDA
    1. Elk monster moet worden geanalyseerd in duplicaten of drievoud. Neem 700 ng totaal RNA uit cellen behandeld met ofwel drager of ligand, en in een microcentrifugebuis. Stel het volume in buis naar 3 pl.
    2. Voer de cDNA-synthese met behulp van de Dual gelabelde probes miRNA bepalingsmethode en de 10x RT primers. Totale volume van elke reactie moet 7,5 pl.
    3. Plaats reageerbuisje in het PCR-systeem Thermocycler, en ingesteld op aanbevolen parameters zoals aangegeven in Dual gelabelde probes miRNA bepalingsmethode. Start de run. Dit cDNA genereren. Merk op dat de cDNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende ten minste 1 week.
    4. Terwijl de RT-reactie wordt uitgevoerd, nemen de DLP-LDA platen en laat het op kamertemperatuur. Elke array plaat bevat 384 putten die uniek miRNA primers en controle primers bevatten.
    5. Take 6 pi van de cDNA (van 5.2.3) en plaats in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 450 ul van de Dual gelabelde probes 2x Universal PCR Master mix en voeg 444 ul RNase-vrij water.
    6. Omkeren buis ongeveer zes keer om de inhoud, en centrifugeer kort mengen.
    7. Wanneer de DLP-LDA plaat kamertemperatuur, belasting 100 ul heeft bereikt in elk van de acht 'Fill poort' van de plaat. Dan, centrifuge de array plaat.
    8. Open de qRT-PCR-systeem en controleer of het blok is dat voor de 384-wells plaat. Opgezet run met de SDS software. Selecteer relatieve kwantificatie (Ct), selecteert u het goed aantal en type array, en voer monster beschrijving om putten te definiëren.
    9. Run array met behulp van de standaard thermische cycli voorwaarden. Wanneer run is voltooid, de resultaten en de uitvoer op te slaan in MS Excel en op te slaan voor verdere analyse met behulp van de ΔΔCT formule (stap 4.3).

6. Bevestiging van miRNA verordeningen gebruik van afzonderlijkeqPCR Analyse

  1. Cyaninekleurstof qPCR analyse
    1. Ontwerp primers voor de gewenste miRNA analyse. Volgorde van de volwassen miRNA, die de voorwaartse primer gelijk, kan worden verkregen bij mirbase.org 14. Zet alle 'U' aan 'T'.
    2. Bereid cDNA: Neem 1 pg totaal RNA en plaats in een 1,5 ml centrifugebuis. Volg de instructies voor polyA staart en de eerste streng cDNA synthese van miRNA uit een miRNA eerste streng cDNA Synthese en qRT-PCR-protocol. Verdun de resulterende cDNA (01:10) en bewaar bij -20 ° C.
    3. Verkrijgen van een 96-well reactie plaat.
    4. Voor elke miRNA qPCR reactie well 16 ng polyA cDNA (uit stap 6.1.2), 2 pmol van elk van de specifieke voorwaartse primer (uit stap 6.1.1) en de universele primer (uit de set van stap 6.1.2 ), en 5 ul van 2x qPCR master mix. Uiteindelijk reactievolume is 10 ul / putje.
    5. Zorg ervoor dat er putjes in drievoud voor elk monster voor elke miRNA (voor technische herhalingen). OokZorg ervoor dat een referentie-gen (meestal U6 snRNA) is inbegrepen.
    6. Op de qRT-PCR-systeem software, wijst de verslaggever en doel, voer reactie volume, selecteert u de vergelijkende drempelcyclus (ΔΔCT) methode en definieer monsterputjes.
    7. Run platen met de standaardinstellingen voor de run. Zorg ervoor dat u smeltcurveanalyse uit te voeren voor alle cyaninekleurstof runs. Elke smeltcurve moet slechts een specifieke piek tonen de amplificatie van een specifiek fragment bevestigen. Indien meer dan een piek of geen duidelijke piek wordt waargenomen, de primers zijn niet specifiek en de gegevens kunnen niet worden gebruikt.
    8. Resultaten na run, en exporteren van gegevens (met name de CT-waarden naar MS Excel) besparen.
  2. Dual gelabelde probes qPCR analyse
    1. Neem 10 ng elk totaal RNA, elk in een volume van 5 pl en plaats in 0,2 ml microcentrifugebuis.
    2. Volg de instructies van het protocol betreffende de uitvoering van de reverse transcriptie (RT) met behulp van de Dual gelabelde probes MicroRNA reverse transcriptase Kit 15. Elke totale reactie volume moet 15 pl. Merk op dat voor de Dual gelabelde probes RT reacties, zijn er specifieke primers voor elke miRNA te bestuderen.
    3. Plaats reageerbuisje in het PCR-systeem thermocycler en parameters volgens het protocol aangegeven in stap 6.2.2 hierboven. Start de run. Het duurt ongeveer 70-80 minuten duren.
    4. Na de RT-reactie Verdun het monster cDNA in een 01:05 verhouding, en slaan al cDNA in het donker bij -20 ° C.
    5. Verkrijgen van een 96-well reactie plaat.
    6. Voor elke miRNA qPCR reactie goed, voeg de volgende: 10 pl Dual gelabelde probes 2x Universal PCR Master Mix (zelfde reagens als stap 5.2.5), 7,67 pl RNase-vrij water, 1 ui van 20 × real-time analyse primer (specifiek voor elk miRNA) en 1,33 gl van het cDNA van stap 6.2.4. Dit moet een 20 pl uiteindelijk reactievolume zijn. Meng de inhoud zachtjes, en centrifugeer kort.
    7. Zorg ervoor dat eere zijn drievoudige putjes voor elk monster voor elke miRNA (voor technische herhalingen). Zorg er ook voor dat een referentie-gen (meestal U6 snRNA) is inbegrepen.
    8. Op de qRT-PCR-systeem software, wijst de verslaggever (FAM) en quencher (NFQ-MGB) voor elke miRNA (doel) van belang, voert reactie volume, selecteert u de vergelijkende drempelcyclus (ΔΔCt) methode en definieer monsterputjes.
    9. Volg de instructies voor het instellen van de parameters voor de qPCR uitgevoerd vanaf de Dual gelabelde probes microRNA assay protocol. Start vervolgens de run. Resultaten na run, en exporteren van gegevens (met name de CT-waarden naar MS Excel) besparen.

Representative Results

Een overzicht van de benadering wordt getoond in Figuur 1 en een vergelijking van de verschillende monster preparaten en nucleïnezuur aanpassingen voor elke techniek wordt gevisualiseerd in figuur 2.

De toestand en de omgeving van de cellen vóór behandeling met een hormoon is van belang om de feitelijke werking van het hormoon 16. Sommige medium en serum groeifactoren die invloed kan hebben, zodat cellen serum onthouden dat alle hormonale effecten zijn tot een minimum beperkt. Vandaar dat, wanneer behandeling met E2, er meer zekerheid dat de waargenomen effecten E2-geassocieerde. Een belangrijke factor is de samenvloeiing van de cellen, die cel-cel contact en gedrag, zoals cel-cel signalering en proliferatie beïnvloedt. Men liet de cellen 80% samenvloeiing (figuur 3A) en goed aanliggend groei mogelijk te maken en verlies van cellen tijdens daaropvolgend wassen en media ch voorkomenange.

De omstandigheden tijdens de RNA-extractie en opslag van belang voor de kwaliteit van RNA en daaropvolgende analyse. Het is ook bekend dat het aantal cellen, de extractiemethode en het GC-gehalte van het miRNA de opbrengst en kwaliteit van zowel mRNA en miRNAs 17 kunnen beïnvloeden. Derhalve is het noodzakelijk om RNA-extractie uit te voeren tijdens RNase-vrije omstandigheden en de kwaliteit van het RNA controleren alvorens experimenten. Na extractie van het RNA kwantificering geeft informatie over de concentratie van het totale RNA (die zowel mRNAs en miRNAs), die observatie van de opbrengst mogelijk maakt. Het biedt ook een grafische voorstelling van de resultaten zoals getoond in figuur 3B, en dit maakt de waarneming van de zuiverheid van het monster (gewoonlijk aangeduid met piek, bovenste paneel). Slechte resultaten van RNA zou geen specifieke absorptie te produceren bij 260 nm (Figuur 3B, onderste paneel). Om te bepalen of de RNA hoge kwaliteit, RNAintegriteit werd gemeten. Een RNA integriteit nummer (RIN) van tussen de 9-10 zorgt ervoor dat de RNA is niet afgebroken en is van optimale kwaliteit. Ook moet de grafische weergave van het RNA worden waargenomen, en de 18S en 28S rRNA moeten pieken zoals getoond in figuur 4 (middelste paneel). Vergelijking met de ladder (figuur 4, bovenste paneel) geeft de grootte van de pieken. Een gedegradeerde RNA zou hebben minder duidelijke pieken en een verminderde relatieve hoeveelheid van de 18S en 28S rRNA (figuur 4, onderste paneel). De fractie van kleine RNA's kunnen verder worden gewaarborgd via de Agilent Small RNA Kit. Het wordt aanbevolen om oestrogeenresponse valideren na de behandeling, onder de gespecificeerde experimentele omstandigheden, alvorens tot miRNA screening. Een qPCR kan worden uitgevoerd op een bekende ER target-gen, zoals PS2 of SPINK4 18, met behulp van cDNA template. Dergelijke genen worden gewoonlijk gereguleerd binnen 1-24 uur na E2 behandeling. Wanneer de kwaliteit van het RNA en de oestrogeenresponseis beoordeeld, verder experiment kan worden uitgevoerd.

Microarray is nog steeds een veel gebruikte techniek voor grootschalige screening op miRNA expressie in cellen. Bijvoorbeeld, de miRNA microarray keer gebruikt bevatte 894 volwassen miRNAs en 50 controles unieke probes in vierlingen 1. Hybridisaties werden uitgevoerd in duplo met kleurstof swap procedure. De miRNA microarray resultaten worden meestal grafisch weergegeven door heat maps. Figuur 5A toont een heat map, die gegevens van een miRNA microarray vergelijking tussen het voertuig en E2 behandelde monsters. De rode geeft aan dat de miRNA wordt opgereguleerd in de E2-behandelde monster (hogere expressie), terwijl de groene aangegeven downregulatie van de miRNA (lagere expressie). De miRNA selectie hangt meestal af van hun betekenis in expressie, en meestal een p-waarde van minder dan 0,05 wordt als significant beschouwd. De miRNAs die aangegeven verschillend tot expressie moet verder worden gevalideerd wet qPCR, om ze te onderscheiden van valse positieven.

De DLP-LDA matrix, anderzijds, gebruikt een qPCR-gebaseerde werkwijze voor het screenen op gereguleerde miRNAs in 384 putjes. Meestal twee 384 putjes (kaarten) worden voorzien, zwembaden A en B. Pool A bevat meestal te karakteriseren en sterk tot expressie miRNAs dan het zwembad B. Het relatieve niveau van elke miRNA bepaald door qPCR, waarbij een miRNA wordt geanalyseerd per goed (Figuur 5B). Een hogere Ct-waarde geeft minder miRNA expressie. Net als de miRNA microarray, behaalde resultaten van de DLP-LDA verder moeten worden gevalideerd om de nauwkeurigheid te garanderen.

Validaties kan worden uitgevoerd met behulp van qPCR. Hier worden twee qPCR detectiemethoden beschreven methode vertekening te voorkomen en te zorgen voor een grondige bevestiging en het onderzoek van miRNA regelgeving. De Cyanine-dye-gebaseerde detectie chemie werkt anders dan DLP dat de DLP-LDA profilering is gebaseerd op, en is geschikt voor het bevestigenatie doeleinden. Het kan minder specifiek als het detecteert alle geamplificeerde dubbelstrengs DNA, maar de homogeniteit van het monster kan worden bepaald door het uitvoeren van een smeltcurve analyse. Figuur 6A (linker paneel) toont de smeltcurve analyse van een miRNA en een duidelijk omschreven uniforme piek te zien. Meerdere pieken waargenomen zou worden indien de primer is niet-specifieke of aanzienlijke hoeveelheden primer-dimeer wordt gevormd (figuur 6A, rechter paneel). DLP miRNA assays anderzijds, meer specifiek alleen amplificatie van de doelwit miRNA wordt gedetecteerd. Versterking percelen van elk doel miRNA kan worden waargenomen, zoals geïllustreerd in figuur 6B. De mogelijkheid om te controleren voor het optreden van meerdere amplificatieproducten met de smeltcurve analyse is echter niet beschikbaar deze chemie en Cyanine kleurstof qPCR goedkoper. Cyaninekleurstof en DLP qPCR assays kan soms gegenereerd iets andere resultaten. Voor beide qPCR assays, vergeleken met een reference gen moet de relatieve expressie van genen tussen twee monsters te bepalen. De referentie-gen, ook wel huishoud-gen, zou een gen waarvan de expressie niet veranderd en die wordt uitgedrukt op hetzelfde niveau als het gen van belang. Een voorbeeld van een geschikte referentie-gen in deze borstkanker cellijnen is ARHGDIA, een Rho BBP-Dissociation Inhibitor dat het BBP / GTP uitwisseling reacties van de Rho-eiwitten functioneert. Zoals in Figuur 6C (boven), wordt het mRNA niveau ARHGDIA niet veranderd tussen het voertuig en de ligand behandelde monsters. De 18S rRNA kan worden gebruikt, hoewel de hoge expressie vereist een aparte 1:500 verdunning van het cDNA voorraad en is daarom minder geschikt. Voor miRNA analyse, is er nog een debat over een goed gedefinieerde referentie-gen. Tot nu toe, de U6 snRNA is een referentie-gen dat breed wordt geaccepteerd voor miRNA analyse. U6 snRNA is de ~ 110 nucleotide lange, niet-coderende kleine nucleaire RNA die functioneren in de nucleaire pre-mRNA splicing 19. Zoals in Figuur 6C (bodem), U6 expressieniveaus zijn ongeveer hetzelfde in alle getoonde monsters, waardoor voor de berekeningen van de variabele niveaus van miRNA. Een grafische voorstelling van een miRNA qPCR resultaat een vergelijking tussen het voertuig en E2-behandelde cellen die werden genormaliseerd op het referentievlak U6 kan worden waargenomen in figuur 6D. Dit illustreert een miRNA die werden gedetecteerd als niet gereguleerd na 24 uur E2 behandeling, maar die ER-chromatine bindingsplaatsen dicht bij zijn genomische locatie herbergt, en de analyse van tijdreeksen van een significante regulering 72 uur na de behandeling.

Figuur 1
Figuur 1. Een overzicht van de aanpak gebruikt voor de detectie van de hormonale regulatie van miRNA in borstkankercellen.

Figuur 2
Figuur 2. Vergelijking van de verschillende monster voorbereidingen en nucleïnezuur manipulaties voor elke miRNA detectietechniek. (A) miRNA microarray met behulp van de μParaflo technologie methode omvat verrijking, poly-A-tailing en ligatie etikettering. (B) DLP-technologie monstervoorbereiding en detectiemethode omvat een gebogen cDNA synthese primer die zich na de denaturatiestap en zorgt voor een langere fragment herbergt de reverse primer en probe-sequentie. (C) cyaninekleurstof technologie monstervoorbereidingen detectiemethode bijvoorbeeld poly A-staart, en cDNA-synthese met oligo-dT-primers met een algemene 5 'sequentie.

Figuur 3
Figuur 3. Celcultuur en RNA-extractie. (A) Gekweekte cellen illustreren 80% confluentie nodig vóór behandeling met ligand. (B) Grafische weergave van RNA-concentratie en zuiverheid na extractie. Elke piek staat voor een monster en een succesvolle extractieproces levert pure RNA (bovenste paneel). Een slecht geëxtraheerde RNA toont geen duidelijke absorptie piek bij 260 nm (onderste paneel).

Figuur 4
Figuur 4. & #160; RNA kwaliteitscontrole Resultaten van RNA integriteit analyse toont grafische weergave voor de ladder (boven), een goede kwaliteit RNA (midden) en een afgebroken RNA-monster (onder)..

Figuur 5
Figuur 5. Een illustratie van miRNA profilering resultaten. (A) Een heat map representatie van miRNA microarray resultaten voor differentieel tot expressie miRNAs. miR-A, B, C worden opgereguleerd in de E2-behandelde monster zoals aangegeven in rood, terwijl miR-D, E, F, G worden downregulated in de E2-behandelde monster zoals aangegeven in groen. (B) Amplification percelen voor elk miRNA van de DLP-LDA resultaten. miRNA gedetecteerd worden versterkt zoals door verhoging van de Rn waarde.

Figuur 6 Figuur 6. qPCR analyse van miRNA regelgeving. (A) smeltcurve analyse voor miRNA geanalyseerd met Cyanine kleurstof detectie toont homogeniteit van alle geteste monsters (links) en amplificatie van meerdere fragmenten (rechts). (B) Amplification percelen voor elk monster een miRNA. Dit kan zowel uit Cyanine kleurstof of DLP detectiemethoden. (C) Staafdiagram weergave geschikte referentie genen voor mRNA analyse ARHGDIA (boven) en miRNA analyse U6 snRNA (onder) toont geen significante differentiële expressie tussen monsters. (D) miRNA qPCR resultaten om een vergelijking van de relatieve expressie niveaus van miR-135a illustreren over een tijdsverloop. is Figuur 6D herdrukt van Katchy et al.. 1 met toestemming van Elsevier. Waarden zijn meestal het gemiddelde van de afzonderlijke expertiseiments (biologische duplicaten) ± SD. Student's t-test wordt gebruikt om significantie tonen: * p <0,05.

Discussion

Bepaling het mechanisme voor hormonale regulatie van miRNA in borstkankercellen een platform voor het begrijpen van deze ziekte en kunnen potentiële behandeling voor borstkanker geven. Het kweken van deze cellen om de optimale conditie voor hormoonwerking voorzien is heel belangrijk. Hier is een protocol dat ervoor zorgt dat het hormoon van belang (oestrogeen) werd uitgesloten voordat de behandeling en dat een optimale dosering van E2 werd gebruikt voor een geschikt moment tijdens de behandeling beschreven. Andere hormonale en groeifactoren effecten werden minimaal gehouden door geleidelijke vermindering van de serum niveaus en met DCC-FBS, die FBS die zijn ontdaan van de meeste hormonen, cytokinen en groeifactoren. Fenolrood-vrij medium werd verder gebruikt om andere nonhormonal te minimaliseren, aangezien fenolrood is gemeld oestrogene activiteit en invloed bepaalde functies in cellijnen 20,21. De tijd van blootstelling van de cellen aan het hormoon van groot belang. Voor-oestrogeen verbonden regulatie van genen, is eerder aangetoond dat 24-hrexposure produceren significante respons van direct doelwit genen in borstkankercellen 1,18. Aangezien miRNAs worden getranscribeerd door RNA polymerase II, zoals mRNA, is het denkbaar dat dit een geschikt tijdstip om directe regulering ook van miRNAs te detecteren. Het moet nog bepaald worden of en hoe deze miRNAs invloed op de expressie van deze bekende ER doelen in borstkankercellen.

miRNA expressie profilering kan een uitdaging zijn vanwege de relatief geringe omvang van de miRNA, het feit dat de volwassen miRNA-sequentie kan ook worden gevonden in de pri-miRNA en de pre-miRNA, en vanwege heterogeniteit in hun GC-gehalte 22. Verschillende technieken en chemische profilering zijn gebruikt om dit probleem te overwinnen. Onder deze zijn verschillende benaderingen van microarray en qPCR analyse (figuur 2). Hoewel microarray algemeen wordt aanvaard voor hele genoom analelyse, het kan valse negatieven bieden en er bestaan ​​verschillen tussen de beschikbare platformen, variërend van de chemie aan de printtechnologie 23. Ook het normalisatieproces een uitdaging bij de analyse van de relatief weinig miRNA genen, die worden gerekend in duizenden opzichte van tienduizenden mRNA transcripten. qPCR, daarentegen, is gevoeliger en beter toegepast wanneer minder genen worden beschouwd. Wanneer uitgevoerd in grote platen met 384 putjes, met slechts een technische repliceren per plaat, moeten meerdere platen worden geanalyseerd voor elk monster die de analyse kostbaar maakt. Ook, in onze handen, veel meer valse negatieve resultaten werden verkregen met de DLP-LDA analyse vergeleken met de microarray. Aangezien de rijpe miRNA sequentie aanwezig in de pri-miRNA en de pre-miRNA sequenties, is het van belang onderscheid te maken tussen deze transcripten met behulp van PCR-technieken 24. DLP sondes zijn ook beschikbaar voor pre-miRNAs, en specifieke primers kunnen worden ontworpen om verschillende rijpe of precursor varianten met Cyanine kleurstof qPCR technologie uitsluiten.

qPCR is een gouden standaard voor de validatie van differentiële expressie van profiling resultaten. De effectiviteit van de qPCR is echter afhankelijk van verschillende parameters waaronder RNA extractie RNA integriteit (kwaliteit), cDNA-synthese primer ontwerp, detectiewerkwijze (chemie), en de referentie-gen voor gegevensnormalisatie 1,22,25. De opties voor primer ontwerp voor miRNA analyse is zeer beperkt, aangezien de korte miRNA reekslengte geen ruimte te geven voor veel alternatieve primer ontwerp, en slechts een primer kan worden gekoesterd in deze korte reeks. Vandaar de nood aan alternatieve manipulaties zoals geïllustreerd in figuur 2. Technische herhalingen zijn belangrijk voor robuustheid van de amplificatie werkwijze en het toegepaste proces valideren. Biologische herhalingen nodig zijn voor een weergave van de algemene biologische variation, inclusief variabele reactie op behandeling ligand, en tonen dat effecten waargenomen in een cel reproduceerbaar. Gebaseerd op onze ervaring, kunnen variaties in miRNA expressie tussen celculturen optreden. Meestal zijn deze verschillen minder dan 1,3-maal, en het gemiddelde van de waarden en de bijbehorende SD identificeert de natuurlijke en technologische variatie. Deze variatie kan resulteren uit verscheidene factoren, waaronder, celdichtheid en dat celfuncties kunnen veranderen van passage tot passage. Statistisch significante aanduidingen die voortkomen uit ligand behandeling identificeren, een algemeen aanvaarde betekenis is wanneer de p-waarde minder dan 0,05. Hier zijn een student t-test op biologische en technische replicaten met de tweezijdige distributie en twee steekproeven ongelijke variantie parameters gebruikt. Andere t-testparameters bestaan, en de keuze hangt af van de experimentele opstelling 26.

Een gedetailleerd protocol bij het evalueren van de hormonale regeling van volwassen miRNA in borstkankercellen is verstrekt. Belangrijke technologieën en chemie in profilering en valideren van deze miRNA uitdrukkingen zijn duidelijk uitgelegd. De gekozen voor studies van miRNA in borstkankercellen technologie hangt uiteindelijk af van wat er precies wordt onderzocht.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor Dr Xiaolian Gao, Universiteit van Houston, voor het verstrekken van advies aan de LC Sciences miRNA microarray platform, Dr Karin Edvardsson, Karolinska Institute, Zweden, en Dr Eylem Aydogdu, Universiteit van Houston, voor hun miRNA deskundigheid delen . Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health Award onder nummer R01CA172437. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Texas Emerging Technology Fund, onder de Overeenkomst niet. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  3. Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).
  4. Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).
  5. Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).
  6. Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).
  7. Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).
  8. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).
  9. Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).
  10. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  11. Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).
  12. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  13. Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
  14. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
  15. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  16. Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  18. Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).
  19. Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1 (1), 46-54 (1995).
  20. Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).
  21. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).
  22. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  23. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  24. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32 (4), e43 (2004).
  25. Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
  26. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).

Tags

Geneeskunde borstkanker microRNA oestrogeen oestrogeen-receptor microarray qPCR
Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katchy, A., Williams, C. Profiling… More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter