Summary
Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.
Abstract
O estrogênio desempenha um papel vital no desenvolvimento da glândula mamária e progressão do câncer de mama. Ele medeia a sua função pela ligação e ativação dos receptores de estrogênio (ERS), ERa e RpE. ERa é freqüentemente regulada no câncer de mama e impulsiona a proliferação de células de câncer de mama. Os ERs funcionar como fatores de transcrição e regulam a expressão do gene. Considerando que o Regulamento do ERa de genes codificadores de proteínas está bem estabelecida, sua regulamentação não codificante de microRNA (miRNA) é menos explorado. miRNAs desempenham um papel importante na regulação pós-transcricional de genes, inibindo a sua tradução ou a degradação de ARNm sua. miRNAs pode funcionar como oncogenes ou supressores de tumor e também são promissores biomarcadores. Entre os ensaios miRNA disponíveis, microarray e em tempo real PCR quantitativo (qPCR) têm sido amplamente utilizados para detectar e quantificar os níveis de miRNA. Para identificar os miRNAs regulamentados pela sinalização estrogênio no câncer de mama, thexpressão eir em linhagens de células de câncer de mama ERa-positivas foram comparados antes e depois de estrogênio-ativação usando tanto os microarrays μParaflo-microfluídicos e Dual-sondas marcadas baixas matrizes densidade. Os resultados foram validados usando ensaios qPCR específicas, aplicando-se tanto Cyanine corante à base e Dual rotulada química baseada em Sondas. Além disso, um ensaio de ponto de tempo foi usado para identificar os regulamentos ao longo do tempo. Vantagens da abordagem ensaio miRNA utilizado neste estudo é que ele permite uma triagem rápida de regulamentos maduro miRNA em inúmeras amostras, mesmo com quantidades de amostras limitadas. O layout, incluindo as condições específicas para a cultura de células e tratamento com estrógeno, repetições biológicos e técnicos, e de triagem em larga escala seguido de confirmações em profundidade usando técnicas distintas, garante uma detecção robusta de regulamentos miRNA e elimina falsos positivos e outros artefatos. No entanto, os miRNAs mutantes ou desconhecidos, ou regulamentos no leve transcrito primário e precursorl, não irá ser detectado. O método aqui apresentado representa uma investigação aprofundada da regulamentação miRNA mediada por estrogênio.
Introduction
O estrogênio é um hormônio que é importante durante o desenvolvimento da glândula mamária. O estrogênio também desempenha um papel importante no desenvolvimento, manutenção, risco e tratamento do câncer de mama 1. O estrogênio exerce sua função através da ligação a ERs, que são fatores de transcrição e regulam genes-alvo específicos. Das duas variantes do receptor, ERa é essencial para a proliferação dependente de estrogénio das células do cancro da mama. A maioria dos cânceres de mama são ERa positivo e depende de estrogênio para o crescimento. Isso fez com que a sinalização estrogênio e ERa um alvo para o tratamento in-receptor de hormônio de câncer de mama positivo. Compreender o mecanismo subjacente de ERa é importante para melhorar os resultados do tratamento, superar a resistência ao tratamento, e entender como o câncer de mama se desenvolve.
miRNAs desempenham papéis críticos em funções celulares devido ao seu grande impacto na regulação gênica pós-transcricional. miRNAs são 19-24 nucleotídeos curto, de cadeia única, Não codificante RNAs que são primeiro transcritos pela RNA polimerase II em transcrições primárias miRNA (pri-miRNA). Eles são processados no núcleo por Drosha em precursoras-miRNAs curtas de gancho (pré-miRNA) e em seguida processada por Dicer e separadas em cadeias individuais para formar miRNAs maduras no citoplasma. O single-stranded miRNAs maduros são transferidos para as proteínas Argonaute para formar complexo RISC. Em seguida, os miRNAs pode hibridar com as regiões 3 'não traduzidas (3'-UTR) de um ARNm alvo, levando a regulação pós-transcricional, bloqueando a tradução ou a degradação do mRNA-alvo 2.
Devido ao importante papel que estrogênio e miRNAs desempenham na progressão do tumor, identificando miRNAs associados sinalização normal ou interrompido o estrogênio é importante para melhorar a nossa compreensão do desenvolvimento e melhorar o tratamento do câncer de mama. Embora haja uma boa compreensão de como ERa regula genes codificadores de proteínas, a extensãoe detalhes de não-codificante regulamentos RNA continua a ser minuciosamente investigadas. Os estudos iniciais com o objetivo de elucidar ERa regulação do miRNA em linhas de células de câncer de mama tiveram resultados conflitantes, mesmo quando a mesma linhagem de células foi analisado 3-6. Isto pode ser um resultado de tratamentos diferentes, variações biológicas, a utilização de técnicas diferentes, e ao facto de o pequeno tamanho destes pequenos RNAs torná-los difíceis de analisar. Aqui, um protocolo que controla as variações do método e artefactos é descrito.
Para identificar quais miRNAs são regulados pelo estrogênio, o perfil de um modelo de câncer de mama bem definida de atividade ERa é um primeiro passo. Várias linhas de células foram geradas a partir de tumores da mama humanos ERa-positiva, que são dependentes de estrogénio parecido com a maioria dos cancros da mama clínicos. As propriedades moleculares de duas destas linhas de células, T47D e MCF7, incluindo a expressão de ERa e seu alvo a jusante,o receptor da hormona progesterona (PR), a falta de expressão do receptor da membrana de HER2, juntamente com a expressão de genes de diferenciação de resposta ao estrogénio e luminais-epitelial, torná-los adequados como modelos para o subtipo luminal dos tumores mamários 7-10. 17β-estradiol (E2) é a forma predominante de estrogénio, e as concentrações e os pontos de tempo para a activação da transcrição óptima de ERa foram caracterizados em vários estudos. Neste protocolo 10 nM tratamento E2 por 24 horas é usado e T47D e MCF7 como modelos para a atividade ERa em células de câncer de mama 1. Além disso, os regulamentos miRNA tempo-dependentes podem ser especificamente analisados em um intervalo de tempo de por exemplo 1-72 horas.
Em segundo lugar, analisando miRNA tem desafios diferentes, em parte devido aos seus tamanhos curtos. miRNAs não são bem retidos na preparação de ARN total, quando guanidina thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol precipitações RNA regulares são realizados, ou quando rpurificações coluna Andard são utilizados. Precauções especiais devem ser tomadas para manter ou enriquecer para a menor fração de RNAs. Aumentando o volume de isopropanol, baixando a temperatura antes da centrifugação (-80 ° C), e omitindo a lavagem com etanol a 70%, a retenção destes pequenos RNAs pode ser aumentada durante a precipitação. Ou, as colunas e os tampões específicos para uma preparação de ARN total contendo miARN de alta qualidade e robusto pode ser utilizado. Também para a própria análise, seus tamanhos curtos criar desafios. Para a seleção de miRNA de todo o genoma, há três miRNA comuns técnicas para escolher de perfil: microarrays, qPCR, e sequenciamento de última geração. Cada técnica pode ser realizada utilizando várias plataformas diferentes, e são necessárias diferentes preparações de amostra, cada uma com diferentes riscos da introdução de artefactos. Em miRNA microarray, um slide é manchado ou sintetizado com milhares de oligonucleotídeos. Estes oligonucleótidos são usados como sondas, e cada um de a sondas é desenhado para hibridar com uma sequência de miARN particular. A preparação de amostras para microarrays, como realizado neste estudo, o primeiro enriquece para miRNAs e depois introduz Cy5 e Cy3 rotulagem para os miRNAs. Microarray dá a oportunidade para observar os níveis de expressão relativa de um grande número de genes em simultâneo, é rápido e adequado para o rastreio de grande número de amostras, mas só pode analisar as sequências presentes no micro-arranjo e por exemplo não detectar alterações na desconhecido ou mutado miRNAs. Análise Microarray como realizado neste protocolo também requer quantidades relativamente grandes, cerca de 5 mg, de RNA total por amostra para análise. Baixa densidade qPCR miARN perfis requer menos material (700 ng / amostra e replicar), e permite a detecção e quantificação de miRNAs. Níveis de transcrição podem ser determinados, e a quantidade pode ser um valor absoluto ou um valor relativo. análise qPCR primeiro requer a conversão de miRNA em cDNA, aqui usando um loopprimer para cada miRNA específicas que garantam a análise de apenas amadurecer miRNA. Isto gera um modelo já que pode ser amplificado utilizando um iniciador de sentido directo específicos de miARN e um iniciador inverso universal complementar para a sequência loop, e podem abrigar a inserção de uma sonda dupla etiquetado para especificidade. qPCR pode ser utilizado num formato de baixa densidade em que centenas de miRNAs pode ser detectado em paralelo utilizando uma ou várias placas de 384 poços com os pares de iniciadores individuais em cada poço 11. Sequenciação da próxima geração, por outro lado, é a única destas técnicas que permite para a descoberta de novos, miRNAs mutadas ou modificadas, como todos os ARN de uma amostra pode ser sequenciado 11. Esta técnica, contudo, requer várias etapas para enriquecer pequenos RNAs e produzem uma pequena biblioteca de ARN utilizando várias etapas de ligaduras ligantes e purificações com riscos subsequentes melhoradas de modular os níveis de expressão relativa entre amostras. Também requer bioinformati significativasanálise cs. Dadas as diversas técnicas de miARN perfis, a técnica mais apropriada depende das aplicações. Microarrays são mais adequados quando o material é relativamente abundante e os juros é definir expressão diferencial de miRNAs já conhecidos. Baixa densidade matrizes qPCR são os mais adequados quando uma quantidade limitada de amostra está disponível e uma maior sensibilidade destes pequenos RNAs de baixa expressa é necessário. A sequenciação é mais apropriado quando é necessária a análise de miRNAs desconhecidas, mutantes ou isoformas diferentes de um miARN.
No estudo dos miRNAs regulados por estrogénios em câncer de mama, duas células de linhas de modelo são usadas, T47D e MCF7, onde grandes quantidades de RNA estão prontamente disponíveis. Cada linha celular foi analisada em culturas de células replicadas, utilizando diferentes passagens, cada uma em repetições técnicas de tratamento. Isto permite a detecção robusta de reprodutível, miRNAs ERa regulamentados. Relativos níveis de expressão de miRNA foram comparados usando tanto microarray miRNA eSondas marcadas duplas - matrizes de baixa densidade (DLP-LDA) e validou os resultados com qPCR específico usando tanto corante Cyanine e químicas de DLP. regulamentos miRNA foram, então, analisados em séries temporais para definir sua regulamentação exata ao longo do tempo, o que pode ajudar a diferenciar variações aleatórias ou circadianos dos regulamentos induzida pelo estrógeno, e indicar efeitos primários de efeitos secundários. Comparações Bioinformatical com estudos de ligação da cromatina de ERa pode auxiliar ainda mais na diferenciação do ensino primário contra efeitos secundários. O ensaio resultou em uma avaliação fiável dos regulamentos miRNA onde poderia ser estabelecido que, após tratamento E2 24 hr transcrições codificadores de proteínas foram prontamente regulada mas miRNAs maduros não foram afetadas 1. No entanto, é possível que os miRNAs são regulados pelo posteriores pontos temporais, como demonstrado na análise de séries temporais de miRNAs selecionados 1. Os detalhes precisam ser mais explorados eo protocolo apresentado aqui fornece uma Robust maneira de estudar regulação hormonal de miRNAs maduros em linhas celulares de cancro da mama.
Protocol
1. Preparação da Cultura Celular Mídia
- Para T47D linha celular meios de cultura:
- Misturar 500 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com F12 de 500 ml [DMEM/F12 (1:1)] em um autoclave de 1 L garrafa.
- Adicionar 50 ml de soro fetal bovino (esta faz com que 5% de FBS) e depois 10 ml de penicilina estreptomicina (esta faz com que 1% PEST). Misturar o conteúdo completo.
- Armazenar a 4 ° C.
- Para MCF7 linha celular meios de cultura:
- Misturar 500 mL de DMEM com 25 ml de FBS (5% de FBS), e, em seguida, 5 ml de penicilina estreptomicina (1% PEST).
- Armazenar a 4 ° C.
- Por meio de cultura com soro reduzido:
- Para T47D: Misturar 500 ml de fenol DMEM livre de vermelho com F12 de 500 ml (01:01) em uma autoclave de 1 L de garrafas, e adicionar 50 ml da tratados com carvão (DCC) de FBS revestido com dextrano 5% de DCC-FBS. Faça um frasco separado com 5 ml DCC-FBS para 0,5% DCC-FBS. Em seguida, adicione 10 ml de PEST (1% PEST) para cada garrafa. Misture completamente o conteúdo, armazenamentoe a 4 ° C.
- Para MCF7: Misturar 500 ml de fenol DMEM livre de vermelho com 5 ml de 100x de L-glutamina (200 mM de concentração final). Adicionar 25 ml de DCC-FBS (5% de DCC-FBS). Fazer um frasco separado com 2,5 ml de DCC-FBS (0,5% de DCC-FBS). Em seguida, adicionar 5 ml de PEST (1% PEST) para cada garrafa. Misturar o conteúdo completo, armazenar a 4 ° C.
- Para a solução salina (PBS) tamponada com fosfato:
- Encha uma garrafa de vidro de 1 L com água ultrapura autoclavada ou água destilada.
- Adicionar um comprimido PBS e agitar ocasionalmente até comprimido se dissolva.
- Autoclave solução PBS e armazenar a temperatura ambiente.
- Preparação de estoques ligante:
- Prepare uma solução estoque de 100 mM de E2 dissolvendo 2,72 mg de 17β-estradiol em 100 mL de etanol ou DMSO em um estéril de 1,5 ml tubo de microcentrífuga, e misturar o conteúdo com cuidado. Gire brevemente e fazer diluições em série (1:10) para produzir 10 mM, 1 mM e 0,1 mM estoque concentrções utilizando o solvente. Armazenar todas as soluções de ações E2 a -20 ° C.
- Prepare uma solução estoque de 100 mM de ICI dissolvendo 6,07 mg de ICI 182,780 em 100 mL EtOH ou DMSO em um estéril de 1,5 ml tubo de microcentrífuga, e misturar o conteúdo com cuidado. Girar rapidamente e fazer diluições em série (1:10) para se obter 10 mM, 1 mM, 0,1 mM, as concentrações de imagens usando o solvente. Armazenar todas as soluções de ações da ICI a -20 ° C.
- O veículo é o solvente (etanol ou DMSO). Coloque 0,5-1 ml de etanol a 100% ou DMSO num esterilizado de 1,5 mL de microcentrífuga de tubo, e armazenar a -20 ° C.
2. Cultura Celular e Tratamento
Execute cada tratamento em placas duplas ou triplas para repetições técnicas. Processo de cultura de células e tratamento repetir usando uma passagem diferente da mesma linha de células, o que serviria como uma réplica biológica desta linha celular. Repita o procedimento com uma linha de célula diferente para replicate resultados em mais de uma linha celular. Todas as técnicas de cultura celular deve ser realizado sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar.
- Cultura startup celular
- Aquece-se a media de 37 ° C em um banho de água quente estéril.
- Descongelar um frasco frozen de células T47D ou MCF-7.
- Limpe a parte externa do frasco e frasco de mídia com etanol 70%, e em seguida, coloque ambos frasco e frasco estéril em capela de fluxo laminar.
- Rotular um frasco estéril T-75 em conformidade (na capa).
- Adicionar 12-15 ml de meios adequados para o balão com uma pipeta estéril sorológica (garantir que a superfície é completamente coberto com a mídia).
- Transferir as células do frasco para o frasco, e agitar suavemente.
- Coloque balão numa incubadora a 37 ° C, fornecido com 5% de CO 2.
- Preparação das células para o tratamento
- Tome células para fora da incubadora e observar sob um microscópio para assegurar que as células são pelo menos 80% de confluent. Isso é para garantir que não existem células suficientes para experimento. Frasco Transferir para capa estéril.
- Retirar mídia de balão, utilizando uma pipeta Pasteur estéril ligada a um vácuo. Delicadamente, lave as células unidas por duas vezes com PBS.
- Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA quente para o balão, balão e colocar na incubadora por 2 min. Isto é para tornar as células separar do balão.
- Adicionam-se cerca de 3-4 ml de meio morno apropriados para o balão e triturar as células isoladas usando uma pipeta de 5 ml serológico. Tritura-se tomando-se as células na pipeta serológica e libertando as células com a ponta da pipeta colocada contra o fundo do frasco para aumentar a pressão. Isto é para quebrar as células, para além em células individuais.
- Contar as células, por exemplo, usando um contador de células, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Rotular placas de 100 mm (conforme necessário) e adicionar cerca de 10 ml de meio para as placas. Placa cerca de 2,0 x 10 6 células / placa. Distribuir células por gentle rodar as placas.
- Incubar as células por 24-48 horas, até cerca de 80% confluentes.
- Em 80% de confluência, lave as células duas vezes com PBS, e adicionar os 5% mídia DCC-FBS apropriadas. Em seguida, as células incubar durante 24 horas.
- Após 24 horas, lave as células duas vezes com PBS, e adicionar os 0,5% mídia DCC-FBS apropriadas. Em seguida, as células incubar durante 48 horas adicionais.
- Tratamento celular
- Após 48 horas, lavar as células duas vezes com PBS. Certifique-se de remover o máximo do PBS possível.
- Em um tubo de 15 ml, adicionar 10 ml de 0,5% mídia DCC-FBS apropriadas. Em seguida, adicionar 1 ml de estoque 0,1 mM de ligando (E2 ou ICI) para uma concentração final de 10 nM. Além disso, adicionar 1 ml de veículo de 10 ml de meio num tubo separado para a experiência de controlo.
- Misturar o conteúdo em tubo suavemente e adicionar às células em placa. Este deve ser um ligando por placa.
- Incubar as células para o ponto de tempo escolhido (0-72 h).
- Extração de RNA
- Depois de terminar o tratamento, para o período de tempo desejado, lavar as células duas vezes com PBS, em seguida, adicionar cerca de 1-2 ml de solução de guanidínio tiocianato-fenol para as células da placa. CUIDADO: Solução de tiocianato de fenol Guanidinium é tóxico por contato com a pele ou os olhos, por inalação ou ingestão. Usar vestuário de protecção, luvas e proteção para os olhos / face e usar coifa.
- Certifique-se de que o volume de células não é mais do que 10% do volume da solução de tiocianato de guanidínio-fenol, e que a placa está coberta com a solução e permitir a sentar-se durante 1 min. Em seguida, raspar as células com um raspador de borracha e transferir para um tubo de microcentrífuga. As células podem ser armazenadas com esta solução a -80 ° C por semana.
- Extrair e purificar o ARN total a partir de cada tratamento, utilizando o método de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidina seguido por purificação em coluna de centrifugação e ADNaseMétodo de degradação de ADN I para células animais.
- Após a extração, as células são eluídos em 60 mL livre de RNase água. Aliquota 1-2 ul de RNA para análise de quantificação e armazenamento de RNA a -80 ° C.
- Medem-se as concentrações de RNA usando um ul de RNA e aspectrophotometer. Certifique-se de que há um espaço em branco tiradas antes de qualquer medição é feita. Além disso, seque completamente o tempo alcance espectrofotômetro a medição é feita. As concentrações são geralmente mostrado em ng / mL. Salve os resultados que apresentem concentrações de RNA.
- Controle de qualidade RNA
- Tome cerca de 100 ng de RNA de cada amostra e colocar em um tubo de microcentrífuga.
- Medir a integridade do RNA usando um Bioanalyzer. Normalmente 12 amostras podem ser executados de uma só vez em um Bioanalyzer. Execute normalmente leva cerca de 25 min.
- Comparar os resultados com a escada de RNA para assegurar que o ARN é boa para a experiência. Salvar e resultados de impressão.
4. Confirmação de Treatmento: qPCR de genes codificadores de proteínas
- A síntese de cDNA
- Tome 500 ng ou 1 mg de RNA total (de cada amostra) e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Traga o volume de cada tubo até 10 ml com água RNAse-free.
- Adicionar 2 mL de 50 uM iniciadores hexâmeros aleatórios e tubos de calor a 70 ° C durante 10 min.
- Transferir para tubos de gelo durante 5 min.
- Para cada amostra, adicionar 4 mL de tampão de primeira cadeia de 5x, 1 ul de DTT 0,1 M, 1 ul de dNTPs 10 mM, 0,5 ul de sobrescrito III, e 1,5 mL de água isenta de RNase.
- Colocar os tubos em um bloco C de calor de 25 ° ou banho-maria por 10 min.
- Tubos de transferência para um bloco de aquecimento 46 ° C por 1 hora. Em seguida, os tubos de transferência de calor para um bloco de 70 ° C durante 15 minutos para parar a reacção.
- Diluir o cDNA para a / estoque mL 5 ng (calculado usando a entrada total de RNA), utilizando água RNase para diluições e armazenar a -20 ° C.
- qPCR
- Obter primers para genes de genes de interesse e de referência. Primers podem ser facilmente projetados usando a ferramenta de desenho cartilha sobre programa Primer-BLAST do NCBI 12. Isto normalmente gera um iniciador directo e inverso para cada um dos genes de interesse. Os iniciadores devem ser 18-22 pb de comprimento, tem uma temperatura de fusão de 52-58 ° C, tem um teor de GC de 40-60%, e um comprimento de fragmento amplificado de 100-180 pb.
- Para cada reacção de qPCR poço, adicionam-se 10 ng de cDNA (2 ul de estoque de concentração do passo 4.1.7), 1 pmol de cada um dos iniciadores directos e do gene de interesse reversa (a partir do passo 4.2.1), e 5 ul de 2x Cyanine corante PCR master mix. A reacção de cada poço deve ter um volume de reacção final de 10 ul.
- Certifique-se de que há três cavidades para cada amostra para cada gene (para repetições técnicas). A placa de reacção de 96 poços pode ser usado.
- No software do sistema de qRT-PCR, atribuir o repórter e alvo, insira volume de reação, selecione o comparativométodo de ciclo limiar (ΔΔCt), e define poços de amostra.
- Certifique-se de realizar a análise de curva de fusão para todos os corantes Cyanine corre para confirmar a amplificação de um fragmento específico. Execute placas usando as configurações padrão para a execução.
- Salve resultados após corrida, e os dados de exportação (em especial os valores de Ct para o MS Excel).
- A análise de dados usando a fórmula qPCR ΔΔCT
A mudança na expressão do mRNA relativa pode ser calculada como se dobra a mudança em relação ao controlo em Excel para cada amostra, utilizando os seguintes passos:- Todos os resultados exportados a partir do qPCR acima devem ter os valores Ct incluídos. Calcular o valor ΔCT usando a fórmula que se segue:
- ΔCT = CT (gene alvo) - CT (gene de referência)
- A seguir, o cálculo do desvio padrão total (SD) para cada amostra. Primeiro calcularSD para o gene de referência e, em seguida, calcular a SD para o gene alvo (isto pode ser feito em Excel usando a função Desv nos valores do CT). Em seguida, calcule o total de SD para cada amostra usando esta fórmula:
- Total SD = (SD2 (target) + SD2 (referência)) 1/2
- Calcular o ΔΔCT de cada amostra dentro de um gene de (meta) por:
- ΔΔCT = ΔΔCT (tratado amostra / ensaio) - ΔΔCT (controle / sample calibrador)
- Finalmente, calcular as fold-change (FC) valores de cada amostra, utilizando a fórmula:
- FC = 2-ΔΔCT
- O teste t de Student pode ser usado para análise estatística usando distribuição bicaudal e de duas amostras variância desigualparâmetros: (p <0,001 (***), p <0,01 (**), e P <0,05 (*)). Isto pode ser conseguido em Excel. Confirme se o tratamento resultou em regulação de alvos conhecidos antes de prosseguir com miRNA perfil.
- Todos os resultados exportados a partir do qPCR acima devem ter os valores Ct incluídos. Calcular o valor ΔCT usando a fórmula que se segue:
5. miRNA Análise Profiling
- miRNA microarray
- Tome 5 ug de RNA isolado a partir de células tratadas com veículo ou ligante, e colocar num tubo de microcentrífuga. Ajustar o volume em tubos de 20 mL. Cada comparação deve ser realizado em duplicado ou triplicado.
- Realize o microarray miRNA usando as amostras de RNA acima. perfis de expressão de miRNA microarray deve ser determinada utilizando microarray miRNA humano dual-cores amostra matriz Tecnologia Biochip μParaflo microfluídicos (Sanger miRBase Lançamento 14,0) 13.
- Os resultados devem mostrar miRNAs diferencialmente expressos. Considere expressões miRNA significativas quando p <0.05.p-valor <0,10 também pode ser considerado para uma maior coanálise nfirmatory utilizando qPCR. Salve esta lista miRNA para posterior validação com qPCR.
- miRNA profiling: DLP-LDA
- Cada amostra deve ser analisada em duplicata ou triplicata. Tomar 700 ng de RNA total a partir de células tratadas com veículo ou ligante, e colocar num tubo de microcentrífuga. Ajuste o volume no tubo de 3 mL.
- Realizar a síntese de cDNA usando o método de ensaio de sondas de miARN dupla etiquetado e os iniciadores de RT 10x. O volume total de cada reacção deve ser de 7,5 mL.
- Coloque o tubo de reação no sistema Termociclador PCR, e definir os parâmetros recomendados, conforme indicado em Dual rotulada método de ensaio Sondas miRNA. Comece a correr. Isto vai gerar ADNc. Note-se que o ADNc pode ser armazenada a -20 ° C durante pelo menos 1 semana.
- Enquanto reação RT está em execução, tirar as placas DLP-LDA e deixe descansar em temperatura ambiente. Cada placa matriz contém 384 poços que contêm primers miRNA únicas e iniciadores de controlo.
- Take 6 mL do cDNA (de 5.2.3) e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 450 mL da mistura Mestre Sondas 2x PCR Universal dupla rotulada e adicionar 444 mL de água livre de RNase.
- Inverta tubo cerca de seis vezes para misturar o conteúdo, e brevemente centrífuga.
- Quando a placa de DLP-LDA atingiu a temperatura ambiente, a carga 100 ml em cada um dos oito 'Preencher porta' da placa. Depois, centrifugar a placa de matriz.
- Abra o sistema de qRT-PCR e verificar que o bloco é que, para a placa de 384 poços. Configure de execução usando o software SDS. Selecione quantificação relativa (Ct), selecione o número bem e tipo de matriz, e entrar descrição da amostra para definir poços.
- Execute matriz usando as condições de ciclos térmicos predefinidos. Quando corrida terminar, salvar resultados e exportação para MS Excel e salvar para posterior análise usando a fórmula ΔΔCT (passo 4.3).
6. Confirmação de Regulamentos miRNA usando separadoAnálise qPCR
- Corante Cyanine análise qPCR
- Iniciadores do projeto para análise miRNA desejado. Sequência da miARN madura, que é igual ao iniciador para a frente, pode ser obtido a partir de mirbase.org 14. Converter tudo 'U' para 'T'.
- Prepare cDNA: Tome 1 mg de RNA total e colocar em um tubo de centrífuga de 1,5 ml. Siga as instruções para polyA rejeitos e síntese de cDNA da primeira cadeia de miRNA de um protocolo de cDNA Synthesis e qRT-PCR miRNA primeira vertente. Dilui-se o ADNc resultante (1:10) e armazenar a -20 ° C.
- Obter uma placa de reacção de 96 cavidades.
- Para cada reacção de miARN qPCR bem, adicionar 16 ng de poliA de cDNA (a partir do passo 6.1.2), 2 pmol de cada um dos iniciadores para a frente específico (a partir do passo 6.1.1) e com o iniciador universal (do kit a partir do passo 6.1.2 ) e 5 mL de 2x qPCR master mix. Volume final da reacção é de 10 uL / poço.
- Certifique-se de que há três cavidades para cada amostra para cada miRNA (para repetições técnicas). Também, Certifique-se de que um gene de referência (geralmente U6 snRNA) está incluído.
- No software do sistema de qRT-PCR, atribuir o repórter e alvo, insira volume de reação, selecione o ciclo limiar comparativa (ΔΔCT) método, e definir poços de amostra.
- Execute placas usando as configurações padrão para a execução. Certifique-se de realizar a análise de curva de fusão para todos os corantes Cyanine corridas. Cada curva de fusão deve apresentar apenas um pico específico para confirmar a amplificação de um fragmento específico. Se mais do que um pico ou nenhum pico claro é observada, os iniciadores não são específicas e os dados não podem ser utilizados.
- Salve resultados após corrida, e os dados de exportação (em especial os valores de Ct para o MS Excel).
- Identificada dupla análise Sondas qPCR
- Tome 10 ng de cada RNA total, cada um em um volume de 5 mL e coloque em 0,2 ml tubo de microcentrífuga.
- Siga as instruções do protocolo sobre a realização da transcrição reversa (RT), utilizando a dupla sondas marcadas MicroRNA da transcriptase reversa Kit 15. Cada volume total de reacção deve ser de 15 ul. Note-se que para as reacções de sondas RT dupla marcadas, não são específicos para cada um dos iniciadores de miARN a ser estudados.
- Colocar o tubo de reacção do sistema termociclador de PCR, e ajustar os parâmetros de acordo com o protocolo indicado no passo 6.2.2 supra. Comece a correr. Deve levar cerca de 70-80 min.
- Depois da reacção RT, diluir a amostra de cDNA numa proporção de 1:5, e de armazenar todos cDNA no escuro a -20 ° C.
- Obter uma placa de reacção de 96 cavidades.
- Para cada reação miRNA qPCR bem, adicione o seguinte: 10 ml de Sondas dupla rotuladas 2x Universal PCR Master Mix (mesmo reagente como passo 5.2.5), 7,67 ul de água livre de RNase, 1 l de 20 × tempo real ensaio cartilha (específico para cada miARN), e 1,33 mL de cDNA a partir do passo 6.2.4 supra. Este deve ser um volume de reacção final de 20 ul. Misturar o conteúdo suavemente, e centrifugar brevemente.
- Certifique-se de que poere são triplicadas poços para cada amostra para cada miRNA (para repetições técnicas). Além disso, certifique-se de que um gene de referência (geralmente U6 snRNA) está incluído.
- No software do sistema de qRT-PCR, atribuir o repórter (FAM) e supressor (QNQ-MGB) para cada miRNA (target) de interesse, entrar volume de reação, selecione o ciclo limiar comparativa (ΔΔCt) método, e definir poços de amostra.
- Siga as instruções para configurar os parâmetros para a qPCR funcionam a partir do protocolo do ensaio Sondas microRNA dupla rotulada. Em seguida, inicie a corrida. Salve resultados após corrida, e os dados de exportação (em especial os valores de Ct para o MS Excel).
Representative Results
Uma visão geral do método é apresentado na Figura 1 e uma comparação entre as várias preparações de amostras e modificações de ácidos nucleicos necessárias para cada técnica é visualizado na Figura 2.
A condição eo ambiente das células antes do tratamento com hormônio é importante para determinar os efeitos reais do hormônio 16. Alguns meio e soro contêm factores de crescimento que possam afectar os resultados, então as células são privadas de soro para garantir que todos os efeitos hormonais foram reduzidas a um mínimo. Assim, aquando do tratamento com E2, existe mais certeza de que os efeitos observados são E2-associado. Um fator importante é a confluência das células, o que influencia contato e comportamentos, como sinalização e proliferação de células célula-célula. As células foram deixadas a 80% confluentes (Figura 3A) e bem ligada para permitir o crescimento e evitar a perda de células durante a subsequente lavagem e meios de change.
As condições durante a extracção de ARN e de armazenamento são importantes para a qualidade do ARN e a análise subsequente. Sabe-se também que o número de células, o método de extracção, e o teor de GC da miARN pode afectar o rendimento e qualidade dos dois mRNAs e miRNAs 17. Assim, é necessário realizar a extracção de ARN em condições livres de RNase e para verificar a qualidade do ARN antes de continuar com as experiências. Após a extracção, a quantificação do ARN fornece informação sobre a concentração de RNA total (contendo ambos os ARNm e miRNAs), que permite a observação de rendimento. Ele também fornece uma representação gráfica dos resultados, como visto na Figura 3B, e isto permite a observação da pureza da amostra (normalmente indicado por um pico, painel superior). Pobre rendimento de RNA não produziria nenhum absorção específica a 260 nm (Figura 3B, painel inferior). Para determinar se o ARN é de alta qualidade, o ARNintegridade foi medido. Um número de integridade do RNA (NIR) de entre 9-10 garante que o ARN não é degradado e é de qualidade óptima. Além disso, a representação gráfica da ARN deve ser observada, e o 18S e 28S rRNA deve ter picos, como mostrado na Figura 4 (painel do meio). Comparação com a escada de mão (Figura 4, painel superior) identifica o tamanho dos picos. Um RNA degradado teria picos menos claras e de uma quantidade relativamente reduzida de 18S e 28S rRNA (Figura 4, painel inferior). A fração de pequenos RNAs pode ainda ser assegurada usando o Agilent RNA pequeno Kit. Recomenda-se para validar resposta de estrogénio após o tratamento, de acordo com as condições experimentais especificadas, antes de se proceder ao rastreio miARN. Um qPCR pode ser realizada em um gene alvo conhecido como ER pS2 SPINK4 ou 18, utilizando um molde de ADNc. Estes genes são normalmente regulados positivamente dentro de 1-24 horas após o tratamento com E2. Uma vez que a qualidade do RNA e a resposta de estrogéniofoi avaliada, outra experiência pode ser conduzida.
Microarray ainda é uma técnica amplamente utilizada para o rastreio em larga escala para a expressão em células de miARN. Por exemplo, o microarray miRNA uma vez utilizada continha 894 miRNAs maduros e 50 controles sondas únicas no quadrigêmeos 1. As hibridações foram realizadas em duplicados com permuta de corantes procedimento. Os resultados de microarray miRNA são geralmente representados graficamente por mapas de calor. Figura 5A mostra um mapa de calor, que representa os dados a partir de uma comparação de microarray miARN entre o veículo e E2 amostras tratadas. O vermelho indica que a miARN é regulada na amostra tratada com E2 (expressão superior), enquanto o verde indica a regulação negativa da miARN (menor expressão). A selecção miARN geralmente depende da sua importância na expressão, e geralmente um valor de p menor que 0,05 é considerado significativo. Os miRNAs que são indicados para serem diferencialmente expressos devem ser mais validada wom qPCR, para distingui-los dos falsos positivos.
A matriz DLP-LDA, por outro lado, utiliza um método baseado em qPCR para triagem de miRNAs regulamentados em um formato de 384 poços. Normalmente, duas placas de 384 poços (placas) são fornecidos, piscinas A e B. Grupo A contém normalmente mais bem caracterizada e mais altamente expresso miRNAs de piscina B. O nível relativo de cada miARN são determinados por qPCR, onde um miARN é analisada por bem (Figura 5B). A Ct-valor mais alto indica menor expressão de miRNA. Muito parecido com o microarray miRNA, os resultados alcançados a partir da DLP-LDA precisam ser mais validado para garantir a precisão.
Validações pode ser realizada utilizando qPCR. Aqui, dois métodos de detecção de qPCR são descritos para evitar tendência do método e para permitir a confirmação e investigação de regulamentos miRNA completa. O Cyanine à base de corantes detecção química funciona diferente do que DLP que o profiling DLP-LDA é baseada em, e é apropriado para confirmarfins ation. Ele pode ser menos específico que detecta todos os ADN de cadeia dupla amplificados, mas a homogeneidade da amostra pode ser avaliado através da realização de uma análise de fusão curva Figura 6A. (Painel à esquerda) mostra a análise de fusão da curva de um miARN, e um pico uniforme claramente definida pode ser visto. Vários picos seria observado se o primer é quantidades não específicas ou significativas de cartilha-dímero é formado (Figura 6A, painel direito). Ensaios de DLP miRNA, por outro lado, é mais específica que a amplificação de apenas o alvo é detectado miARN. Parcelas de amplificação de cada um dos alvos miARN pode ser observada, como exemplificado na Figura 6B. A opção de controle para a ocorrência de vários produtos de amplificação utilizando a análise da curva de fusão é, no entanto, não está disponível com esta química e corante Cianina qPCR é menos dispendioso. Tintura Cyanine e DLP qPCR ensaios podem, por vezes, gerado resultados ligeiramente diferentes. Para ambos os ensaios de qPCR, a comparação para um refecia do gene são necessários para determinar a expressão relativa de genes entre duas amostras. O gene de referência, também referido como gene de manutenção, deveria ser um gene cuja expressão não é alterado e que é expressa em níveis semelhantes aos do gene de interesse. Um exemplo de um gene de referência apropriado nestas linhas celulares de cancro da mama é ARHGDIA, um PIB de Rho-dissociação Inibidor que funciona reacções das proteínas Rho taxas de GDP / GTP. Como pode ser observado na Figura 6C (parte superior), o nível de ARNm de ARHGDIA não é alterada entre o veículo e as amostras tratadas com ligando. O ARNr 18S também pode ser usado, embora a sua expressão requer uma alta diluição 1:500 em separado da unidade de cDNA e, portanto, é menos adequada. Para a análise de miRNA, ainda há um debate sobre um gene de referência bem definida. Até agora, o U6 snRNA é um gene de referência que é amplamente aceito para análise de miRNA. U6 snRNA é o, não codificante RNA nuclear pequeno ~ 110 nucleotídeos de comprimento que funciona no nuclear spl pré-mRNAgelo 19. Como pode ser observado na Figura 6C (baixo), os níveis de expressão U6 são praticamente os mesmos em todas as amostras apresentadas, permitindo cálculos dos níveis variáveis de miRNA. Uma representação gráfica de um resultado miARN qPCR para uma comparação entre o veículo e as células tratadas com E2, que foram normalizadas para o U6 referência pode ser observado na Figura 6D. Isto ilustra um miARN que foram detectados como não reguladas após o tratamento 24 horas E2, mas que abriga os sítios de ligação da cromatina de ER perto da sua localização genómica, e análise de séries identificou a regulação significativa 72 horas após o tratamento.
Figura 1. Uma visão geral da abordagem empregada para a detecção de regulação hormonal de miRNA em células de câncer de mama.
Figura 2. A comparação das várias preparações de amostras e manipulação de ácidos nucleicos para cada técnica de detecção de miARN. (A) microarray miARN usando o método de tecnologia μParaflo inclui enriquecimento, poli-A de rejeito e rotulagem ligadura. (B) a preparação da amostra a tecnologia DLP e método de detecção inclui um cDNA de síntese iniciador anelada que se estende após o passo de desnaturação e proporciona um fragmento mais longo que alberga o preparação de amostras primer e sonda seqüência reversa. (C) a tecnologia dye Cyaninee método de detecção inclui um poli-cauda, e síntese de cDNA com uma iniciadores oligo-dT, incluindo uma sequência 5 'universal.
Figura 3. Cultura celular e extração de RNA. (A) Células cultivadas para ilustrar 80% de confluência antes do tratamento necessário com ligando. (B) representação gráfica da concentração de RNA e pureza após a extracção. Cada pico representa um exemplo de um processo de extracção e bem sucedida origina ARN puro (painel superior). A RNA extraído mal não mostra pico de absorção clara a 260 nm (painel inferior).
Figura 4. & #160; RNA controle de qualidade Os resultados da análise de integridade de RNA mostrando a representação gráfica para a escada (em cima), um RNA de boa qualidade (meio) e uma amostra de RNA degradado (baixo)..
Figura 5. Uma ilustração de miRNA resultados de perfil. (A) A representação mapa de calor de miRNA resultados de microarranjos para miRNAs diferencialmente expressos. miR-A, B, C são regulados positivamente no tratado com amostra de E2, tal como indicado no vermelho, enquanto que o miR-D, E, F, G são reprimidos na amostra tratada com E2, tal como indicado no verde. (B) Amplificação de parcelas para cada miRNA a partir dos resultados DLP-LDA. miARN detectados são amplificadas tal como indicado pelo aumento do valor Rn.
Figura 6. análise qPCR de regulamentos miRNA. (A) análise de fusão curva para um miRNA analisados usando detecção corante Cyanine, mostrando homogeneidade de todas as amostras testadas (esquerda) e amplificação de vários fragmentos (direita). (B) parcelas de amplificação para cada amostra para um miRNA. Esta pode ser tanto de corante Cianina DLP ou métodos de detecção. (C) representação em gráfico de barras de genes de referência adequados para análise de ARNm ARHGDIA (topo) e para a análise de miARN ARNnp de U6 (inferior), não apresentando expressão diferencial significativa entre as amostras (D). resultados miRNA qPCR para ilustrar a comparação dos níveis de expressão relativa de miR-135 ao longo de um curso de tempo. Figura 6D é reproduzido a partir Katchy et al. 1 com permissão de Elsevier. Os valores são geralmente a média de exper separadoiments (duplicatas biológicos) ± SD. Teste t de Student, é utilizado para demonstrar significado: * p <0,05.
Discussion
Determinar o mecanismo de regulação hormonal de miRNA em células de câncer de mama pode fornecer uma plataforma para a compreensão desta doença e pode fornecer potencial tratamento para o cancro da mama. A cultura destas células para proporcionar a condição óptima para a acção da hormona é muito importante. Aqui, um protocolo que assegura que a hormona de interesse (estrogénio) foi excluída antes do tratamento e que uma dose óptima de E2 foi utilizado durante um tempo apropriado, durante o tratamento foi descrito. Outros efeitos do factor de crescimento hormonais e foram mantidas a um mínimo através da redução gradual dos níveis séricos e usando DCC-FBS, o qual é de FBS que foram arrancados da maior parte da sua hormona, citoquinas, e factores de crescimento. Fenol mídia livre de vermelho foi ainda utilizado para minimizar outros efeitos não-hormonais, dado que o fenol vermelho foi reportado como tendo actividade estrogénica e afectar certas funções em linhas celulares de 20,21. O tempo de exposição das células à hormona é de grande importância. Para regulação associados com estrogénio de genes, tem sido mostrado previamente que 24 hrexposure produzir uma resposta significativa de genes alvos directos nas células do cancro da mama 1,18. Desde miRNAs são transcritos pela RNA polimerase II, como mRNAs, é concebível que este é um ponto de tempo adequado para detectar regulação direta também de miRNAs. É ainda a ser determinado, se e como estes miRNAs afetar a expressão dessas metas ER conhecidos em células de câncer de mama.
miARN perfil de expressão pode ser um desafio devido ao pequeno tamanho relativo da miARN, o facto de a sequência madura miARN pode ser encontrado também na pri-miARN e o pré-miARN, e por causa da heterogeneidade no seu teor de GC 22. Várias técnicas de perfilamento e químicas têm sido empregadas para superar esta dificuldade. Entre estes são diferentes abordagens de microarray e análise de qPCR (figura 2). Apesar de microarray é amplamente aceito por todo genoma analysis, pode proporcionar falsos negativos e existem diferenças entre as plataformas disponíveis, que variam a partir da química para a tecnologia de impressão 23. Além disso, o processo de normalização apresenta um desafio ao analisar os relativamente poucos genes miRNA, que são contados em milhares comparação com as dezenas de milhares de cópias de RNAm. qPCR, por outro lado, é mais sensível, e é melhor aplicada quando menos genes devem ser considerados. No entanto, quando realizado em grandes placas de 384 poços, com apenas uma réplica técnica por placa, várias placas necessitam de ser analisados para cada amostra o que torna a análise dispendiosa. Além disso, em nossas mãos, muitos resultados mais negativos falsos foram obtidos por meio da análise DLP-LDA em comparação com o microarray. Dado que a sequência de miARN madura está presente no pri-miARN e as sequências pré-miRNA, é de interesse para diferenciar entre estas transcrições que utilizam técnicas de PCR de 24. Sondas de DLP estão disponíveis também para pré-miRNAs, e spprimers ecific também pode ser projetado para excluir diferente maduro ou precursor variantes usando corante Cyanine tecnologia qPCR.
qPCR é um padrão de ouro para a validação da expressão diferencial de perfil resultados. A eficácia da qPCR, no entanto, depende de vários parâmetros, incluindo a extracção de ARN, a integridade do RNA (qualidade), a síntese de cDNA, o desenho de primers, método de detecção (química), e o gene de referência para a normalização dos dados 1,22,25. As opções para o desenho de primers para análise de miRNA é muito limitado, uma vez que o comprimento da seqüência de curto miRNA não dá muito espaço para desenho de primers alternativa, e apenas uma cartilha pode ser abrigado neste curto espaço de seqüência. Por isso, a necessidade de manipulações alternativos, como ilustrado na Figura 2. Repetições técnicas são importantes para validar a robustez do método de amplificação e do processo empregado. Réplicas biológicas são necessárias para uma representação do variatio biológica geraln, incluindo a resposta variável ao ligando de tratamento, e para mostrar que os efeitos observados em uma célula são reprodutíveis. Com base em nossa experiência, as variações na expressão de miRNA entre culturas celulares podem ocorrer. Normalmente, estas diferenças são menores do que cerca de 1,3 vezes, e a média de valores e correspondente SD identifica a variação natural e tecnológico. Esta variação pode resultar de vários factores, incluindo, a densidade celular e o facto de as funções celulares podem mudar de passagem para passagem. Para identificar estatisticamente significativas expressões resultantes do tratamento ligante, um significado amplamente aceito é quando o valor de p for menor que 0,05. Aqui, o teste t de um estudante nas repetições biológicas e técnicas que utilizam a distribuição de duas caudas e de duas amostragens parâmetros de variância desiguais têm sido utilizados. Existem outros parâmetros t-teste, ea escolha depende da configuração experimental 26.
Um protocolo detalhado para avaliar regulamentos hormonais de maduro miRNA em células de câncer de mama foi fornecido. Tecnologias importantes e química em perfis e validar essas expressões miRNA foram claramente explicados. A tecnologia escolhida para estudos de miRNA em células de câncer de mama em última análise, depende do que exatamente está sendo investigado.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos ao Dr. Xiaolian Gao, da Universidade de Houston, para prestação de consultoria para a plataforma de microarray LC Ciências miRNA, a Dr. Karin Edvardsson, Instituto Karolinska, na Suécia, e Dr. Eylem Aydogdu, da Universidade de Houston, por compartilhar seus conhecimentos miRNA . A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número R01CA172437. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health. Este trabalho também foi apoiado por subsídios do Fundo Emerging Technology Texas, no âmbito do Acordo não. 300-9-1958.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11885092 | |
| F12 | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 | |
| Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment | |
| DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| PBS tablet | Medicago, Accurate Chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
| ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML | |
| T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) | |
| T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 | |
| Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) | |
| Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 | |
| 100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 | |
| Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 | |
| Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 | |
| Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 | |
| Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 | |
| RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 | |
| Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) | |
| All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA | |
| First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate | Life Technologies | 4346906 | |
| Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 | |
| 2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 | |
| 7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 | |
| μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) | |
| DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 | |
| Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 | |
| GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 | |
| Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | |
| SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 | |
| NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 | |
| 10x DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA | |
| 20x DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |
References
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