Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Profilering af østrogen-regulerede MicroRNA i brystkræftceller

Published: February 21, 2014 doi: 10.3791/51285
Automatic Translation
1, 1
1Center for Nuclear Receptors and Cell Signaling, Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Molekylær signalering gennem både østrogen og microRNA'er er kritiske i brystkræft udvikling og vækst. Østrogen aktiverer østrogenreceptorer, som transkriptionsfaktorer. Mange transkriptionsfaktorer kan regulere ekspression af microRNA, og østrogen-regulerede microRNA kan profileres ved hjælp af forskellige storstilede teknikker.

Abstract

Østrogen spiller afgørende roller i mælkekirtlen udvikling og brystkræft progression. Det formidler sin funktion ved at binde til og aktivere østrogen-receptorer (ERS), ERa og ERβ. ERa ofte opreguleret i brystkræft og driver spredning af brystkræftceller. ERS fungerer som transkriptionsfaktorer og regulere genekspression. Betragtninger ERa regulering af protein-kodende gener er veletableret, dens regulering af noncoding microRNA (miRNA) er mindre udforsket. miRNA spiller en stor rolle i den post-transkriptionel regulering af gener, hæmme deres oversættelse eller nedværdigende deres mRNA. miRNA kan fungere som onkogener eller tumor undertrykkere og er også lovende biomarkører. Blandt de miRNA assays til rådighed, har microarray og kvantitativ real-time polymerase chain reaction (qPCR) er blevet flittigt brugt til at detektere og kvantificere miRNA niveauer. At identificere miRNA reguleret af østrogen signalering i brystkræft, their udtryk i ERa-positive brystkræft cellelinier blev sammenlignet før og efter østrogen-aktivering ved hjælp af både de μParaflo-mikrofluidenheder microarrays og Dual mærkede prober-low density arrays. Resultaterne blev valideret ved bestemte qPCR assays, anvender både cyaninfarvestof-baserede og Dual mærkede prober baseret kemi. Endvidere var en tid-punkt assay anvendes til at identificere regler over tid. Fordele ved miRNA assay fremgangsmåde, der anvendes i denne undersøgelse er, at det muliggør en hurtig screening af modne miRNA regler i talrige prøver, selv med begrænsede prøvemængde. Layoutet, herunder de særlige betingelser for cellekultur og østrogen behandling, biologiske og tekniske gentagelser, og storstilet screening efterfulgt af dybdegående bekræftelser bruger separate teknikker sikrer en robust detektion af miRNA regulativer og eliminerer falske positiver og andre artefakter. Men, muterede eller ukendte miRNA eller regulativer på de primære og forløber udskrift Level, vil ikke blive registreret. Metoden præsenteres her repræsenterer en grundig undersøgelse af østrogen-medierede miRNA regulering.

Introduction

Østrogen er et hormon, der er vigtigt i mælkekirtlen udvikling. Østrogen spiller også vigtige roller i udvikling, vedligeholdelse, risiko, og behandling af brystkræft 1. Østrogen udøver sin funktion ved at binde til ERS, som er transkriptionsfaktorer og regulerer specifikke target gener. Af de to receptor-varianter, ERa er afgørende for østrogen-afhængige proliferation af brystcancerceller. De fleste brystkræft er ERa-positive og afhænger af østrogen for vækst. Det har gjort østrogen signalering og ERa et mål for behandling i hormon-receptor positiv brystkræft. Er vigtigt at forstå den underliggende mekanisme af ERa at forbedre behandlingsresultater, overvinde modstand mod behandling, og forstå, hvordan brystkræft udvikler sig.

miRNA spiller afgørende roller i celle funktioner på grund af deres større indvirkning på posttranskriptionel genregulering. miRNA er 19-24 nukleotider korte, enkeltstrengede, Noncoding RNA, der først transskriberet af RNA-polymerase II i primære miRNA udskrifter (pri-miRNA). De behandles i kernen af ​​drosha i korte hårnål precursor-miRNA (pre-miRNA) og derefter behandles af Dicer og opdelt i enkelt-strenge til at danne modne miRNA i cytoplasmaet. De enkelt-strengede modne miRNA overføres til Argonaute proteiner til at danne RISC kompleks. Derefter kan miRNA hybridiserer til 3'-utranslaterede regioner (3'-UTR) af et mål-mRNA, der fører til post-transkriptionel regulering ved at blokere translation eller nedbryde target mRNA'en 2.

På grund af den vigtige rolle, som både østrogen og miRNA spiller i tumorprogression, identificere miRNA forbundet med normal eller forstyrres østrogen signalering er vigtig for at øge vores forståelse af udviklingen og forbedre behandlingen af ​​brystkræft. Mens der er en god forståelse af, hvordan ERa regulerer protein-kodende gener, udvidelseog detaljer om noncoding RNA regler stadig at blive grundigt undersøgt. Indledende undersøgelser har til formål at belyse ERa regulering af miRNA i brystkræft cellelinier har givet modstridende resultater, selv når samme cellelinje er blevet analyseret 3-6. Dette kan være et resultat af forskellige behandlinger, biologiske variationer anvendelse af forskellige teknikker, og det faktum, at den lille størrelse af miRNA gøre dem udfordrende at analysere. Her er en protokol, der styrer for variationer og metode artefakter beskrevet.

At identificere, hvilke miRNA er reguleret af østrogen, profilering af en veldefineret brystkræft model af ERa aktivitet er et første skridt. Adskillige cellelinier er blevet genereret fra humane ERa-positiv brystkræft tumorer, der er afhængige af østrogen svarende til størstedelen af ​​de kliniske brystkræft. De molekylære egenskaber af to af disse cellelinjer, T47D og MCF7, herunder udtryk for ERa og dens downstream mål,progesteron hormon receptor (PR), manglende ekspression af membran-receptor HER2, sammen med ekspressionen af østrogen-responsive og luminale-epitel-differentiering gener, som gør dem egnede som modeller for den luminale undertype af brysttumorer 7-10. 17β-østradiol (E2) er den dominerende form for østrogen, og koncentrationer og tidspunkter for optimal transkriptionsaktivering af ERa blevet karakteriseret i flere studier. I denne protokol 10 nM E2 behandling i 24 timer er brugt og T47D og MCF7 som modeller for ERa aktivitet i brystkræftceller 1. Desuden kan tidsafhængige miRNA forskrifter specifikt analyseret i et tidsinterval på fx 1-72 timer.

For det andet, analysere miRNA har separate udfordringer, dels på grund af deres korte størrelser. miRNA er ikke godt bevaret i den totale RNA præparat, når regelmæssige Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA udfældninger udføres, eller når stAndard kolonne rensninger anvendes. Særlige forholdsregler der skal træffes for at opretholde eller berige for den mindre fraktion af RNA. Ved at øge mængden af ​​isopropanol, sænke temperaturen før centrifugering (-80 ° C) og udeladelse af vask i 70% ethanol, kan fastholdelse af miRNA forstærkes nedbør. Eller kan bruges bestemte kolonner og buffere til et præparat af miRNA-holdige total RNA høj kvalitet og robust. Også for selve analysen, deres korte størrelser skaber udfordringer. For genome-wide miRNA screening, der er tre almindelige miRNA profilering teknikker til at vælge imellem: microarrays, qPCR og næste generation sekventering. Hver teknik kan udføres ved hjælp af flere forskellige platforme, og forskellige præparater prøve er påkrævet, hver med forskellige risici for at indføre artefakter. I miRNA microarray, er et dias plettet eller syntetiseret med tusindvis af oligonukleotider. Disse oligonukleotider anvendes som prober, og hver af probens er udformet til at hybridisere til en bestemt miRNA sekvens. Den prøveforberedelse for microarrays, som udføres i denne undersøgelse, først beriger for miRNA og derefter introducerer Cy5 og Cy3 mærkning på miRNA. Microarray giver mulighed for at observere de relative ekspressionsniveauer af et stort antal gener samtidigt, er hurtig og velegnet til screening af et stort antal prøver, men kan kun analysere sekvenserne til stede på microarray og vil fx ikke påvise ændringer i ukendt eller muteret miRNA. Microarray analyse som udføres i denne protokol kræver også relativt store mængder, omkring 5 ug af total RNA per prøve til analyse. Low-density qPCR miRNA-profilering kræver mindre materiale (700 ng / prøve og replikere), og giver mulighed for detektion og kvantificering af miRNA. Kan bestemmes transkriptniveauer, og mængden kan være en absolut beløb eller en relativ mængde. qPCR analyse først kræver konvertering af miRNA i cDNA, her ved hjælp af en buetprimer for hver specifikke miRNA sikrer analyse af kun modne miRNA. Dette frembringer en længere skabelon, der kan forstærkes udnytte en miRNA-specifik fremadrettet primer og en revers universel primer komplementær til sekvensen i løkke og kan harbor optagelse af en Dual mærkede probe for specificitet. qPCR kan anvendes i en lav-densitet-format, hvor hundredvis af miRNA kan påvises i parallel ved hjælp af en eller flere 384-brønds plader med de enkelte primerpar i hver brønd 11. Næste generation sekventering på den anden side er den eneste af disse teknikker, der giver mulighed for opdagelsen af hidtil ukendte, muterede eller redigeret miRNA, da alle RNA i en prøve kan sekventeres 11. Denne teknik kræver imidlertid flere trin, som vil berige små RNA'er og producere en lille RNA-bibliotek ved hjælp af flere trin af linker-ligeringer og rensninger med efterfølgende forøgede risiko for at modulere deres relative ekspressionsniveauer mellem prøverne. Det kræver også betydelige bioinformatics analyse. I betragtning af de forskellige teknikker til miRNA-profilering, den mest hensigtsmæssige teknik afhænger af de programmer. Microarrays er mest velegnet, når materialet er relativt rigelige og interessen er at definere forskellen udtryk for allerede kendte miRNA. Low-density qPCR arrays er mest egnet, når en begrænset mængde af prøven er til rådighed, og en høj følsomhed af lav-udtrykte miRNA er påkrævet. Sekventering er mest velegnet, når analysen af ​​ukendte miRNA, muterede eller forskellige isoformer af et miRNA er påkrævet.

I undersøgelsen af ​​østrogen-regulerede miRNA i brystkræft, er to model cellelinjer anvendte T47D og MCF7, hvor store mængder af RNA er let tilgængelige. Hver cellelinje blev analyseret i replikerede cellekulturer ved hjælp af forskellige passager, der hver tekniske gentagelser af behandling. Dette giver mulighed for robust detektion af reproducerbart, ERa regulerede miRNA. Relative miRNA udtryk niveauer blev sammenlignet ved hjælp af både miRNA microarray ogDual mærkede prober - lav densitetsarrays (DLP-LDA) og valideret resultaterne med specifik qPCR bruger både cyaninfarvestof og DLP kemi. miRNA forordninger blev derefter yderligere analyseret i tidsserier til at definere deres nøjagtige regulering over tid, hvilket kan hjælpe med at differentiere tilfældige eller døgnrytmen variationer fra østrogen-induceret regulativer og angive primære virkninger fra sekundære effekter. Bioinformatiske sammenligninger med kromatin-bindende studier af ERa yderligere kan støtte i differentiering af primær versus sekundære effekter. Analysen resulterede i en pålidelig vurdering af miRNA regler, hvor det kunne konstateres, at efter 24 timer E2 behandling protein-kodende udskrifter var let reguleret, men modne miRNA var ikke påvirket 1.. Det er dog muligt, at miRNA er reguleret på senere tidspunkter, som påvist i tidsserieanalyser af udvalgte miRNA 1. Detaljerne skal undersøges nærmere, og den protokol, der præsenteres her giver en Robust måde at studere hormonelle regulering af modne miRNA i brystcancercellelinjer.

Protocol

1.. Fremstilling af cellekulturmedier

  1. For T47D cellelinien dyrkningsmedier:
    1. Bland 500 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 500 ml F12 [DMEM/F12 (1:1)] i en autoklaveret 1 L flaske.
    2. 50 ml oksefosterserum (dette gør 5% FBS) og derefter 10 ml penicillin streptomycin (dette gør 1% PEST). Bland indholdet fuldstændigt.
    3. Opbevares ved 4 ° C.
  2. For MCF7-cellelinie dyrkningsmedier:
    1. 500 ml DMEM med 25 ml af FBS (5% FBS) og derefter 5 ml penicillin streptomycin (1% PEST).
    2. Opbevares ved 4 ° C.
    3. For reduceret serum kultur medier:
      1. For T47D: Bland 500 ml phenolrødt-frit DMEM med 500 ml F12 (1:1) i en autoklaveret 1 L flaske, og der tilsættes 50 ml af dextrancoatet trækul-behandlet (DCC) FBS 5% DCC-FBS. Lav en separat flaske med 5 ml DCC-FBS til 0,5% DCC-FBS. Derefter tilsættes 10 ml PEST (1% PEST) til hver flaske. Bland indholdet fuldstændigt, opbevaringe ved 4 ° C.
      2. For MCF7: Bland 500 ml phenolrødt-frit DMEM med 5 ml 100x L-glutamin (200 mM slutkoncentration). 25 ml DCC-FBS (5% DCC-FBS). Lav en separat flaske med 2,5 ml DCC-FBS (0,5% DCC-FBS). Derefter tilsættes 5 ml af PEST (1% PEST) til hver flaske. Bland indholdet helt, opbevares ved 4 ° C.
    4. Til phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning:
      1. Fyld en 1 L autoklaveret glasflaske med ultrarent vand eller destilleret vand.
      2. Tilsæt en PBS tablet og ryst lejlighedsvis indtil tabletten er opløst.
      3. Autoklave PBS-opløsning og opbevares ved stuetemperatur.
    5. Udarbejdelse af ligand bestande:
      1. Forbered en 100 mM stamopløsning af E2 ved at opløse 2,72 mg 17β-østradiol i 100 ul ethanol eller DMSO i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og bland indholdet forsigtigt. Centrifuger kortvarigt og foretage serielle fortyndinger (1:10) til opnåelse af 10 mM, 1 mM, og 0,1 mM stamopløsning concentrtioner ved hjælp af opløsningsmidlet. Opbevar alle E2 stamopløsninger ved -20 ° C.
      2. Forbered en 100 mM stamopløsning af ICI ved at opløse 6,07 mg ICI 182.780 i 100 ul EtOH eller DMSO i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og bland indholdet forsigtigt. Centrifuger kortvarigt og foretage serielle fortyndinger (1:10) til opnåelse af 10 mM, 1 mM, 0,1 mM stamkoncentrationer hjælp af opløsningsmidlet. Opbevar alle ICI stamopløsninger ved -20 ° C.
      3. Køretøjet er opløsningsmiddel (ethanol eller DMSO). Placer 0,5-1 ml 100% ethanol eller DMSO i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør, og opbevares ved -20 ° C.

2. Celledyrkning og behandling

Udfør hver behandling i dobbelte eller tredobbelte plader til tekniske gentagelser. Gentag cellekultur proceduren og behandling ved hjælp af en anden passage af den samme cellelinie, som skulle tjene som en biologisk gentagelse af denne cellelinie. Gentag proceduren med en anden cellelinje til replfikat resultater i mere end en cellelinie. Alle cellekulturteknikker bør udføres under sterile forhold i en laminar flow hætte.

  1. Cell opstart kultur
    1. Varm mediet til 37 ° C i en steril varmt vandbad.
    2. Tø en frossen hætteglas med T47D eller MCF7 celler.
    3. Rengør ydersiden af ​​hætteglasset og medier flaske med 70% ethanol, og derefter placere både hætteglas og flaske i sterile laminar flow hætte.
    4. Mærk en steril T-75 kolbe tilsvarende (i hætten).
    5. Tilføj 12-15 ml af passende medier ind i kolben ved hjælp af en steril serologisk pipette (sikre, at overfladen er helt dækket med medier).
    6. Overfør cellerne fra hætteglasset til kolben, og blandes forsigtigt.
    7. Placer kolben i en 37 ° C inkubator, leveres med 5% CO2.
  2. Fremstilling af celler til behandling
    1. Tag celler ud af inkubatoren og observere under et mikroskop for at sikre, at cellerne er mindst 80% confluent. Dette er for at sikre, at der er nok celler til eksperimentet. Overfør kolben til steril hætte.
    2. Fjern medier fra kolben ved hjælp af en steril Pasteur-pipette forbundet med en vakuumkilde. Vask forsigtigt vedhæftede celler to gange med PBS.
    3. Tilsæt 1 ml varmt trypsin-EDTA i kolben, og sætte kolben i inkubatoren i 2 min. Dette er for at få cellerne løsnes fra kolben.
    4. Tilsæt ca 3-4 ml af passende varme medier til kolben og tritureres de løsrevne celler under anvendelse af en 5 ml serologisk pipette. Tritureres ved optagelse af cellerne i serologisk pipette og frigørelse af cellerne med spidsen af ​​pipetten placeret mod bunden af ​​kolben for at øge trykket. Dette er for at bryde cellerne fra hinanden i enkeltceller.
    5. Tæl cellerne, fx under anvendelse af en celletæller, i henhold til producentens protokol.
    6. Mærk 100 mm plader (efter behov), og der tilsættes ca 10 ml medium til pladerne. Plate omkring 2,0 x 10 6 celler / plade. Fordel celler ved gentle hvirvlende pladerne.
    7. Cellerne inkuberes i 24-48 timer, indtil cirka 80% sammenflydende.
    8. Ved 80% sammenflydning vaskes cellerne to gange med PBS, og tilføje de passende 5% DCC-FBS medier. Derefter inkuberes cellerne i 24 timer.
    9. Efter 24 timer vaskes cellerne to gange med PBS, og tilføje de relevante 0,5% DCC-FBS medier. Derefter inkuberes cellerne i yderligere 48 timer.
  3. Cellebehandling
    1. Efter 48 timer vaskes cellerne to gange med PBS. Sørg for at fjerne så meget af PBS som muligt.
    2. I en 15 ml konisk rør tilsættes 10 ml af de passende 0,5% DCC-FBS medier. Derefter tilsættes 1 ml af 0,1 mM ligand stock (E2 eller ICI) til en slutkoncentration på 10 nM. Også, tilsættes 1 ml af køretøjet til 10 ml medium i et separat rør til kontrol eksperiment.
    3. Bland indholdet i røret forsigtigt og tilføje til celler i pladen. Dette bør være et ligand per plade.
    4. Cellerne inkuberes til det valgte tidspunkt (0-72 timer).
<p class = "jove_title"> 3. RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol

  1. RNA-ekstraktion
    1. Efter behandlingen er færdig for den ønskede tidsperiode vaskes cellerne to gange med PBS, og derefter tilsættes ca 1-2 ml guanidinium-thiocyanat-phenol-opløsning til cellerne i pladen. ADVARSEL: guanidiniumthiocyanat-phenol løsning er giftigt ved kontakt med huden eller øjnene, indånding eller indtagelse. Bær passende beskyttelsesdragt, handsker og beskyttelsesbriller / ansigtsskærm, og bruge emhætte.
    2. Sikrer, at mængden af ​​celler er ikke mere end 10% af mængden af ​​guanidiniumthiocyanat-phenol-opløsning og at pladen er dækket med opløsningen og tillade at sidde i 1 min. Derefter skrabes celler under anvendelse af en gummiskraber og overføres til et mikrocentrifugerør. Celler kan opbevares i denne opløsning ved -80 ° C i flere uger.
    3. Uddrag og oprense totalt RNA fra hver behandling ved hjælp af guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-metoden efterfulgt af spinkolonne oprensning og DNaseI DNA-nedbrydning fremgangsmåde til dyreceller.
    4. Efter ekstraktion celler elueres i 60 pi RNase-frit vand. Alikvot 1-2 ul RNA til kvantificering analyse og butik RNA ved -80 ° C.
    5. Mål-RNA-koncentrationer under anvendelse af 1 ml af RNA og aspectrophotometer. Sørg for at der er en tom taget før en måling er færdig. Også helt tørre spektrofotometer rækkevidde gang en måling er taget. Koncentrationerne er normalt vist i ng / ul. Gem resultaterne viser RNA koncentrationer.
  2. RNA kvalitetskontrol
    1. Tage omkring 100 ng RNA fra hver prøve og sted i et mikrocentrifugerør.
    2. Mål-RNA-integritet ved hjælp af en Bioanalyzer. Normalt 12 prøver kan køres på én gang i en Bioanalyzer. Køre normalt tager omkring 25 min.
    3. Sammenlign resultater med RNA-stigen at sikre, at RNA er godt for eksperimentet. Gemme og udskrive resultater.

4.. Bekræftelse af Treatling: qPCR af protein-kodende gener

  1. cDNA-syntese
    1. Tag 500 ng eller 1 ug af total RNA (af hver prøve) og sat i en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Bring rumfanget af hvert rør op til 10 ul ved hjælp af RNAse-frit vand.
    2. Tilsæt 2 pi 50 pM tilfældige hexamerprimere og varme rør til 70 ° C i 10 min.
    3. Overfør rør til is i 5 minutter.
    4. For hver prøve tilsættes 4 pi 5x første streng-puffer, 1 pi 0,1 M DTT, 1 pi 10 mM dNTP'er, 0,5 pi hævet III og 1,5 pi RNase-frit vand.
    5. Rørene anbringes i en 25 ° C varmeblok eller et vandbad i 10 min.
    6. Overfør rør til en 46 ° C varme blok i 1 time. Så, for at overføre rør til en 70 ° C varme blok i 15 min stoppe reaktionen.
    7. Fortynd cDNA til en 5 ng / pl stock (beregnet ved hjælp af total RNA input) ved hjælp af RNase-frit vand til fortyndinger og opbevares ved -20 ° C.
  2. qPCR
    1. Anskaf primere for gener af renter og reference-gener. Primere kan let konstrueres ved hjælp af primer designe værktøj på NCBI s Primer-BLAST-programmet 12. Dette medfører normalt en fremad og revers primer for hvert gen af ​​interesse. Primere bør være fra 18 til 22 bp i længde, har en smeltetemperatur på 52-58 ° C, har et GC-indhold på 40-60% og en amplikon længde på 100-180 bp.
    2. For hver qPCR reaktion brønd tilsættes 10 ng cDNA (2 pi fra stamopløsningskoncentration fra trin 4.1.7), 1 pmol af hver af forward og reverse primere af genet af interesse (fra trin 4.2.1) og 5 pi 2x cyaninfarvestof PCR Master Mix. Reaktionen til hver brønd bør have en 10 pi endelig reaktionsvolumen.
    3. Sørg for, at der er tre brønde for hver prøve for hvert gen (tekniske gentagelser). En 96-brønds reaktionsplade kan anvendes.
    4. På qRT-PCR system-software, tildele journalisten og mål, indtast reaktion volumen, skal du vælge den sammenlignendetærskel cyklus (ΔΔCt)-metoden, og definere prøvebrønde.
    5. Sørg for at udføre smeltekurve analyse for alle cyaninfarvestof løber for at bekræfte forstærkning af en bestemt fragment. Kør plader ved hjælp af standardindstillingerne for kørslen.
    6. Gem resultaterne efter Kør og eksport af data (især CT-værdier til MS Excel).
  3. qPCR dataanalyse ved hjælp af ΔΔCT formel
    Ændringen i den relative mRNA-ekspression kan beregnes som fold ændring i forhold til at styre på Excel for hver prøve ved hjælp af følgende trin:
    1. Alle eksporterede resultater fra ovenstående qPCR skal have Ct-værdierne er inkluderet. Beregn ACt værdi ved hjælp af nedenstående formel:
      • ACt = CT (målgenet) - CT (henvisning genet)
      Dette skal gøres for hver prøve. Målet er genet eller miRNA af interesse.
    2. Dernæst beregner den totale standardafvigelse (SD) for hver prøve. Første beregneSD for referencen genet og derefter beregne SD for målet genet (dette kan gøres på excel vha. STD DEV-funktionen på CT-værdier). Derefter beregner den samlede SD for hver prøve ved hjælp af denne formel:
      • Samlet SD = (SD2 (mål) + SD2 (reference)) 1/2
    3. Beregn ΔΔCT af hver prøve i et gen (mål) ved:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (behandlet / prøve) - ΔΔCT (kontrol / kalibrator prøve)
      Kalibratoren Prøven er den ubehandlede prøve.
    4. Endelig beregne fold-Change (FC) værdier for hver prøve ved hjælp af formlen:
      • FC = 2-ΔΔCT
      Fold-ændring af hver prøve, der giver den relative ekspression af genet / miRNA, som er blevet normaliseret til reference-genet og kontrolprøve.
    5. Student t-test kan bruges til statistisk analyse ved hjælp af to-sidede fordeling og to-stikprøve ulige variansparametre: (P <0,001 (***), P <0,01 (**) og P <0,05 (*)). Dette kan opnås på Excel. Bekræft, at behandling resulterede i reguleringen af ​​kendte mål før du fortsætter med miRNA-profilering.

5.. miRNA profilanalyse

  1. miRNA microarray
    1. Take 5 ug isolerede RNA fra celler behandlet med enten bil eller ligand, og sted i et mikrocentrifugerør. Justere lydstyrken i røret til 20 ul. Hver sammenligning skal udføres i duplikater eller triplikater.
    2. Udfør miRNA microarray ved hjælp af RNA-prøver ovenfor. miRNA microarray udtryk profiler bestemmes ved hjælp af menneskelige miRNA microarray tofarvet prøve array ved μParaflo Mikrofluid Biochip Technology (Sanger miRBase Udgivelse 14,0) 13..
    3. Resultaterne skal vise differentielt udtrykte miRNA. Overvej betydelige miRNA udtryk, når p <0.05.p-værdi <0,10 kan også anses for yderligere samarbejdenfirmatory analyse ved hjælp af qPCR. Gem denne miRNA liste for yderligere validering med qPCR.
  2. miRNA-profilering: DLP-LDA
    1. Hver prøve skal analyseres i duplikater eller triplikater. Tag 700 ng totalt RNA fra celler behandlet med enten bil eller ligand, og placere i et mikrocentrifugerør. Juster lydstyrken i røret til 3 gl.
    2. Udfør cDNA-syntese ved hjælp af dobbelt mærkede prober miRNA assaymetode og 10x RT-primere. Samlet volumen for hver reaktion bør være 7,5 gl.
    3. Placer reaktion røret i PCR-system Thermocycler, og sat til anbefalede parametre som angivet i Dual mærkede prober miRNA assay metode. Start kørslen. Dette vil generere cDNA. Bemærk, at cDNA kan opbevares ved -20 ° C i mindst 1 uge.
    4. Mens RT-reaktionen kører, tage ud DLP-LDA pladerne og lad den sidde ved stuetemperatur. Hvert array plade indeholder 384 brønde, der indeholder unikke miRNA primere og kontrol-primere.
    5. Tag 6 pi af cDNA (fra 5.2.3) og anbringes i en 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilføj 450 ul af Dual mærkede prober, 2x Universal PCR Master mix og tilføje 444 pi RNase-frit vand.
    6. Vend røret omkring seks gange for at blande indholdet og centrifuger kortvarigt.
    7. Når DLP-LDA plade har nået stuetemperatur, belastning 100 ul i hver af de otte 'Fyld havn' af pladen. Derefter centrifugeres array plade.
    8. Åbn qRT-PCR systemet og kontrollere, at blokken er at for 384 brønde. Opsæt køre ved hjælp af SDS-softwaren. Vælg relativ kvantificering (Ct), vælg godt nummer og matrix, og indtast prøve beskrivelse til at definere brønde.
    9. Kør array ved hjælp af standardindstillingerne termiske cyklisternes forhold. Når kørslen er færdig, skal du gemme resultater og eksport til MS Excel, og gem til yderligere analyse ved hjælp af ΔΔCT formel (trin 4.3).

6.. Bekræftelse af miRNA forordninger bruge separateqPCR analyse

  1. Cyaninfarvestof qPCR analyse
    1. Design primere til ønsket miRNA-analyse. Sekvens af det modne miRNA, som er lig med den fremadrettede primer, kan fås fra mirbase.org 14. Konverter alle 'U' til 'T'.
    2. Forbered cDNA: Tag 1 pg total RNA og sted i en 1,5 ml centrifugerør. Følg instruktionerne for polyA hale og første cDNA syntese af miRNA fra en miRNA første cDNA Synthesis og qRT-PCR-protokol. Fortynd den resulterende cDNA (1:10) og opbevares ved -20 ° C.
    3. Få en 96-brønds reaktionsplade.
    4. For hver miRNA qPCR reaktion brønd tilsættes 16 ng polyA cDNA (fra trin 6.1.2), 2 pmol af hver af den specifikke fremadrettede primer (fra trin 6.1.1) og det universelle primer (fra sættet fra trin 6.1.2 ) og 5 ul 2x qPCR Master mix. Endelige reaktionsvolumen er 10 gl / brønd.
    5. Sørg for, at der er tre brønde for hver prøve for hver miRNA (for tekniske gentagelser). OgsåSørg for, at en henvisning gen (sædvanligvis U6 snRNA) er inkluderet.
    6. På qRT-PCR system-software, tildele journalisten og mål, indtast reaktion volumen, skal du vælge den sammenlignende tærskel cyklus (ΔΔCT)-metoden, og definere prøvebrønde.
    7. Kør plader ved hjælp af standardindstillingerne for kørslen. Sørg for at udføre smeltekurve analyse for alle cyaninfarvestof kørsler. Hver smeltekurve bør kun vise én specifik top for at bekræfte amplifikation af et specifikt fragment. Hvis der observeres mere end en top eller ingen klar top primerne ikke er specifikke, og dataene kan ikke anvendes.
    8. Gem resultaterne efter Kør og eksport af data (især CT-værdier til MS Excel).
  2. Dual mærkede prober qPCR analyse
    1. Tag 10 ng af hver total-RNA, hver i en 5 pi volumen og anbringes i 0,2 ml mikrocentrifugerør.
    2. Følg instruktionerne fra protokollen om at udføre revers transkription (RT) ved hjælp af Dual mærkede prober, MicroRNA revers transkriptase Kit 15. Hver samlede reaktion volumen skal være 15 pi. Bemærk, at for de Dual mærkede prober, RT-reaktioner, er der specifikke primere for hver miRNA, der skal undersøges.
    3. Placer reaktion røret i PCR-system thermocycler, og indstille parametre i henhold til protokollen er angivet i trin 6.2.2 ovenfor. Start kørslen. Det bør tage omkring 70-80 min.
    4. Efter RT-reaktionen, fortyndes prøven cDNA i en 1:5 ratio og gemme alle cDNA i mørke ved -20 ° C.
    5. Få en 96-brønds reaktionsplade.
    6. For hver miRNA qPCR reaktion godt tilføje følgende: 10 ul af Dual mærkede prober 2x Universal PCR Master Mix (samme reagens som trin 5.2.5), 7,67 pi RNase-frit vand, 1 ml af 20 × realtid assay primer (specifik for hver miRNA) og 1,33 pi af cDNA'et fra trin 6.2.4 ovenfor. Dette bør være en 20 ul endelig reaktionsvolumen. Bland indholdet forsigtigt, og centrifuger kortvarigt.
    7. Sørg for, at there er tredobbelte brønde til hver prøve for hver miRNA (tekniske gentagelser). Sørg også for, at en henvisning gen (sædvanligvis U6 snRNA) er inkluderet.
    8. På qRT-PCR system-software, tildele reporter (FAM) og quencher (NFQ-MGB) for hver miRNA (mål) af interesse, indtast reaktion volumen, skal du vælge den sammenlignende tærskel cyklus (ΔΔCt)-metoden, og definere prøvebrønde.
    9. Følg vejledningen til opsætning af parametrene for qPCR kører fra Dual mærkede prober microRNA assayprotokollen. Derefter starte kørslen. Gem resultaterne efter Kør og eksport af data (især CT-værdier til MS Excel).

Representative Results

En oversigt over den tilgang er præsenteret i figur 1, og en sammenligning af de forskellige prøve præparater og nukleinsyre ændringer, der kræves for hver teknik er visualiseret i figur 2..

Betingelsen og miljø af de celler, før behandlingen med et hormon er vigtigt i fastsættelsen af de faktiske virkninger af hormonet 16. Nogle medium og serum indeholder vækstfaktorer, der kan påvirke resultaterne, så cellerne er serumudsultet at sikre at alle hormonelle virkninger er blevet reduceret til et minimum. Derfor, når behandling med E2, der er mere sikkerhed for, at de observerede virkninger er E2-associeret. En vigtig faktor er konfluens af celler, som har indflydelse på celle-celle-kontakt og adfærd, såsom celle-celle-signalering og proliferation. Cellerne fik lov til at være 80% sammenflydende (figur 3A) og godt fastgjort til at tillade vækst og undgå tab af celler under efterfølgende vask og medier lmange.

De betingelser under RNA-ekstraktion og oplagring er vigtige for kvaliteten af ​​RNA og efterfølgende analyse. Det er også kendt, at antallet af celler, udvinding metode, og indholdet af miRNA GC kan påvirke udbyttet og kvaliteten af både mRNA'er og miRNA 17. Således er det nødvendigt at udføre RNA-ekstraktion under RNase-fri betingelser, og til at kontrollere kvaliteten af ​​RNA før man går videre med eksperimenter. Efter ekstraktion kvantificering af RNA giver information om koncentrationen af ​​det totale RNA (indeholdende både mRNA'er og miRNA), hvilket muliggør observation af udbytte. Det giver også en grafisk gengivelse af resultater, som det ses i figur 3B, og dette giver mulighed for observation af renheden af prøven (normalt angivet ved en top, øverste panel). Dårligt udbytte af RNA ville producere nogen specifikke absorption ved 260 nm (figur 3B nederste panel). At afgøre, om RNA er af høj kvalitet, RNAintegritet blev målt. En RNA-integritet nummer (RIN) på mellem 9-10 sikrer, at RNA nedbrydes ikke og er af optimal kvalitet. Desuden bemærkes den grafiske repræsentation af RNA og 18S og 28S rRNA har toppe, som vist i figur 4 (midterste panel). Sammenligning med stigen (figur 4, øverste panel) identificerer størrelsen af toppene. En nedbrudt RNA vil have mindre tydelige toppe og en reduceret relative mængde af 18S og 28S rRNA (fig. 4, nederste panel). Fraktionen af ​​små RNA'er kan yderligere sikres ved hjælp af Agilent Small RNA Kit. Det anbefales at validere østrogen respons efter behandling under specificerede eksperimentelle betingelser, før du fortsætter til miRNA screening. En qPCR kan udføres på en kendt ER målgen såsom PS2 eller SPINK4 18, ved hjælp af cDNA-skabelon. Sådanne gener er normalt opreguleres indenfor 1-24 timer efter E2 behandling. Når kvaliteten af ​​RNA og østrogen reaktioner blevet vurderet, kan gennemføres yderligere eksperiment.

Microarray er stadig en udbredt teknik til storstilet screening for miRNA ekspression i celler. For eksempel miRNA microarray engang brugt indeholdt 894 modne miRNA og 50 kontroller unikke sonder i firlinger 1. Hybridiseringer blev udført i dubletter med farvestof swap procedure. MiRNA microarray Resultaterne er som regel grafisk repræsenteret af varme kort. 5A viser et zonekort, der repræsenterer data fra en miRNA microarray sammenligning mellem køretøj og E2 behandlede prøver. Den røde viser, at miRNA er opreguleret i E2-behandlede prøve (højere ekspression), mens den grønne angivne nedregulering af miRNA (lavere ekspression). MiRNA udvalg normalt afhænger af deres betydning i udtryk, og som regel en p-værdi mindre end 0,05 anses for signifikant. De miRNA, der er angivet til at være differentielt udtrykte bør yderligere valideres wed qPCR, at skelne dem fra falske positiver.

DLP-LDA-array, på den anden side bruger et qPCR-baserede metode til at screene for regulerede miRNA i en 384-brønds format. Normalt to 384-brønds plader (kort) er forudsat, pools A og B. Pool A indeholder som regel bedre karakteriseret og mere overudtrykt miRNA end puljen B. relative niveau for hver miRNA bestemmes af qPCR, hvor den ene miRNA analyseres pr godt (figur 5B). En højere Ct-værdi angiver mindre miRNA udtryk. Meget ligesom miRNA microarray, opnåede resultater fra DLP-LDA skal valideres yderligere at sikre nøjagtigheden.

Valideringer kan udføres ved hjælp qPCR. Her er to qPCR beskrevne metoder til at forebygge metode bias og at give mulighed for en grundig bekræftelse og efterforskning af miRNA regler. Cyaninfarvestoffet-baseret detektion kemi fungerer anderledes end DLP, at DLP-LDA profilering er baseret på, og er velegnet til bekræfteation formål. Det kan være mindre specifik, da den registrerer alle forstærket dobbeltstrenget DNA, men homogeniteten kan vurderes ved at udføre en smelte-kurve analyse. 6A (venstre panel) viser smeltepunkt kurve analyse af et miRNA, og en klart defineret ensartet spids kan ses. Flere toppe ville blive opfyldt, hvis primeren er uspecifikke eller betydelige mængder af primer-dimer er dannet (figur 6A, højre panel). DLP miRNA assays på den anden side, er mere specifik, da kun amplifikation af målet detekteres miRNA. Amplification plots af hvert mål miRNA kan observeres, som eksemplificeret i figur 6B. Muligheden for at kontrollere for forekomsten af ​​flere amplificeringsprodukter hjælp smeltekurven analyse er imidlertid ikke tilgængelige med denne kemi og cyaninfarvestof qPCR er billigere. Cyaninfarvestof og DLP qPCR assays kan undertiden genereres lidt forskellige resultater. For begge qPCR, sammenlignet med en reference-gen er nødvendig for at bestemme den relative ekspression af gener mellem to prøver. Henvisningen genet, også kaldet housekeeping-genet, bør være et gen, hvis ekspression ikke er ændret, og som udtrykkes på lignende niveauer som genet af interesse. Et eksempel på en egnet henvisning gen i disse brystkræft cellelinier er ARHGDIA en Rho BNP-Dissociation Inhibitor der fungerer BNP / GTP udveksle reaktioner Rho proteiner. Som anført i figur 6C (øverst) er mRNA-niveauet af ARHGDIA ikke ændret mellem køretøjet og ligand-behandlede prøver. 18S rRNA kan også anvendes, omend dens høj ekspression kræver en separat 1:500 fortynding af cDNA materiel og er derfor mindre relevant. For miRNA-analyse, er der stadig en debat om et veldefineret henvisning genet. Hidtil U6 snRNA er en reference gen, der er bredt accepteret for miRNA-analyse. U6 snRNA er ~ 110 nukleotider lange, noncoding små nukleare RNA, der fungerer i nukleare præ-mRNA splglasur 19. Som anført i figur 6C (nederst), U6 udtryk niveauer er omtrent det samme på tværs af alle prøver viste, hvilket giver mulighed for beregninger af de variable niveauer af miRNA. Der kan konstateres en grafisk repræsentation af et miRNA qPCR resultat for en sammenligning mellem køretøj og E2-behandlede celler, der er blevet normaliseret til referencen U6 i 6D. Dette illustrerer en miRNA, der blev påvist som nonregulated efter 24 timers E2 behandling, men som huser ER kromatin-bindende steder tæt på sin genomisk placering, og tidsserieanalyser identificerede væsentlige regulering 72 timer efter behandlingen.

Figur 1
Figur 1. En oversigt over tilgang som anvendes til påvisning af hormonelle regulering af miRNA i brystkræftceller.

Figur 2
Figur 2. Sammenligning af de forskellige prøve præparater og nukleinsyre manipulationer for hver miRNA detektion teknik. (A) miRNA microarray vha. μParaflo teknologi omfatter fremgangsmåden tilsætning, poly-A-hale og ligering mærkning. (B) DLP-teknologi prøveforberedelse og påvisningsmetode omfatter en løkke cDNA-syntese primer, der strækker sig efter denatureringstrin og giver en længere fragmentet, som indeholder forberedelse revers primer og probe-sekvensen. (C) cyaninfarvestof teknologi prøveog påvisningsmetode omfatter poly A-hale, og cDNA syntese med en oligo-dT-primere, herunder en universel 5'-sekvens.

Figur 3
Figur 3. Celledyrkning og RNA-ekstraktion. (A) Dyrkede celler til at illustrere 80% sammenflydning nødvendig før behandling med ligand. (B) Grafisk fremstilling af RNA-koncentration og renhed efter ekstraktion. Hver top repræsenterer en prøve og en vellykket udvinding processen giver ren RNA (øverste panel). Et dårligt ekstraheret RNA viser ingen klar absorptionstop ved 260 nm (nederste panel).

Figur 4
Figur 4.. & #160; RNA kvalitetskontrol Resultater fra RNA integritet analyse, der viser grafisk repræsentation for stigen (øverst), en god kvalitet RNA (midten) og et forringet RNA prøve (nederst)..

Figur 5
Figur 5. En illustration af miRNA resultater. (A) En zonekort repræsentation af miRNA microarray resultater for differentielt udtrykte miRNA. miR-A, B, C er opreguleret i E2-behandlede prøve som angivet i rød, mens miR-D, E, F, G er nedreguleret i E2-behandlede prøve som angivet i grøn. (B) Amplification plots for hver miRNA fra de resultater, DLP-LDA. miRNA detekteret forstærkes som indikeret ved stigningen i Rn værdi.

Figur 6 Figur 6. qPCR analyse af miRNA regler. (A) Melting-kurve analyse for en miRNA analyseres ved hjælp cyaninfarvestof afsløring, viser homogenitet af alle undersøgte prøver (til venstre) og forstærkning af flere fragmenter (til højre). (B) Amplification grunde til hver prøve til en miRNA. Dette kan enten være fra cyaninfarvestof eller DLP påvisningsmetoder. (C) Bar graf repræsentation af passende referenceprøver gener for mRNA analyse ARHGDIA (øverst) og til miRNA-analyse snRNA U6 (nederst), viser ingen signifikant forskellig ekspression mellem prøverne. (D) miRNA qPCR resultaterne til at illustrere sammenligning af relative ekspressionsniveauer af miR-135a i et tidsforløb. 6D er genoptrykt fra Katchy et al. 1 med tilladelse fra Elsevier. Værdier er normalt gennemsnittet af særskilte ekspertiseiments (biologiske dubletter) ± SD. Students t-test anvendes til at påvise betydning: * p <0,05.

Discussion

Bestemmelse af mekanismen til hormonelle regulering af miRNA i brystkræftceller kan give en platform for at forstå denne sygdom og kan give potentiel behandling for brystkræft. Dyrkning af disse celler til at give den optimale betingelse for hormonaktivitet er meget vigtig. Her er en protokol, der sikrer, at hormon af interesse (østrogen) blev udelukket før behandling, og at en optimal dosis af E2 blev anvendt til et passende tidspunkt under behandling er blevet beskrevet. Andre hormonale og vækstfaktor effekter blev holdt på et minimum ved gradvist at sænke serumniveauer og bruge DCC-FBS, der er FBS, der er blevet frataget de fleste af sine hormon, cytokiner og vækstfaktorer. Phenolrødt-frie medier blev yderligere anvendes til at minimere andre nonhormonal virkninger, eftersom phenolrødt er blevet rapporteret at have østrogen aktivitet og påvirke visse funktioner i cellelinier 20,21. Tidspunktet for eksponering af cellerne til hormonet er af stor betydning. Østrogen-associeret regulering af gener, er det tidligere vist, at 24-hrexposure producere signifikant respons direkte målgener i brystcancerceller 1,18. Da miRNA transskriberet af RNA-polymerase II, som mRNA'er, er det tænkeligt, at det er et passende tidspunkt til at detektere direkte regulering også miRNA. Det er endnu ikke fastlagt, om og hvordan disse miRNA påvirker ekspressionen af ​​disse kendte ER mål i brystkræftceller.

analyse af miRNA kan være en udfordring på grund af den relativt lille størrelse af miRNA, at den modne miRNA sekvensen kan også findes i pri-miRNA og pre-miRNA, og på grund af heterogenitet i deres GC-indhold 22. Adskillige teknikker til profilering og kemier er blevet anvendt til at overvinde denne vanskelighed. Blandt disse er forskellige tilgange af microarray og qPCR analyse (Figur 2). Selvom microarray er almindeligt accepteret for hele genomet analradiokemiske analyser, kan det give falsk negative, og der findes forskelle mellem de tilgængelige platforme, lige fra kemi til printteknologi 23. Også normaliseringsproces er en udfordring, når man analyserer de relativt få miRNA gener, som tælles i tusinder i forhold til de titusinder af mRNA udskrifter. qPCR, på den anden side, er mere følsom, og er bedre anvendes, når færre gener der skal overvejes. Når den udføres i store 384-brønds plader, med kun én teknisk replikat per plade, behov for flere plader imidlertid skal analyseres for hver prøve, som gør analysen dyrt. Også i vores hænder, var der mange flere falske negative resultater er opnået ved hjælp af DLP-LDA analyse sammenlignet med microarray. Eftersom den modne miRNA sekvens er til stede i den pri-miRNA og præ-miRNA-sekvenser, er det af interesse at skelne mellem disse transkripter under anvendelse af PCR teknikker 24. DLP sonder er tilgængelige også for pre-miRNA, og specific primere kan også være udformet til at udelukke forskellige modne eller precursor varianter hjælp cyaninfarvestof qPCR-teknologi.

qPCR er en gylden standard for validering af differentieret udtryk fra profilering resultater. Effektiviteten af qPCR, afhænger imidlertid af en række parametre, herunder RNA ekstraktion, RNA integritet (kvalitet), cDNA syntese, primer design, afsløring metode (kemi), og henvisningen genet for data normalisering 1,22,25. Mulighederne for primer design for miRNA-analyse er meget begrænset, idet den korte miRNA sekvenslængde ikke giver plads til meget alternativ primer design, og kun én primer kan huses i denne korte sekvens. Der er således behov for alternative manipulationer som illustreret i figur 2. Tekniske gentagelser er vigtigt at validere robusthed amplifikationsmetoden og den anvendte proces. Er nødvendige biologiske replikater for en repræsentation af den generelle biologiske Variation, herunder responsvariabel ligand behandling, og for at vise, at de observerede virkninger i en celle er reproducerbare. Baseret på vores erfaringer, kan variationer i miRNA-ekspression mellem cellekulturer forekomme. Disse forskelle er normalt mindre end 1,3 gange, og gennemsnittet af værdierne og tilsvarende SD identifikation af den fysiske og teknologiske variation. Denne variation kan skyldes forskellige faktorer, herunder, celledensitet og at cellefunktioner kunne skifte fra passage til passage. At identificere statistisk signifikante udtryk som følge af ligand behandling, en bredt accepteret betydning er, når p-værdien er mindre end 0,05. Her har en student t-test på de biologiske og tekniske gentagelser ved hjælp af tosidet fordeling og to stikprøver ulige varians parametre været anvendt. Andre t-test parametre eksisterer, og valget afhænger af forsøgsopstillingen 26.

En detaljeret protokol i evalueringen hormonelle forskrifter modne miRNA i brystkræftceller er tilvejebragt. Vigtige teknologier og kemi i profilering og validering af disse miRNA udtryk er blevet tydeligt forklaret. Den valgte til undersøgelser af miRNA i brystkræftceller teknologi i sidste ende afhænger af, hvad der præcist er ved at blive undersøgt.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Dr. Xiaolian Gao, University of Houston, for at rådgive LC Sciences miRNA microarray platform, Dr. Karin Edvardsson, Karolinska Instituttet, Sverige og Dr. Eylem Aydogdu, University of Houston, for at dele deres miRNA ekspertise . Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award nummer R01CA172437. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. Dette arbejde blev også støttet af tilskud fra Texas Emerging Technology Fund, i henhold til aftale nr. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  3. Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).
  4. Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).
  5. Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).
  6. Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).
  7. Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).
  8. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).
  9. Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).
  10. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  11. Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).
  12. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  13. Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
  14. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
  15. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  16. Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  18. Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).
  19. Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1 (1), 46-54 (1995).
  20. Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).
  21. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).
  22. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  23. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  24. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32 (4), e43 (2004).
  25. Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
  26. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).

Tags

Medicine brystkræft microRNA østrogen østrogen-receptor microarray qPCR
Profilering af østrogen-regulerede MicroRNA i brystkræftceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katchy, A., Williams, C. Profiling… More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter