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Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Published: February 21, 2014 doi: 10.3791/51285
Automatic Translation
1, 1
1Center for Nuclear Receptors and Cell Signaling, Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

Abstract

Gli estrogeni svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo della ghiandola mammaria e la progressione del cancro al seno. Esso media la sua funzione legandosi e attivando i recettori degli estrogeni (ER), ERa e ERp. ERa è frequentemente iperespresso nel cancro al seno e spinge la proliferazione delle cellule del cancro al seno. I requisiti essenziali funzionano come fattori di trascrizione e di regolare l'espressione genica. Considerando che la regolamentazione di ERa di geni codificanti proteine ​​è ben definito, la sua regolamentazione di non codificanti microRNA (miRNA) è meno esplorati. microRNA svolgono un ruolo importante nella regolazione post-trascrizionale di geni, inibendo la loro traduzione o degradante loro mRNA. miRNA possono funzionare come oncogeni o soppressori tumorali e sono anche promettenti biomarcatori. Tra i saggi miRNA disponibili, microarray e real-time PCR quantitativa (qPCR) sono stati ampiamente utilizzati per rilevare e quantificare i livelli di miRNA. Per identificare miRNA regolati dalla segnalazione estrogeni nel cancro al seno, thEIR espressione in linee cellulari di cancro al seno ERa-positivi sono stati confrontati prima e dopo gli estrogeni attivazione utilizzando sia i microarrays μParaflo-microfluidica e doppia etichetta Sonde-bassa densità array. I risultati sono stati convalidati usando specifici saggi qPCR, applicando sia Cyanine dye-based e doppia etichetta chimica a base di sonde. Inoltre, un saggio time-point è stato usato per identificare le normative nel tempo. I vantaggi dell'approccio test miRNA utilizzato in questo studio è che permette uno screening veloce di regolamenti maturo miRNA in numerosi campioni, anche con quantità di campione limitato. Il layout, comprese le condizioni specifiche per coltura cellulare e trattamento con estrogeni, repliche biologiche e tecniche, e lo screening su larga scala seguita da conferme di approfondimento utilizzando tecniche distinte, assicura un rilevamento affidabile di regolamenti miRNA, ed elimina i falsi positivi e altri manufatti. Tuttavia, miRNA mutati o sconosciute, o regolamenti a leve trascritto primario e precursorel, non sarà rilevato. Il metodo qui presentato costituisce un esame approfondito della regolamentazione miRNA estrogeno-mediata.

Introduction

L'estrogeno è un ormone che è importante durante lo sviluppo della ghiandola mammaria. Gli estrogeni svolge anche un ruolo importante per lo sviluppo, la manutenzione, il rischio, e il trattamento del cancro al seno 1. Estrogeni esercita la sua funzione legandosi a ER, che sono fattori di trascrizione e regolano specifici geni bersaglio. Dei due varianti del recettore, ERa è essenziale per la proliferazione estrogeno-dipendente delle cellule di cancro al seno. La maggior parte dei tumori al seno sono ERa-positivi e dipende estrogeni per la crescita. Ciò ha reso segnalazione estrogeni e ERa un obiettivo per il trattamento di ormone-recettore cancro al seno positivo. Comprendere il meccanismo alla base della ERa è importante per migliorare i risultati del trattamento, superare la resistenza al trattamento, e capire come si sviluppa il cancro al seno.

microRNA svolgono un ruolo critico in funzioni cellulari a causa del loro forte impatto nella regolazione genica post-trascrizionale. miRNA sono 19-24 nucleotidi a breve, a singolo filamento, RNA non codificanti che vengono prima trascritti dalla RNA polimerasi II in primarie trascrizioni miRNA (pri-miRNA). Essi sono trattati nel nucleo da Drosha in precursori-miRNA breve tornante (pre-miRNA) e poi elaborati dal Dicer e separati in singoli filamenti per formare miRNA maturi nel citoplasma. I miRNA maturi singolo filamento vengono trasferiti alle proteine ​​Argonaute per formare complessi RISC. Poi, i miRNA possono ibridare alle regioni 3 'non tradotte (3'-UTR) di un mRNA bersaglio, portando a regolazione post-trascrizionale bloccando traduzione o degradare l'mRNA bersaglio 2.

A causa del ruolo importante che sia gli estrogeni e miRNA svolgono nella progressione del tumore, individuando miRNA associati alla segnalazione normale o interrotto estrogeni è importante al fine di migliorare la nostra comprensione dello sviluppo e migliorare il trattamento del cancro al seno. Mentre vi è una buona comprensione di come ERa regola geni codificanti proteine, l'estensionee dettagli di RNA non codificanti normativa deve ancora essere approfonditi. Gli studi iniziali volti a chiarire regolamentazione ERa di miRNA in linee cellulari di cancro al seno hanno dato risultati contrastanti, anche quando la stessa linea cellulare è stata analizzata 3-6. Questo può essere il risultato di trattamenti diversi, variazioni biologiche, l'uso di tecniche diverse, e il fatto che le piccole dimensioni dei miRNA li rendono difficili da analizzare. Qui, un protocollo che controlla le variazioni e manufatti metodo è descritto.

Per identificare quale miRNA sono regolati dagli estrogeni, profilatura di un modello di cancro al seno ben definito di attività ERa è un primo passo. Diverse linee cellulari sono stati generati da cancro al seno tumori umani ERa-positivo, che dipendono dagli estrogeni simile alla maggior parte dei tumori al seno clinici. Le proprietà molecolari di due di queste linee cellulari, T47D e MCF7, compresa la formulazione di ERa e il suo obiettivo finale,il recettore dell'ormone progesterone (PR), una mancanza di espressione di recettori di membrana HER2, insieme con l'espressione di geni di differenziazione estrogeno-sensibili e luminali-epiteliale, li rendono adatti come modelli per il sottotipo luminale dei tumori al seno 7-10. 17β-estradiolo (E2) è la forma dominante di estrogeni, e le concentrazioni e tempo-punti per l'attivazione trascrizionale ottimale di ERa sono stati caratterizzati in studi multipli. In questo protocollo di trattamento 10 nM E2 per 24 ore viene utilizzato e T47D e MCF7 come modelli per l'attività ERa in cellule di cancro al seno 1. Inoltre, regolamenti miRNA dipendenti dal tempo possono essere specificamente analizzati in un intervallo di tempo di esempio 1-72 ore.

In secondo luogo, analizzando miRNA ha sfide separati, in parte a causa delle loro dimensioni brevi. miRNA non sono ben conservati nella preparazione di RNA totale quando vengono eseguite regolarmente Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol precipitazioni RNA, o quando stsono utilizzati purificazioni colonna Andard. Speciali precauzioni devono essere prese per mantenere o arricchire la frazione più piccola di RNA. Aumentando il volume di isopropanolo, abbassando la temperatura prima centrifugazione (-80 ° C), e omettendo il lavaggio in etanolo al 70%, il mantenimento di miRNA può essere migliorata durante la precipitazione. Oppure, possono essere usate colonne e tamponi specifici per una elevata qualità e robusta preparazione di RNA totale-miRNA contenente. Anche l'analisi stessa, loro brevi dimensioni creano sfide. Per lo screening miRNA genome-wide, ci sono tre miRNA comuni tecniche da scegliere profilazione: microarrays, qPCR, e sequenziamento di prossima generazione. Ogni tecnica può essere eseguita utilizzando più piattaforme diverse, e sono necessarie diverse preparazioni del campione, ognuno con differenti rischi di introdurre artefatti. In miRNA microarray, una diapositiva è macchiato o sintetizzato con migliaia di oligonucleotidi. Questi oligonucleotidi sono utilizzati come sonde, e ciascuno della sondas è progettato per ibridare ad una particolare sequenza miRNA. La preparazione del campione per microarray, interpretato in questo studio, primo arricchisce di miRNA e poi introduce l'etichettatura Cy5 e Cy3 sui miRNA. Microarray dà la possibilità di osservare i livelli di espressione relativi di un gran numero di geni contemporaneamente, è veloce e adatto per lo screening di un gran numero di campioni, ma può analizzare solo le sequenze presenti sul microarray e verrà non es rilevare variazioni di sconosciuto o mutato miRNA. Analisi Microarray interpretato in questo protocollo richiede anche relativamente grandi quantità, circa 5 mcg, di RNA totale per campione per l'analisi. Bassa densità qPCR miRNA profiling richiede meno materiale (700 ng / campione e replicare), e consente l'individuazione e la quantificazione dei miRNA. Livelli di trascrizione possono essere determinati, e la quantità può essere un valore assoluto o relativo importo. analisi qPCR richiede prima conversione di miRNA in cDNA, qui usando un loopPrimer per ogni specifico miRNA assicurando che l'analisi di un solo maturare miRNA. Questo genera un modello più che può essere amplificato utilizzando un primer forward specifici miRNA e un primer reverse universale complementare alla sequenza di loop, e può porto l'inclusione di una sonda a doppio etichetta per specificità. qPCR può essere utilizzato in un formato a bassa densità dove centinaia di miRNA possono essere rilevati in parallelo utilizzando uno o più piastre a 384 pozzetti con singole coppie di primer in ciascun pozzetto 11. Sequenziamento di prossima generazione, d'altra parte, è l'unica di queste tecniche che consente la rivelazione di romanzo, miRNA mutati o modificati, come tutti gli RNA in un campione possono essere sequenziati 11. Questa tecnica, tuttavia, richiede più passaggi per arricchire piccoli RNA e produrre una piccola libreria di RNA utilizzando diversi passaggi di legature linker e purificazioni con conseguenti rischi migliorate di modulare i livelli di espressione relativi tra i campioni. Si richiede inoltre bioinformati significativianalisi cs. Date le varie tecniche di profiling miRNA, la tecnica più appropriata dipende dalle applicazioni. Microarray sono più adatte quando il materiale è relativamente abbondante e l'interesse è quello di definire espressione differenziale dei miRNA già noti. Bassa densità qPCR array sono più adatto per una quantità limitata di campione è disponibile è richiesta una elevata sensibilità di miRNA low-espressi. Sequencing è più adatto quando è richiesta l'analisi dei miRNA sconosciuti, mutati o diverse isoforme di miRNA.

Nello studio dei miRNA regolati dagli estrogeni nel tumore della mammella, vengono utilizzate due linee cellulari modello, T47D e MCF7, dove sono facilmente disponibili grandi quantità di RNA. Ogni linea cellulare è stata analizzata in colture cellulari replicate utilizzando diversi passaggi, ognuno in replicati tecniche di trattamento. Questo permette robusto individuazione di riproducibile, miRNA ERa regolamentate. Relativi livelli di espressione di miRNA sono stati confrontati utilizzando sia miRNA microarray eSonde doppie etichettato - array a bassa densità (DLP-LDA) e convalidati i risultati con specifiche qPCR utilizzando sia colorante Cyanine e chimiche DLP. regolamenti miRNA sono stati poi analizzati ulteriormente nella serie temporali per definire la loro regolazione esatta nel tempo, che può aiutare a differenziare le variazioni casuali o circadiani da regolamenti estrogeno-indotta, e indicano effetti primari di effetti secondari. Confronti Bioinformatical con studi cromatina vincolante di ERa possono ulteriori aiuti nella differenziazione di primaria rispetto agli effetti secondari. Il test ha comportato una valutazione affidabile della normativa miRNA dove potrebbe essere stabilito che dopo 24 ore di trattamento E2 trascritti codificanti proteine ​​sono state prontamente regolati ma miRNA maturi non sono stati influenzati 1. Tuttavia, è possibile che miRNAs sono regolate a successivi punti temporali, come dimostrato nell'analisi di serie temporali di miRNA selezionati 1. I dettagli devono essere ulteriormente esplorato e il protocollo presentato qui offre un robust modo per studiare regolazione ormonale dei miRNA maturi in linee cellulari di cancro al seno.

Protocol

1. Preparazione di Cell Culture Media

  1. Per T47D linea cellulare di coltura:
    1. Mescolare 500 ml di mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con 500 ml F12 [DMEM/F12 (1:1)] in un autoclave 1 L bottiglia.
    2. Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino (questo rende il 5% FBS), e poi 10 ml di penicillina di streptomicina (questo fa 1% PEST). Mescolare completamente il contenuto.
    3. Conservare a 4 ° C.
  2. Per MCF7 linea cellulare di coltura:
    1. Mescolare 500 ml DMEM con 25 ml di FBS (5% FBS), quindi 5 ml di penicillina di streptomicina (1% PEST).
    2. Conservare a 4 ° C.
    3. Per siero ridotto di coltura:
      1. Per T47D: Mescolare 500 ml di fenolo DMEM privo di rosso con 500 ml F12 (1:1) in un autoclave 1 L bottiglia, e aggiungere 50 ml di destrano rivestite di carbone-trattati (DCC) FBS per il 5% DCC-FBS. Effettuare una bottiglia separata con 5 ml DCC-FBS 0,5% DCC-FBS. Quindi, aggiungere 10 ml di Pest (1% PEST) per ogni bottiglia. Mescolare completamente il contenuto, store a 4 ° C.
      2. Per MCF7: Mescolare 500 ml di fenolo DMEM privo di rosso con 5 ml di 100x L-glutammina (200 mm di concentrazione finale). Aggiungere 25 ml di DCC-FBS (5% DCC-FBS). Effettuare una bottiglia separata con 2,5 ml di DCC-FBS (0,5% DCC-FBS). Quindi, aggiungere 5 ml di Pest (1% PEST) per ogni bottiglia. Mescolare contenuti completamente, conservare a 4 ° C.
    4. Per la soluzione tampone fosfato salino (PBS):
      1. Riempire una bottiglia di vetro autoclavato 1 L con acqua ultrapura o acqua distillata.
      2. Aggiungere una compressa PBS e agitare di tanto in tanto fino tablet si è sciolta.
      3. Autoclave soluzione PBS e conservare a temperatura ambiente.
    5. Preparazione delle scorte ligando:
      1. Preparare una soluzione madre di 100 mm E2 sciogliendo 2,72 mg di 17β-estradiolo in 100 ml di etanolo o DMSO in una sterile 1,5 ml provetta, e mescolare il contenuto con precauzione. Spin brevemente e fare diluizioni seriali (1:10) per produrre 10 mm, 1 mm e 0,1 mm magazzino Concentrazionezioni utilizzando il solvente. Conservare tutte le soluzioni di archivi E2 a -20 ° C.
      2. Preparare una soluzione madre 100 mm di ICI sciogliendo 6.07 mg di ICI 182.780 in 100 microlitri EtOH o DMSO in una sterile 1,5 ml provetta, e mescolare il contenuto con precauzione. Spin brevemente e fare diluizioni seriali (1:10) per produrre 10 mm, 1 mm, 0,1 mm concentrazioni di archivi utilizzando il solvente. Conservare tutte le soluzioni di archivi ICI a -20 ° C.
      3. Il veicolo è il solvente (etanolo o DMSO). Mettere 0,5-1 ml di etanolo al 100% o DMSO in una sterile 1,5 ml provetta, e conservare a -20 ° C.

2. Cella Cultura e trattamento

Eseguire ogni trattamento in lastre doppie o triplicato per replicati tecnici. Ripetere cella procedura di coltura e il trattamento utilizzando un diverso passaggio della stessa linea cellulare, che fungerebbe da replicare biologica di questa linea cellulare. Ripetere il procedimento con una linea cellulare diverso replficato risultati in più di una linea cellulare. Tutte le tecniche di coltura cellulare devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.

  1. Cella cultura startup
    1. Riscaldare il supporto a 37 ° C in un bagno di acqua calda sterile.
    2. Scongelare una fiala congelata di cellule T47D o MCF7.
    3. Pulire l'esterno della fiala e bottiglia di media con il 70% di etanolo, e quindi posizionare sia fiala e bottiglia in cappa a flusso laminare sterile.
    4. Etichettare un pallone T-75 sterile conseguenza (nel cappuccio).
    5. Aggiungere 12-15 ml di supporto appropriato nel pallone usando una pipetta sierologica sterile (assicurarsi che la superficie sia completamente ricoperta di media).
    6. Trasferire le cellule dal flaconcino al pallone, e mescolare delicatamente.
    7. Mettere pallone in un incubatore a 37 ° C, in dotazione con il 5% di CO 2.
  2. Preparazione delle cellule per il trattamento
    1. Prendere le cellule fuori dell'incubatore e osservare al microscopio per assicurare che le cellule sono almeno 80% confluent. Questo per garantire che ci siano abbastanza cellule per esperimento. Trasferimento pallone cappa sterile.
    2. Rimuovere i supporti dal beuta con una pipetta Pasteur sterile collegato ad un vuoto. Lavare delicatamente le cellule attaccate due volte con PBS.
    3. Aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA caldo al pallone, e mettere matraccio in incubatrice per 2 min. Questo per rendere le cellule si staccano dal pallone.
    4. Aggiungere circa 3-4 ml di appropriati mezzi caldi al pallone e triturare le cellule staccate con un 5 ml pipetta sierologica. Triturare prendendo le cellule nella pipetta sierologica e rilasciando le cellule con la punta della pipetta posto contro il fondo del pallone per aumentare la pressione. Questo è per rompere le cellule scomposto in singole cellule.
    5. Contare le cellule, per esempio usando un contatore di cellule, secondo il protocollo del produttore.
    6. Etichettare 100 lastre mm (se necessario) e aggiungere circa 10 ml di media per i piatti. Piatto circa 2,0 x 10 6 cellule / piastra. Distribuire cellule gentle vorticoso le piastre.
    7. Incubare le cellule per 24-48 ore, fino a circa l'80% confluenti.
    8. Al 80% di confluenza, lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere il 5% mezzi DCC-FBS appropriate. Poi, incubare cellule per 24 ore.
    9. Dopo 24 ore, lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere il 0.5% dei media DCC-FBS appropriate. Poi, incubare cellule per ulteriori 48 ore.
  3. Trattamento con cellule
    1. Dopo 48 ore, lavare le cellule due volte con PBS. Assicurarsi di rimuovere la maggior quantità di PBS possibile.
    2. In un tubo da 15 ml, aggiungere 10 ml di 0.5% supporto DCC-FBS appropriate. Poi, aggiungere 1 ml di ligando magazzino 0,1 mM (E2 o ICI) per una concentrazione finale di 10 nM. Inoltre, aggiungere 1 ml di veicolo a 10 ml media in un tubo separato per l'esperimento di controllo.
    3. Mescolare il contenuto in provetta delicatamente e aggiungere alle cellule nella piastra. Questo dovrebbe essere un ligando per piastra.
    4. Incubare le cellule per il punto temporale prescelto (0-72 ore).
<p class = "jove_title"> 3. RNA Estrazione e Controllo Qualità

  1. Estrazione di RNA
    1. Dopo il trattamento è finito per il periodo di tempo desiderato, lavare le cellule due volte con PBS, poi aggiungere circa 1-2 ml Guanidinium soluzione di tiocianato-fenolo alle cellule nella piastra. ATTENZIONE: Guanidinium soluzione di tiocianato-fenolo è tossico per contatto con la pelle o con gli occhi, per inalazione o ingestione. Indossare indumenti protettivi, guanti e protezione per gli occhi / la faccia, e utilizzare cappa.
    2. Assicurarsi che il volume delle cellule è non più del 10% del volume di soluzione di tiocianato-fenolo Guanidinium, e che la piastra è rivestita con la soluzione e lasciare riposare per 1 min. Poi, raschiare le cellule con un raschietto di gomma e trasferire in una provetta. Le celle possono essere memorizzati in questa soluzione a -80 ° C per settimane.
    3. Estrarre e purificare RNA totale da ogni trattamento con il metodo del tiocianato-fenolo-cloroformio guanidinio seguito da centrifuga purificazione colonna e DNasiI DNA metodo degrado per le cellule animali.
    4. Dopo l'estrazione, le cellule vengono eluite in 60 acqua RNase-free microlitri. Aliquota 1-2 ml di RNA per l'analisi e la quantificazione negozio di RNA a -80 ° C.
    5. Misurare le concentrazioni di RNA usando 1 ml di RNA e aspectrophotometer. Assicurarsi che vi sia un vuoto presa prima di una misurazione è fatto. Inoltre, pulire completamente il tempo spettrofotometro portata una misura è presa. Le concentrazioni sono solitamente riportati in ng / mL. Salvare i risultati con concentrazioni di RNA.
  2. Controllo di qualità RNA
    1. Prendete circa 100 ng RNA di ciascun campione e posto in una provetta.
    2. Misurare l'integrità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore. Di solito 12 campioni possono essere eseguiti in una sola volta in un bioanalizzatore. Eseguire solito dura circa 25 min.
    3. Confrontare i risultati con la scaletta RNA per garantire che l'RNA è buono per esperimento. Salvare e risultati di stampa.

4. Conferma di Treatmento: qPCR di geni codificanti proteine

  1. sintesi del cDNA
    1. Prendere 500 ng o 1 mg di RNA totale (di ogni campione) e messo in una provetta 1,5 ml microcentrifuga. Portare il volume di ciascuna provetta fino a 10 ml con acqua priva di RNasi.
    2. Aggiungere 2 ml di 50 mM Hexamer primer casuali e tubi di calore a 70 ° C per 10 min.
    3. Trasferimento tubi in ghiaccio per 5 min.
    4. Per ogni campione, aggiungere 4 ml di 5x primo buffer strand, 1 ml di 0,1 M DTT, 1 ml di dNTP 10 mM, 0,5 ml di apice III, e 1,5 di acqua RNase-free microlitri.
    5. Porre le provette in un blocco di calore di 25 ° C o bagnomaria per 10 min.
    6. Tubi di trasferimento di un blocco di calore 46 ° C per 1 ora. Poi, tubi di trasferimento di un blocco di calore a 70 ° C per 15 minuti per fermare la reazione.
    7. Diluire il cDNA per un / magazzino ml 5 ng (calcolata utilizzando il metodo di RNA totale) con acqua RNase-free per le diluizioni e conservare a -20 ° C.
  2. qPCR
    1. Ottenere primer per i geni di interesse e di riferimento geni. Primer possono essere facilmente progettati utilizzando lo strumento di progettazione primer su programma Primer-BLAST del NCBI 12. Questo di solito genera un primer in avanti e retromarcia per ogni gene di interesse. Primers dovrebbero essere 18-22 bp di lunghezza, hanno una temperatura di fusione di 52-58 ° C, hanno un contenuto di GC del 40-60%, e una lunghezza amplicone di 100-180 bp.
    2. Per ogni reazione qPCR bene, aggiungere 10 ng di cDNA (2 ml di concentrazione magazzino dal punto 4.1.7), 1 pmol di ciascuno degli avanti e reverse primer del gene di interesse (dal punto 4.2.1), e 5 ml di 2x Cyanine colorante PCR master mix. La reazione per ciascun pozzetto dovrebbe avere un volume di reazione finale 10 microlitri.
    3. Assicurarsi che non ci sono pozzi triplicato per ogni campione per ogni gene (per replicati tecnici). Una piastra di reazione 96 pozzetti può essere utilizzato.
    4. Sul software di sistema qRT-PCR, assegnare il giornalista e di destinazione, immettere volume di reazione, selezionare la comparativaMetodo ciclo soglia (ΔΔCt), e definire pozzetti del campione.
    5. Assicurarsi di eseguire l'analisi della curva di fusione per tutte le esecuzioni Cyanine colorante per confermare l'amplificazione di un frammento specifico. Eseguire le piastre utilizzando le impostazioni predefinite per la corsa.
    6. Salvare i risultati dopo l'esecuzione, ed esportare i dati (in particolare i valori CT a MS Excel).
  3. analisi dei dati qPCR utilizzando la formula ΔΔCT
    La variazione di espressione mRNA relativa può essere calcolata come piega variazione rispetto al controllo sulla Excel per ogni campione mediante la seguente procedura:
    1. Tutti i risultati esportati dalla qPCR sopra dovrebbero avere i valori Ct inclusi. Calcolare il valore ΔCT utilizzando la seguente formula:
      • ΔCT = CT (gene target) - CT (gene di riferimento)
      Questo dovrebbe essere fatto per ogni campione. L'obiettivo è il gene o miRNA di interesse.
    2. Successivamente, calcolare la deviazione standard totale (SD) per ogni campione. Primo calcolarela SD per il gene di riferimento e quindi calcolare la deviazione standard per il gene bersaglio (questo può essere fatto in Excel utilizzando la funzione STD DEV sui valori CT). Quindi calcolare la deviazione standard totale per ogni campione utilizzando questa formula:
      • Totale SD = (SD2 (target) + SD2 (di riferimento)) 1/2
    3. Calcolare il ΔΔCT di ciascun campione all'interno di un gene (target) da:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (trattato campione / test) - ΔΔCT (controllo / campione calibratore)
      Il campione calibratore è il campione non trattato.
    4. Infine, calcolare i valori pieghevole change (FC) di ogni campione mediante la formula:
      • FC = 2-ΔΔCT
      Il valore pieghevole variazione di ciascun campione dà l'espressione relativa del gene / miRNA che è stato normalizzato al gene di riferimento e il campione di controllo.
    5. T-test di Student può essere utilizzato per l'analisi statistica utilizzando distribuzione a due code e due campioni varianza disugualeparametri: (P <0.001 (***), P <0,01 (**), e P <0.05 (*)). Ciò può essere ottenuto su Excel. Verificare che il trattamento ha provocato nella regolazione degli obiettivi noti prima di procedere con miRNA profiling.

5. miRNA Profiling Analysis

  1. miRNA microarray
    1. Prendere 5 microgrammi di RNA isolato da cellule trattati con veicolo o legante, e posto in una provetta. Regolare il volume in tubo da 20 ml. Ogni confronto deve essere eseguita in duplicati o triplicati.
    2. Eseguire il microarray miRNA utilizzando i campioni di RNA di cui sopra. profili di espressione miRNA microarray devono essere determinate con microarray miRNA umani array doppio colore campione μParaflo Microfluidic biochip Technology (Sanger miRBase uscita 14.0) 13.
    3. I risultati dovrebbero mostrare miRNA differenzialmente espressi. Considerare significative espressioni miRNA quando p <0.05.p valore <0.10 può anche essere considerato per un'ulteriore cooperazioneanalisi nfirmatory utilizzando qPCR. Salvare lista miRNA per ulteriore validazione con qPCR.
  2. miRNA profiling: DLP-LDA
    1. Ogni campione deve essere analizzato in duplicato o triplicato. Prendere 700 ng di RNA totale da cellule trattati con veicolo o legante, e metterli in una provetta. Regolare il volume in tubo a 3 ml.
    2. Eseguire la sintesi del DNA utilizzando il metodo di analisi Probes miRNA doppia etichetta e 10x primer RT. Il volume totale di ogni reazione dovrebbe essere di 7,5 microlitri.
    3. Mettere tubo di reazione del sistema Thermocycler PCR, e impostare i parametri raccomandati come indicato nella doppia etichetta metodo di dosaggio Sonde miRNA. Avviare la corsa. Questo genererà cDNA. Si noti che il cDNA può essere conservato a -20 ° C per almeno 1 settimana.
    4. Mentre la reazione RT è in funzione, togliere le piastre DLP-LDA e lasciar riposare a temperatura ambiente. Ogni piastra matrice contiene 384 pozzi che contengono primer miRNA unici e primer di controllo.
    5. Take 6 ml di cDNA (da 5.2.3) e posto in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 450 microlitri della miscela master Probes 2x Universal PCR doppia etichetta e aggiungere 444 di acqua RNase-free microlitri.
    6. Capovolgere il tubo circa sei volte per mescolare il contenuto e centrifugare brevemente.
    7. Quando la piastra DLP-LDA ha raggiunto la temperatura ambiente, carico di 100 ml in ciascuna delle otto 'Riempi porto' del piatto. Poi, centrifugare la piastra matrice.
    8. Aprire il sistema qRT-PCR e controllare che il blocco è che per la piastra a 384 pozzetti. Impostare esecuzione utilizzando il software SDS. Selezionare quantificazione relativa (Ct), selezionare il numero pozzo e tipo di matrice, e inserire la descrizione del campione per definire pozzetti.
    9. Eseguire matrice usando le condizioni di ciclo termico di default. Quando corsa è terminata, salvare i risultati e l'esportazione in MS Excel e salvare per ulteriori analisi utilizzando la formula ΔΔCT (punto 4.3).

6. La conferma dei regolamenti miRNA con separataAnalisi qPCR

  1. Cyanine colorante analisi qPCR
    1. Primer design per l'analisi miRNA desiderato. Sequenza dei miRNA maturo, che equivale al primer forward, può essere ottenuto da mirbase.org 14. Convertire tutti i 'U' a 'T'.
    2. Preparare cDNA: Prendere 1 mg di RNA totale e posto in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Seguire le istruzioni per polyA tailing e primo filamento sintesi di cDNA di miRNA da un protocollo cDNA Synthesis e qRT-PCR miRNA primo filamento. Diluire il cDNA risultante (1,10) e conservare a -20 ° C.
    3. Ottenere una piastra di reazione a 96 pozzetti.
    4. Per ogni reazione miRNA qPCR bene, aggiungere 16 ng di cDNA polyA (dal punto 6.1.2), 2 pmol di ciascun primer forward specifico (dal punto 6.1.1) e il primer universale (dal kit dal punto 6.1.2 ), e 5 ml di 2x qPCR master mix. Volume di reazione finale è 10 microlitri / pozzetto.
    5. Assicurarsi che non ci sono pozzi triplicato per ogni campione per ogni miRNA (per replicati tecnici). Anche, Assicurarsi che un gene di riferimento (di solito U6 snRNA) è incluso.
    6. Sul software di sistema qRT-PCR, assegnare il giornalista e di destinazione, immettere volume di reazione, selezionare il ciclo soglia comparativa (ΔΔCT) metodo, e definire pozzetti del campione.
    7. Eseguire le piastre utilizzando le impostazioni predefinite per la corsa. Assicurarsi di eseguire l'analisi della curva di fusione per tutte le esecuzioni Cyanine tintura. Ciascuna curva di fusione dovrebbe mostrare solo picco specifico per confermare l'amplificazione di un frammento specifico. Se si osserva più di un picco o nessun picco chiara, i primer non sono specifici ei dati non possono essere utilizzati.
    8. Salvare i risultati dopo l'esecuzione, ed esportare i dati (in particolare i valori CT a MS Excel).
  2. Etichettato analisi Doppio Sonde qPCR
    1. Prendere 10 ng di ogni RNA totale, ognuno in un volume di 5 ml e il luogo in 0,2 ml provetta.
    2. Seguire le istruzioni del protocollo su come eseguire la trascrizione inversa (RT) con la doppia etichetta Sonde MicroRNA trascrittasi inversa Kit 15. Ogni volume totale di reazione dovrebbe essere di 15 ml. Si noti che per le reazioni Sonde RT doppia etichetta, ci sono primer specifici per ogni miRNA da studiare.
    3. Inserire il tubo di reazione del sistema termociclatore PCR, e impostare i parametri secondo il protocollo indicato al precedente punto 6.2.2. Avviare la corsa. Si dovrebbe prendere circa 70-80 min.
    4. Dopo la reazione RT, diluire il cDNA campione in un rapporto 1:5, e memorizzare tutti cDNA al buio a -20 ° C.
    5. Ottenere una piastra di reazione a 96 pozzetti.
    6. Per ogni reazione miRNA qPCR bene, aggiungere il seguente: 10 ml di sonde a doppia etichetta 2x Universal PCR Master Mix (lo stesso reagente come punto 5.2.5), 7,67 ml di acqua RNase-free, 1 ml di 20 × tempo reale analisi di fondo (specifico per ogni miRNA), e 1,33 ml di cDNA da sopra passo 6.2.4. Questo dovrebbe essere un volume finale di reazione di 20 microlitri. Mescolare delicatamente il contenuto, e centrifugare brevemente.
    7. Assicurarsi che esimoere sono pozzetti in triplicato per ogni campione per ogni miRNA (per le repliche tecniche). Inoltre, assicurarsi che un gene di riferimento (di solito U6 snRNA) è incluso.
    8. Sul software di sistema qRT-PCR, assegnare il reporter (FAM) e quencher (NFQ-MGB) per ogni miRNA (target) di interesse, immettere volume di reazione, selezionare il ciclo soglia comparativa (ΔΔCt) metodo, e definire pozzetti del campione.
    9. Seguire le istruzioni per la configurazione dei parametri per il qPCR gestito dal protocollo del test Sonde microRNA doppia etichetta. Poi, inizia la corsa. Salvare i risultati dopo l'esecuzione, ed esportare i dati (in particolare i valori CT a MS Excel).

Representative Results

Una panoramica dell'approccio è presentata nella Figura 1 e un confronto tra i vari campioni preparati e modifiche di acido nucleico richieste per ogni tecnica viene visualizzato in Figura 2.

La condizione e l'ambiente delle cellule prima del trattamento con un ormone è importante per determinare gli effetti reali dell'ormone 16. Alcuni medio e siero contengono fattori di crescita che possono influenzare i risultati, così cellule sono affamate di siero per garantire che tutti gli effetti ormonali sono stati ridotti al minimo. Pertanto, quando il trattamento con E2, c'è più certezza che gli effetti osservati sono E2-associati. Un fattore importante è la confluenza di cellule, che influenza contatto e comportamenti come segnale e la proliferazione cellula-cellula cellula-cellula. Le cellule sono stati autorizzati a essere 80% confluenti (Figura 3A) e ben collegata a consentire la crescita ed evitare la perdita di cellule durante il successivo lavaggio e supporti change.

Le condizioni durante l'estrazione dell'RNA e stoccaggio sono importanti per la qualità del RNA e successiva analisi. È anche noto che il numero di cellule, il metodo di estrazione, e il contenuto di GC del miRNA possono influenzare la resa e la qualità di mRNA e miRNA 17. Pertanto, è necessario effettuare l'estrazione di RNA in condizioni RNase-free e controlla la qualità dell'RNA prima di procedere con esperimenti. Dopo l'estrazione, la quantificazione del RNA fornisce informazioni sulla concentrazione dell'RNA totale (contenente sia mRNA e miRNA), che permette l'osservazione dei rendimenti. Esso fornisce anche una rappresentazione grafica dei risultati come mostrato nella figura 3B, e questo permette l'osservazione della purezza del campione (tipicamente indicato con un picco, pannello superiore). Scarso rendimento di RNA produrrebbe alcun assorbimento specifico a 260 nm (figura 3B, pannello inferiore). Per determinare se l'RNA è di alta qualità, RNAintegrità è stata misurata. Un numero integrità dell'RNA (RIN) compresa tra 9-10 assicura che l'RNA non è degradato ed è di ottima qualità. Inoltre, la rappresentazione grafica del RNA deve essere osservato, e il 18S e 28S rRNA dovrebbe avere picchi come mostrato nella Figura 4 (pannello centrale). Il confronto con la scala (figura 4, pannello superiore) identifica la dimensione dei picchi. Un RNA degradato avrebbe picchi meno chiare e una quantità relativamente ridotta del 18S e 28S rRNA (figura 4, pannello inferiore). La frazione di piccoli RNA può essere ulteriormente garantita utilizzando il Kit Agilent Small RNA. Si raccomanda di convalidare risposta estrogeni dopo il trattamento, nelle condizioni sperimentali specificate, prima di procedere allo screening miRNA. Un qPCR può essere eseguita su un noto ER gene bersaglio come PS2 o SPINK4 18, utilizzando cDNA. Tali geni sono di solito sovraregolati entro 1-24 ore dopo il trattamento E2. Una volta che la qualità dell'RNA e la risposta estrogeniè stato valutato, ulteriore esperimento può essere condotto.

Microarray è ancora una tecnica largamente usata per lo screening su larga scala per miRNA nelle cellule. Ad esempio, il microarray miRNA, una volta utilizzato conteneva 894 miRNA maturi e 50 controlli sonde uniche in quartine 1. Ibridazioni sono state eseguite in duplicato con procedura di scambio colorante. I risultati microarray miRNA sono generalmente rappresentati graficamente con mappe di calore. Figura 5A mostra una mappa di calore, che rappresenta i dati da un confronto microarray miRNA tra il veicolo e E2 campioni trattati. Il rosso indica che il miRNA è upregulated nel campione E2-trattato (espressione superiore), mentre il verde indicato downregulation del miRNA (espressione inferiore). La selezione miRNA di solito dipende dalla loro importanza nella espressione, e di solito un p-value inferiore a 0.05 è considerato significativo. I miRNA che sono indicate per essere espresso in modo differenziale dovrebbero essere ulteriormente validati wesimo qPCR, per distinguerli dai falsi positivi.

La matrice DLP-LDA, invece, utilizza un metodo basato qPCR per schermare per miRNA regolamentati in un formato 384 pozzetti. Di solito due piastre da 384 pozzetti (carte) sono forniti, piscine A e B. Girone A di solito contiene meglio caratterizzati e più altamente espresso miRNA rispetto alla piscina B. Il livello relativo di ciascun miRNA sono determinati da qPCR, dove si miRNA viene analizzato per pozzo (Figura 5B). Una maggiore Ct-valore indica l'espressione dei miRNA minore. Molto simile al microarray miRNA, i risultati raggiunti dal DLP-LDA devono essere ulteriormente convalidato per garantire l'accuratezza.

Convalide possono essere eseguite utilizzando qPCR. Qui, due metodi di rilevazione qPCR sono descritti per prevenire metodo pregiudizi e per consentire la conferma completa e indagine dei regolamenti miRNA. La chimica di rilevamento Cyanine dye fabbrica diversa da DLP che il profiling DLP-LDA si basa su, ed è adatto per confermafini di cooperazione. Può essere meno specifici come rileva tutto il DNA a doppio filamento amplificato, ma l'omogeneità del campione può essere valutata mediante un'analisi fusione curva. Figura 6A (pannello di sinistra) mostra l'analisi di fusione curva di un miRNA, e picco uniforme chiaramente definito può essere visto. Picchi multipli sarebbero stati rispettati se il primer è importi non specifici o significative di primer-dimero si forma (figura 6A, pannello di destra). Saggi DLP miRNA invece, è più specifico come solo l'amplificazione del bersaglio viene rilevato miRNA. Trame di amplificazione di ogni target di miRNA possono essere osservate, come esemplificato nella figura 6B. La possibilità di controllare il verificarsi di molteplici prodotti di amplificazione usando l'analisi della curva di fusione è, tuttavia, non disponibile con questa chimica e Cyanine colorante qPCR è meno costoso. Cyanine tintura e DLP qPCR saggi possono a volte generare risultati leggermente diversi. Per entrambi i saggi qPCR, rispetto ad un refegene renza è necessaria per determinare l'espressione di geni tra due campioni. Il gene di riferimento, indicato anche come gene housekeeping, dovrebbe essere un gene la cui espressione non è cambiata e che è espressa a livelli simili a quelli del gene di interesse. Un esempio di un gene di riferimento adatto in queste linee cellulari di cancro al seno è ARHGDIA, un PIL Rho-Dissociazione Inhibitor che funziona reazioni di scambio GDP / GTP delle proteine ​​Rho. Come osservato nella Figura 6C (alto), il livello di mRNA ARHGDIA non viene modificato tra il veicolo ed i campioni trattati con ligando. Il 18S rRNA può anche essere utilizzato, anche se la sua alta espressione richiede una diluizione 1:500 separata del cDNA magazzino ed è pertanto meno opportuno. Per l'analisi miRNA, c'è ancora una discussione su un gene di riferimento ben definita. Finora, l'U6 snRNA è un gene di riferimento che è ampiamente accettato per l'analisi miRNA. U6 snRNA è il ~ lungo 110 nucleotidi, codificante piccolo RNA nucleare che funzionano in nucleare pre-mRNA splglassa 19. Come osservato nella Figura 6C (in basso), i livelli di espressione U6 sono circa gli stessi in tutti i campioni indicati, permettendo così di calcolo dei livelli variabili di miRNA. Una rappresentazione grafica di un risultato miRNA qPCR per un confronto tra il veicolo e le cellule trattate con E2 che sono stati normalizzati alla U6 riferimento può essere osservato nella Figura 6D. Questo illustra un miRNA che sono stati rilevato come sregolata dopo il trattamento 24 ore E2, ma che porti ER-cromatina siti di legame vicino alla sua posizione genomica e analisi delle serie temporali identificato regolamentazione significativo 72 ore dopo il trattamento.

Figura 1
Figura 1. Una panoramica del metodo impiegato per il rilevamento della regolazione ormonale del miRNA in cellule di cancro al seno.

Figura 2
Figura 2. Il confronto tra le varie preparazioni del campione e manipolazioni di acidi nucleici per ogni tecnica di rilevamento miRNA. (A) miRNA microarray utilizzando il metodo tecnologia μParaflo comprende arricchimento, poly-A tailing ed etichettatura legatura. (B) preparazione del campione tecnologia DLP e metodo di rilevazione comprende un loop cDNA sintesi di primer che si estende dopo la fase di denaturazione e offre un frammento più lungo ospitante il preparazione del campione inverse primer e sequenza di sonda. (C) tecnologia Cyanine colorantee metodo di rilevazione comprende poli A-tailing, e la sintesi cDNA con un primer oligo-dT tra cui una sequenza universale 5 '.

Figura 3
Figura 3. Coltura cellulare e l'estrazione di RNA. (A) le cellule coltivate per illustrare l'80% di confluenza necessario prima del trattamento con ligando. (B) Rappresentazione grafica della concentrazione dell'RNA e la purezza dopo l'estrazione. Ogni picco rappresenta un campione e un processo di estrazione con successo produce RNA puro (pannello superiore). Un RNA estratto male non mostra alcun picco di assorbimento chiara a 260 nm (pannello inferiore).

Figura 4
Figura 4. & #160; controllo di qualità RNA risultati di analisi dell'integrità dell'RNA mostra la rappresentazione grafica per la scala (in alto), un RNA di buona qualità (al centro) e un campione di RNA degradato (in basso)..

Figura 5
Figura 5. L'illustrazione di miRNA risultati profiling. (A) Una rappresentazione mappa termica di miRNA risultati di microarray per miRNA differenzialmente espressi. miR-A, B, C sono upregulated in-campione trattato E2 come indicato in rosso, mentre miR-D, E, F, G sono smorzati nel campione E2-trattate a verde. (B) Trame amplificazione per ciascun miRNA dai risultati DLP-LDA. miRNA rilevati sono amplificati come indicato dalla incremento del valore Rn.

Figura 6 Figura 6. analisi qPCR dei regolamenti miRNA. (A) Analisi di fusione curva per un miRNA analizzati utilizzando il rilevamento Cyanine colorante, mostrando l'omogeneità di tutti i campioni esaminati (a sinistra) e l'amplificazione di frammenti multipli (a destra). (B) appezzamenti di amplificazione per ogni campione per un miRNA. Questo può essere sia da Cyanine tintura o DLP metodi di rilevamento. (C) rappresentazione grafica Bar di geni di riferimento adeguati per l'mRNA analisi ARHGDIA (in alto) e per l'analisi dei miRNA snRNA U6 (in basso), che non mostrano espressione differenziale significativo tra i campioni. (D) risultati miRNA qPCR per illustrare il confronto dei livelli di espressione relativi di miR-135a nel corso di un corso di tempo. Figura 6D è stato ristampato da Katchy et al. 1 con il permesso di Elsevier. I valori sono di solito la media di compe separatoiments (duplicati biologici) ± SD. T-test di Student serve a dimostrare significato: * p <0,05.

Discussion

Determinazione del meccanismo di regolazione ormonale del miRNA in cellule di cancro al seno in grado di fornire una piattaforma per la comprensione di questa malattia e può fornire un potenziale trattamento per il cancro al seno. Coltura di tali cellule per fornire la condizione ottimale per l'azione ormonale è molto importante. Qui, un protocollo che garantisce che l'ormone di interesse (estrogeni) è stata esclusa prima del trattamento e che la dose ottimale di E2 è stato utilizzato per un tempo adeguato durante il trattamento è stato descritto. Altri effetti dei fattori ormonali e di crescita sono stati mantenuti al minimo riducendo gradualmente i livelli sierici e utilizzando DCC-FBS, che è FBS che sono stati privati ​​della maggior parte del suo ormone, citochine e fattori di crescita. Fenolo mezzi privi di rosso è stato ulteriormente utilizzato per ridurre altri effetti non ormonali, dato che il fenolo rosso è stato segnalato per avere attività estrogenica e influenzare alcune funzioni in linee cellulari 20,21. Il tempo di esposizione delle cellule alla ormone è di grande importanza. Per la regolazione degli estrogeni associati dei geni, è stato precedentemente dimostrato che 24-hrexposure produrre risposta significativa di geni bersaglio diretti in cellule di carcinoma mammario 1,18. Poiché miRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi II, come mRNA, è ipotizzabile che questo è un punto di tempo idoneo a rilevare regolamentazione diretta anche dei miRNA. E 'ancora da definire se e come questi miRNA influenzano l'espressione di questi obiettivi ER noti in cellule di carcinoma mammario.

miRNA profili di espressione può essere difficile a causa della piccola dimensione relativa del miRNA, il fatto che la sequenza matura miRNA possono essere trovate anche nella pri-miRNA e pre-miRNA, ea causa della eterogeneità nel loro contenuto GC 22. Diverse tecniche di profilazione e chimiche sono state impiegate per superare questa difficoltà. Tra questi sono diversi approcci di microarray e analisi qPCR (Figura 2). Anche se microarray è ampiamente accettato per intero anale genomalisi, può fornire falsi negativi e sono presenti differenze tra le piattaforme disponibili, che vanno dalla chimica alla tecnologia di stampa 23. Anche il processo di normalizzazione rappresenta una sfida quando si analizzano i relativamente pochi geni miRNA, che si contano in migliaia, rispetto alle decine di migliaia di trascritti di mRNA. qPCR, d'altra parte, è più sensibile, ed è meglio applicato quando meno geni sono da considerare. Tuttavia, quando eseguito in piastre da 384 pozzetti grandi, con solo un replicato tecnica per piastra, piastre multiple devono essere analizzati per ciascun campione che rende l'analisi costosa. Inoltre, nelle nostre mani, molti più risultati falsi negativi sono stati ottenuti usando l'analisi DLP-LDA rispetto al microarray. Dato che la sequenza matura miRNA è presente nel pri-miRNA e le sequenze pre-miRNA, è di interesse per distinguere tra queste trascrizioni utilizzando tecniche di PCR 24. Sonde DLP sono anche disponibili per il pre-miRNA, e spprimer ecific possono anche essere progettati per escludere diverso maturi o precursore varianti usando Cyanine colorante tecnologia qPCR.

qPCR è uno standard d'oro per la convalida di espressione differenziale di profilazione risultati. L'efficacia del qPCR, tuttavia, dipende da vari parametri tra cui l'estrazione di RNA, integrità dell'RNA (qualità), sintesi di cDNA, progettazione di primer, metodo di rilevamento (chimica), e il gene di riferimento per la normalizzazione dei dati 1,22,25. Le opzioni per la progettazione di primer per l'analisi dei miRNA è molto limitata, dal momento che a breve miRNA lunghezza della sequenza non dà spazio a molto il design fondo alternativo, e solo un innesco possono essere nutrito in questa breve sequenza. Di qui, la necessità di manipolazioni alternativi come illustrato nella Figura 2. Replicati tecnici sono importanti per convalidare robustezza del metodo di amplificazione e il procedimento usato. Repliche biologiche sono necessari per una rappresentazione della variatio biologico generalen, compresa la risposta variabile al ligando del trattamento, e per dimostrare che gli effetti osservati in una cella sono riproducibili. Sulla base della nostra esperienza, possono verificarsi variazioni di espressione di miRNA tra colture cellulari. Solitamente queste differenze sono meno di 1,3 volte, e la media dei valori e corrispondenti SD identifica la variazione naturale e tecnologico. Questa variazione potrebbe derivare da vari fattori tra cui, densità cellulare e il fatto che le funzioni cellulari possono cambiare da passaggio per passaggio. Per identificare statisticamente significative espressioni derivanti dal trattamento ligando, un significato largamente accettata è quando il p-value è inferiore a 0.05. Qui, sono state utilizzate t-test di uno studente sulle replicati biologici e tecnici che utilizzano il due campioni parametri di varianza disuguale distribuzione a due code e. Esistono altri parametri t-test, e la scelta dipende dal setup sperimentale 26.

Un protocollo dettagliato per valutare regolamenti ormonali maturo miRNA in cellule di cancro al seno è stato fornito. Importanti tecnologie e la chimica di profiling e la convalida di questi miRNA espressioni sono stati chiaramente spiegati. La tecnologia scelta per gli studi di miRNA in cellule di cancro al seno dipende in ultima analisi su ciò che esattamente è indagato.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati al Dr. Xiaolian Gao, Università di Houston, per fornire consulenza alla piattaforma microarray LC Scienze miRNA, il dottor Karin Edvardsson, Karolinska Institute, in Svezia, e il dottor Eylem Aydogdu, Università di Houston, per condividere la loro esperienza miRNA . Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health nel quadro Premio Numero R01CA172437. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Questo lavoro è stato supportato anche da sovvenzioni dal Texas Emerging Technology Fund, ai sensi dell'accordo di no. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

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