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Medicine

स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एस्ट्रोजन विनियमित microRNAs की रूपरेखा

doi: 10.3791/51285 Published: February 21, 2014

Summary

एस्ट्रोजन और microRNAs दोनों के माध्यम से संकेत आण्विक स्तन कैंसर के विकास और विकास में महत्वपूर्ण हैं. एस्ट्रोजन प्रतिलेखन कारक हैं जो एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स को सक्रिय करता है. कई प्रतिलेखन कारक microRNAs की अभिव्यक्ति को नियंत्रित कर सकते हैं, और एस्ट्रोजन विनियमित microRNAs विभिन्न बड़े पैमाने पर तकनीक का उपयोग कर profiled किया जा सकता है.

Abstract

एस्ट्रोजन स्तन ग्रंथि विकास और स्तन कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. यह करने के लिए बाध्य है और एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स (नेताओं), ERα, और ERβ को सक्रिय करने के द्वारा अपने कार्य मध्यस्थता करता है. ERα अक्सर स्तन कैंसर में upregulated और स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रसार को ड्राइव है. नेताओं प्रतिलेखन कारक के रूप में कार्य और जीन अभिव्यक्ति को विनियमित. प्रोटीन जीन कोडिंग की ERα के नियमन अच्छी तरह से स्थापित है, जबकि microRNA (miRNA) noncoding के अपने विनियमन कम का पता लगाया है. miRNAs उनके अनुवाद बाधा या उनके mRNA अपमानजनक, जीन के बाद transcriptional विनियमन में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. miRNAs ओंकोजीन या ट्यूमर शामक के रूप में कार्य कर सकते हैं और भी बायोमार्कर का वादा कर रहे हैं. उपलब्ध miRNA assays के अलावा, माइक्रोएरे और मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) बड़े पैमाने पर miRNA के स्तर का पता लगाने और यों इस्तेमाल किया गया है. स्तन कैंसर, वीं में एस्ट्रोजन संकेतन द्वारा विनियमित miRNAs की पहचान करने के लिएERα पॉजिटिव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में EIR अभिव्यक्ति की तुलना में थे पहले और बाद में जांच कम घनत्व सरणियों लेबल μParaflo-microfluidic प्रोटीन और दोहरी दोनों का उपयोग कर एस्ट्रोजन सक्रियण. परिणाम जांच आधारित रसायन शास्त्र लेबल जाती डाई आधारित और दोहरी दोनों को लागू करने, विशिष्ट qPCR assays का उपयोग मान्य किया गया. इसके अलावा, एक समय बिंदु परख समय के साथ नियमों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस अध्ययन में इस्तेमाल miRNA परख दृष्टिकोण के लाभ यह भी सीमित नमूना मात्रा के साथ, कई नमूनों में परिपक्व miRNA नियमों की एक तेजी से स्क्रीनिंग के लिए सक्षम बनाता है. विशेष सेल संस्कृति के लिए स्थितियां और एस्ट्रोजन उपचार, जैविक और तकनीकी replicates, और बड़े पैमाने पर प्रदर्शन सहित लेआउट, अलग तकनीक का उपयोग कर में गहराई पुष्टियों द्वारा पीछा किया, miRNA नियमों का एक मजबूत पता लगाने सुनिश्चित करता है, और झूठी सकारात्मक और अन्य कलाकृतियों को समाप्त. प्राथमिक और अग्रदूत प्रतिलेख छुट्टी पर हालांकि, उत्परिवर्तित या अज्ञात miRNAs, या विनियमोंएल, पता नहीं होगा. यहाँ प्रस्तुत विधि एस्ट्रोजन की मध्यस्थता miRNA विनियमन की पूरी जांच का प्रतिनिधित्व करता है.

Introduction

एस्ट्रोजन स्तन ग्रंथि के विकास के दौरान महत्वपूर्ण है कि एक हार्मोन है. एस्ट्रोजन भी स्तन कैंसर 1 के विकास, रखरखाव, जोखिम, और उपचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. एस्ट्रोजन प्रतिलेखन कारक हैं और विशिष्ट लक्ष्य जीन को नियंत्रित जो नेताओं के बंधन से अपने कार्य डाल रही है. दो रिसेप्टर वेरिएंट की, ERα स्तन कैंसर की कोशिकाओं का एस्ट्रोजन निर्भर प्रसार के लिए आवश्यक है. अधिकांश स्तन कैंसर ERα पॉजिटिव हैं और विकास के लिए एस्ट्रोजन पर निर्भर करता है. इस एस्ट्रोजन संकेतन बनाया और हार्मोन रिसेप्टर पॉजिटिव स्तन कैंसर में उपचार के लिए एक लक्ष्य ERα गया है. ERα की अंतर्निहित तंत्र को समझना, उपचार परिणामों में सुधार उपचार के लिए प्रतिरोध पर काबू पाने, और स्तन कैंसर विकसित कैसे समझने के लिए महत्वपूर्ण है.

miRNAs की वजह से बाद transcriptional जीन विनियमन में उनके प्रमुख प्रभाव के लिए सेल कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. miRNAs 19-24 nucleotides कम कर रहे हैं, एकल असहाय, पहले प्राथमिक miRNA टेप (प्राथमिक miRNA) में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित रहे हैं कि RNAs noncoding. वे कम बाल के लिये कांटा अग्रदूत-miRNAs (पूर्व miRNA) में Drosha द्वारा नाभिक में कार्रवाई की और फिर पासा खेलनेवाला द्वारा संसाधित और cytoplasm में परिपक्व miRNAs के लिए फार्म एक किस्में में विभाजित हैं. एकल असहाय परिपक्व miRNAs RISC जटिल प्रपत्र Argonaute प्रोटीन के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. फिर, miRNAs अनुवाद अवरुद्ध या लक्ष्य mRNA 2 अपमानजनक द्वारा बाद transcriptional विनियमन के लिए अग्रणी, एक लक्ष्य mRNA की 3'-untranslated क्षेत्र (3'-UTR) को संकरण कर सकते हैं.

कारण एस्ट्रोजन और miRNAs दोनों सामान्य या बाधित एस्ट्रोजन संकेत के साथ जुड़े miRNAs की पहचान, ट्यूमर प्रगति में खेलना महत्वपूर्ण भूमिका है कि करने के लिए विकास की हमारी समझ को बढ़ाने और स्तन कैंसर के इलाज को बेहतर बनाने के क्रम में महत्वपूर्ण है. ERα प्रोटीन जीन कोडिंग को नियंत्रित करता है की एक अच्छी समझ है, विस्तार जबकि वहाँऔर शाही सेना के नियमों noncoding का विवरण अच्छी तरह से जांच की बात है. स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में miRNA के ERα विनियमन को स्पष्ट करने के लिए लक्ष्य प्रारंभिक पढ़ाई एक ही सेल लाइन 3-6 विश्लेषण किया गया है, तब भी जब परस्पर विरोधी परिणाम सामने आए. यह अलग उपचार, जैविक विविधताओं, विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हैं, और miRNAs की छोटे आकार का विश्लेषण करने के लिए उन्हें चुनौतीपूर्ण बनाने तथ्य यह है कि एक परिणाम हो सकता है. इधर, विविधताओं और विधि कलाकृतियों के लिए नियंत्रित करता है कि एक प्रोटोकॉल में वर्णित है.

MiRNAs एस्ट्रोजन द्वारा विनियमित रहे हैं जो की पहचान करने के लिए, ERα गतिविधि की एक अच्छी तरह से परिभाषित स्तन कैंसर मॉडल की रूपरेखा एक पहला कदम है. कई सेल लाइनों अस्पताल में स्तन कैंसर के बहुमत के लिए इसी तरह एस्ट्रोजन पर निर्भर हैं जो मानव ERα पॉजिटिव स्तन कैंसर के ट्यूमर से उत्पन्न किया गया है. ERα और इसके नीचे की ओर लक्ष्य की अभिव्यक्ति सहित इन सेल लाइनों के दो, T47D और MCF7, आणविक गुण,प्रोजेस्टेरोन हार्मोन रिसेप्टर (पीआर), एस्ट्रोजन उत्तरदायी और luminal उपकला भेदभाव जीनों की अभिव्यक्ति के साथ झिल्ली रिसेप्टर HER2 की अभिव्यक्ति की कमी, स्तन ट्यूमर 7-10 की luminal उप के लिए मॉडल के रूप में उन्हें उपयुक्त बनाते हैं. 17β-estradiol (E2) एस्ट्रोजन का प्रमुख रूप है, और ERα का इष्टतम transcriptional सक्रियण के लिए सांद्रता और समय अंक कई अध्ययनों में लक्षण वर्णन किया गया है. 24 घंटे के लिए इस प्रोटोकॉल 10 एनएम E2 इलाज में स्तन कैंसर की कोशिकाओं 1 में ERα गतिविधि के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया और T47D और MCF7 है. इसके अलावा, समय पर निर्भर miRNA नियमों विशेष रूप से जैसे 1-72 घंटे का समय अंतराल में विश्लेषण किया जा सकता है.

दूसरे, विश्लेषण करने miRNA के कारण उनके छोटे आकार की वजह से भाग में, अलग चुनौतियों का सामना किया. नियमित Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol आरएनए precipitations प्रदर्शन किया, या जब कर रहे हैं जब miRNAs अच्छी तरह से कुल शाही सेना तैयार करने में बनाए रखा नहीं कर रहे हैं सेंटandard स्तंभ purifications उपयोग किया जाता है. विशेष सावधानियों को बनाए रखने या RNAs के छोटे अंश के लिए समृद्ध करने के लिए उठाए जाने की जरूरत है. Centrifugation (-80 डिग्री सेल्सियस) से पहले तापमान को कम करने, isopropanol की मात्रा बढ़ रही है, और 70% इथेनॉल में वाशिंग omitting द्वारा, miRNAs की बनाए रखने की वर्षा के दौरान बढ़ाया जा सकता है. या, miRNA युक्त कुल शाही सेना के एक उच्च गुणवत्ता और मजबूत तैयारी के लिए विशिष्ट स्तंभ और buffers इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा विश्लेषण के लिए ही, उनके छोटे आकार चुनौतियों का बना. प्रोटीन, qPCR, और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण: जीनोम चौड़ा miRNA स्क्रीनिंग के लिए, तीन सामान्य से चुनने के लिए तकनीक की रूपरेखा miRNA कर रहे हैं. प्रत्येक तकनीक कलाकृतियों शुरू करने की अलग जोखिम के साथ एक, कई विभिन्न प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकता है, और विभिन्न नमूना तैयारी के लिए आवश्यक हैं. MiRNA माइक्रोएरे में, एक स्लाइड देखा है या oligonucleotides के हजारों के साथ संश्लेषित. ये oligonucleotides जांच के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और जांच के प्रत्येकएक विशेष miRNA अनुक्रम को संकरण बनाया गया है. इस अध्ययन में प्रदर्शन के रूप में प्रोटीन के लिए नमूना तैयार करने, पहले miRNAs के लिए समृद्ध और फिर miRNAs पर Cy5 और Cy3 लेबलिंग का परिचय. माइक्रोएरे, एक साथ जीन की एक बड़ी संख्या के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर का पालन करने का अवसर देता है तेजी से और नमूनों की बड़ी संख्या की जांच के लिए उपयुक्त है, लेकिन केवल माइक्रोएरे पर दृश्यों उपस्थित विश्लेषण कर सकते हैं और जैसे में परिवर्तन का पता लगाने नहीं देंगे अज्ञात या उत्परिवर्तित miRNAs. इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के रूप में माइक्रोएरे विश्लेषण भी विश्लेषण के लिए नमूना प्रति कुल शाही सेना की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में, के बारे में 5 ग्राम, की आवश्यकता है. कम घनत्व qPCR miRNA रूपरेखा कम सामग्री (700 एनजी / नमूना और दोहराने) की आवश्यकता है, और miRNAs का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. ट्रांसक्रिप्ट का स्तर निर्धारित किया जा सकता है, और मात्रा एक निरपेक्ष राशि या एक रिश्तेदार राशि हो सकता है. qPCR विश्लेषण पहले एक looped का उपयोग करके यहाँ, सीडीएनए में miRNA के रूपांतरण की आवश्यकताकेवल miRNA परिपक्व का विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक विशिष्ट miRNA के लिए प्राइमर. यह एक miRNA विशिष्ट आगे प्राइमर और looped अनुक्रम को पूरक एक यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर का उपयोग परिलक्षित किया जा सकता है कि एक लंबे समय तक टेम्पलेट उत्पन्न करता है, और विशिष्टता के लिए एक दोहरी लेबल जांच का समावेश कर सकते हैं बंदरगाह. qPCR miRNAs के सैकड़ों प्रत्येक अच्छी तरह से 11 में व्यक्तिगत प्राइमर जोड़े के साथ एक या कई 384 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग समानांतर में पता लगाया जा सकता है, जहां एक कम घनत्व प्रारूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक नमूने में सभी RNAs 11 अनुक्रम किया जा सकता के रूप में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, दूसरे हाथ पर,, उपन्यास, उत्परिवर्तित या संपादित miRNAs की खोज के लिए अनुमति देता है कि इन तकनीकों का ही है. इस तकनीक, हालांकि, छोटे RNAs को समृद्ध और नमूने के बीच उनके रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर नियमन करने के बाद बढ़ाया जोखिम के साथ linker ligations और purifications के कई चरणों का उपयोग कर एक छोटे आरएनए पुस्तकालय का उत्पादन करने के लिए कई कदम की आवश्यकता है. यह भी महत्वपूर्ण bioinformati आवश्यकतासीएस विश्लेषण. MiRNA रूपरेखा के लिए विभिन्न तकनीकों को देखते हुए सबसे उपयुक्त तकनीक आवेदन पर निर्भर करता है. सामग्री अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में है और ब्याज पहले से ही जाना जाता है miRNAs के अंतर अभिव्यक्ति को परिभाषित करने के लिए है जब डीएनए सबसे उपयुक्त हैं. नमूने के एक सीमित मात्रा में उपलब्ध है और कम व्यक्त miRNAs की एक उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता है जब कम घनत्व qPCR सरणियों सबसे उपयुक्त हैं. अनुक्रमण उत्परिवर्तित अज्ञात miRNAs, या एक miRNA के विभिन्न isoforms के विश्लेषण की आवश्यकता है जब सबसे उपयुक्त है.

स्तन कैंसर में एस्ट्रोजन विनियमित miRNAs के अध्ययन में, दो मॉडल कोशिकाओं लाइनों, शाही सेना की बड़ी मात्रा में आसानी से उपलब्ध हैं जहां T47D और MCF7, उपयोग किया जाता है. प्रत्येक कोशिका लाइन उपचार के तकनीकी replicates में अलग मार्ग, प्रत्येक का उपयोग कर दोहराया सेल संस्कृतियों में विश्लेषण किया गया था. इस reproducibly, ERα विनियमित miRNAs की मजबूत पता लगाने के लिए अनुमति देता है. रिश्तेदार miRNA अभिव्यक्ति के स्तर miRNA माइक्रोएरे और दोनों का उपयोग की तुलना में थेदोहरी लेबल जांच - कम घनत्व सरणियों (डीएलपी-झील प्राधिकरण) और जाती डाई और DLP chemistries दोनों का उपयोग कर विशिष्ट qPCR के साथ परिणाम मान्य. miRNA नियमों फिर आगे एस्ट्रोजन प्रेरित नियमों से यादृच्छिक या circadian विविधताओं अंतर करने में मदद, और माध्यमिक प्रभाव से प्राथमिक प्रभाव का संकेत कर सकते हैं जो समय के साथ अपनी सटीक विनियमन, परिभाषित करने के लिए समय श्रृंखला में विश्लेषण किया गया. ERα की chromatin बाध्यकारी पढ़ाई के साथ Bioinformatical तुलना माध्यमिक प्रभाव बनाम प्राथमिक के भेदभाव में सहायता को आगे कर सकते हैं. परख यह 24 घंटा E2 उपचार प्रोटीन कोडिंग टेप के बाद तत्काल विनियमित रहे थे लेकिन परिपक्व miRNAs 1 प्रभावित नहीं थे कि स्थापित किया जा सकता है, जहां miRNA नियमों का एक विश्वसनीय आकलन में हुई. हालांकि, यह चयनित miRNAs 1 के समय श्रृंखला विश्लेषण में प्रदर्शन के रूप miRNAs, बाद में समय बिंदुओं पर विनियमित रहे हैं कि संभव है. विवरण आगे का पता लगाया जा करने की जरूरत है और यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक robus प्रदान करता हैस्तन कैंसर कोशिका लाइनों में परिपक्व miRNAs की हार्मोनल विनियमन का अध्ययन करने के लिए टी रास्ता.

Protocol

1. सेल संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. T47D सेल लाइन संस्कृति मीडिया के लिए:
    1. एक autoclaved 1 एल बोतल में 500 मिलीलीटर F12 [DMEM/F12 (1:1)] के साथ 500 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मिलाएं.
    2. भ्रूण गोजातीय सीरम के 50 एमएल (यह 5% FBS बनाता है), और फिर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 एमएल (यह 1% कीट बनाता है) में जोड़ें. पूरी तरह से सामग्री मिलाएं.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  2. MCF7 सेल लाइन संस्कृति मीडिया के लिए:
    1. 25 FBS (5% FBS) की मिलीलीटर, और फिर 5 पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (1% कीट) के मिलीलीटर के साथ 500 मिलीलीटर DMEM मिलाएं.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
    3. कम सीरम संस्कृति मीडिया के लिए:
      1. T47D के लिए: एक autoclaved 1 एल बोतल में 500 मिलीलीटर F12 (1:1) के साथ 500 मिलीलीटर फिनोल लाल मुक्त DMEM मिक्स, और 5% डीसीसी-FBS के लिए dextran में लिपटे लकड़ी का कोयला का इलाज (डीसीसी) FBS की 50 मिलीलीटर जोड़ें. 0.5% डीसीसी-FBS के लिए 5 एमएल डीसीसी-FBS के साथ एक अलग बोतल बनाने. फिर, प्रत्येक बोतल कीट (1% कीट) के 10 एमएल जोड़ें. पूरी तरह से सामग्री को मिक्स, stor4 डिग्री सेल्सियस पर ई
      2. MCF7 के लिए: 100x एल glutamine के 5 मिलीलीटर (200 मिमी अंतिम एकाग्रता) के साथ 500 मिलीलीटर फिनोल लाल मुक्त DMEM मिलाएं. डीसीसी-FBS (5% डीसीसी-एफबीएस) का 25 मिलीलीटर जोड़ें. 2.5 मिलीलीटर डीसीसी-FBS (0.5% डीसीसी-एफबीएस) के साथ एक अलग बोतल बनाने. फिर, प्रत्येक बोतल कीट (1% कीट) के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर, पूरी तरह से दुकान की सामग्री मिक्स
    4. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान के लिए:
      1. Ultrapure पानी या आसुत जल के साथ एक 1 एल autoclaved कांच की बोतल भरें.
      2. एक पीबीएस गोली जोड़ें और गोली भंग कर दिया है जब तक कभी कभी हिला.
      3. कमरे के तापमान पर पीबीएस समाधान और दुकान आटोक्लेव.
    5. Ligand शेयरों की तैयारी:
      1. एक बाँझ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 100 μl इथेनॉल या DMSO में 17β-estradiol की 2.72 मिलीग्राम भंग करके E2 की एक 100 मिमी शेयर समाधान तैयार है, और धीरे सामग्री मिश्रण. संक्षेप में स्पिन और 10 मिमी, 1 मिमी, और 0.1 मिमी शेयर concentr उपज के लिए धारावाहिक dilutions (1:10) बनानाविलायक का उपयोग ations. -20 डिग्री सेल्सियस पर सभी E2 स्टॉक समाधान स्टोर
      2. एक बाँझ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 100 μl EtOH या DMSO में आईसीआई 182,780 से 6.07 मिलीग्राम भंग करके आईसीआई की एक 100 मिमी शेयर समाधान तैयार है, और धीरे सामग्री मिश्रण. संक्षेप में स्पिन और 10 मिमी, 1 मिमी, विलायक का उपयोग 0.1 मिमी शेयर सांद्रता उपज के लिए धारावाहिक dilutions (1:10) बनाते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर सभी आईसीआई स्टॉक समाधान स्टोर
      3. वाहन विलायक (इथेनॉल या DMSO) है. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब, और दुकान में 100% इथेनॉल या DMSO के 0.5-1 एमएल रखें

2. सेल संस्कृति और उपचार

तकनीकी replicates के लिए डबल या तीन प्रतियों प्लेटों में प्रत्येक उपचार करते हैं. इस सेल लाइन का एक जैविक को दोहराने के रूप में काम करेगा जो एक ही सेल लाइन का एक अलग बीतने का उपयोग सेल संस्कृति प्रक्रिया और उपचार दोहराएँ. Repl के लिए एक अलग सेल लाइन के साथ प्रक्रिया दोहराएँएक से अधिक सेल लाइन में निष्कर्ष icate. सभी सेल कल्चर तकनीक एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

  1. सेल संस्कृति स्टार्टअप
    1. एक बाँझ गर्म पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया गर्म.
    2. T47D या MCF7 कोशिकाओं का एक जमे हुए शीशी पिघलना.
    3. 70% इथेनॉल के साथ शीशी और मीडिया बोतल के बाहर साफ है, और फिर बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में शीशी और बोतल दोनों जगह.
    4. (हुड में) के हिसाब से एक बाँझ टी -75 फ्लास्क लेबल.
    5. (कि सतह पूरी तरह से मीडिया के साथ कवर किया जाता है सुनिश्चित) एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कुप्पी में उपयुक्त मीडिया के 12-15 मिलीलीटर जोड़ें.
    6. कुप्पी शीशी से कोशिकाओं स्थानांतरण, और धीरे मिश्रण.
    7. 5% सीओ 2 के साथ आपूर्ति की एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें.
  2. इलाज के लिए कोशिकाओं की तैयारी
    1. इनक्यूबेटर से बाहर कोशिकाओं ले और कोशिकाओं में कम से कम 80% सह रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे का निरीक्षणnfluent. इस प्रयोग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए है. बाँझ हुड के लिए कुप्पी स्थानांतरण.
    2. एक वैक्यूम से जुड़े एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग कुप्पी से मीडिया निकालें. धीरे पीबीएस के साथ दो बार संलग्न कोशिकाओं धो लो.
    3. फ्लास्क को गर्म trypsin-EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में कुप्पी डाल दिया. यह कोशिकाओं कुप्पी से अलग बनाने के लिए है.
    4. कुप्पी के बारे में 3-4 मिलीलीटर उचित गर्म मीडिया की जोडें और एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर अलग कोशिकाओं Triturate. सीरम वैज्ञानिक पिपेट में कोशिकाओं को ले जा रहा है और दबाव बढ़ाने के लिए कुप्पी के नीचे के खिलाफ रखा पिपेट की नोक के साथ कोशिकाओं को रिहा द्वारा Triturate. इस एकल कक्षों में अलग कोशिकाओं को तोड़ने के लिए है.
    5. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, एक सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं, जैसे गणना.
    6. (जरूरत के रूप में) 100 मिमी प्लेट लेबल और प्लेटों के बारे में 10 एमएल मीडिया जोड़ें. प्लेट के बारे में 2.0 x 10 6 कोशिकाओं / प्लेट. जीई द्वारा कोशिकाओं वितरितntle प्लेटें घूमता.
    7. लगभग 80% मिला हुआ है, जब तक 24-48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
    8. 80% confluency पर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें और उचित 5% डीसीसी-FBS मीडिया जोड़ें. फिर, 24 घंटा के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
    9. 24 घंटे के बाद, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें और उचित 0.5% डीसीसी-FBS मीडिया जोड़ें. फिर, अतिरिक्त 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  3. सेल उपचार
    1. 48 घंटे के बाद, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो. संभव के रूप में पीबीएस के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए सुनिश्चित करें.
    2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, उचित 0.5% डीसीसी-FBS मीडिया के 10 एमएल जोड़ें. फिर, 10 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1 मिमी ligand शेयर (E2 या आईसीआई) का 1 μl जोड़ें. इसके अलावा, नियंत्रण प्रयोग के लिए एक अलग ट्यूब में 10 मिलीलीटर मीडिया के लिए वाहन की 1 μl जोड़ें.
    3. धीरे ट्यूब में सामग्री मिलाएं और थाली में कोशिकाओं को जोड़ने. यह प्लेट प्रति एक ligand होना चाहिए.
    4. चुने हुए समय बिंदु (0-72 एचआर) के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
<पी वर्ग = "jove_title"> 3. शाही सेना निष्कर्षण और गुणवत्ता नियंत्रण

  1. शाही सेना निकासी
    1. उपचार समय के वांछित अवधि के लिए समाप्त होने पर, थाली में कोशिकाओं के बारे में 1-2 एमएल Guanidinium thiocyanate-फिनोल समाधान जोड़ने तो, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो. चेतावनी: Guanidinium thiocyanate-फिनोल समाधान साँस लेना द्वारा, त्वचा या आंखों के साथ संपर्क से विषैला होता है, या अगर निगल लिया. उपयुक्त सुरक्षात्मक कपड़े, दस्ताने, और आंख / चेहरे की सुरक्षा पहनें, और धूआं हुड का उपयोग करें.
    2. कोशिकाओं की मात्रा Guanidinium thiocyanate-फिनोल समाधान की मात्रा की कोई 10 से अधिक% है, और थाली समाधान के साथ कवर और 1 मिनट के लिए बैठने की अनुमति है कि सुनिश्चित करें. फिर, एक रबर खुरचनी का उपयोग कोशिकाओं परिमार्जन और एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण. कोशिकाओं सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान में संग्रहित किया जा सकता है.
    3. निकालें और स्पिन स्तंभ शुद्धि और DNase द्वारा पीछा guanidinium thiocyanate-phenol के क्लोरोफॉर्म पद्धति का उपयोग करके प्रत्येक उपचार से कुल शाही सेना को शुद्धपशु कोशिकाओं के लिए मैं डीएनए गिरावट विधि.
    4. निकासी के बाद, कोशिकाओं 60 μl RNase मुक्त पानी में eluted हैं. सेल्सियस -80 पर मात्रा का ठहराव विश्लेषण और दुकान शाही सेना के लिए विभाज्य 1-2 μl आरएनए
    5. शाही सेना और aspectrophotometer की 1 μl का उपयोग शाही सेना सांद्रता उपाय. किसी भी माप से किया जाता है पहले लिया एक रिक्त सुनिश्चित करते हैं कि. इसके अलावा, पूरी तरह से एक माप लिया जाता है स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पहुंच समय पोंछे. सांद्रता आमतौर पर एनजी / μl में दिखाया गया. शाही सेना सांद्रता परिणाम दिखा बचाओ.
  2. शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण
    1. एक microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक नमूने और जगह के बारे में 100 एनजी शाही सेना लो.
    2. एक Bioanalyzer उपयोग कर आरएनए अखंडता को मापने. आमतौर पर 12 नमूने एक Bioanalyzer में एक समय में चलाया जा सकता है. भागो आमतौर पर के बारे में 25 मिनट लगते हैं.
    3. शाही सेना के प्रयोग के लिए अच्छा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए शाही सेना सीढ़ी के साथ परिणाम की तुलना करें. सहेजें और प्रिंट का परिणाम है.

4. दावत की पुष्टिबयान: प्रोटीन जीन कोडिंग की qPCR

  1. सीडीएनए संश्लेषण
    1. (प्रत्येक नमूने की) कुल शाही सेना के 500 एनजी या 1 ग्राम ले लो और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में डाल दिया. ऊपर RNase मुफ्त पानी का उपयोग 10 μl के लिए प्रत्येक ट्यूब की मात्रा लाओ.
    2. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 माइक्रोन यादृच्छिक hexamer प्राइमरों और गर्मी ट्यूब के 2 μl जोड़ें.
    3. 5min के लिए बर्फ ट्यूब स्थानांतरण.
    4. प्रत्येक नमूना के लिए, 5x पहले कतरा बफर के 4 μl, 0.1 एम डीटीटी का 1 μl, 10 मिमी dNTPs 1 μl, सुपरस्क्रिप्ट III के 0.5 μl, और 1.5 μl RNase मुफ्त पानी जोड़ें.
    5. 10 मिनट के लिए एक 25 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक या पानी के स्नान में जगह ट्यूब.
    6. 1 घंटे के लिए एक 46 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर स्थानांतरण ट्यूबों. फिर, 15 मिनट के लिए एक 70 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक को हस्तांतरण ट्यूब प्रतिक्रिया को रोकने के लिए.
    7. -20 डिग्री सेल्सियस पर dilutions और दुकान के लिए RNase मुफ्त पानी का उपयोग (कुल शाही सेना इनपुट उपयोग कर की गणना) एक 5 एनजी / μl शेयर करने के लिए सीडीएनए पतला
  2. qPCR
    1. ब्याज और संदर्भ जीन की जीन के लिए प्राइमरों प्राप्त करते हैं. प्राइमर आसानी एन सी बी आई के प्राइमर बम का विस्फोट कार्यक्रम 12 पर प्राइमर डिजाइनिंग उपकरण का उपयोग कर बनाया जा सकता है. यह आमतौर पर ब्याज की प्रत्येक जीन के लिए एक आगे और रिवर्स प्राइमर उत्पन्न करता है. प्राइमर लंबाई में 18-22 बी.पी. होना चाहिए,, 52-58 डिग्री सेल्सियस के तापमान के पिघलने है 40-60% की एक जीसी सामग्री है, और 100-180 बीपी के एक amplicon लंबाई.
    2. प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया के लिए अच्छी तरह से, सीडीएनए एनजी (कदम 4.1.7 से शेयर एकाग्रता से 2 μl), आगे से प्रत्येक की 1 pmol 10 जोड़ और (कदम 4.2.1 से) ब्याज की जीन की प्राइमरों रिवर्स, और 5 μl की 2x जाती डाई पीसीआर मास्टर मिश्रण. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह प्रतिक्रिया एक 10 μl अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा होनी चाहिए.
    3. (तकनीकी replicates के लिए) प्रत्येक जीन के लिए प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतियों कुओं सुनिश्चित करें कि वहाँ. 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट इस्तेमाल किया जा सकता है.
    4. QRT-पीसीआर प्रणाली सॉफ्टवेयर पर, रिपोर्टर और लक्ष्य आवंटित प्रतिक्रिया मात्रा दर्ज करें, तुलनात्मक चयनसीमा चक्र (ΔΔCt) विधि, और नमूना कुओं को परिभाषित.
    5. एक विशिष्ट टुकड़ा के प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए सभी जाती डाई रन पिघलने वक्र विश्लेषण करने के लिए सुनिश्चित करें. रन के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग प्लेटों चलाएँ.
    6. चलाने के बाद परिणाम है, और निर्यात डेटा (एमएस एक्सेल करने के लिए विशेष रूप से सीटी मान) को बचाओ.
  3. ΔΔCT सूत्र का उपयोग qPCR डेटा विश्लेषण
    सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन निम्न चरणों का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए एक्सेल पर नियंत्रण करने के लिए गुना परिवर्तन रिश्तेदार के रूप में गणना की जा सकती है:
    1. ऊपर qPCR से सभी निर्यात परिणाम सीटी मूल्यों शामिल किया जाना चाहिए. नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग ΔCT मूल्य की गणना:
      • ΔCT = कनेक्टिकट (लक्ष्य जीन) - सीटी (संदर्भ जीन)
      यह प्रत्येक नमूने के लिए किया जाना चाहिए. लक्ष्य ब्याज की जीन या miRNA है.
    2. अगला, प्रत्येक नमूने के लिए कुल मानक विचलन (एसडी) की गणना. पहले की गणनासंदर्भ जीन के लिए और फिर लक्ष्य जीन (यह सीटी मूल्यों पर एसटीडी देव समारोह का उपयोग कर Excel पर किया जा सकता है) के लिए एसडी गणना एसडी. तो फिर इस सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए कुल एसडी गणना:
      • कुल एसडी = (SD2 (लक्ष्य) + SD2 (संदर्भ)) 1/2
    3. द्वारा एक जीन (लक्ष्य) के भीतर प्रत्येक नमूने की ΔΔCT की गणना:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (इलाज / परीक्षण नमूना) - ΔΔCT (नियंत्रण / अंशशोधक नमूना)
      अंशशोधक नमूना अनुपचारित नमूना है.
    4. अंत में, सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के गुना परिवर्तन (एफसी) मूल्यों की गणना:
      • एफसी = 2 ΔΔCT
      प्रत्येक नमूने के गुना परिवर्तन मूल्य संदर्भ जीन और नियंत्रण नमूना के लिए सामान्यीकृत किया गया है जो जीन / miRNA के रिश्तेदार अभिव्यक्ति देता है.
    5. विद्यार्थी t-परीक्षण दो पूंछ वितरण और दो नमूना असमान विचरण का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपैरामीटर: (पी <0.001 (***), पी <0.01 (**), और पी <0.05 (*)). यह Excel पर प्राप्त किया जा सकता है. उपचार miRNA रूपरेखा के साथ आगे बढ़ने से पहले जाना जाता लक्ष्य के नियमन में कहा कि परिणाम की पुष्टि करें.

5. miRNA रूपरेखा विश्लेषण

  1. miRNA माइक्रोएरे
    1. एक microcentrifuge ट्यूब में वाहन या ligand, और जगह के साथ या तो इलाज कोशिकाओं से अलग शाही सेना के 5 ग्राम ले लो. 20 μl के लिए ट्यूब में मात्रा समायोजित करें. प्रत्येक तुलना डुप्लिकेट या triplicates में किया जाना चाहिए.
    2. ऊपर शाही सेना के नमूने का उपयोग miRNA माइक्रोएरे प्रदर्शन करना. miRNA माइक्रोएरे अभिव्यक्ति प्रोफाइल μParaflo microfluidic biochip प्रौद्योगिकी द्वारा मानव miRNA माइक्रोएरे दोहरी रंग नमूना सरणी (सेंगर miRBase रिलीज 14.0) 13 का उपयोग निर्धारित किया जाना चाहिए.
    3. परिणाम विभिन्न व्यक्त miRNAs दिखाना चाहिए. पी <0.05.p-मूल्य <0.10 आगे भी सहयोग के लिए माना जा सकता है जब महत्वपूर्ण miRNA अभिव्यक्ति पर विचारqPCR का उपयोग nfirmatory विश्लेषण. QPCR साथ आगे की मान्यता के लिए इस miRNA सूची को बचाने के.
  2. miRNA रूपरेखा: DLP-LDA
    1. प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट या triplicates में विश्लेषण किया जाना चाहिए. वाहन या ligand के साथ या तो इलाज कोशिकाओं से कुल शाही सेना के 700 एनजी लो, और एक microcentrifuge ट्यूब में जगह है. 3 μl के लिए ट्यूब में मात्रा समायोजित करें.
    2. दोहरी लेबल जांच miRNA परख विधि और 10x आरटी प्राइमरों का उपयोग सीडीएनए संश्लेषण करते हैं. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए कुल मात्रा 7.5 μl होना चाहिए.
    3. पीसीआर प्रणाली thermocycler में प्रतिक्रिया ट्यूब, जगह और दोहरी लेबल जांच miRNA परख विधि में संकेत के रूप में सिफारिश मानकों को निर्धारित किया है. रन प्रारंभ करें. इस सीडीएनए उत्पन्न होगा. सीडीएनए कम से कम 1 सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है ध्यान दें.
    4. आरटी प्रतिक्रिया से चल रहा है, वहीं DLP-झील प्राधिकरण प्लेटें बाहर ले और कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं. प्रत्येक सरणी थाली अद्वितीय miRNA प्राइमरों और नियंत्रण प्राइमरों होते हैं कि 384 कुओं में शामिल है.
    5. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 6 (5.2.3 से) सीडीएनए की μl और जगह ले लो. दोहरी लेबल जांच 2x यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिश्रण के 450 μl जोड़ें और 444 μl RNase मुफ्त पानी जोड़ें.
    6. सामग्री, और अपकेंद्रित्र संक्षिप्त मिश्रण करने के लिए ट्यूब के बारे में छह बार पलटना.
    7. DLP-LDA प्लेट आठ में से प्रत्येक में कमरे के तापमान, भार 100 μl पर पहुँच गया जब प्लेट के 'पोर्ट भरें'. फिर, सरणी थाली अपकेंद्रित्र.
    8. QRT-पीसीआर प्रणाली खोलें और ब्लॉक है कि जाँच कि 384 अच्छी तरह से थाली के लिए. एसडीएस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चला सेट करें. रिश्तेदार मात्रा का ठहराव (सीटी) का चयन करें, अच्छी तरह से संख्या और सरणी प्रकार का चयन करें, और कुओं को परिभाषित करने के लिए नमूना विवरण दर्ज करें.
    9. डिफ़ॉल्ट थर्मल साइकिल शर्तों का उपयोग सरणी चलाएँ. रन समाप्त हो गया है, एमएस एक्सेल में परिणाम और निर्यात को बचाने और ΔΔCT सूत्र (4.3 चरण) का उपयोग करते हुए आगे के विश्लेषण के लिए बचा.

6. अलग उपयोग कर miRNA विनियम की पुष्टिqPCR विश्लेषण

  1. जाती डाई qPCR विश्लेषण
    1. वांछित miRNA विश्लेषण के लिए डिजाइन प्राइमरों. आगे प्राइमर के बराबर होती है जो परिपक्व miRNA के अनुक्रम, 14 mirbase.org से प्राप्त किया जा सकता है. 'टी' के लिए सभी 'यू' कन्वर्ट.
    2. सीडीएनए तैयार: एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कुल शाही सेना और जगह की 1 ग्राम लें. Pólya एक miRNA पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण और QRT-पीसीआर प्रोटोकॉल से पीछा और miRNA के पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण के लिए निर्देशों का पालन करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर जिसके परिणामस्वरूप सीडीएनए (1:10) और दुकान पतला
    3. एक 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया थाली प्राप्त करते हैं.
    4. प्रत्येक miRNA qPCR प्रतिक्रिया के लिए अच्छी तरह से, कदम 6.1.2 से किट से (16 Pólya सीडीएनए की एनजी (कदम 6.1.2 से), (कदम 6.1.1 से) विशिष्ट आगे प्राइमर का प्रत्येक के 2 pmol और यूनिवर्सल प्राइमर जोड़ ), और 2x qPCR मास्टर मिश्रण के 5 μl. अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 10 μl / अच्छी तरह से है.
    5. (तकनीकी replicates के लिए) प्रत्येक miRNA के लिए प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतियों कुओं सुनिश्चित करें कि वहाँ. भीएक संदर्भ जीन (आमतौर पर U6 snRNA) शामिल है जो यह सुनिश्चित कर लें.
    6. QRT-पीसीआर प्रणाली सॉफ्टवेयर पर, रिपोर्टर और लक्ष्य आवंटित प्रतिक्रिया मात्रा दर्ज करें, तुलनात्मक दहलीज चक्र (ΔΔCT) विधि का चयन करें, और नमूना कुओं को परिभाषित.
    7. रन के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग प्लेटों चलाएँ. सभी जाती डाई रन पिघलने वक्र विश्लेषण करने के लिए सुनिश्चित करें. प्रत्येक पिघलने वक्र एक विशिष्ट टुकड़ा के प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए केवल एक विशिष्ट शिखर दिखाना चाहिए. एक से अधिक चोटी या कोई स्पष्ट शिखर मनाया जाता है, प्राइमरों विशिष्ट नहीं कर रहे हैं और डेटा का उपयोग नहीं किया जा सकता.
    8. चलाने के बाद परिणाम है, और निर्यात डेटा (एमएस एक्सेल करने के लिए विशेष रूप से सीटी मान) को बचाओ.
  2. दोहरी लेबल जांच qPCR विश्लेषण
    1. 0.2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में एक 5 μl मात्रा और जगह में प्रत्येक कुल शाही सेना के 10 एनजी, प्रत्येक ले.
    2. दोहरी लेबल जांच माइक्रो का उपयोग कर रिवर्स प्रतिलेखन (आर टी) के प्रदर्शन पर प्रोटोकॉल से निर्देशों का पालन करेंशाही सेना रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट 15. प्रत्येक कुल प्रतिक्रिया मात्रा 15 μl होना चाहिए. दोहरी लेबल जांच आरटी प्रतिक्रियाओं के लिए, अध्ययन किया जा करने के लिए प्रत्येक miRNA के लिए विशिष्ट प्राइमरों ध्यान दें कि वहाँ.
    3. प्लेस प्रतिक्रिया पीसीआर प्रणाली thermocycler में ट्यूब, और प्रोटोकॉल के अनुसार मानकों सेट ऊपर चरण 6.2.2 में संकेत दिया. रन प्रारंभ करें. इसके बारे में 70-80 मिनट लग चाहिए.
    4. आरटी प्रतिक्रिया के बाद, एक 01:05 अनुपात में नमूना सीडीएनए पतला, और -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सभी सीडीएनए की दुकान
    5. एक 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया थाली प्राप्त करते हैं.
    6. दोहरी लेबल जांच के 10 μl 2x यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिक्स (कदम 5.2.5 के रूप में ही अभिकर्मक), RNase मुक्त पानी के 7.67 μl, 20 × वास्तविक समय परख प्राइमर के 1 μl: प्रत्येक miRNA qPCR प्रतिक्रिया के लिए ठीक है, निम्नलिखित जोड़ें (प्रत्येक miRNA के लिए विशिष्ट), और ऊपर कदम 6.2.4 से सीडीएनए के 1.33 μl. यह एक 20 μl अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा होनी चाहिए. धीरे सामग्री मिक्स, और अपकेंद्रित्र संक्षेप.
    7. यह सुनिश्चित वेंअरे (तकनीकी replicates के लिए) प्रत्येक miRNA के लिए प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतियों कुओं हैं. इसके अलावा, एक संदर्भ जीन (आमतौर पर U6 snRNA) शामिल है जो यह सुनिश्चित कर लें.
    8. QRT-पीसीआर प्रणाली सॉफ्टवेयर पर, ब्याज की प्रत्येक miRNA (लक्ष्य) के लिए रिपोर्टर (परिवार) और पेय (NFQ-MGB) आवंटित प्रतिक्रिया मात्रा दर्ज करें, तुलनात्मक दहलीज चक्र (ΔΔCt) विधि का चयन करें, और नमूना कुओं को परिभाषित.
    9. दोहरी लेबल जांच microRNA परख प्रोटोकॉल से चलाने qPCR के लिए मानकों को स्थापित करने के लिए निर्देशों का पालन करें. फिर, रन शुरू करते हैं. चलाने के बाद परिणाम है, और निर्यात डेटा (एमएस एक्सेल करने के लिए विशेष रूप से सीटी मान) को बचाओ.

Representative Results

दृष्टिकोण का एक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रस्तुत किया है और विभिन्न नमूना तैयारी और प्रत्येक तकनीक के लिए आवश्यक न्यूक्लिक एसिड संशोधनों की तुलना चित्रा 2 में कल्पना है.

एक हार्मोन के साथ इलाज से पहले कक्षों की हालत और पर्यावरण हार्मोन 16 के वास्तविक प्रभाव का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है. कुछ मध्यम और सीरम के परिणाम को प्रभावित कर सकता है कि वृद्धि कारक होते हैं, इसलिए सभी सेल हार्मोनल प्रभाव न्यूनतम करने के लिए कम हो गई है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भूखे सीरम हैं. E2 के साथ इलाज इसलिए, जब मनाया प्रभाव E2 जुड़े रहे हैं कि अधिक निश्चितता नहीं है. एक महत्वपूर्ण कारक सेल सेल से संपर्क करें और इस तरह के सेल सेल संकेतन और प्रसार के रूप में व्यवहार को प्रभावित करती है जो कोशिकाओं की confluency है. प्रकोष्ठों 80% मिला हुआ (चित्रा 3) होने की अनुमति दी है और अच्छी तरह से विकास की अनुमति और बाद में वाशिंग और मीडिया से चर्चा के दौरान कोशिकाओं के नुकसान से बचने के लिए संलग्न थेAnge.

शाही सेना निकासी और भंडारण के दौरान स्थितियां शाही सेना की गुणवत्ता और बाद के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं. यह भी कोशिकाओं की संख्या, निष्कर्षण विधि, और miRNA की जीसी सामग्री mRNAs और miRNAs 17 दोनों की उपज और गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं कि जाना जाता है. इस प्रकार, यह RNase मुक्त शर्तों के दौरान शाही सेना निकासी प्रदर्शन करने के लिए और प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले शाही सेना की गुणवत्ता की जांच करने के लिए आवश्यक है. निकासी के बाद, शाही सेना की मात्रा का ठहराव उपज का अवलोकन सक्षम बनाता है जो (mRNAs और miRNAs दोनों युक्त) कुल शाही सेना की एकाग्रता पर जानकारी प्रदान करता है. यह भी चित्रा 3 बी के रूप में देखा परिणामों की एक ग्राफिक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, और यह (आमतौर पर एक शिखर, शीर्ष पैनल ने संकेत दिया) नमूना की शुद्धता की निगरानी के लिए अनुमति देता है. शाही सेना के गरीब उपज 260 एनएम (चित्रा 3 बी, नीचे पैनल) में कोई विशिष्ट अवशोषण का उत्पादन होगा. शाही सेना के उच्च गुणवत्ता, शाही सेना के लिए तय है किअखंडता मापा गया था. 9-10 के बीच के एक शाही सेना अखंडता संख्या (Rin) आरएनए अपमानित नहीं है और इष्टतम गुणवत्ता की है कि यह सुनिश्चित करता है. इसके अलावा, शाही सेना की चित्रमय प्रतिनिधित्व मनाया जाना चाहिए, और चित्रा 4 (मध्यम पैनल) में दिखाया गया है 18S और 28S rRNA चोटियों होना चाहिए. सीढ़ी (चित्रा 4, शीर्ष पैनल) के साथ तुलना चोटियों के आकार को दिखाता है. एक पदावनत आरएनए कम स्पष्ट चोटियों और 18S और 28S rRNA का एक कम सापेक्ष राशि (चित्रा 4, नीचे पैनल) होगा. छोटे RNAs के अंश आगे Agilent लघु शाही सेना किट का उपयोग कर यह सुनिश्चित किया जा सकता है. यह miRNA स्क्रीनिंग के लिए आगे बढ़ने से पहले, निर्दिष्ट प्रयोगात्मक परिस्थितियों में, उपचार के बाद एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया को मान्य करने की सिफारिश की है. एक qPCR सीडीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर, ऐसे PS2 या SPINK4 18 के रूप में एक ज्ञात ईआर लक्ष्य जीन पर प्रदर्शन किया जा सकता है. इस तरह के जीन आम तौर पर ई 2 उपचार के बाद 1-24 घंटे के भीतर upregulated हैं. शाही सेना की गुणवत्ता और एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया एक बारआगे प्रयोग किया जा सकता है, मूल्यांकन किया गया है.

माइक्रोएरे अभी भी कोशिकाओं में miRNA अभिव्यक्ति के लिए बड़े पैमाने पर प्रदर्शन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है. उदाहरण के लिए, एक बार इस्तेमाल किया miRNA माइक्रोएरे 894 परिपक्व miRNAs और जन्म लेनेवाले 1 में 50 नियंत्रण अनूठा जांच निहित. Hybridizations डाई स्वैप प्रक्रिया के साथ डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया गया. miRNA माइक्रोएरे परिणाम आमतौर पर रेखांकन गर्मी नक्शे से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. चित्रा 5A वाहन और E2 इलाज के नमूने के बीच एक miRNA माइक्रोएरे तुलना से डेटा का प्रतिनिधित्व, एक गर्मी के नक्शे से पता चलता है. लाल, हरे miRNA (कम अभिव्यक्ति) के डाउनरेगुलेशन संकेत दिया जबकि miRNA, E2 इलाज नमूना (उच्च अभिव्यक्ति) में upregulated रहा है. miRNA चयन आमतौर पर अभिव्यक्ति में उनके महत्व पर निर्भर करता है, और 0.05 की तुलना में आमतौर पर एक पी मूल्य कम महत्वपूर्ण माना जाता है. विभिन्न व्यक्त किया जा करने के लिए संकेत कर रहे हैं कि miRNAs आगे डब्ल्यू मान्य किया जाना चाहिएith qPCR, झूठी सकारात्मक से अलग करने के लिए.

DLP-LDA सरणी, दूसरी ओर, एक 384 प्रारूप में अच्छी तरह विनियमित miRNAs लिए स्क्रीन के लिए एक qPCR आधारित पद्धति का उपयोग करता है. आमतौर पर दो 384 अच्छी तरह से प्लेट (कार्ड) पूल ए, प्रदान की जाती हैं और बी पूल ए प्रत्येक miRNA के रिश्तेदार स्तर एक miRNA के अनुसार विश्लेषण किया जाता है जहां qPCR, द्वारा निर्धारित कर रहे हैं पूल बी से miRNAs आमतौर पर बेहतर विशेषता में शामिल है और अधिक अत्यधिक व्यक्त अच्छी तरह से (चित्रा 5 ब). एक उच्च सीटी-मूल्य कम miRNA अभिव्यक्ति को इंगित करता है. ज्यादा miRNA माइक्रोएरे तरह, DLP-झील प्राधिकरण से प्राप्त परिणाम आगे सटीकता सुनिश्चित करने के लिए मान्य होना चाहिए.

Validations qPCR का उपयोग किया जा सकता है. यहां, दो qPCR तरीकों का पता लगाने विधि पूर्वाग्रह को रोकने के लिए और पूरी तरह से पुष्टि और miRNA नियमों की जांच के लिए अनुमति देने के लिए वर्णित हैं. जाती डाई आधारित पता लगाने के रसायन शास्त्र DLP-झील प्राधिकरण की रूपरेखा पर आधारित है कि डीएलपी से अलग काम करता है, और पुष्टि के लिए उपयुक्त हैव्यावहारिक उद्देश्यों. यह एक miRNA के पिघलने वक्र विश्लेषण से पता चलता है कि यह सब परिलक्षित डबल असहाय डीएनए का पता लगाता है, लेकिन नमूने की एकरूपता. चित्रा 6A (पैनल छोड़ दिया है) एक पिघलने वक्र विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के रूप में कम विशिष्ट हो सकता है और एक स्पष्ट रूप से परिभाषित वर्दी शिखर देखा जा सकता है. प्राइमर प्राइमर डिमर की अविशिष्ट या महत्वपूर्ण मात्रा में है (चित्रा 6A, सही पैनल) का गठन किया गया है तो कई चोटियों मनाया जाएगा. दूसरी ओर डीएलपी miRNA assays, miRNA का पता चला है लक्ष्य का केवल प्रवर्धन के रूप में अधिक विशिष्ट है. चित्रा 6B में उदाहरण के रूप में प्रत्येक लक्ष्य miRNA के प्रवर्धन भूखंडों, देखा जा सकता है. पिघलने वक्र विश्लेषण का उपयोग कई प्रवर्धन उत्पादों की घटना के लिए नियंत्रित करने के लिए विकल्प, इस रसायन विज्ञान और जाती डाई qPCR कम खर्चीला है के साथ हालांकि, उपलब्ध नहीं है. जाती डाई और DLP qPCR assays कभी कभी थोड़ा अलग परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं. एक refe के लिए दोनों qPCR assays, तुलना के लिएrence जीन दो नमूनों के बीच जीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है. यह भी गृह व्यवस्था जीन के रूप में भेजा संदर्भ जीन, जिनकी अभिव्यक्ति नहीं बदला गया है और जो ब्याज की जीन के रूप में समान स्तर पर व्यक्त की है कि एक जीन होना चाहिए. इन स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में एक उपयुक्त संदर्भ जीन का एक उदाहरण ARHGDIA, रो प्रोटीन की सकल घरेलू उत्पाद / जीटीपी विनिमय प्रतिक्रियाओं कि यह कार्य एक रो सकल घरेलू उत्पाद पृथक्करण अवरोध करनेवाला है. चित्रा 6C (ऊपर) में के रूप में मनाया, ARHGDIA की mRNA स्तर वाहन और ligand के इलाज के नमूने के बीच नहीं बदला गया है. इसकी उच्च अभिव्यक्ति सीडीएनए स्टॉक का एक अलग 1:500 कमजोर पड़ने की आवश्यकता है और इसलिए कम उपयुक्त है यद्यपि 18S rRNA भी इस्तेमाल किया जा सकता है. MiRNA विश्लेषण के लिए, एक अच्छी तरह से परिभाषित संदर्भ जीन पर एक बहस अभी भी वहाँ है. अब तक, U6 snRNA व्यापक रूप से miRNA विश्लेषण के लिए स्वीकार कर लिया है कि एक संदर्भ जीन है. U6 snRNA परमाणु पूर्व mRNA SPL में समारोह में कहा कि ~ 110 न्यूक्लियोटाइड लंबे, noncoding छोटे परमाणु शाही सेना हैटुकड़े 19. चित्रा 6C (नीचे) में के रूप में मनाया, U6 अभिव्यक्ति के स्तर इस प्रकार miRNA के चर स्तर की गणना के लिए अनुमति देता है, दिखाए गए सभी नमूनों भर में लगभग एक ही हैं. संदर्भ U6 के लिए सामान्यीकृत किया गया है कि वाहन और E2 इलाज कोशिकाओं के बीच एक तुलना के लिए एक miRNA qPCR परिणाम के एक ग्राफिक प्रतिनिधित्व चित्रा 6D में मनाया जा सकता है. यह 24 घंटा E2 उपचार के बाद nonregulated के रूप में पाया गया कि एक miRNA दिखाता है, लेकिन इसके जीनोमिक स्थान के करीब ईआर chromatin बाध्यकारी साइटों बंदरगाहों, और समय श्रृंखला विश्लेषण उपचार के बाद महत्वपूर्ण विनियमन 72 घंटा पहचान है.

चित्रा 1
चित्रा 1. स्तन कैंसर की कोशिकाओं में miRNA के हार्मोनल विनियमन का पता लगाने के लिए कार्यरत दृष्टिकोण का अवलोकन.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रत्येक miRNA पहचान तकनीक के लिए विभिन्न नमूना तैयारी और न्यूक्लिक एसिड जोड़तोड़ की तुलना. (ए) μParaflo प्रौद्योगिकी पद्धति का उपयोग miRNA माइक्रोएरे संवर्धन, पाली, एक पीछा और बंधाव लेबलिंग भी शामिल है. (बी) DLP प्रौद्योगिकी नमूना तैयार करने और पहचान पद्धति विकृतीकरण कदम के बाद फैली जो एक looped सीडीएनए संश्लेषण प्राइमर भी शामिल है और शरण देने के एक लंबे समय तक टुकड़ा प्रदान करता है प्राइमर और जांच अनुक्रम रिवर्स. (सी) जाती डाई प्रौद्योगिकी नमूना तैयारऔर पहचान पद्धति पाली एक पीछा, और एक सार्वभौमिक 5 'अनुक्रम सहित एक oligo-dt प्राइमरों के साथ सीडीएनए संश्लेषण में शामिल हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. सेल संस्कृति और शाही सेना निकासी. (ए) संवर्धित कोशिकाओं ligand के साथ उपचार की जरूरत से पहले 80% confluency वर्णन करने के लिए. (बी) आरएनए एकाग्रता और पवित्रता की चित्रमय प्रतिनिधित्व निकासी के बाद. प्रत्येक चोटी एक नमूना का प्रतिनिधित्व करता है और एक सफल निष्कर्षण प्रक्रिया शुद्ध शाही सेना (शीर्ष पैनल) अर्जित करता है. एक खराब निकाले आरएनए 260 एनएम (नीचे पैनल) में कोई स्पष्ट अवशोषण शिखर से पता चलता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. & #160, शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण सीढ़ी (ऊपर), एक अच्छी गुणवत्ता आरएनए (मध्य) और एक अपमानित शाही सेना के नमूने (नीचे) के लिए ग्राफिकल प्रतिनिधित्व दिखा आरएनए अखंडता विश्लेषण से परिणाम..

चित्रा 5
चित्रा 5. MiRNA रूपरेखा परिणामों का एक उदाहरण. (ए) विभिन्न व्यक्त miRNAs के लिए miRNA माइक्रोएरे परिणाम की गर्मी का नक्शा प्रतिनिधित्व. लाल संकेत के रूप में हरे रंग में संकेत के रूप में मीर डी, ई, एफ, जी E2 इलाज के नमूने में downregulated कर रहे हैं, जबकि मीर ए, बी, सी, E2 इलाज नमूना में upregulated हैं. प्रत्येक के लिए (बी) प्रवर्धन भूखंडों DLP-LDA परिणामों से miRNA. आर.एन. मूल्य में वृद्धि से संकेत के रूप में पहचान miRNA परिलक्षित कर रहे हैं.

चित्रा 6 चित्रा 6. miRNA नियमों की qPCR विश्लेषण. एक miRNA के लिए (ए) पिघलने वक्र विश्लेषण सभी परीक्षण के नमूने (बाएं) और कई टुकड़े (दाएं) के प्रवर्धन की एकरूपता, दिखा जाती डाई पता लगाने का उपयोग का विश्लेषण किया. एक के लिए प्रत्येक नमूने के लिए (बी) प्रवर्धन भूखंडों miRNA. यह या तो जाती डाई या DLP तरीकों का पता लगाने से हो सकता है. (सी) के नमूनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर अभिव्यक्ति दिखा mRNA विश्लेषण ARHGDIA (ऊपर) के लिए और miRNA विश्लेषण snRNA U6 (नीचे) के लिए उपयुक्त संदर्भ जीन, बार ग्राफ़ प्रतिनिधित्व. (डी) एक समय के पाठ्यक्रम पर मीर 135a के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना वर्णन करने के लिए miRNA qPCR परिणाम. चित्रा 6D Elsevier से अनुमति के साथ Katchy एट अल. 1 से reprinted है. मान आमतौर पर अलग अनुभव का औसत रहे हैंiments (जैविक डुप्लिकेट) एसडी ±. * पी <0.05: विद्यार्थी t-परीक्षण महत्व को प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

Discussion

स्तन कैंसर की कोशिकाओं में miRNA के हार्मोनल विनियमन के लिए तंत्र का निर्धारण इस रोग को समझने के लिए एक मंच प्रदान कर सकते हैं और स्तन कैंसर के लिए संभावित उपचार प्रदान कर सकते हैं. हार्मोन कार्रवाई के लिए इष्टतम स्थिति प्रदान करने के लिए इन कोशिकाओं संवर्धन बहुत महत्वपूर्ण है. इधर, E2 के एक इष्टतम खुराक इलाज के दौरान एक उपयुक्त समय के लिए इस्तेमाल किया गया था इलाज से पहले और कहा कि ब्याज (एस्ट्रोजेन) के हार्मोन बाहर रखा गया था कि यह सुनिश्चित करता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. अन्य हार्मोनल और वृद्धि कारक प्रभाव धीरे - धीरे सीरम का स्तर कम करने और अपने हार्मोन, साइटोकिन्स, और वृद्धि कारकों के अधिकांश के छीन लिया गया है कि FBS है जो डीसीसी-FBS, का उपयोग करके एक न्यूनतम पर रखा गया था. Phenol लाल मुक्त मीडिया आगे फिनोल लाल estrogenic गतिविधि है और सेल लाइनों 20,21 में कुछ कार्यों को प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है, यह देखते हुए अन्य nonhormonal प्रभाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हार्मोन के लिए कोशिकाओं के जोखिम के समय बहुत महत्व है. जीन की एस्ट्रोजन जुड़े नियमन के लिए, यह पहले से 24 hrexposure स्तन कैंसर की कोशिकाओं 1,18 में प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन की महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया है कि उत्पादन दिखाया गया है. MiRNAs शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित रहे हैं, mRNAs की तरह, यह यह भी miRNAs की प्रत्यक्ष विनियमन पता लगाने के लिए एक उपयुक्त समय मुद्दा यह है कि कल्पना है. यह इन miRNAs स्तन कैंसर की कोशिकाओं में इन ज्ञात ईआर लक्ष्य की अभिव्यक्ति को कैसे प्रभावित करते हैं और अगर अभी तक निर्धारित किया है.

miRNA अभिव्यक्ति की रूपरेखा क्योंकि miRNA, परिपक्व miRNA अनुक्रम प्राथमिक miRNA और पूर्व miRNA में भी पाया जा सकता है कि इस तथ्य के रिश्तेदार छोटे आकार का चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और क्योंकि उनके जीसी सामग्री 22 में विविधता के कर सकते हैं. कई तकनीकों और chemistries इस कठिनाई को दूर करने के लिए नियोजित किया गया है. इनमें माइक्रोएरे और qPCR विश्लेषण के लिए अलग अलग दृष्टिकोण (चित्रा 2) हैं. माइक्रोएरे व्यापक रूप से पूरे जीनोम गुदा के लिए स्वीकार कर लिया है हालांकिysis, यह झूठी नकारात्मक प्रदान कर सकते हैं और रसायन विज्ञान से मुद्रण प्रौद्योगिकी 23 से लेकर उपलब्ध प्लेटफार्मों के बीच मतभेद मौजूद हैं. MRNA टेप के हजारों की तुलना में हजारों की संख्या में गिने जाते हैं जो अपेक्षाकृत कुछ miRNA जीन, विश्लेषण करते समय भी सामान्य बनाने की प्रक्रिया एक चुनौती प्रस्तुत करता है. qPCR, दूसरी ओर, अधिक संवेदनशील है, और कम जीनों माना जाना हो तो बेहतर लागू किया जाता है. थाली में केवल एक तकनीकी दोहराने के साथ, बड़ी 384 अच्छी तरह प्लेटें में प्रदर्शन किया हालांकि, जब कई प्लेटें विश्लेषण महंगा बना देता है जो प्रत्येक नमूने के लिए विश्लेषण करने की आवश्यकता है. इसके अलावा, हमारे हाथ में, बहुत अधिक गलत नकारात्मक परिणाम माइक्रोएरे की तुलना DLP-LDA विश्लेषण का उपयोग कर प्राप्त किया गया. परिपक्व miRNA अनुक्रम प्राथमिक miRNA और पूर्व miRNA दृश्यों में मौजूद है को देखते हुए, यह पीसीआर तकनीक 24 का उपयोग कर इन टेप के बीच अंतर करने के लिए ब्याज की है. डीएलपी जांच पूर्व miRNAs, और सपा के लिए भी उपलब्ध हैंecific प्राइमरों भी जाती डाई qPCR प्रौद्योगिकी का उपयोग वेरिएंट विभिन्न परिपक्व या अग्रदूत को छोड़ने के लिए तैयार किया जा सकता है.

qPCR परिणाम की रूपरेखा से अंतर अभिव्यक्ति की मान्यता के लिए एक सुनहरा मानक है. qPCR की प्रभावशीलता, तथापि, शाही सेना निकासी, आरएनए अखंडता (गुणवत्ता), सीडीएनए संश्लेषण, प्रथम डिजाइन, पहचान पद्धति (रसायन विज्ञान), और डेटा सामान्य बनाने 1,22,25 के लिए संदर्भ जीन सहित कई मापदंडों पर निर्भर करता है. कम miRNA अनुक्रम की लंबाई ज्यादा विकल्प प्राइमर डिजाइन के लिए कमरा नहीं देता है के बाद से miRNA विश्लेषण के लिए प्रथम डिजाइन के लिए विकल्प बहुत सीमित है, और केवल एक प्राइमर इस छोटे से दृश्य में harbored किया जा सकता है. अत: वैकल्पिक जोड़तोड़ के लिए की जरूरत चित्रा 2 में सचित्र के रूप में. तकनीकी replicates प्रवर्धन विधि की मजबूती और नियोजित प्रक्रिया को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. जैविक प्रतिकृति सामान्य जैविक variatio के एक प्रतिनिधित्व के लिए आवश्यक हैंएन, उपचार ligand के लिए, और एक सेल में देखा प्रभाव प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं दिखाने के लिए कि चर प्रतिक्रिया भी शामिल है. हमारे अनुभव के आधार पर, सेल संस्कृतियों के बीच miRNA अभिव्यक्ति में बदलाव हो सकता है. आमतौर पर इन मतभेदों को 1.3 गुना से कम नहीं हैं, और मूल्यों के औसत और इसी एसडी प्राकृतिक और तकनीकी भिन्नता को पहचानती है. इस बदलाव सेल घनत्व और सेल कार्यों पारित करने के लिए पारित होने से बदल सकता है तथ्य यह है कि, सहित विभिन्न कारकों से परिणाम सकता है. पी मूल्य 0.05 से कम है जब ligand उपचार से उत्पन्न सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए, एक व्यापक रूप से स्वीकार महत्व है. इधर, दो पूंछ वितरण और दो नमूना असमान विचरण मापदंडों का उपयोग जैविक और तकनीकी replicates पर एक छात्र के टी परीक्षण का इस्तेमाल किया गया है. अन्य T-परीक्षण मापदंडों मौजूद हैं, और चुनाव प्रयोगात्मक सेटअप 26 पर निर्भर करता है.

परिपक्व मीर के हार्मोनल नियमों के मूल्यांकन में एक विस्तृत प्रोटोकॉलस्तन कैंसर की कोशिकाओं में एनए प्रदान की गई है. रूपरेखा में और इन miRNA अभिव्यक्ति मान्य के महत्वपूर्ण प्रौद्योगिकियों और रसायन शास्त्र स्पष्ट रूप से समझाया गया है. स्तन कैंसर की कोशिकाओं में miRNA के अध्ययन के लिए चुना प्रौद्योगिकी अंत में वास्तव में जांच की जा रही है पर निर्भर करता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम उनके miRNA विशेषज्ञता को साझा करने के लिए डा. कैरिन Edvardsson, कारोलिंस्का संस्थान, स्वीडन, और डॉ. Eylem Aydogdu, ह्यूस्टन विश्वविद्यालय, के लिए, नियंत्रण रेखा विज्ञान miRNA माइक्रोएरे मंच करने के लिए सलाह प्रदान करने के लिए, डॉ. Xiaolian गाओ, ह्यूस्टन विश्वविद्यालय के आभारी हैं . इस प्रकाशन में सूचना दी अनुसंधान पुरस्कार संख्या R01CA172437 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. यह काम भी समझौते के तहत टेक्सास उभरते प्रौद्योगिकी कोष, कोई से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

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References

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स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एस्ट्रोजन विनियमित microRNAs की रूपरेखा
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Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

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