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Medicine

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

doi: 10.3791/51285 Published: February 21, 2014

Summary

에스트로겐과 마이크로 RNA 모두를 통해 신호 분자는 유방암의 발전과 성장에 중요하다. 에스트로겐은 전사 인자이다 에스트로겐 수용체를 활성화합니다. 많은 전사 인자는 마이크로 RNA의 발현을 조절할 수 있으며, 에스트로겐 조절 마이크로 RNA는 다른 대규모 기법을 사용하여 프로파일 링 할 수있다.

Abstract

에스트로겐은 유선의 발달과 유방 암의 진행에 중요한 역할을한다. 그것은에 바인딩 및 에스트로겐 수용체 (ER로), ERα와 ERβ를 활성화하여 그 기능을 매개한다. ERα 자주 유방암에서 상향 조절 및 유방암 세포의 증식을 구동한다. ER로는 전사 인자로서 기능 및 유전자 발현을 조절한다. 단백질 코딩 유전자의 ERα의 조절이 잘 확립되어있는 반면, 마이크로 RNA (miRNA의)를 비 암호화의 조절에 덜 탐구되는 것입니다. 의 miRNAs는 자신의 번역을 억제하거나 mRNA의 저하, 유전자의 전사 후 조절에 중요​​한 역할을한다. 의 miRNA가 암 유전자 또는 종양 억제로서의 기능을 수행 할 수 있으며, 또한 생체를 약속합니다. 제공되는 miRNA의 분석법 중에서도 마이크로 어레이 및 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)은 광범위 miRNA의 수준을 검출하고 정량화하기 위해 사용되어왔다. 유방암, 일에 에스트로겐 신호에 의해 조절의 miRNAs를 확인하려면ERα-양성 유방암 세포 라인에서 EIR 식을 비교 한 이전과 이후 프로브 - 저밀도 배열을 레이블 μParaflo - 미세 마이크로 어레이 및 듀얼을 모두 사용하여 에스트로겐 활성화. 결과는 프로브 계 화학 레이블 시아닌 염료 계 및 이중 모두 적용, 특정의 qPCR 분석을 이용하여 검증 하였다. 또한, 시간 점 분석은 시간이 지남에 따라 규제를 식별하는 데 사용 하였다. 본 연구에 사용 된 miRNA의 분석 방식의 장점은 심지어 제한된 샘플 양의 수많은 샘플에서 성숙한 miRNA의 규정의 빠른 스크리닝을 가능하게한다는 것이다. 특정 세포 배양 조건과 에스트로겐 치료, 생물학적 기술은 복제, 대규모 심사 등의 레이아웃은, 별도의 기술을 사용하여 심층적으로 확인을 한 후, miRNA의 규정의 강력한 탐지를 보장하고, 오탐 (false positive) 및 기타 아티팩트를 제거합니다. 기본 및 전구체 전 사체의 leve에서 그러나, 돌연변이 또는 알의 miRNAs, 또는 규정L은 감지되지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 에스트로겐 중재의 miRNA 규제의 철저한 조사를 나타냅니다.

Introduction

에스트로겐은 유선을 개발하는 동안 중요한 호르몬이다. 에스트로겐은 유방암 1의 개발, 유지 보수, 위험 및 치료에 중요한 역할을한다. 에스트로겐은 전사 인자이며, 특정 표적 유전자를 조절의 ER에 결합하여 그 기능을 발휘한다. 두 수용체의 변형, ERα는 유방암 세포의 에스트로겐 의존 확산을 위해 필수적입니다. 대부분의 유방암은 ERα 양성과 성장을위한 에스트로겐에 따라 달라집니다. 이것은 에스트로겐 신호를 만들어 호르몬 수용체 양성 유방암의 치료를위한 표적을 ERα있다. ERα의 기본 메커니즘을 이해하는 것은 치료 결과를 향상 치료에 저항을 극복하고, 유방암을 개발하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다.

의 miRNAs 인해 전사 후 유전자 조절에서의 큰 영향을 세포 기능에 중요한 역할을한다. 의 miRNA는 19 ~ 24 뉴클레오티드 짧고, 단일 가닥먼저 기본 miRNA의 성적 증명서 (PRI-miRNA의)에 RNA 중합 효소 II에 의해 전사되는 RNA를 비 암호화. 그들은 짧은 머리 핀 전구체의 miRNA (사전의 miRNA)에 Drosha에 의해 핵으로 처리하고 주사위 놀이를하는 사람에 의해 처리 세포질에서 성숙의 miRNA를 형성하는 단일 가닥으로 분리된다. 본쇄 성숙의 miRNAs는 RISC 복합체를 형성하기 Argonaute 단백질에 전송된다. 그런 다음의 miRNAs 번역을 차단 또는 대상 mRNA의 2를 분해하여 전사 후 조절로 이어지는, 대상의 mRNA의 3'-비 번역 영역 (3'-UTR)에 하이브리드 수 있습니다.

때문에 에스트로겐과의 miRNA가 모두 정상 또는 중단 에스트로겐 신호와 관련있는 miRNA를 식별, 종양의 진행에서 재생 중요한 역할에 개발에 대한 우리의 이해를 강화하고 유방암의 치료를 개선하기 위해 중요합니다. ERα 단백질 코딩 유전자를 조절하는 방법을 잘 이해하고, 확장이 있지만와 RNA의 규제를 비 암호화에 대한 자세한 내용은 충분히 조사 할 수 남아 있습니다. 유방암 세포주에서의 miRNA의 ERα 규제 해명을 목표로 초기 연구는 동일 세포주 3-6을 분석 한 경우에도 상반되는 결과를 낳았다. 이것은 다양한 치료법, 생물학적 변동, 다른 기술의 사용, 및의 miRNAs의 소형 분석하기가 어려운하게한다는 사실의 결과 일 수있다. 여기, 변형 및 방법의 이슈를 제어하는​​ 프로토콜을 설명한다.

의 miRNAs가 에스트로겐에 의해 조절되는 식별하려면 ERα 활동의 잘 정의 유방암 모델의 프로파일은 첫번째 단계이다. 여러 세포 라인은 임상 유방암의 대부분의 유사 에스트로겐에 의존하는 인간의 ERα-양성 유방암 종양에서 생성되었다. ERα와 그 하류 표적의 발현을 포함하여 이들 세포주이, T47D 및 MCF7의 분자 성질황체 호르몬 수용체 (PR), 에스트로겐 반응과 내강 상피 분화 유전자의 발현과 함께 막 수용체 HER2의 발현의 부족은 유방 종양 7-10의 내강 하위 유형에 대한 모델 '에 적합하다. 17β-에스트라 디올 (E2)는 에스트로겐의 지배적 인 형태이며, ERα 최적의 전사 활성화의 농도와 시간 점은 여러 연구를 특징으로하고 있습니다. 24 시간 동안이 프로토콜 10 nM의 E2 치료에서 유방암 세포 1 ERα 활동에 대한 모델로 사용 T47D와 MCF7된다. 또한, 시간에 따른 miRNA의 규정을 구체적 1-72 시간의 시간 간격으로 분석 할 수있다.

둘째, 분석의 miRNA는 그들의 짧은 크기에 부분적으로, 별도의 과제를 가지고 있습니다. 일반 구 아니 thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA의 침전을 수행 할 때 또는 때의 miRNA가 잘 총 RNA의 준비에 유지되지 않습니다 성andard 열 않는 정화가 사용됩니다. 특별한주의 사항은 유지하거나 RNA를의 작은 일부분에 대한 풍부하게 수행 될 필요가있다. 원심 분리 (-80 ° C) 전에 온도를 낮추고, 이소프로판올의 양이 증가하고, 70 % 에탄올로 세정을 생략하여, 유지 된 miRNAs의 침전 과정을 향상시킬 수있다. 또는 miRNA를 함유 총 RNA의 높은 품질과 견고한 제조를위한 특정 열 및 버퍼가 사용될 수있다. 또한 분석 자체에 대한 자신의 짧은 크기는 문제를 만들 수 있습니다. 마이크로 어레이, qPCR에, 차세대 시퀀싱 : 게놈 전체의 miRNA의 심사를 들어, 일반적인 세​​ 가지 선택할 수있는 프로파일 링 기술의 miRNA가 있습니다. 각 기술은 아티팩트를 도입 다른 위험으로 각각 다른 복수의 플랫폼을 사용하여 수행 될 수 있으며, 서로 다른 샘플의 준비가 필요하다. miRNA의 마이크로 어레이에서 슬라이드가 발견되거나 올리고 뉴클레오티드의 수천 합성. 이러한 올리고 뉴클레오티드는 프로브로 사용되어 프로브의 각의는 특정 miRNA의 서열에 하이브리드하도록 설계되어 있습니다. 본 연구에서 수행으로 마이크로 어레이의 샘플 준비, 첫 번째의 miRNA에 대한 풍부하고있는 miRNA에 Cy5에와 Cy3에 라벨을 소개합니다. 마이크로 어레이는 동시에 유전자의 다수의 상대적인 발현 수준을 관찰 할 수있는 기회를 제공 빠른 샘플의 다수의 검사에 적합하지만, 단지 마이크로 어레이에 서열이 존재하게 분석 할 수 있고 예를 들면 변화를 감지하지 않을 불명 또는 돌연변이 의 miRNAs. 이 프로토콜에서 수행으로 마이크로 어레이 분석은 분석을 위해 샘플 당 총 RNA의 상대적으로 많은 양의 약 5 μg가 필요합니다. 저밀도 qPCR에 miRNA의 프로파일 링은 적은 재료 (700 NG / 샘플 및 복제)이 필요하고,의 miRNA의 검출 및 정량화 할 수 있습니다. 전 사체 수준을 측정 할 수 있고, 양 절대량 또는 상 대량 수있다. qPCR의 분석은 우선 루프 형을 사용하여, 여기의 cDNA로 miRNA의 변환을 필요만의 miRNA 성숙의 분석을 보장 각각의 특정 miRNA에 대한 입문서. 이 miRNA를 특정 순방향 프라이머 및 루프 서열에 상보 보편적 역방향 프라이머를 이용하여 증폭 할 수 이상 템플릿을 생성하고, 특이성에 대한 이중 표지 프로브의 포함을 정박 할 수있다. qPCR에의 miRNAs는 수백 각 웰 (11)의 개별 프라이머 쌍과 하나 또는 다수의 384 - 웰 플레이트를 사용하여 병렬로 감지 할 수있는 저밀도 형식으로 사용될 수있다. 샘플의 모든 RNA를 11 서열화 될 수있는 차세대 시퀀싱은, 반면에, 신규 한 변이되거나 편집 된 miRNAs의 발견을 허용 이러한 기술에 있습니다. 이 기술은, 그러나, 작은 RNA를 풍부와 샘플 사이의 상대적인 발현 수준을 변조 이후 강화 된 위험으로 링커 ligations 및 않는 정화의 여러 단계를 사용하여 작은 RNA 라이브러리를 생성하기 위해 여러 단계가 필요합니다. 또한 중요한 bioinformati이 필요합니다CS의 분석. miRNA의 프로파일 링에 대한 다양한 기술을 감안할 때, 가장 적합한 기술은 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 물질이 상대적으로 풍부하고 관심이 이미 알려져있는 miRNA의 차등 표현을 정의하는 마이크로 어레이는 최적입니다. 샘플의 제한된 양을 사용할 수 있고 낮은 표현의 miRNAs의 높은 감도가 요구되는 경우 낮은 밀도의 qPCR 어레이는 최적입니다. 시퀀싱 변이 불명의 miRNAs 또는 miRNA의 다른 이소 폼의 분석이 요구되는 경우에 최적이다.

유방암에서 에스트로겐 규제의 miRNA의 연구에서는 두 가지 모델 셀 라인은 RNA의 많은 양이 쉽게 사용할 수있는 T47D 및 MCF7을 사용합니다. 각 세포주의 치료 기술 반복 실험의 여러 통로 각각을 사용하여 복제 된 세포 배양에서 분석 하였다. 이 재현성, ERα 규제의 miRNAs의 강력한 탐지 할 수 있습니다. 상대 miRNA의 발현 수준의 miRNA 마이크로 어레이 및 모두를 사용하여 비교 하​​였다이중 레이블 프로브 - 저밀도 어레이 (DLP-LDA)과는 시아닌 염료 및 DLP 화학을 모두 사용하여 특정 qPCR에와 결과를 확인. miRNA의 규정은 다음 추가 에스트로겐에 의한 규제에서 무작위주기 변화를 차별화하고, 차 효과의 기본 효과를 나타낼 수 있습니다 시간이 지남에 따라 자신의 정확한 규칙을 정의하는 시계열 분석 하였다. ERα의 크로 마틴 결합 연구와 Bioinformatical 비교는 보조 효과 대 차의 분화에 도움을 발전 할 수 있습니다. 분석은 24 시간 E2 치료 단백질 코딩 성적 증명서 후 즉시 규제되었지만 성숙의 miRNA가 1에 영향을받지 않을 것을 구축 할 수 있습니다 miRNA의 규정의 신뢰성 평가 결과. 그러나, 선택된 하나의 miRNAs의 시계열 분석에서 설명한대로의 miRNAs는, 나중에 타임 포인트에서 조절되는 것이 가능하다. 세부 사항은 더 탐구해야하고 여기에 제시된 프로토콜은 robus를 제공합니다유방암 세포주에서 성숙의 miRNA의 호르몬 조절을 연구하는 T 방법.

Protocol

1. 세포 배양 배지의 제조

  1. T47D 세포주 배양 배지 용 :
    1. 멸균 1 L 병 500 ㎖ F12 [DMEM/F12 (1:1)]와 함께 500 ㎖의 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)을 섞는다.
    2. 소 태아 혈청 50 ㎖ (이 5 % FBS를 만든다), 후 페니실린 스트렙토 마이신 10 ㎖ (이것은 1 %의 해충을 만든다)를 추가합니다. 완전히 내용을 섞는다.
    3. 4 ℃에서 보관
  2. MCF7 세포주 배양 배지 용 :
    1. 25 FBS (5 % FBS)의 ML 후 5 페니실린 스트렙토 마이신 (1 % PEST)의 ㎖를 500 ㎖의 DMEM 섞는다.
    2. 4 ℃에서 보관
    3. 감소 된 혈청 배지의 경우 :
      1. T47D의 경우 : 멸균 1 L 병 500 ㎖ F12 (1:1)과 500 ㎖의 페놀 레드가없는 DMEM을 혼합, 5 % DCC-FBS에 대한 덱스 트란 코팅 된 숯 처리 (DCC) FBS 50 ㎖를 추가합니다. 0.5 % DCC-FBS에 대한 5 ㎖ DCC-FBS와 별도의 병을 확인합니다. 그런 다음, 각각의 병에 해충 (1 % PEST) 10 ㎖를 추가합니다. 완전히 내용을 혼합, STOR4 ° C에서 전자
      2. MCF7의 경우 : 100 배의 L-글루타민 5 ㎖ (200 mM의 최종 농도)과 500 ㎖의 페놀 레드가없는 DMEM을 섞는다. DCC-FBS (5 % DCC-FBS)의 25 ML을 추가합니다. 2.5 ㎖의 DCC-FBS (0.5 % DCC-FBS)과 별도의 병을 확인합니다. 그런 다음, 각각의 병에 해충 (1 % PEST) 5 ㎖를 추가합니다. 4 ℃에서 완전히 매장을 내용을 혼합
    4. 인산 완충 식염수 (PBS) 용액 용 :
      1. 초순수 나 증류수로 1 L 멸균 유리 병을 채우십시오.
      2. 한 PBS 태블릿을 추가하고 태블릿이 용해 될 때까지 때때로 흔들어.
      3. 실온에서 PBS 용액 및 판매자를 압력솥.
    5. 리간드 주식의 준비 :
      1. 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 100 ㎕의 에탄올 또는 DMSO에 17β-에스트라 디올 2.72 ㎎의 용해에 의해 E2의 100 ㎜ 주식 솔루션을 준비하고 부드럽게 내용을 혼합한다. 간단히 스핀 10 ㎜, 1 ㎜, 0.1 ㎜ 재고 concentr를 산출하는 일련 희석 (1:10)합니다용매를 사용하여 관리 포인트. -20 ° C에서 모든 E2 주식 솔루션을 저장
      2. 멸균 1.5 ML microcentrifuge 관에 100 μL의 EtOH 또는 DMSO에 ICI 182,780의 6.07 MG를 용해하여 ICI의 100 ㎜ 주식 솔루션을 준비하고 부드럽게 내용을 혼합한다. 간단히 스핀 10 ㎜, 1 ㎜, 용매를 사용하여 0.1 ㎜의 주식 농도를 산출하는 일련 희석 (1:10)합니다. -20 ° C에서 모든 ICI 주식 솔루션을 저장
      3. 비히클은 용매 (에탄올 또는 DMSO)이다. -20 ° C에서 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 100 % 에탄올 또는 DMSO의 0.5 ML를 배치

2. 세포 배양 및 치료

기술은 복제 이중 또는 삼중 판에 각각의 처리를 수행합니다. 이 세포주의 생물학적 역할을 복제하는 것과 같은 세포주의 다른 통로를 이용한 세포 배양 및 치료 과정을 반복한다. REPL에 다른 셀 라인과 절차를 반복하나 이상의 세포주에서의 연구 결과를 icate. 모든 세포 배양 기술은 층류 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다.

  1. 세포 배양 시작
    1. 멸균 따뜻한 물을 욕조에 37 ° C에 미디어를 따뜻하게.
    2. T47D 또는 MCF7 세포의 고정 된 유리 병을 해동.
    3. 70 % 에탄올로 유리 병 및 미디어 병의 외부를 청소 한 다음 멸균 층류 후드에 유리 병 병을 모두 놓습니다.
    4. (후드) 따라 멸균 T-75 플라스크 레이블을 지정합니다.
    5. (즉, 표면이 완전히 매체로 덮여 확인) 멸균 혈청 피펫을 사용하여 플라스크에 해당하는 용지의 12 ~ 15 ML을 추가합니다.
    6. 플라스크에 유리 병에서 세포를 전송하고 부드럽게 섞는다.
    7. 5 % CO 2와 함께 제공되는 37 ° C 배양기에서 플라스크를 놓습니다.
  2. 치료를위한 세포의 준비
    1. 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 세포가 80 % 이상을 공동으로 보장하기 위해 현미경으로 관찰nfluent. 이 실험에 대한 충분한 세포가 있다는 것을 확인하는 것입니다. 멸균 후드에 플라스크를 전송합니다.
    2. 진공에 연결 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 플라스크에서 용지를 제거합니다. 부드럽게 PBS로 두 번 붙어 세포를 씻어.
    3. 플라스크에 따뜻한 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ㎖를 추가하고 2 분 동안 인큐베이터에서 플라스크를 넣어. 이것은 세포가 플라스크에서 분리하는 것이다.
    4. 플라스크에 3 ~ 4 ㎖의 적절한 따뜻한 미디어를 추가하고 5 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 분리 된 세포를 씹다. 혈청학 피펫으로 셀을 차지 압력을 증가 플라스크의 바닥에 대해 배치 된 피펫 팁으로 세포를 방출 의해 분쇄 액. 이것은 하나의 세포로 떨어져 세포를 파괴하는 것입니다.
    5. 제조자의 프로토콜에 따라, 세포 계수기를 사용하여 세포, 예를 센다.
    6. (필요에 따라) 100 밀리 판을 레이블과 접시에 약 10 ㎖의 미디어를 추가 할 수 있습니다. 플레이트 약 2.0 X 10 6 세포 / 플레이트. GE에 의해 세포를 배포ntle 판을 소용돌이.
    7. 약 80 %의 합류 때까지 48 시간 동안 세포를 품어.
    8. 80 %의 포화 상태에서, PBS로 두 번 세포를 세척하고 해당 5 % DCC-FBS 미디어를 추가 할 수 있습니다. 그 후, 24 시간 동안 세포를 배양한다.
    9. 24 시간 후, PBS로 두 번 세포를 세척하고 해당 0.5 % DCC-FBS 미디어를 추가 할 수 있습니다. 그런 다음, 추가로 48 시간 동안 세포를 배양한다.
  3. 세포 치료
    1. 48 시간 후, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 가능한 한 PBS의 많은 부분을 제거해야합니다.
    2. 15 ML 원뿔 관에서 적절한 0.5 % DCC-FBS 매체의 10 ML을 추가합니다. 그런 다음, 10 nm의 최종 농도 0.1 mM의 리간드 재고 (E2 또는 ICI)의 1 μl를 추가합니다. 또한, 제어 실험에 대한 별도의 튜브에 10 ㎖ 미디어에 차량의 1 μl를 추가합니다.
    3. 부드럽게 튜브의 내용을 섞어서 접시에 셀을 추가 할 수 있습니다. 이 접시 당 하나의 리간드해야한다.
    4. 선택한 시점 (0-72 시간)에 세포를 품어.
<P 클래스 = "jove_title"> 3. RNA 추출 및 품질 관리

  1. RNA 추출
    1. 처리 시간은 원하는 시간 동안 끝나면 접시에 세포를 약 1-2 ㎖의 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 용액을 부가 한 다음, PBS로 두 번 세포를 씻어. 주의 : 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 용액을 흡입, 피부 나 눈에 접촉에 의한 독성하거나 삼키면. 적절한 보호 복, 보호 장갑 및 눈 / 안면 보호구를 착용하고, 흄 후드를 사용합니다.
    2. 세포의 부피가 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 용액의 부피의 더 이상 10 % 이하이고, 판을 용액 피복 1 분 동안 앉아 있도록되어 있는지 확인. 그런 다음, 고무 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어 microcentrifuge 관에 전송합니다. 세포 주 동안 -80 ° C에서이 솔루션에 저장할 수 있습니다.
    3. 추출 및 스핀 칼럼 정제 및 DNase의 뒤에 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 법을 이용하여 각 처리로부터 전체 RNA를 정제동물 세포에 대한 I DNA 분해 방법.
    4. 추출 후, 세포를 60 μL의 RNase가없는 물에 용출된다. C. ° -80에서 정량 분석​​ 및 저장 RNA에 대한 나누어지는 1 ~ 2 μL의 RNA
    5. RNA와 aspectrophotometer 1 μL를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. 모든 측정이 완료되기 전에 찍은 공백이 있는지 확인하십시오. 또한, 완전히 측정을 촬영 분광 광도계의 도달 시간을 닦습니다. 농도는 일반적으로 NG / μL에 표시됩니다. RNA 농도를 보여주는 결과를 저장합니다.
  2. RNA의 품질 관리
    1. microcentrifuge 관에있는 각각의 샘플과 장소에 대한 100 NG의 RNA를 가져 가라.
    2. bioanalyzer를 사용하여 RNA의 무결성을 측정한다. 보통 12 샘플 bioanalyzer에서 한 번에 실행할 수 있습니다. 실행은 일반적으로 약 25 분 소요됩니다.
    3. RNA는 실험을 위해 좋은 있는지 확인하기 위해 RNA의 사다리 결과를 비교. 저장 및 인쇄 결과.

4. 치료의 확인, 표준 : 단백질 코딩 유전자의 qPCR에

  1. cDNA 합성
    1. (각 샘플의) 총 RNA 500 NG 또는 1 μg을 가지고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 넣어. 최대 RNase가없는 물을 사용하여 10 μL 각 튜브의 볼륨을 가져와.
    2. 10 분 동안 70 ° C에 50 μM 임의의 헥사 프라이머 및 열 튜브의 2 μl를 추가합니다.
    3. 5 분 동안 얼음에 튜브를 전송합니다.
    4. 각 샘플의 경우, 배 첫 번째 가닥 버퍼 4 μL, 0.1 M DTT의 1 μL, 10 mM의 dNTPs를 1 μL, 첨자 III의 0.5 μL, 1.5 μL의 RNase가없는 물을 추가합니다.
    5. 10 분 동안 25 ° C의 열 블록 또는 물을 욕조에 넣고 관.
    6. 1 시간 동안 46 ° C의 열 블록에 전송 관. 이어서, 15 분간 70 ° C의 열 블록 전열관은 반응을 정지.
    7. -20 ℃ 희석과 상점에 대한 RNase가없는 물을 사용 (총 RNA의 입력을 사용하여 계산) 5 NG / μL 주식에 cDNA를 희석
  2. qPCR에
    1. 관심과 참고 유전자의 유전자에 대한 프라이머를 얻습니다. 프라이머 간단 NCBI의 뇌관-BLAST 프로그램 (12)에 대한 프라이머 설계 도구를 이용하여 설계 될 수있다. 이것은 일반적으로 관심의 각 유전자의 전방 및 역 프라이머를 생성합니다. 프라이머의 길이는 18-22 염기쌍이어야, 52-58 °의 C의 융점이 40 % ~ 60 %의 GC 함량을 가지고, 100-180 염기쌍의 앰플 리콘 길이.
    2. 각각의 qPCR 반응 아니라, cDNA의 NG (단계 4.1.7에서 재고 농도에서 2 μL), 앞으로 각 1 pmol의 10을 추가하고 (단계 4.2.1에서) 그 유전자의 프라이머를 반전, 5 μL의 배 시아닌 염료 PCR 마스터 믹스. 각 웰에 대한 반응은 10 μl의 최종 반응 볼륨이 있어야합니다.
    3. (기술은 복제의 경우) 각 유전자에 대한 각 샘플에 대한 세중의 우물이 있다는 것을 확인합니다. 96 - 웰 반응 플레이트가 사용될 수있다.
    4. QRT-PCR 시스템 소프트웨어에서, 기자와 대상을 할당 반응 부피를 입력, 비교를 선택임계 사이클 (ΔΔCT) 방법 및 샘플 우물을 정의합니다.
    5. 하나의 특정 단편의 증폭을 확인하기 위해 시아닌 염료 실행을위한 융해 곡선 분석을 수행해야합니다. 실행에 대한 기본 설정을 사용하여 번호판을 실행합니다.
    6. 실행 후 결과 및 데이터 내보내기 (MS Excel로, 특히 CT 값)을 저장합니다.
  3. ΔΔCT의 공식을 사용하여 qPCR의 데이터 분석
    상대적인 mRNA 발현의 변화는 다음 단계를 사용하여 각 시료에 대한 엑셀 제어 방면 변경 상대적으로 계산 될 수있다 :
    1. 위의 qPCR에서 보낸 모든 결과는 캐럿의 값이 포함되어 있어야합니다. 아래 공식을 사용하여 식에서 ΔCT 값을 계산한다 :
      • 식에서 ΔCT = CT (표적 유전자) - CT (참조 유전자)
      이것은 각각의 샘플에 대해 수행해야합니다. 대상은 관심의 유전자 또는 miRNA의입니다.
    2. 다음으로, 각 샘플의 총 표준 편차 (SD)를 계산합니다. 첫 번째 계산참조 유전자 후 표적 유전자 (이것은 CT 값에서 STD DEV 함수를 사용하여 엑셀에서 수행 될 수있다)을위한 SD를 산출 SD. 그런 다음이 수식을 사용하여 각 샘플에 대한 총 SD를 계산 :
      • 전체 SD = (SD2 (대상) + SD2 (참고)) 1 / 2
    3. 에 의해 유전자 (대상) 내에서 각 샘플의 ΔΔCT를 계산
      • ΔΔCT = ΔΔCT (치료 / 시험 샘플) - ΔΔCT (제어 / 교정기 샘플)
      캘리브레이터 샘플은 처리되지 않은 샘플입니다.
    4. 마지막으로, 수식을 사용하여 각 샘플의 배 변화 (FC) 값을 계산합니다 :
      • FC = 2 ΔΔCT
      각 샘플의 접이식 변경 값은 상기 기준 유전자 및 대조 샘플로 정규화 한 유전자 / miRNA의 상대적 표현을 제공한다.
    5. 스튜던트 t-시험은 양측 분포 및 2 샘플 불균등 분산을 사용하여 통계 분석을 위해 사용될 수있다파라미터 (P <0.001 (***), P <0.01 (**), 및 P <0.05 (*)). 이 엑셀에 달성 될 수있다. 치료가 miRNA의 프로파일을 진행하기 전에 알려진 대상 규제의 결과 있는지 확인합니다.

5. miRNA의 프로파일 분석

  1. miRNA의 마이크로 어레이
    1. microcentrifuge 관에 차량 또는 리간드, 장소 하나와 함께 처리 된 세포에서 고립 된 RNA 5 μg을 가져 가라. 20 μL에 관에서 볼륨을 조정합니다. 각각의 비교 중복 또는 삼중으로 수행해야합니다.
    2. 위의 RNA 샘플을 사용하여 miRNA의 마이크로 어레이를 수행합니다. miRNA의 마이크로 어레이 발현 프로파일은 μParaflo 미세 유체 바이오칩 기술에 의해 인간의 miRNA 마이크로 어레이 이중 색상 견본 배열 (생어 miRBase 릴리스 14.0) (13)을 사용하여 결정되어야한다.
    3. 결과는 차별적 표현의 miRNA를 표시해야합니다. P <0.05.p-값 <0.10도 더 협력을 위해 고려 될 수있을 때 중요한 miRNA의 식을 고려qPCR에를 사용 nfirmatory 분석. qPCR에있는 더 검증이 miRNA의 목록을 저장합니다.
  2. miRNA의 프로파일 : DLP-LDA
    1. 각 샘플은 중복 또는 삼중으로 분석해야한다. 차량이나 리간드 하나와 함께 처리 된 세포에서 총 RNA 700 NG를 가지고, microcentrifuge 관에 배치합니다. 3 μL에 관에서 볼륨을 조정합니다.
    2. 이중 레이블 프로브 miRNA의 정량법 및 10X RT 프라이머를 사용하여 cDNA 합성을 수행한다. 각 반응의 총 부피는 7.5 ㎕를해야한다.
    3. PCR 시스템의 열 순환기에 반응 관을 배치하고 이중 레이블 프로브의 miRNA 분석 방법에 표시된 권장 매개 변수를 설정합니다. 실행을 시작합니다. 이 cDNA를 생성합니다. cDNA를 적어도 1 주일 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
    4. RT 반응이 실행되는 동안, DLP-LDA 판을 꺼내 실온에 앉아 할 수 있습니다. 각 배열 판은 고유의 miRNA 프라이머 및 제어 프라이머를 포함 384 우물을 포함하고 있습니다.
    5. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 6 (5.2.3에서)의 cDNA ㎕의 장소를 가지고 간다. 이중 레이블 프로브 2 배 범용 PCR 마스터 믹스 450 μl를 추가하고 444 μL의 RNase가없는 물을 추가합니다.
    6. 내용과 원심 분리기를 짧게 혼합 관에게 여섯 번 반전.
    7. DLP-LDA 판은 여덟 각각에 실내 온도, 부하 100 μL에 도달하면 판의 '포트를 입력합니다'. 그런 다음, 배열 판을 원심 분리기.
    8. QRT-PCR 시스템을 열고 블록이 있는지 확인하는 384 - 웰 플레이트. SDS 소프트웨어를 사용하여 런타임을 설정합니다. 상대 정량 (CT)을 선택, 잘 번호와 배열 유형을 선택하고 우물을 정의하는 샘플에 대한 설명을 입력합니다.
    9. 기본 열 사이클링 조건을 사용하여 배열을 실행합니다. 실행이 완료되면, MS Excel로 결과 및 수출을 저장하고 ΔΔCT 식 (4.3 단계)를 사용하여 추가 분석을 위해 저장합니다.

6. 분리를 사용하여 miRNA의 규정 확인qPCR의 분석

  1. 시아닌 염료의 qPCR 분석
    1. 원하는 miRNA의 분석을위한 디자인 프라이머. 포워드 프라이머와 같은지 성숙의 miRNA의 시퀀스는 14 mirbase.org로부터 얻을 수있다. 'T'모든 'U'로 변환합니다.
    2. cDNA를 준비 : 1.5 ㎖의 원심 분리 관에서 총 RNA 및 장소 1 μg을 가져 가라. 폴리 A는 miRNA의 첫 번째 가닥의 cDNA 합성 및 QRT-PCR 프로토콜에서 미행과의 miRNA의 첫 번째 가닥 cDNA 합성에 대한 지침을 따르십시오. -20 ° C에서 생성 된 cDNA (1시 10분) 및 저장을 희석
    3. 한 96 웰 반응 플레이트를 얻습니다.
    4. 각각의 miRNA의 qPCR 반응에 잘 단계 6.1.2에서 키트 (16 폴리 A의 cDNA NG (단계 6.1.2에서), (단계 6.1.1에서) 특정 앞으로 프라이머의 각각의 2 pmol의 및 보편적 인 프라이머를 추가 ) 및 2 배의 qPCR 마스터 믹스의 5 μL. 최종 반응 부피가 10 μL / 잘.
    5. (기술은 복제에 대한) 각각의 miRNA에 대한 각 샘플에 대한 세중의 우물이 있다는 것을 확인합니다. 또한, 참조 유전자 (보통 U6 snRNA)가 포함되어 있는지 확인하십시오.
    6. QRT-PCR 시스템 소프트웨어에서, 기자와 대상을 할당 반응 부피를 입력, 비교 임계 사이클 (ΔΔCT) 방법을 선택하고 샘플 우물을 정의합니다.
    7. 실행에 대한 기본 설정을 사용하여 번호판을 실행합니다. 모든 시아닌 염료 실행을위한 녹는 곡선 분석을 수행해야합니다. 각각의 용융 곡선은 하나의 특정 단편의 증폭을 확인하는 하나의 특정 피크를 표시해야합니다. 하나 이상의 피크 또는 명확한 피크가 관찰되는 경우, 프라이머는 특정되지 않고 데이터는 사용할 수 없다.
    8. 실행 후 결과 및 데이터 내보내기 (MS Excel로, 특히 CT 값)을 저장합니다.
  2. 이중 레이블이 프로브의 qPCR 분석
    1. 0.2 ML microcentrifuge 관에 5 μL 볼륨과 장소에 각 총 RNA 10 ng의 각을 가져 가라.
    2. 이중 레이블 프로브 마이크로를 사용하여 역전사 (RT)을 수행의 프로토콜과 지침에 따라RNA 역전사 키트 15. 각 총 반응 부피는 15 ㎕를해야한다. 이중 레이블 프로브 RT 반응에 대해 연구 할 각 miRNA의 특정 프라이머가 있습니다.
    3. 장소 반응 PCR 시스템의 열 순환기의 튜브 및 프로토콜에 따라 매개 변수를 설정은 위의 단계 6.2.2에 표시된. 실행을 시작합니다. 그것은 약 70 ~ 80 분 소요됩니다.
    4. RT 반응 후, 1:5 비율로 샘플의 cDNA를 희석하고, -20 ° C에서 어둠 속에서 모두의 cDNA를 저장
    5. 한 96 웰 반응 플레이트를 얻습니다.
    6. 이중 레이블이 프로브의 10 ㎕의 2 배 범용 PCR 마스터 믹스 (단계 5.2.5과 같은 시약), RNase가없는 물 7.67 μL, 20 × 실시간 분석 프라이머 1 ㎕를 각 miRNA의 qPCR에 반응을 잘 다음을 추가합니다 (각 miRNA의 특정), 그리고 위의 단계 6.2.4에서의 cDNA 1.33 μL. 이것은 20 ㎕의 최종 반응 부피해야합니다. 부드럽게 내용을 혼합하고, 원심 분리기 잠시.
    7. 그 일을 확인감수 (기술은 복제에 대한) 각각의 miRNA에 대한 각 샘플에 대한 세중의 우물이다. 또한, 참조 유전자 (보통 U6 snRNA)가 포함되어 있는지 확인하십시오.
    8. QRT-PCR 시스템 소프트웨어에서, 그 각각의 miRNA (대상)의 기자 (FAM)와 소광 (NFQ-MGB)을 할당 반응 부피를 입력, 비교 임계 사이클 (ΔΔCT) 방법을 선택하고 샘플 우물을 정의합니다.
    9. 이중 레이블 프로브 마이크로 RNA 분석 프로토콜에서 실행 qPCR에 대한 매개 변수를 설정하기위한 지시 사항을 따르십시오. 그런 다음, 실행을 시작합니다. 실행 후 결과 및 데이터 내보내기 (MS Excel로, 특히 CT 값)을 저장합니다.

Representative Results

방법의 개요는도 1에 제시 및 다양한 샘플 준비 및 각 기술에 필요한 핵산 변형의 비교가도 2에 시각화된다.

호르몬 치료 전에 세포의 상태 및 환경 호르몬 (16)의 실제적인 효과를 결정하는데 중요하다. 일부 매체와 혈청은 결과에 영향을 미칠 수있는 성장 인자를 포함, 그래서 세포는 모든 호르몬의 영향이 최소한으로 감소 된 것을 확인하기 위해 공복 혈청 있습니다. E2로 처리 할 때 따라서, 관찰 된 효과가 E2-관련된 것을 더 확신이있다. 중요한 요인은 세포 - 세포 접촉과 같은 세포 - 세포 신호 전달 및 증식과 같은 동작에 영향을 미치는 세포의 컨 플루이다. 세포가 80 % 합류 (도 3a)까지 가능하고 잘 성장을 허용하고 후속 세척 및 미디어 CH 동안 세포의 손실을 방지하기 위해 부착 된앤지.

RNA 추출 및 보관시 조건은 RNA의 품질 및 후속 분석을 위해 중요하다. 또한 셀의 수, 추출 방법, 및의 miRNA의 GC 함량의 mRNA 및 (17) 모두의 miRNAs의 수율과 품질에 영향을 미칠 수있는 것으로 알려져있다. 따라서, RNase가없는 조건에서 RNA 추출을 수행하는 실험을 진행하기 전에 RNA의 품질을 확인하는 것이 필요하다. 추출 후, RNA 정량 수율의 관찰을 가능하게 (의 mRNA와의 miRNA를 모두 포함)의 총 RNA의 농도에 대한 정보를 제공합니다. 또한 그림 (b)에서와 같이 결과의 그래픽 표현을 제공하고,이 (보통 하나의 피크, 상단 패널로 표시) 샘플의 순도를 관찰 할 수 있습니다. RNA의별로 수율은 260 nm의 (그림 3B, 하단 패널)에서 특정 흡수를 생산 없을 것입니다. RNA는 높은 품질, RNA의 여부를 확인하는 방법완전성을 측정 하였다. 9-10 사이의 RNA 무결성 번호 (RIN)는 RNA가 분해되지 않고, 최적 품질의 것을 보장한다. 또한, RNA의 그래픽 표현이 관찰되어야하고, 그림 4 (중간 패널)과 같이 18S와 28S rRNA의 봉우리가 있어야합니다. 사다리 (그림 4, 상단 패널)과의 비교는 피크의 크기를 식별합니다. 성능이 저하 된 RNA는 분명하지 봉우리와 18S와 28S rRNA의 감소 된 상대적인 양 (그림 4, 하단 패널)을해야합니다. RNA를 작은 분율 더욱 애질런트 작은 RNA 키트를 이용하여 확보 할 수있다. 그것은 miRNA의 심사로 진행하기 전에, 지정된 실험 조건에서, 치료 후 에스트로겐 응답의 유효성을 검사하는 것이 좋습니다. qPCR의 cDNA를 템플릿을 사용하여, 예컨대 PS2 SPINK4 또는 18과 같은 공지 된 ER 타겟 유전자에 대해 수행 될 수있다. 이러한 유전자는 일반적으로 E2 치료 후 1-24 시간 내에 상향 조절된다. RNA의 질 및 에스트로겐 응답 일단추가 실험이 실시 될 수 있으며, 평가하고있다.

마이크로 어레이는 여전히 세포에서 miRNA의 발현을위한 대규모 검열을위한 널리 사용되는 기술이다. 예를 들어, 한 번 사용 된 miRNA의 마이크로 어레이는 894 성숙의 miRNA와 네 쌍둥이 1 50 컨트롤 고유의 프로브가 포함되어 있습니다. 혼성화는 염료 스왑 절차 중복으로 수행 하였다. miRNA의 마이크로 어레이 결과는 일반적으로 그래픽 히트 맵으로 표시됩니다. 그림 (a)는 차량 및 E2 처리 샘플 사이의 miRNA 마이크로 어레이의 비교 데이터를 대표하는 히트 맵을 보여줍니다. 빨강은 녹색의 miRNA (낮은 표현)의 하향 조절을 지시하는 동안의 miRNA가, E2 처리 샘플 (높은 표현)에서 발현이 증가되어 있음을 나타냅니다. miRNA의 선택은 일반적으로 식에 자신의 중요성에 따라, 0.05보다 일반적으로 p 값 덜 중요한 것으로 간주됩니다. 차별적 표현하는 표시되어있는 miRNA는 더욱 승 유효성을 검사해야i 번째의 qPCR은 오탐 (false positive)과 구별한다.

DLP-LDA 배열은, 다른 한편으로는, 384 - 웰 포맷으로 규제 된 miRNAs 대한 화면 qPCR에 기반 방법을 사용한다. 보통 두 개의 384 - 웰 플레이트 (카드) 풀, 제공 및 B. 풀은 각각의 miRNA의 상대적 수준이 하나의 miRNA가 당 분석 qPCR에 의해 결정되는 풀 B.보다의 miRNA를 일반적으로 더 나은 특성화 포함하고 더 높은 표현 잘 (그림 5B). 높은 CT-값이 낮은 miRNA의 발현을 나타냅니다. 대부분의 miRNA 마이크로 어레이와 같은 DLP-LDA에서 얻을 결과는 더 정확성을 기하기 위해 확인해야합니다.

검증은 qPCR에를 사용하여 수행 될 수있다. 여기, 두 qPCR의 검출 방법은 방법의 편견을 방지하기 위해 철저한 확인 및 miRNA의 규정을 조사 할 수 있도록 설명되어 있습니다. 시아닌 염료 기반 탐지 화학은 DLP-LDA 프로파일의 기반이 DLP와 다른 작동하고, 확인을 위해 적당하다ATION 목적. 그것은의 miRNA의 용융 곡선 분석을 보여준다는 모두 증폭 된 이중 가닥 DNA를 검출하지만, 샘플의 균질성.도 6A (패널 왼쪽) 용융 곡선 분석을 수행함으로써 평가 될 수있는대로 적은 즉, 수 명확하게 정의 된 균일 한 피크를 볼 수 있습니다. 프라이머는 프라이머 이량 체의 특이 현상 또는 상당한 양의 (그림 6A, 오른쪽 패널)이 형성되어있는 경우 여러 개의 피크가 관찰 될 것이다. 한편 DLP miRNA의 분석법은 miRNA의이 검출 대상의 증폭뿐만 아니라 더 구체적. 도 6b에 예시 된 바와 같이, 각 타겟의 miRNA 증폭 플롯이 관찰 될 수있다. 용융 곡선 분석을 사용하여 여러 증폭 산물의 발생을 제어하기위한 옵션이 화학 및 시아닌 염료 qPCR에 덜 비싸다 가진 그러나 사용할 수 없습니다. 시아닌 염료와 DLP의 qPCR 분석은 때때로 약간 다른 결과를 생성 할 수 있습니다. REFE에 모두의 qPCR 분석, 비교를 위해rence 유전자는 두 개의 샘플 사이의 유전자의 상대적 발현을 결정하기 위해 필요합니다. 또한 하우스 키핑 유전자라고도 참조 유전자는 발현이 변경되지 않고 또한 유전자와 유사한 수준으로 발현되는 유전자이어야한다. 이러한 유방암 세포주에 적합한 참조 유전자의 예는 ARHGDIA, RHO 단백질의 GDP / GTP 교환 반응 작용 RHO GDP 해리 억제제이다. 그림 (c) (위)에서 관찰 된 바와 같이, ARHGDIA의 mRNA의 수준은 차량과 리간드 처리 샘플 사이에 변경되지 않습니다. 높은식이의 cDNA 재고 별도 1:500 희석을 필요로하며, 따라서 덜 적합한 불구 18S rRNA에 또한 사용될 수있다. miRNA의 분석을 위해, 잘 정의 된 기준 유전자에 대한 논쟁은 여전히​​ 존재한다. 지금까지, U6 snRNA 폭넓게 miRNA의 분석을 위해 허용되는 참조 유전자이다. U6 snRNA 핵 사전 mRNA의 SPL에서 작동 ~ 110 개의 핵산, 비 암호화 작은 핵 RNA입니다장식 19. 도 6c (바닥)에서 관찰 된 바와 같이, U6 발현 수준은 따라서의 miRNA의 가변 레벨의 계산을 허용 도시 된 모든 샘플에 대해 가로 질러 동일하다. 기준 U6에 정상화 된 차량과 E2-처리 된 세포 사이의 비교의 miRNA의 qPCR 결과의 그래픽 표현도 6d에 관찰 할 수있다. 이것은 24 시간 E2 처리 후 규제 없슴로 검출되었다의 miRNA를 보여줍니다, 그러나 그것의 게놈 위치에서 가까운 응급실 염색질 결합 부위를 비호하고, 시계열 분석은 치료 후 상당한 규제 72 시간을 확인한다.

그림 1
그림 1. 유방암 세포에서의 miRNA의 호르몬 조절의 검출에 이용 방법의 개요.

그림 2
그림 2. 각 miRNA의 검출 기법에 대한 다양한 샘플 제제 및 핵산 조작의 비교. (A) μParaflo 기술 방법을 이용하여 miRNA의 마이크로 어레이는 풍부, 폴리-A 꼬리 끌림 및 결찰 라벨을 포함한다. (B) DLP 기술 샘플 준비 및 검출 방법은 변성 단계 후에 연장 루프 cDNA 합성 프라이머를 포함하며, 숨겨 긴 단편을 제공한다 프라이머 및 프로브의 순서를 반대로. (C) 시아닌 염료 기술 샘플 준비및 검출 방법은 폴리 A-미행하고, 보편적 5 '서열을 포함하는 올리고-DT 프라이머로 cDNA 합성을 포함한다.

그림 3
그림 3. 세포 배양 및 RNA 추출. (A) 배양 세포 리간드로 처리하기 전에 필요한 80 %의 포화 상태를 설명합니다. (B) RNA 농도와 순도의 그래픽 표현을 추출 후. 각 피크 샘플을 나타내며 성공적으로 추출 과정은 순수한 RNA (상판)를 산출한다. 제대로 추출 된 RNA는 260 nm의 (아래 패널)에 명확한 흡수 피크를 보여줍니다.

그림 4
그림 4. & #160, RNA 품질 관리 사다리 (위), 좋은 품질의 RNA (가운데)와 성능이 저하 된 RNA 샘플 (아래)에 대한 그래픽 표현을 표시 RNA 무결성 분석의 결과..

그림 5
그림 5. miRNA의 프로파일 링 결과를 보여줍니다. (A) 차별적 표현의 miRNA에 대한 miRNA의 마이크로 어레이 결과 열지도 표현입니다. 적색으로 표시된 바와 같이, 녹색에 표시된 미르 - D, E는, F, G는 E2-처리 된 샘플에서 하향 조절하면서 미르 - A, B, C는, E2 처리 된 샘플에서 상향 조절된다. 각 (B)의 증폭 플롯 DLP-LDA 결과에서의 miRNA. Rn의 값의 증가에 의해 지시 된 바와 같이 검출의 miRNA가 증폭된다.

그림 6 그림 6. miRNA의 규정의 qPCR 분석.의 miRNA에 대한 (A) 융해 곡선 분석 모든 테스트 샘플 (왼쪽)과 여러 조각 (오른쪽)의 증폭의 동질성을 보여주는, 시아닌 염료 검출을 사용하여 분석 하였다. 각 샘플에 대한 (B)의 증폭 플롯 miRNA의. 이것은 하나 시아닌 염료 또는 DLP 탐지 방법을에서 할 수있다. (C) 시료간에 유의 한 차이 식을 보여주는 mRNA를 분석 ARHGDIA (위)과의 miRNA 분석 snRNA의 U6 (아래)에 적합한 기준 유전자의 막대 그래프 표현입니다. (D) 시간의 과정을 통해 미르-135A의 상대적인 발현 수준의 비교를 설명하는 miRNA의 qPCR의 결과. 그림 6D는 엘스 비어의 허가를 Katchy 등. 1에서 다시 인쇄됩니다. 값은 일반적으로 별도의 exper를 평균입니다iments (생물학적 중복) SD를 ±. * P <0.05 : 학생의 T-테스트는 의미를 설명하는 데 사용됩니다.

Discussion

유방암 세포에서의 miRNA의 호르몬 조절을위한 메커니즘을 결정하는 것은이 질병을 이해하기위한 플랫폼을 제공 할 수 있고, 유방암에 대한 잠재적 인 치료를 제공 할 수있다. 호르몬 활동을위한 최적의 조건을 제공하기 위해 이러한 세포를 배양하는 것은 매우 중요합니다. 여기서, E2의 최적 투여 량은 치료하는 동안 적절한 시점에 사용 된 치료 전 및 관심 (에스트로겐)의 호르몬 제외되었다는 것을 보장 프로토콜이 설명되었다. 기타 호르몬 및 성장 인자의 효과는 서서히 혈청 수준을 낮추고 그 호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자의 대부분 스트리핑 된 FBS이다 DCC-FBS를 사용하여 최소로 유지 하였다. 페놀 레드없는 배지 더욱 페놀 레드 에스트로겐 활성을 가지며 세포 라인 (20, 21)의 특정 기능에 영향을 미치는 것으로보고되었다 주어진 다른 nonhormonal 효과를 최소화하기 위해 사용되었다. 호르몬에 대한 세포의 노출 시간은 매우 중요하다. 유전자의 에스트로겐 관련된 규제를 들면, 이전 24 hrexposure가 유방암 세포 1,18 직접적인 표적 유전자의 상당한 반응을하는 것이 밝혀졌다. 의 miRNAs는 RNA 중합 효소 II에 의해 전사되므로, mRNA를 같이,이도의 miRNAs의 직접적인 조절을 검출하기 위해 적절한 시점이라고 생각된다. 이들의 miRNAs는 유방암 세포에서 이러한 공지 된 ER 표적의 발현에 미치는 영향 경우 아직 결정하여야한다.

miRNA의 발현 프로파일 때문에 miRNA의, 성숙한 miRNA의 순서가 PRI-miRNA의 및 사전 miRNA의도 찾을 수 있다는 사실의 상대적인 작은 사이즈의 도전, 그리고 있기 때문에 자신의 GC 함량 22 이질성 수 있습니다. 여러 프로파일 링 기술과 화학은 이러한 어려움을 극복하기 위해 사용되었다. 이 중 마이크로 어레이 및 qPCR에 분석의 다른 방법 (그림 2)입니다. 마이크로 어레이 널리 전체 게놈 항문에 허용되지만ysis, 그것은 음성 (false negative)을 제공 할 수 있고 화학에서 인쇄 기술 (23)에 이르기까지, 가능한 플랫폼 간의 차이가 존재한다. mRNA의 성적 수만에 비해 수천에서 계산 된 상대적으로 적은 수의 miRNA 유전자를 분석 할 때 또한 정규화 과정은 도전을 선물한다. qPCR에, 다른 한편으로는, 더 민감하고, 적은 수의 유전자가 고려 될 때 잘 적용된다. 플레이트 당 하나의 복제 기술로 큰 384 - 웰 플레이트에서 수행 그러나, 다수의 플레이트를 분석 비싼하는 각 샘플에 대해 분석 될 필요가있다. 또한, 우리 손에, 많은 위음성 결과를 마이크로 어레이에 비해 DLP-LDA 분석을 사용하여 수득 하였다. 성숙한 miRNA의 순서가 PRI-miRNA의 및 사전의 miRNA 서열에 존재하는 것을 감안할 때, 그것은 PCR 기술 (24)를 사용하여 이러한 성적 증명서를 구분하는 관심입니다. DLP 프로브는 사전의 miRNAs 및 SP도 사용할 수 있습니다ecific 프라이머는 시아닌 염료 qPCR의 기술을 사용하여 변형 다른 성숙 또는 전구체를 제외하도록 설계 할 수있다.

qPCR에 결과를 프로파일 링에서 차등 발현의 검증을위한 황금 표준입니다. qPCR에의 효과는, 그러나, RNA 추출, RNA 무결성 (품질), cDNA 합성 프라이머 디자인, 검출 방법 (화학), 데이터 정규화 1,22,25의 참조 유전자 등 여러 파라미터에 의존한다. 짧은 miRNA의 시퀀스 길이가 많이 다른 프라이머 디자인을위한 공간을 제공하지 않기 때문에 miRNA의 분석을위한 프라이머 디자인에 대한 옵션은 매우 제한적이며, 하나의 뇌관이 짧은 순서로 정박 할 수있다. 따라서, 대체 조작의 필요성은도 2에 도시 된 바와 같이. 기술은 복제가 증폭 방법의 견고성과 사용 과정을 확인하는 것이 중요합니다. 생물은 복제는 일반적으로 생물학적 variatio의 표현에 필요한N, 치료 리간드, 및 셀에서 본 효과는 재현임을 보여 변수 응답을 포함한. 우리의 경험을 바탕으로, 세포 배양 사이의 miRNA 발현의 변화가 발생할 수 있습니다. 보통 이러한 차이는 1.3 배 이하이고, 값의 평균 및 대응하는 SD는 천연 및 기술 변화를 식별한다. 이 변이는 세포 밀도 및 세포 기능이 통로 통로에서 변경 될 수 있다는 사실을 포함하는 다양한 요인에 기인 있었다. P 값이 0.05보다 작을 때 배위자 치료로 인한 유의 한 식을 식별하기 위해 널리 통용되는 의미이다. 여기서, 양측 분포 및 2 샘플 불균등 분산 파라미터를 이용하여 생물학적 기술은 복제에 학생의 t-테스트가 사용되었다. 기타 t-테스트 파라미터가 존재하고, 선택은 실험 장치 (26)에 의존한다.

성숙한 미르의 호르몬 규정을 평가 상세한 프로토콜유방암 세포의 NA가 제공되었다. 프로파일에서 이러한 miRNA의 식을 검증하는 중요한 기술과 화학 명확하게 설명하고 있습니다. 유방암 세포에서 miRNA의 연구를 위해 선택된 기술은 궁극적으로 정확하게 조사되는 내용에 따라 달라집니다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 그들의 miRNA의 전문 지식을 공유하기 위해 박사 카린 Edvardsson, 카롤린스카 연구소, 스웨덴, 박사 Eylem Aydogdu, 휴스턴의 대학에, LC 과학의 miRNA 마이크로 어레이 플랫폼에 조언을 제공하기 위해, 박사 Xiaolian 가오, 휴스턴 대학교 감사 . 이 책에서보고 된 연구는 상 수 R01CA172437에서 건강의 국립 연구소의 국립 암 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 이 작품은 또한 계약에 따라 텍사스 신흥 기술 기금, 아니에서 교부금에 의해 지원되었다. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

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References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128, (3-5), 145-153 (2012).
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유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일
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Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

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