Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Profilering av Østrogen-regulerte MicroRNAs i brystkreftceller

Published: February 21, 2014 doi: 10.3791/51285
Automatic Translation
1, 1
1Center for Nuclear Receptors and Cell Signaling, Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Molecular signalering gjennom både østrogen og microRNAs er kritiske i brystkreft utvikling og vekst. Østrogen aktiverer østrogenreseptorer, som er transkripsjonsfaktorer. Mange transkripsjonsfaktorer kan regulere ekspresjon av microRNAs og østrogenregulert microRNAs kan profileres ved hjelp av forskjellig store teknikker.

Abstract

Østrogen spiller viktige roller i melkekjertlene utvikling og brystkreft progresjon. Det formidler sin funksjon ved å binde seg til og aktivere østrogenreseptorer (ER), ERα og ERβ. ERα er hyppig oppregulert ved brystkreft og driver spredning av brystkreftceller. De grunnleggende kravene fungere som transkripsjonsfaktorer og regulere genuttrykket. Mens ERα regulering av protein-kodende gener er godt etablert, er dens regulering av noncoding mikroRNA (miRNA) mindre utforsket. mirnas spille en viktig rolle i den post-transcriptional regulering av gener, hemme deres oversettelse eller nedverdigende deres mRNA. mirnas kan fungere som onkogener eller tumor suppressors og lover også biomarkører. Blant de miRNA analyser tilgjengelig, har microarray og kvantitativ real-time PCR (qPCR) vært mye brukt for å påvise og kvantifisere miRNA nivåer. Å identifisere mirnas regulert av østrogen signalering i brystkreft, their uttrykk i ERα-positive brystkreft cellelinjer ble sammenlignet før og etter østrogen-aktivering ved hjelp av både μParaflo-microfluidic mikromatriser og Dual merkede prober-low density arrays. Resultatene ble validert ved hjelp av bestemte qPCR analyser, anvende både Cyanine dye-basert og Dual merkede prober basert kjemi. Videre ble en tid-punkt-analyse for å identifisere regler over tid. Fordeler av miRNA analysen tilnærmingen som brukes i denne studien er at det muliggjør en rask screening av modne miRNA forskrifter i mange prøver, selv med begrensede prøvemengder. Oppsettet, herunder de spesifikke vilkår for cellekultur og østrogenbehandling, biologiske og tekniske gjentak, og storskala screening etterfulgt av bekreftelser i dybden ved hjelp av separate teknikker, sikrer en robust deteksjon av miRNA forskrifter, og eliminerer falske positiver og andre gjenstander. Men, muterte eller ukjente mirnas, eller forskrifter på barne og forløper transkripsjon level, vil det ikke bli detektert. Metoden som presenteres her representerer en grundig undersøkelse av østrogen-mediert miRNA regulering.

Introduction

Østrogen er et hormon som er viktig under melkekjertlene utvikling. Østrogen spiller også viktige roller i utviklingen, vedlikehold, risiko og behandling av brystkreft en. Østrogen utøver sin funksjon ved å binde seg til ende kravene, som er transkripsjonsfaktorer og regulerer spesifikke målgener. Av de to reseptor-variantene, er ERα avgjørende for østrogen-avhengige proliferasjon av brystkreftceller. De fleste brystkrefttilfeller er ERα-positive og avhenger av østrogen for vekst. Dette har gjort østrogensignalisering og ERα et mål for behandling av hormon-reseptor positiv brystkreft. Forstå den underliggende mekanismen for ERα er viktig for å bedre behandlingsresultatene, overvinne motstand mot behandling, og forstå hvordan brystkreft utvikler seg.

mirnas spiller avgjørende roller i cellefunksjoner på grunn av deres store utslag i post-transcriptional genregulering. mirnas er 19-24 nukleotider kort, single-strandet, Kodende RNA som er første transkribert av RNA polymerase II inn i primære miRNA transkripsjoner (pri-miRNA). De er behandlet i kjernen av drosha i korte-hårnål forløper-mirnas (pre-miRNA) og deretter behandlet av Dicer og delt opp i ett og ett hårstrå til å danne modne miRNAs i cytoplasma. Singelen-strandet modne miRNAs overføres til Argonaute proteiner for å danne RISC-komplekset. Deretter kan de miRNAs hybridisere til 3'-utranslaterte regioner (3'-UTR) av et mål-mRNA, som fører til post-transkripsjonell regulering ved å blokkere oversettelse eller nedbryte mål mRNA 2..

På grunn av den viktige rollen som både østrogen og miRNAs spiller i tumorprogresjon, identifisere miRNAs forbundet med normal eller avbrutt østrogensignalisering er viktig for å øke vår forståelse av utviklingen og forbedre behandlingen av bryst-cancer. Selv om det er en god forståelse av hvordan ERα regulerer protein-kodende gener, utvidelseog detaljer om kodende RNA regelverket gjenstår å bli grundig undersøkt. Innledende studier tar sikte på å belyse ERα regulering av miRNA i brystkreft cellelinjer har gitt motstridende resultater, selv når den samme cellelinje har blitt analysert 3-6. Dette kan være et resultat av forskjellige behandlinger, biologiske variasjoner, bruk av forskjellige teknikker, og det faktum at den lille størrelsen på miRNAs gjør dem vanskelig å analysere. Her er en protokoll som styrer for variasjoner og metode gjenstander beskrevet.

For å identifisere hvilke mirnas er regulert av østrogen, er profilering av en veldefinert brystkreft modell av ERα aktivitet et første skritt. Flere cellelinjer har blitt generert fra humane ERα-positiv brystkreft svulster, som er avhengig av østrogen ligner på de fleste kliniske brystkreft. De molekylære egenskaper av to av disse cellelinjer, T47D og MCF7, inkludert ekspresjonen av ERα og dets nedstrøms mål,progesteron hormon reseptor (PR), mangel på uttrykk av membran reseptor HER2, sammen med uttrykk av østrogen-responsiv og luminal-epitelial differensiering gener, gjør dem egnet som modeller for luminal subtype av brystsvulster 7-10. 17β-østradiol (E2) er den dominerende form for østrogen, og konsentrasjonene og tidspunkter for optimal transcriptional aktivering av ERα har vært preget i flere studier. I denne protokoll 10 nM E2 behandling for 24 timer er brukt og T47D og MCF7 som modeller for ERα aktivitet i brystkreftceller en. I tillegg kan tidsavhengige miRNA forskrifter være spesielt analyseres i et tidsintervall på for eksempel 1-72 timer.

For det andre har å analysere miRNA separate utfordringer, delvis på grunn av deres korte størrelser. miRNAs ikke er godt bevart i den totale RNA-preparat ved vanlige guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA-presipiteringer blir utført, eller når stAndard kolonne renselser er brukt. Spesielle forholdsregler må tas for å opprettholde eller berike for den mindre fraksjonen av RNA. Ved å øke volumet av isopropanol, senke temperaturen før sentrifugering (-80 ° C), og utelatelse av vasking i 70% etanol, kan holde av miRNAs forsterkes ved utfelling. Alternativt kan spesifikke kolonner og buffere for en høy kvalitet og robust fremstilling av miRNA holdige total RNA brukes. Også for analysen selv, sine korte størrelser skaper utfordringer. For genome-wide miRNA screening, er det tre vanlige miRNA profilering teknikker å velge mellom: Mikromatriser, qPCR, og neste generasjons sekvensering. Hver teknikk kan utføres ved hjelp av flere ulike plattformer, og ulike prøve forberedelser er nødvendig, hver med ulik risiko for å introdusere gjenstander. I miRNA microarray, er et lysbilde flekket eller syntetisert med tusenvis av oligonukleotider. Disse oligonukleotider er brukt som prober, og hver av sondens er utformet for å hybridisere til en bestemt miRNA sekvens. Den prøveopparbeidelse for mikromatriser, som utføres i denne studien, beriker først for mirnas og introduserer Cy5 og Cy3 merking på de miRNAs da. Microarray gir mulighet til å observere de relative ekspresjonsnivåer av et stort antall gener som samtidig er rask og egnet for screening av store antall prøver, men bare kan analysere sekvensene tilstede i microarray, og vil for eksempel ikke oppdage endringer i ukjente eller mutert mirnas. Microarray analyse som utføres i denne protokollen krever også relativt store mengder, ca 5 mikrogram, av total RNA per prøve for analyse. Lav tetthet qPCR miRNA profilering krever mindre materiale (700 ng / prøve og replikere), og gjør det mulig for påvisning og kvantifisering av miRNAs. Transkripsjon nivåer kan bestemmes, og mengden kan være et absolutt beløp eller en relativ mengde. qPCR analyser første krever konvertering av miRNA inn cDNA, her ved hjelp et bøydprimer for hver spesifikke miRNA sikrer analyse av bare modne miRNA. Dette genererer en lengre mal som kan forsterkes benytte en miRNA spesifikk forover primer og en universal revers primer komplementær til den løkkesekvens, og kan havnen inkluderingen av en dobbelt merket probe for spesifisitet. qPCR kan brukes i en lav-tetthet-format hvor hundrevis av miRNAs kan påvises i parallell ved hjelp av en eller flere 384-brønns plater med individuelle primerpar i hver brønn 11.. Neste generasjon sekvensering, på den annen side, er den eneste av disse teknikker som gjør det mulig for oppdagelsen av nye, mutert eller redigerte miRNAs, ettersom alle RNA i en prøve kan bli sekvensert 11.. Denne teknikken krever imidlertid flere trinn for å berike små RNA og produsere et lite RNA-bibliotek ved hjelp av flere trinn av linkerligeringer og rensinger med påfølgende forbedret risiko for å modulere deres relative ekspresjonsnivåer mellom prøvene. Det krever også betydelige bioinformatics analyse. Gitt de ulike teknikker for miRNA profilering, avhenger det mest hensiktsmessig teknikk på søknadene. Mikromatriser er mest egnet når materialet er relativt rikelig, og interessen er å definere differensial uttrykk for allerede kjente miRNAs. Lav tetthet qPCR arrays er mest egnet når en begrenset mengde prøve er tilgjengelig, og en høy følsomhet av lavt uttrykt miRNAs er nødvendig. Sekvensering egner seg best når analyse av ukjente miRNAs, muterte eller forskjellige isoformer av en miRNA er nødvendig.

I studiet av østrogenregulert miRNAs i brystkreft, er to modell celler linjer benyttes, T47D og MCF7, hvor store mengder av RNA er lett tilgjengelige. Hver celle linjen ble analysert i replikert cellekulturer ved hjelp av ulike passasjer, hver i tekniske replikat av behandling. Dette gjør det mulig for robust deteksjon av reproduserbart, ERα-regulerte mirnas. Relative miRNA uttrykk nivåer ble sammenliknet med både miRNA microarray ogDual merkede prober - low density arrays (DLP-LDA) og validert resultatene med spesifikke qPCR bruker både Cyanine fargestoff og DLP kjemi. miRNA forskrifter ble deretter videre analysert i tidsserier for å definere nøyaktig regulering over tid, noe som kan bidra til å skille tilfeldige eller biologiske variasjoner fra østrogen-indusert forskrifter, og indikerer primære effekter fra sekundære effekter. Bioinformatical sammenligninger med kromatin-bindende studier av ERα kan ytterligere hjelp i differensieringen av primær versus sekundære effekter. Analysen resulterte i en pålitelig vurdering av miRNA regelverk der det kunne bli etablert at etter 24 timers E2 behandling protein-koding transkripsjoner lett ble regulert, men modne miRNAs ble ikke påvirket en. Det er imidlertid mulig at miRNAs reguleres ved senere tids-punkter, som vist i tidsserieanalyse av utvalgte miRNAs en. Detaljene må bli ytterligere utforsket og protokollen presenteres her gir en Robust måte å studere hormonell regulering av modne miRNAs i brystkreftcellelinjer.

Protocol

En. Preparation of Cell Culture Media

  1. For T47D cellelinje vekstmedium:
    1. Bland 500 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 500 ml F12 [DMEM/F12 (1:1)] i en autoklavert 1 L flaske.
    2. Tilsett 50 ml føtalt bovint serum (dette gjør 5% FBS), og deretter 10 ml av penicillin streptomycin (dette gjør 1% PEST). Bland innholdet helt.
    3. Oppbevar ved 4 ° C.
  2. For MCF7 cellelinje vekstmedium:
    1. Bland 500 ml DMEM med 25 ml av FBS (5% FBS) og deretter 5 ml penicillin-streptomycin (1% PEST).
    2. Oppbevar ved 4 ° C.
    3. For redusert serum vekstmedium:
      1. For T47D: Bland 500 ml fenolrødt-fritt DMEM med 500 ml F12 (1:1) i en autoklavert 1 L-flaske, og tilsett 50 ml av den dekstran-belagte trekull-behandlet (DCC) FBS for 5% DCC-FBS. Lag en egen flaske med 5 ml DCC-FBS for 0,5% DCC-FBS. Deretter legger 10 ml av PEST (1% PEST) til hver flaske. Bland innholdet helt, store ved 4 ° C.
      2. For MCF7: Bland 500 ml fenolrødt-fritt DMEM med 5 ml 100 x L-glutamin (200 mM endelig konsentrasjon). Tilsett 25 ml av DCC-FBS (5% DCC-FBS). Lag en egen flaske med 2,5 ml DCC-FBS (0,5% DCC-FBS). Deretter legger 5 ml av PEST (1% PEST) til hver flaske. Bland innholdet helt, oppbevares ved 4 ° C.
    4. For fosfat-bufret saltvann (PBS) løsning:
      1. Fyll en 1 L Autoclaved glassflaske med ultrarent vann eller destillert vann.
      2. Legg en PBS tablett og rist av og til inntil tabletten er oppløst.
      3. Autoklav PBS løsning og oppbevares ved romtemperatur.
    5. Utarbeidelse av ligand aksjer:
      1. Tilbered en 100 mM stamløsning av E2 ved å oppløse 2,72 mg 17β-østradiol i 100 ul etanol eller DMSO i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør, og bland innholdet forsiktig. Spin kort og foreta serielle fortynninger (1:10) for å gi 10 mM, 1 mM og 0,1 mM stam konsentrasjonersjoner ved bruk av løsningsmidlet. Oppbevar alle E2 lager løsninger ved -20 ° C.
      2. Tilbered en 100 mM stamløsning av ICI ved å oppløse 6,07 mg av ICI 182780 i 100 mL EtOH eller DMSO i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør, og bland innholdet forsiktig. Spin kort og foreta serielle fortynninger (1:10) for å gi 10 mM, 1 mM, 0,1 mM stamkonsentrasjoner ved hjelp av oppløsningsmidlet. Oppbevar alle ICI lager løsninger ved -20 ° C.
      3. Kjøretøyet er det løsningsmiddel (etanol eller DMSO). Plasser 0,5-1 ml av 100% etanol eller DMSO, i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør, og oppbevares ved -20 ° C.

2. Cell Culture and Treatment

Utfør hver behandling i doble eller tredoble plater for tekniske gjentak. Gjenta cellekultur fremgangsmåte og behandling ved hjelp av en annen passasje av den samme cellelinje, som ville tjene som en biologisk replikere i denne cellelinjen. Gjenta fremgangsmåten med en annen cellelinje til replsilikat funn i mer enn en cellelinje. Alle cellekulturteknikker bør utføres under sterile betingelser i en laminær strømningshette.

  1. Cellekultur oppstart
    1. Varm media til 37 ° C i et sterilt varmt vannbad.
    2. Tine en frossen hetteglass med T47D eller MCF7 celler.
    3. Rengjør utsiden av hetteglass og media flaske med 70% etanol, og deretter plassere både hetteglass og flaske i sterile laminær hette.
    4. Merke en steril T-75 kolbe tilsvarende (i panseret).
    5. Til 12 til 15 ml av egnede medier inn i kolben ved hjelp av en steril serologisk pipette (sørge for at overflaten er fullstendig dekket med media).
    6. Overfør cellene fra hetteglasset til kolben, og bland forsiktig.
    7. Plasser flasken i en 37 ° C inkubator, som følger med 5% CO2.
  2. Fremstilling av celler for behandlingen
    1. Ta celler ut av inkubatoren og observere under et mikroskop for å sikre at cellene er i det minste 80% confluent. Dette er for å sikre at det er nok celler for eksperimentet. Overfør kolbe til sterilt hette.
    2. Fjern mediet fra kolben ved hjelp av en steril Pasteur-pipette koplet til et vakuum. Vask forsiktig festet cellene to ganger med PBS.
    3. Tilsett 1 ml varmt trypsin-EDTA til kolben, og kolben satt i inkubator i 2 min. Dette er for å gjøre cellene løsner fra kolben.
    4. Tilsett ca 3-4 ml av hensiktsmessige varme medier til flaska og Triturer frittliggende celler ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette. Trituratet ved å ta opp i cellene i det serologisk pipette og frigjøre cellene med pipettetuppen plasseres mot bunnen av kolben for å øke trykket. Dette er for å bryte cellene fra hverandre i enkeltceller.
    5. Tell cellene, for eksempel ved hjelp av en celleteller, i henhold til produsentens protokoll.
    6. Etiketten 100 mm plater (etter behov) og tilsett ca 10 ml media til platene. Plate ca 2,0 x 10 6 celler / plate. Fordel celler ved gentle virvlende platene.
    7. Inkuber cellene for 24-48 timer, inntil ca 80% sammenflytende.
    8. Ved 80% confluency, vaske cellene to ganger med PBS, og legge de riktige 5% DCC-FBS media. Deretter inkuberes cellene for 24 hr.
    9. Etter 24 timer, vaske cellene to ganger med PBS, og legge de riktige 0,5% DCC-FBS media. Deretter inkuberes cellene for ytterligere 48 timer.
  3. Cellen behandling
    1. Etter 48 timer, vaske cellene to ganger med PBS. Sørg for å fjerne så mye av PBS som mulig.
    2. I et 15 ml konisk rør, tilsett 10 ml av de ovenfor nevnte 0,5% DCC-FBS medium. Deretter, tilsett 1 pl av 0,1 mM ligand lager (E2-eller ICI) i en sluttkonsentrasjon på 10 nM. Også, tilsett 1 pl av kjøretøyet til 10 ml medium i et eget rør for kontrolleksperiment.
    3. Bland innholdet i rør forsiktig og legge til celler i platen. Dette bør være en ligand pr plate.
    4. Inkuber cellene for valgt tidspunkt (0-72 timer).
<p class = "jove_title"> 3. RNA Utvinning og Quality Control

  1. RNA ekstraksjon
    1. Etter at behandlingen er fullført til den ønskede tidsperiode, vaskes cellene to ganger med PBS, deretter til ca 1-2 ml guanidiniumtiocyanat-fenol-løsningen til cellene i platen. FORSIKTIG: guanidiniumtiocyanat-fenol løsning er giftig ved kontakt med hud eller øyne, innånding eller svelging. Bruk egnede verneklær, hansker og vernebriller / ansiktsskjerm, og bruke avtrekkshette.
    2. Påse at volumet av cellene er ikke mer enn 10% av volumet av guanidiniumtiocyanat-fenol-løsning, og at platen blir dekket med oppløsningen, og tillates å stå i 1 min. Deretter skrapes cellene ved hjelp av en gummiskrape og overført til et mikrosentrifugerør. Celler kan lagres i denne løsning ved -80 ° C i flere uker.
    3. Ekstraher og rense total RNA fra hver behandling ved hjelp av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-metoden fulgt spinnkolonne rensing og DNase vedI DNA degradering fremgangsmåte for dyreceller.
    4. Etter ekstraksjon, er celler eluert i 60 ul RNase-fritt vann. Delmengde 1-2 mL RNA for kvantifisering analyse og butikken RNA ved -80 ° C.
    5. Mål RNA konsentrasjoner ved hjelp av en ul av RNA og aspectrophotometer. Sørg for at det er en blank tatt før noen måling er gjort. Også helt tørke av spektrofotometer rekkevidde gang en måling er tatt. Konsentrasjonene er vanligvis vist i ng / mL. Lagre resultater som viser RNA konsentrasjoner.
  2. RNA kvalitetskontroll
    1. Ta ca 100 ng RNA fra hver prøve, og plasser i et mikrosentrifugerør.
    2. Mål RNA integritet ved hjelp av en Bioanalyzer. Vanligvis 12 prøvene kan kjøres på en gang i en Bioanalyzer. Kjør vanligvis tar ca 25 min.
    3. Sammenlign resultatene med RNA stige for å sikre at den RNA som er bra for eksperimentet. Lagre og skrive ut resultatene.

4. Bekreftelse på Treatling: qPCR av protein-kodende gener

  1. cDNA-syntese
    1. Ta 500 ng eller 1 pg av total RNA (for hver prøve) og satt på en 1,5 ml mikrosentrifugerør. Bring volumet til hvert rør opp til 10 pl ved bruk av RNase-fritt vann.
    2. Tilsett 2 pl av 50 pM tilfeldige hexamer primere og varmerørene til 70 ° C i 10 min.
    3. Overfør rør til is for 5min.
    4. For hver prøve, tilsett 4 mL av 5x første tråd buffer, 1 pl 0,1 M DTT, 1 pl av 10 mM dNTPs, 0,5 ul av hevet III, og 1,5 pl RNase-fritt vann.
    5. Plasser rørene i en 25 ° C varmeblokk eller et vannbad i 10 min.
    6. Overfør-rør til en 46 ° C varmeblokk i 1 time. Så, for å overføre rør til en 70 ° C varme blokk for 15 min stoppe reaksjonen.
    7. Fortynn cDNA til 5 ng / mL lager (beregnet ved hjelp av total RNA-inngang) ved hjelp av RNase-fritt vann for fortynninger og oppbevar ved -20 ° C.
  2. qPCR
    1. Skaffe primere for gener av interesse og referanse gener. Primere kan enkelt lages med primer utforme verktøy på NCBI sin Primer-BLAST program 12. Dette genererer vanligvis en forward og revers primer for hvert gen av interesse. Primere bør være 18 til 22 bp i lengde, har en smeltetemperatur på 52-58 ° C, har et GC-innhold på 40-60%, og et fragment lengde på 100-180 bp.
    2. For hver qPCR reaksjonen godt, tilsettes 10 ng cDNA (2 pl fra lager-konsentrasjon fra trinn 4.1.7), 1 pmol av hver av forover og revers primere av genet av interesse (fra trinn 4.2.1), og 5 pl av 2x Cyanine fargestoff PCR mester mix. Reaksjonen for hver brønn bør ha en 10 ul sluttreaksjonsvolum.
    3. Sørg for at det finnes tre eksemplarer brønner for hver prøve for hvert gen (for tekniske replikat). En 96-vel reaksjonsplaten kan brukes.
    4. På QRT-PCR systemprogramvaren, tilordne reporter og mål, skriv reaksjon volum, velge komparativeterskel syklus (ΔΔCt)-metoden, og definere prøvebrønner.
    5. Sørg for å utføre smeltekurve analyse for alle Cyanine fargestoff går å bekrefte forsterkningen av en bestemt fragment. Kjør plater med standardinnstillingene for kjøringen.
    6. Lagre resultater etter løp, og eksportere data (spesielt CT verdier til MS Excel).
  3. qPCR dataanalyse ved hjelp av ΔΔCT formelen
    Endringen i relative mRNA uttrykk kan beregnes som ganger endring i forhold til å kontrollere på Excel for hver prøve ved å gjøre følgende:
    1. Alle eksporterte resultater fra qPCR ovenfor bør ha Ct-verdiene inkludert. Beregn ΔCT verdi ved hjelp av formelen nedenfor:
      • ΔCT = CT (mål gen) - CT (referanse genet)
      Dette må gjøres for hver prøve. Målet er genet eller miRNA av interesse.
    2. Deretter beregner den totale standardavvik (SD) for hver prøve. Først beregnSD for referanse genet og deretter beregne SD for målgenet (dette kan gjøres på excel bruker STD DEV-funksjonen på CT-verdier). Deretter beregner den totale SD for hver prøve ved hjelp av følgende formel:
      • Total SD = (SD2 (mål) + SD2 (referanse)) 1/2
    3. Beregn ΔΔCT av hver prøve i løpet av et gen (target) av:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (behandlet / prøven) - ΔΔCT (kontroll / kalibrator prøve)
      Kalibratoren prøven er den ubehandlede prøven.
    4. Til slutt beregner de fold-endring (FC) verdiene for hver prøve ved hjelp av formelen:
      • FC = 2-ΔΔCT
      Fold-endring verdien av hver prøve gir den relative ekspresjon av genet / miRNA som er blitt normalisert til referanse genet og kontrollprøven.
    5. Student 's t-test kan anvendes for statistisk analyse ved bruk av tosidige fordelingen og to utvalg ulik variansparametere: (P <0,001 (***), P <0,01 (**), og P <0,05 (*)). Dette kan oppnås på Excel. Bekreft at behandlingen førte til regulering av kjente mål før du fortsetter med miRNA profilering.

5. miRNA profilering Analysis

  1. miRNA microarray
    1. Ta 5 ug av RNA isolert fra celler behandlet med enten vehikkel eller ligand, og plasser i et mikrosentrifugerør. Juster volumet i røret til 20 mL. Hver sammenligning bør utføres i duplikater eller triplicates.
    2. Utfør miRNA microarray hjelp av RNA prøver ovenfor. miRNA microarray uttrykk profiler bør bestemmes ved hjelp av menneskelig miRNA microarray dual-fargeprøve utvalg av μParaflo Microfluidic biochip Technology (Sanger miRBase Utgivelses 14,0) 13.
    3. Resultatene skal vise forskjellig uttrykt mirnas. Tenk betydelige miRNA uttrykk når p <0.05.p-verdi <0,10 kan også bli vurdert for videre samarbeidnfirmatory analyse ved hjelp av qPCR. Lagre dette miRNA liste for ytterligere validering med qPCR.
  2. miRNA profilering: DLP-LDA
    1. Hver prøve skal analyseres i duplikater eller triplicates. Ta 700 ng av total RNA fra celler behandlet med enten bil eller ligand, og plasser i en mikrosentrifuge tube. Juster volumet i røret til 3 pl.
    2. Utfør cDNA syntese ved bruk av Dual merkede prober miRNA analysemetode og 10x RT primere. Totalt volum for hver reaksjon bør være 7,5 mL.
    3. Plasser reaksjonsrøret i PCR system Termocycler, og satt til anbefalte parametre som angitt i Dual merkede prober miRNA analysemetode. Start løp. Dette vil generere cDNA. Legg merke til at cDNA kan lagres ved -20 ° C i minst 1 uke.
    4. Mens RT reaksjon er i gang, ta ut de DLP-LDA plater og la det sitte i romtemperatur. Hver rekke plate inneholder 384 brønner som inneholder unike miRNA primere og kontroll primere.
    5. Ta 6 mL av cDNA (fra 5.2.3) og plasser i en 1,5 ml mikrosentrifuge tube. Legg 450 mL av Dual merkede prober 2x Universal PCR Master mix og tilsett 444 mL RNase-fritt vann.
    6. Vend røret omtrent seks ganger for å blande innholdet, og sentrifuger kort.
    7. Når DLP-LDA platen har nådd romtemperatur, belastning 100 ul i hver av de åtte Utfyllings port "av platen. Deretter sentrifuger matriseplaten.
    8. Åpne QRT-PCR-systemet og kontroller at blokken er at for 384-brønns plate. Sett opp kjøre ved hjelp av SDS-programvaren. Velg relativ kvantifisering (Ct), velg brønn nummer og rekke type, og angi prøve beskrivelse å definere brønner.
    9. Kjør array ved hjelp av standard termiske sykkelforholdene. Når kjøringen er ferdig, lagre resultater og eksport til MS Excel og lagre for videre analyse ved hjelp av ΔΔCT formel (trinn 4,3).

6. Bekreftelse av miRNA Forskrift bruke separateqPCR Analysis

  1. Cyanine fargestoff qPCR analyse
    1. Design primere for ønsket miRNA analyse. Sekvens av den modne miRNA, som tilsvarer den frem primer, kan fås fra mirbase.org 14. Konverter alle 'U' til 'T'.
    2. Forbered cDNA: Ta en mikrogram total RNA og plasser i en 1,5 ml sentrifugerør. Følg instruksjonene for polyA tailing og første-tråd cDNA syntese av miRNA fra en miRNA første-tråd cDNA Synthesis og QRT-PCR protokollen. Fortynn den resulterende cDNA (01:10) og oppbevares ved -20 ° C.
    3. Skaff en 96-brønns reaksjon plate.
    4. For hver miRNA qPCR reaksjonen brønn, tilsett 16 ng av polyA cDNA (fra trinn 6.1.2), 2 pmol av hvert av de spesifikke forover primer (punkt 6.1.1), og det universelle primer (fra settet fra trinn 6.1.2 ), og 5 mL av 2x qPCR mester mix. Endelig reaksjonsvolum er 10 ul / brønn.
    5. Sørg for at det finnes tre eksemplarer brønner for hver prøve for hver miRNA (for tekniske replikat). Også, Sørg for at en referanse genet (vanligvis U6 snRNA) er inkludert.
    6. På QRT-PCR systemprogramvaren, tilordne reporter og mål, skriv reaksjon volum, velge komparative terskel syklus (ΔΔCT)-metoden, og definere prøvebrønner.
    7. Kjør plater med standardinnstillingene for kjøringen. Sørg for å utføre smeltekurve analyse for alle Cyanine dye går. Hver smeltekurve bør vise bare en bestemt topp for å bekrefte at forsterkningen av ett spesifikt fragment. Hvis mer enn en topp eller ingen klar topp observeres, primerne ikke er bestemt og data kan ikke brukes.
    8. Lagre resultater etter løp, og eksportere data (spesielt CT verdier til MS Excel).
  2. Dual merkede prober qPCR analyse
    1. Ta 10 ng av hver total RNA, hver i et volum på 5 ul og plasseres i 0,2 ml mikrosentrifugerør.
    2. Følg instruksjonene fra protokollen på å utføre revers transkripsjon (RT) ved bruk av Dual merkede prober MicroRNA revers transkriptase Kit 15. Hver totale reaksjonsvolum er 15 pl. Merk at for de Dual merkede prober RT reaksjoner, er det spesifikke primere for hver miRNA å bli studert.
    3. Place reaksjonsrøret i PCR system thermocycler, og sette parametre i henhold til protokollen angis i trinn 6.2.2 ovenfor. Start løp. Det bør ta ca 70-80 min.
    4. Når RT-reaksjonen, fortynne prøven cDNA i et 1:05-forhold, og lagre alle cDNA i mørket ved -20 ° C.
    5. Skaff en 96-brønns reaksjon plate.
    6. For hver miRNA qPCR reaksjon godt, legge til følgende: 10 mL av Dual merkede prober 2x Universal PCR Master Mix (samme reagens som trinn 5.2.5), 7,67 mL av RNase-fritt vann, 1 mL av 20 × sanntid analysen primer (spesifikk for hver miRNA), og 1,33 pl av cDNA fra trinn 6.2.4 over. Dette bør være et 20 ul sluttreaksjonsvolum. Bland innholdet forsiktig, og sentrifuger kort.
    7. Sørg for at there er tre eksemplarer brønner for hver prøve for hver miRNA (for tekniske replikat). Sørg også for at en referanse genet (vanligvis U6 snRNA) er inkludert.
    8. På QRT-PCR systemprogramvaren, tilordne reporter (FAM) og drikk (NFQ-MGB) for hver miRNA (mål) av interesse, skriv reaksjon volum, velge komparative terskel syklus (ΔΔCt)-metoden, og definere prøvebrønner.
    9. Følg instruksjonene for å sette opp parametrene for qPCR kjøres fra Dual merkede prober mikroRNA analyseprotokollen. Deretter starter oppkjøringen. Lagre resultater etter løp, og eksportere data (spesielt CT verdier til MS Excel).

Representative Results

En oversikt over fremgangsmåten er presentert i figur 1, og en sammenligning av de forskjellige eksempelpreparater og nukleinsyre-modifikasjoner som er nødvendige for hver teknikk er visualisert i figur 2..

Tilstanden og miljøet i cellene før behandling med et hormon som er viktig for å bestemme de faktiske effektene av hormonet 16.. Noen medium og serum inneholder vekstfaktorer som kan påvirke resultatene, slik at cellene er serum sultet for å sikre at alle hormonelle effekter har blitt redusert til et minimum. Derfor, ved behandling med E2, det er mer sikkerhet at de effekter som ble observert er E2-assosiert. En viktig faktor er konfluens av celler, noe som påvirker celle-celle kontakt og virkemåter som celle-cellesignalisering og proliferasjon. Celler ble tillatt å være 80% sammenflytende (figur 3A) og vel festet for å tillate vekst og unngå tap av celler under etterfølgende vasking og media change.

Betingelsene under RNA ekstraksjon og lagring er viktig for kvaliteten av RNA og påfølgende analyse. Det er også kjent at antallet av celler, utvinning metoden, og GC-innhold av miRNA påvirker utbyttet og kvaliteten av både mRNA og miRNAs 17.. Således er det nødvendig å utføre RNA ekstraksjon under RNase-frie betingelser, og for å kontrollere kvaliteten på det RNA før fortsetter med eksperimenter. Etter ekstraksjon, kvantifisering av RNA gir informasjon om konsentrasjonen av det totale RNA (inneholdende både mRNA og miRNAs), som muliggjør observasjon av utbyttet. Det gir også en grafisk fremstilling av resultatene som vist i fig 3B, og dette gjør det mulig for observasjon av renhet av prøven (vanligvis angitt med en topp, øvre panel). Dårlig utbytte av RNA ville produsere ingen spesifikk absorpsjon ved 260 nm (Figur 3B, nedre panel). For å fastslå om RNA er av høy kvalitet, RNAintegritet ble målt. Et RNA integritet nummer (RIN) på mellom 9-10 sikrer at RNA ikke er nedbrutt, og er av optimal kvalitet. I tillegg bør den grafiske representasjon av RNA observeres, og 18S og 28S rRNA bør ha topper som vist i figur 4 (midtre panel). Sammenligning med stigen (figur 4, øvre panel) identifiserer størrelsen av toppene. En degradert RNA ville ha mindre klare topper og en redusert relativ mengde av 18S og 28S rRNA (figur 4, nedre panel). Fraksjonen av små RNA kan ytterligere sikres ved hjelp av Agilent små RNA Kit. Det anbefales å validere østrogenrespons etter behandling, i henhold til de spesifiserte eksperimentelle forhold, før du fortsetter til miRNA screening. En qPCR kan utføres på en kjent ER målgenet som PS2 eller SPINK4 18, ved hjelp av cDNA-mal. Slike gener er vanligvis oppregulert innen 1-24 timer etter at E2 behandling. Når kvaliteten av RNA og østrogenresponser vurdert, ytterligere eksperiment kan utføres.

Microarray er fortsatt en mye brukt teknikk for storskala screening for miRNA uttrykk i celler. For eksempel, miRNA microarray gang brukt inneholdt 894 modne miRNAs og 50 kontroller unike sonder i firlinger en. Hybridizations ble utført i duplikater med fargestoff swap prosedyre. Mirna microarray resultater er vanligvis grafisk representert ved varmekart. Figur 5A viser en varme kart, som representerer data fra en miRNA microarray sammenligning mellom kjøretøyet og E2-behandlede prøver. Den røde indikerer at miRNA oppregulert i E2-behandlede prøven (høyere ekspresjon), mens den grønne indikert nedregulering av miRNA (lavere ekspresjon). Den miRNA utvalg vanligvis avhenger av deres betydning i uttrykket, og vanligvis en p-verdi mindre enn 0,05 regnes som signifikant. De miRNAs som er indikert til å være forskjellig uttrykt bør videre validert with qPCR, for å skille dem fra falske positiver.

DLP-LDA matrise, på den annen side bruker en qPCR basert metode for å screene for regulerte miRNAs i en 384-brønners format. Vanligvis to 384-brønners plater (kort) er gitt, bassenger A og B. Gruppe A inneholder vanligvis bedre karakterisert og mer sterkt uttrykt mirnas enn bassenget B. Den relative nivået på hvert miRNA er bestemt av qPCR, hvor man miRNA analyseres per godt (Figur 5B). En høyere Ct-verdi angir mindre miRNA uttrykk. Mye som miRNA microarray, oppnådde resultater fra DLP-LDA trenger å bli ytterligere validert for å sikre nøyaktighet.

Valideringer kan utføres ved hjelp av qPCR. Her er to qPCR deteksjonsmetoder er beskrevet å hindre metode bias og å gi grundig bekreftelse og etterforskning av miRNA forskrifter. Den Cyanine dye-basert gjenkjenning kjemien fungerer annerledes enn DLP at DLP-LDA profilering er basert på, og er egnet for confirmasjon formål. Den kan være mindre nøyaktig som den oppdager alle forsterket dobbelt-trådet DNA, men homogeniteten til prøven kan bli vurdert ved å utføre en smeltekurve analyse. Figur 6A (venstre panel) viser smeltekurven analyse av en miRNA, og en klart definert enhetlig topp kan sees. Flere topper ville bli observert når primeren er ikke-spesifikke, eller betydelige mengder av primer-dimer blir dannet (figur 6A, høyre panel). DLP miRNA analyser på den annen side, er mer spesifikt som kun amplifikasjon av målet miRNA detekteres. Amplification plott av hvert mål miRNA kan observeres, som eksemplifisert i Figur 6B. Muligheten til å kontrollere for forekomsten av flere amplifiseringsprodukter ved hjelp av smeltekurve analyse er imidlertid ikke tilgjengelig med denne kjemien og Cyanine fargestoff qPCR er mindre kostbart. Cyanine fargestoff og DLP qPCR analyser kan noen ganger generert litt forskjellige resultater. For begge qPCR analyser, sammenlignet med en referanse genet er nødvendig for å fastslå den relative uttrykket av gener mellom to prøver. Referanse genet, også referert til som husholdningsgenet, være et gen hvis ekspresjon ikke er endret, og som er uttrykt på samme nivå som genet av interesse. Et eksempel på en egnet referanse-genet i disse brystkreftcellelinjer er ARHGDIA, en Rho GDP-Dissosiasjon Inhibitor som fungerer GDP / GTP utvekslings reaksjoner av Rho proteiner. Som observert i fig 6C (øverst), blir mRNA nivå av ARHGDIA ikke endret mellom kjøretøyet og den ligand-behandlede prøver. Den 18S rRNA kan også brukes, skjønt det er høy ekspresjon krever en separat 1:500 fortynning av cDNA-lager og er derfor mindre egnet. For miRNA analyse, er det fortsatt en debatt om en veldefinert referanse genet. Så langt er det U6 snRNA en referanse gen som er allment akseptert for miRNA analyse. U6 snRNA er ~ 110 nucleotide lang, noncoding liten kjernefysiske RNA som fungere i atom pre-mRNA splising 19. Som observert i figur 6C (nederst), U6 uttrykk nivåer er omtrent den samme på tvers av alle prøvene vist, og dermed gir for beregninger av de variable nivåer av miRNA. En grafisk representasjon av en miRNA qPCR resultat for en sammenligning mellom kjøretøyet og E2-behandlede celler som har blitt normalisert til referanse U6 kan observeres i figur 6D. Dette illustrerer et miRNA som ble oppdaget som nonregulated etter 24 timers E2 behandling, men som havner ER kromatin-bindende områder nær sin genomisk sted, og tidsserieanalyse avdekket et betydelig regulering 72 timer etter behandling.

Figur 1
Figur 1. En oversikt over tilnærmingen ansatt for påvisning av hormonell regulering av miRNA i brystkreftceller.

Fig. 2
Figur 2. Sammenligning av de forskjellige eksempelpreparater og nukleinsyre-manipulasjoner for hver miRNA deteksjonsteknikk. (A) miRNA microarray ved hjelp av μParaflo teknologi metoden omfatter anrikning, poly-A tailing og ligering merking. (B) DLP-teknologi prøvepreparering og deteksjonsmetode innbefatter et bøyd cDNA syntese primer som strekker seg etter denaturering trinn og gir et lengre fragment harbo reverse primer-og probe-sekvensen. (C) Cyanine fargestoff teknologi prøveprepareringog deteksjonsmetode inneholder poly A-tailing, og cDNA-syntese med en oligo-dT-primere, inkludert et universal 5 'sekvens.

Figur 3
Figur 3. Cellekultur-og RNA-ekstraksjon. (A) dyrkede celler for å illustrere 80% konfluens nødvendig før behandling med ligand. (B) Grafisk representasjon av RNA-konsentrasjon og renhet etter ekstraksjon. Hver topp representerer en prøve og en vellykket utvinning prosessen gir ren RNA (øverste panel). En dårlig ekstrahert RNA viser ingen klar absorpsjon topp på 260 nm (nedre panel).

Figur 4
Figur 4. & #160, RNA kvalitetskontroll Resultater fra RNA integritet analyse viser grafisk representasjon for stigen (øverst), en god kvalitet RNA (i midten) og en degradert RNA prøve (nederst)..

Figur 5
Figur 5. En illustrasjon av miRNA profilering resultater. (A) En varmekartet representasjon av miRNA microarray resultater for forskjellig uttrykt mirnas. Mir-A, B, C er oppregulert i E2-behandlede prøven som angitt i rødt, mens Mir-D, E, F, G er nedregulert i E2-behandlede prøven som angitt i grønt. (B) Amplification plott for hvert miRNA fra DLP-LDA resultater. miRNA detektert blir forsterket som vist ved økning i Rn verdi.

Figur 6 Figur 6. qPCR analyse av miRNA forskrifter. (A) Smelte-kurve-analyse for en miRNA analysert ved hjelp av Cyanine fargestoff deteksjon, som viser homogenitet av alle prøver som ble testet (til venstre), og amplifikasjon av flere fragmenter (høyre). (B) Amplification tomter for hver prøve for en miRNA. Dette kan være enten fra Cyanine fargestoff eller DLP deteksjonsmetoder. (C) Bar graf representasjon av egnede referanse gener for mRNA-analyse ARHGDIA (øverst) og for miRNA analyse snRNA U6 (nederst), som viser ingen signifikant differensial uttrykk mellom prøvene. (D) miRNA qPCR resultater å illustrere sammenligning av relative uttrykk nivåer av Mir-135a over et tidsforløp. er Figur 6D gjengitt fra Katchy et al. en med tillatelse fra Elsevier. Verdier er vanligvis gjennomsnittet av egen kompetanseiments (biologiske duplikater) ± SD. Student 's t-test anvendes for å demonstrere betydningen: * p <0,05.

Discussion

Bestemme mekanisme for hormonell regulering av miRNA i brystkreftceller kan gi en plattform for å forstå denne sykdommen og kan gi potensiell behandling for brystkreft. Dyrking av disse cellene for å gi den optimale betingelse for hormon handling er meget viktig. Her har en protokoll som sikrer at hormonet av interesse (østrogen) ble ekskludert før behandling, og at en optimal dose av E2 ble anvendt etter en passende tid i løpet av behandlingen er blitt beskrevet. Andre hormonelle og vekstfaktoreffekter ble holdt på et minimum ved å gradvis senke serumnivåene og ved hjelp av DCC-FBS, som er FBS som er blitt strippet for mesteparten av sitt hormon, cytokiner og vekstfaktorer. Fenolrødt-fritt medium ble videre brukt for å minimalisere andre nonhormonal effekter, gitt at fenolrødt er blitt rapportert å ha østrogen aktivitet og påvirke visse funksjoner i cellelinjer 20,21. Tiden for eksponering av cellene til hormonet er av stor viktighet. For østrogen-assosiert regulering av gener, har det tidligere blitt vist at 24-hrexposure produsere signifikant respons av direkte målgener i brystkreftceller 1,18. Siden miRNAs er transkribert ved RNA polymerase II, slik som mRNA, kan det tenkes at dette er et egnet tidspunkt for å detektere direkte regulering også av miRNAs. Det er ennå ikke bestemt om og hvordan disse miRNAs påvirker uttrykket av disse kjente ER mål i brystkreftceller.

miRNA uttrykk profilering kan være utfordrende på grunn av den relativt lille størrelsen på miRNA, at det modne miRNA sekvensen kan finnes også i det pri-miRNA og pre-miRNA, og på grunn av heterogeniteten i deres GC-innhold 22. Flere profilering teknikker og kjemi har vært ansatt for å overvinne disse problemene. Blant disse er ulike tilnærminger av microarray og qPCR analyse (figur 2). Selv microarray er allment akseptert for hele genomet analysis, kan det gi falske negative og det eksisterer forskjeller mellom de tilgjengelige plattformer, alt fra kjemien til utskriftsteknologi 23. Også normalisering prosessen presenterer en utfordring når analysere de relativt få miRNA gener, som telles i tusener i forhold til de titusenvis av mRNA transkripsjoner. qPCR, på den annen side, er mer følsom, og er bedre i bruk når færre gener som skal vurderes. Imidlertid, når utført i store 384-brønns plater, med bare en teknisk replikere per plate, flere plater må analyseres for hver prøve som gjør analysen kostbare. Også i våre hender, ble mange flere falske negative resultater oppnådd ved bruk av DLP-LDA analyse i forhold til microarray. Gitt at den modne miRNA sekvensen er til stede i den pri-miRNA og de ​​pre-miRNA sekvenser, er det av interesse å skille mellom disse transkripsjoner bruker PCR teknikker 24. DLP sonder er tilgjengelig også for pre-miRNAs, og specific primere kan også være designet for å utelukke annen moden eller forløper varianter bruker Cyanine fargestoff qPCR teknologi.

qPCR er en gylden standard for validering av differensial uttrykk fra profilering resultater. Effektiviteten av qPCR imidlertid er avhengig av flere parametere inkludert RNA ekstraksjon, RNA integritet (kvalitet), cDNA-syntese, primer utforming, deteksjonsmetode (kjemi), og referanse-genet for data normalisering 1,22,25. Alternativene til primer design for miRNA analyse er meget begrenset, ettersom den korte miRNA sekvenslengde ikke gir rom for mye alternativ primer konstruksjon, og bare én primer kan det inneholdes i denne korte sekvens. Derfor er det behov for alternative manipulasjoner som illustrert i figur 2. Tekniske replikater er viktig for å validere robusthet amplifikasjonsmetoden og prosessen som anvendes. Biologiske replikater er nødvendig for en representasjon av den generelle biologiske variation, inkludert variable respons på ligand-behandling, og for å vise at effekten sett i en celle er reproduserbare. Basert på vår erfaring, kan variasjoner i miRNA uttrykk mellom cellekulturer oppstår. Vanligvis er disse forskjellene er mindre enn 1,3 ganger, og gjennomsnittet av verdier og tilsvarende SD identifiserer naturlig og teknisk variant. Denne variasjon kan skyldes forskjellige faktorer, inkludert, celletettheten, og det faktum at celle-funksjoner kan endres fra passasje til passasje. Å identifisere statistisk signifikante uttrykk som følge av ligand behandling, er en allment akseptert betydning når p-verdien er mindre enn 0,05. Her har en student t-test på de biologiske og tekniske gjentak med den tosidige fordelingen og to-utvalgs ulik varians parametere blitt brukt. Andre t-testparametere eksisterer, og valget avhenger av eksperimentelle oppsettet 26.

En detaljert protokoll i å vurdere hormonelle regler i modne MirNA i brystkreft celler har blitt gitt. Viktige teknologier og kjemi i profilering og validere disse miRNA uttrykk har blitt tydelig forklart. Teknologien som er valgt for studier av miRNA i brystkreftceller slutt avhenger av hva som blir etterforsket.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til Dr. Xiaolian Gao, University of Houston, for å gi råd til LC Sciences miRNA microarray plattform, til Dr. Karin Edvardsson, Karolinska Institute, Sverige, og Dr. Eylem Aydogdu, University of Houston, for å dele sine miRNA kompetanse . Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Antall R01CA172437. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health. Dette arbeidet ble også støttet med tilskudd fra Texas Emerging Technology Fund under avtalen no. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  3. Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).
  4. Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).
  5. Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).
  6. Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).
  7. Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).
  8. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).
  9. Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).
  10. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  11. Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).
  12. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  13. Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
  14. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
  15. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  16. Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  18. Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).
  19. Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1 (1), 46-54 (1995).
  20. Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).
  21. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).
  22. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  23. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  24. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32 (4), e43 (2004).
  25. Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
  26. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).

Tags

Medicine brystkreft microRNA østrogen estrogen reseptor microarray qPCR
Profilering av Østrogen-regulerte MicroRNAs i brystkreftceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katchy, A., Williams, C. Profiling… More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter