Summary
Molekylär signalering genom både östrogen och mikroRNA är avgörande för bröstcancerutveckling och tillväxt. Östrogen aktiverar östrogenreceptorer, som är transkriptionsfaktorer. Många transkriptionsfaktorer kan reglera uttrycket av microRNAs, och östrogenreglerade microRNAsna kan profileras med användning av olika storskaliga tekniker.
Abstract
Östrogen spelar viktiga roller i bröstkörtel utveckling och bröstcancer progression. Det medierar sin funktion genom att binda till och aktivera östrogenreceptorerna (ERS), ERa och ERp. ERa ofta uppregleras i bröstcancer och driver spridningen av bröstcancerceller. ERS fungerar som transkriptionsfaktorer och reglera genuttrycket. Av följande skäl ERa reglering av protein-kodande gener är väl etablerad, är dess reglering av icke-kodande mikro-RNA (miRNA) mindre utforskade. miRNA spelar en viktig roll i den posttranskriptionella regleringen av gener, hämma deras översättning eller förnedrande deras mRNA. miRNA kan fungera såsom onkogener eller tumörsuppressorer och är också lovande biomarkörer. Bland de miRNA analyser finns tillgängliga, har mikroarray och kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (qPCR) i stor utsträckning använts för att detektera och kvantifiera miRNA nivåer. För att identifiera miRNA regleras av östrogen signalering i bröstcancer, thEIR uttryck i ERa-positiva bröstcancercellinjer jämfördes före och efter östrogen-aktivering med hjälp av både μParaflo-mikroflödes microarrays och Dual märkta prober-låg densitet arrayer. Resultaten validerades med specifika qPCR analyser, tillämpa både cyaninfärgämnet baserat och Dual-märkta prober-baserad kemi. Vidare har en tid-punkt-analys användas för att identifiera regler över tiden. Fördelar med miRNA-analys metod som används i denna studie är att det möjliggör en snabb genomgång av mogna miRNA regler i många prov, även med begränsade mängder prov. Layouten, inbegripet de särskilda villkoren för cellodling och östrogenbehandling, biologiska och tekniska replikat, och storskalig screening följt av bekräftelser på djupet med hjälp av olika tekniker, säkerställer en robust detektering av miRNA förordningar, och eliminerar falska positiva och andra artefakter. Men muterade eller okända miRNA, eller förordningar i den primära och gångare avskrift level, inte kommer att upptäckas. Den metod som presenteras här utgör en grundlig utredning av östrogen-medierad miRNA reglering.
Introduction
Östrogen är ett hormon som är viktigt under bröstkörtelutveckling. Östrogen spelar också viktiga roller i utvecklingen, underhåll, risk och behandling av bröstcancer 1. Östrogen utövar sin funktion genom att binda till ERS, som är transkriptionsfaktorer och reglerar specifika mål gener. Av de två receptorvarianter, är ERa väsentliga för östrogenberoende proliferation av bröstcancerceller. De flesta bröstcancer är ERa-positiva och är beroende av östrogen för tillväxt. Detta har gjort östrogen signalering och ERa ett mål för behandling vid hormonreceptorpositiv bröstcancer. Att förstå den bakomliggande mekanismen av ERa är viktigt att förbättra behandlingsutfallet, övervinna motstånd till behandling, och förstå hur bröstcancer utvecklas.
miRNA spelar avgörande roller i cellfunktioner på grund av deras stora genomslag i posttranskriptionell genreglering. miRNA är 19-24 nukleotider korta, enkelsträngade, Icke-kodande RNA som först transkriberas av RNA-polymeras II i primära miRNA avskrifter (pri-miRNA). De bearbetas i kärnan av Drosha i kort hårnål prekursor-miRNA (pre-miRNA) och sedan bearbetas av Dicer och separeras till enkelsträngar för att bilda mogna miRNA i cytoplasman. De enkelsträngade mogna miRNA överförs till Argonaute proteiner för att bilda RISC komplex. Sedan kan de miRNA hybridisera till 3'-otranslaterade regioner (3'-UTR) av ett mål-mRNA, vilket leder till post-transkriptionell reglering, genom att blockera translation eller försämra mål-mRNA-2.
På grund av den viktiga roll som både östrogen och miRNA spelar i tumörprogression, identifiera miRNA i samband med normal eller störs östrogen signalering är viktigt för att öka vår förståelse av utvecklingen och förbättra behandlingen av bröstcancer. Även om det finns en god förståelse för hur ERa reglerar protein-kodande gener, förlängningoch uppgifter om icke-kodande RNA-regler återstår att undersökas grundligt. Initiala studier som syftar till att belysa ERa reglering av miRNA i bröstcancer cellinjer har gett motstridiga resultat, även om samma cellinje har analyserats 3-6. Detta kan vara ett resultat av olika behandlingar, biologiska variationer, användning av olika tekniker, och det faktum att den lilla storleken av miRNA göra dem utmanande att analysera. Här är ett protokoll som kontrollerar för variationer och metod artefakter beskrivs.
För att identifiera vilken miRNA regleras av östrogen, är profilering av en väldefinierad bröst modell av ERa aktivitet cancer ett första steg. Flera cellinjer har genererats från ERa-positiva bröstcancertumörer mänskliga, som är beroende av östrogen som liknar de flesta kliniska bröstcancer. De molekylära egenskaperna hos två av dessa cellinjer, T47D och MCF7, inklusive expression av ERa och dess nedströms mål,progesteron hormonreceptor (PR), en frånvaro av uttryck av membranreceptor HER2, tillsammans med uttryck av östrogen-lyhörd och luminal-epitelial differentiering gener, gör dem lämpliga som modeller för den luminala subtyp av brösttumörer 7-10. 17β-östradiol (E2) är den dominerande formen av östrogen, och koncentrationerna och tids poäng för optimal transkriptionsaktivering av ERa har präglats av flera studier. I detta protokoll 10 nM E2 behandling för 24 timmar används och T47D och MCF7 som modeller för ERa aktivitet i bröstcancerceller 1. Dessutom kan tidsberoende miRNA föreskrifter vara specifikt analyseras i ett tidsintervall på t ex 1 till 72 timmar.
För det andra har att analysera miRNA separata utmaningar, delvis på grund av deras korta storlekar. miRNA är inte väl kvar i den totala RNA-preparatet när vanliga Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA utfällningar utförs, eller när stAndard kolumn reningar används. Särskilda försiktighetsåtgärder måste vidtas för att bibehålla eller anrika för den mindre fraktionen av RNA. Genom att öka volymen av isopropanol, sänka temperaturen innan centrifugering (-80 ° C) och med utelämnande av tvättning i 70% etanol, kan ökas den kvarhållande av miRNA från nederbörd. Eller, kan specifika kolumner och buffertar för en hög kvalitet och robust beredning av miRNA-innehållande totalt RNA användas. Även för själva analysen, deras korta storlekar skapar utmaningar. För genomet hela miRNA screening, det finns tre vanliga miRNA profilering tekniker att välja mellan: microarrays, qPCR och nästa generations sekvensering. Varje teknik kan utföras med hjälp av flera olika plattformar, och olika provpreparat erfordras, var och en med olika risker för att införa förvrängningar. I miRNA microarray är en bild fläckig eller syntetiseras med tusentals oligonukleotider. Dessa oligonukleotider används som prober, och var och en av probens är utformad för att hybridisera till en särskild miRNA sekvens. Den provberedning för microarrays, som utförts i denna studie, berikar först för miRNA och sedan introducerar Cy5 och Cy3 märkning på de miRNA. Microarray ger möjlighet att observera de relativa expressionsnivåer av ett stort antal gener samtidigt, är snabb och lämpar sig för screening av stort antal prover, men kan bara analysera sekvenserna finns på microarray och kommer till exempel inte upptäcka förändringar i okända eller muterade miRNA. Microarray analys som utförs i detta protokoll kräver också relativt stora mängder, ca 5 mikrogram, av total RNA per prov för analys. Low-density qPCR miRNA profilering kräver mindre material (700 ng / prov och replikera), och gör det möjligt att upptäcka och kvantifiera miRNA. Transkriptnivåer kan fastställas, och mängden kan vara en absolut mängd eller en relativ mängd. qPCR analys kräver först omvandling av miRNA till cDNA, här genom en slingprimer för varje specifika miRNA säkerställer analysen av endast mogna miRNA. Detta genererar en längre mall som kan amplifieras med användning av en miRNA-specifik framåtriktad primer och en universell omvänd primer komplementär till den slingsekvensen och kan hamnen inkluderandet av en Dual märkta proben för specificitet. qPCR kan användas i en låg densitet format där hundratals miRNA kan detekteras parallellt med användning av en eller flera 384-brunnsplattor med enskilda primerparen i varje brunn 11. Nästa generations sekvensering, å andra sidan, är den enda av dessa tekniker som möjliggör upptäckten av nya, muterade eller redigerade miRNA, eftersom alla RNA-molekyler i ett prov kan sekvenseras 11. Denna teknik erfordrar emellertid multipla steg för att berika små RNA och producera ett litet RNA-bibliotek med användning av flera steg av linker-ligeringar och reningar med påföljande förbättrade riskerna för att modulera deras relativa expressionsnivåer mellan proverna. Det kräver också betydande bioinformatics analys. Med tanke på de olika teknikerna för miRNA profilering, den lämpligaste tekniken beror på ansökningarna. Microarrays är mest lämplig när materialet är relativt riklig och intresset är att fastställa differentierade uttryck av redan kända miRNA. Low-density qPCR arrayer är mest lämpliga när en begränsad mängd prov finns tillgänglig och en hög känslighet Ande uttrycks miRNA krävs. Sekvense är mest lämplig när det krävs en analys av okända miRNA, muterade eller olika isoformer av en miRNA.
I studien av östrogenreglerade miRNA i bröstcancer, är två modell cellinjer som används, T47D och MCF7, där stora mängder RNA är lätt tillgängliga. Varje cellinje analyserades i replikerade cellodlingar med användning av olika kanaler, vardera i tekniska replikat av behandling. Detta gör det möjligt för robust upptäcka reproducerbart, ERa-reglerade miRNA. Relativa miRNA expressionsnivåer jämfördes med både miRNA microarray ochDubbla märkta prober - låg densitet arrayer (DLP-LDA) och validerat resultaten med särskild qPCR använda både cyaninfärgämnet och DLP kemier. miRNA föreskrifter analyserades därefter ytterligare i tidsserier för att fastställa deras exakta reglering över tiden, vilket kan bidra till att skilja slumpmässiga eller dygnsrytm variationer från östrogen-inducerad regler, och ange primära effekter från sekundära effekter. Bioinformatiska jämförelser med kromatin bindande studier av ERa kan ytterligare stöd i differentiering av primär kontra sekundära effekter. Analysen resulterade i en tillförlitlig bedömning av miRNA föreskrifter där det kan fastställas att efter 24 timmar E2 behandling protein-kodande avskrifter var klart reglerade men mogna miRNA påverkades inte 1. Det är emellertid möjligt att miRNA regleras vid senare tidpunkter, vilket visas i tidsserieanalys av utvalda miRNA 1. Detaljerna behöver utforskas ytterligare och det protokoll som presenteras här ger en Robust sätt att studera hormonell reglering av mogna miRNA i bröstcancercellinjer.
Protocol
1. Beredning av Cell Culture Media
- För T47D cellinje odlingsmedia:
- Blanda 500 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 500 ml F12 [DMEM/F12 (1:1)] i en autoklaverad 1 L flaska.
- Tillsätt 50 ml fetalt bovint serum (detta gör 5% FBS) och sedan 10 ml av penicillin streptomycin (detta gör 1% PEST). Blanda innehåll helt.
- Förvaras vid 4 ° C.
- För MCF7 cellinje odlingsmedia:
- Blanda 500 ml DMEM med 25 ml av FBS (5% FBS) och därefter 5 ml av penicillin streptomycin (1% PEST).
- Förvaras vid 4 ° C.
- För reducerad serumodlingsmedier:
- För T47D: Blanda 500 ml fenolrött-fritt DMEM med 500 ml F12 (1:1) i en autoklaverad 1 L flaska, och tillsätt 50 ml av dextran-belagt träkol-behandlade (DCC) FBS under 5% DCC-FBS. Gör en separat flaska med 5 ml DCC-FBS för 0,5% DCC-FBS. Lägg sedan till 10 ml PEST (1% PEST) till varje flaska. Blanda innehåll helt, lagringe vid 4 ° C.
- För MCF7: Blanda 500 ml fenolrött-fritt DMEM med 5 ml 100x L-glutamin (200 mM slutkoncentration). Tillsätt 25 ml av DCC-FBS (5% DCC-FBS). Gör en separat flaska med 2,5 ml DCC-FBS (0,5% DCC-FBS). Lägg sedan till 5 ml PEST (1% PEST) till varje flaska. Blanda innehåll helt, förvara vid 4 ° C.
- För fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-lösning:
- Fyll en 1 L autoklaverat glasflaska med ultrarent vatten eller destillerat vatten.
- Lägg en PBS-tablett och skaka då och då tills tabletten har lösts upp.
- Autoklav PBS-lösning och förvara i rumstemperatur.
- Beredning av ligand lager:
- Förbered en 100 mM stamlösning av E2 genom att lösa 2,72 mg 17β-östradiol i 100 l etanol eller DMSO i en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör, och blanda innehållet försiktigt. Snurra kort och gör seriella spädningar (1:10) för erhållande av 10 mM, 1 mM och 0,1 mM stam concentrtioner med användning av lösningsmedlet. Förvara alla E2 stamlösningar vid -20 ° C.
- Förbered en 100 mM stamlösning av ICI genom att lösa 6,07 mg ICI 182.780 i 100 l EtOH eller DMSO i en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör, och blanda innehållet försiktigt. Snurra kort och gör seriella spädningar (1:10) för erhållande av 10 mM, 1 mM, 0,1 mM stamkoncentrationer med hjälp av lösningsmedel. Förvara alla ICI stamlösningar vid -20 ° C.
- Fordonet är lösningsmedel (etanol eller DMSO). Placera 0,5 till 1 ml av 100% etanol eller DMSO i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.
2. Cellodling och behandling
Utför varje behandling i dubbel-eller trippelplattor för tekniska replikat. Upprepa cellodlingsförfarande och behandling med en annan passage av samma cellinje, som skulle fungera som en biologisk kopia av denna cellinje. Upprepa proceduren med en annan cellinje till replicate rön i mer än en cellinje. Alla cellodlingstekniker bör utföras under sterila betingelser i ett dragskåp med laminärt flöde.
- Cellodling startup
- Värm media till 37 ° C i en steril varmt vattenbad.
- Tina en fryst flaska med T47D eller MCF7 celler.
- Rengör utsidan av flaskan och medieflaska med 70% etanol, och sedan placera både flaskan och flaskan i sterila laminärt flöde huva.
- Märk en steril T-75 kolv i enlighet därmed (i huven).
- Lägg till 12-15 ml av lämpliga medier i kolven med hjälp av en steril serologisk pipett (se till att ytan är helt täckt med media).
- Överför celler från flaskan till kolven, och blanda försiktigt.
- Placera kolven i ett 37 ° C inkubator, levereras med 5% CO2.
- Framställning av celler för behandling
- Ta celler ut ur inkubatorn och observera i mikroskop för att säkerställa att cellerna är åtminstone 80% Confluent. Detta för att se till att det finns tillräckligt med celler för experiment. Ta kolven till steril huva.
- Ta ut mediet från kolven med användning av en steril pasteurpipett förbunden med en vakuum. Tvätta försiktigt fästa cellerna två gånger med PBS.
- Tillsätt 1 ml varm trypsin-EDTA till kolven, och sätta kolven i inkubatorn under 2 min. Detta för att göra att cellerna lossnar från kolven.
- Lägg ungefär 3-4 ml lämpliga varma medier till kolven och mal sönder de lösgjorda cellerna med hjälp av en 5 ml serologisk pipett. Finfördela genom att ta upp cellerna i serologisk pipett och släppa cellerna med spetsen på pipetten placeras mot botten av kolven för att öka trycket. Detta är för att bryta sönder cellerna i enstaka celler.
- Räkna celler, t.ex. med användning av en cellräknare, enligt tillverkarens protokoll.
- Märk 100 mm plattor (vid behov) och tillsätt ungefär 10 ml medium till plattorna. Tallrik ungefär 2,0 x 10 6 celler / platta. Fördela celler genom GEntle virvlande plattorna.
- Inkubera cellerna under 24-48 timmar, tills ca 80% konfluenta.
- Vid 80% sammanflytning, tvätta cellerna två gånger med PBS, och lägga till lämpliga 5% DCC-FBS media. Därefter inkuberas cellerna under 24 timmar.
- Efter 24 timmar, tvätta cellerna två gånger med PBS, och lägga till lämpliga 0,5% DCC-FBS media. Därefter inkubera cellerna under ytterligare 48 timmar.
- Cell behandling
- Efter 48 timmar tvättas cellerna två gånger med PBS. Var noga med att ta bort så mycket av PBS som möjligt.
- I ett 15 ml koniskt rör, tillsätt 10 ml av lämpliga 0,5% DCC-FBS media. Lägg sedan till 1 ìl av 0,1 mM ligand lager (E2 eller ICI) för en slutlig koncentration av 10 nM. Lägg också till en fil av fordonet till 10 ml medium i ett separat rör för kontrollförsöket.
- Blanda innehållet i röret försiktigt och tillsätt till celler i plattan. Detta bör vara en ligand per platta.
- Inkubera cellerna för den valda tidspunkten (0-72 tim).
- RNA-extraktion
- Efter behandling är färdig för den önskade tidsperiod, tvätta cellerna två gånger med PBS, tillsätt sedan ca 1-2 ml guanidintiocyanat-fenol-lösning till cellerna i plattan. VARNING: guanidintiocyanat-fenollösning är giftigt vid kontakt med hud eller ögon, genom inandning eller förtäring. Använd lämpliga skyddskläder, handskar och ögon / ansiktsskydd, och använda dragskåp.
- Se till att volymen av celler är inte mer än 10% av volymen av guanidintiocyanat-fenol-lösning, och att plattan täcks med lösningen och låt stå i 1 min. Sedan, skrapa cellerna med en gummiskrapa och överföra till ett mikrocentrifugrör. Celler kan lagras i denna lösning vid -80 ° C i flera veckor.
- Utdrag och rena total RNA från varje behandling med hjälp av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform metod som spinnkolonn rening och DNasI DNA-metod nedbrytning för djurceller.
- Efter extraktion, celler eluerades i 60 ^ il RNas-fritt vatten. Fördela 1-2 pl RNA för kvantifiering analys och lagra RNA vid -80 ° C.
- Mät RNA koncentrationer med hjälp av 1 l av RNA och aspectrophotometer. Se till att det finns ett tomt vidtas innan någon mätning görs. Dessutom, helt utplåna spektrofotometern nå gång en mätning görs. Halterna brukar visas i ng / ul. Spara resultat som visar RNA-koncentrationer.
- RNA kvalitetskontroll
- Ta ca 100 ng RNA för varje prov och placera i en mikrocentrifugrör.
- Mät RNA integritet med hjälp av en Bioanalyzer. Vanligtvis 12 prover kan köras på en gång i en Bioanalyzer. Kör vanligtvis tar ca 25 min.
- Jämför resultaten med RNA stege för att säkerställa att RNA är bra för experimentet. Spara och skriva ut resultatet.
4. Bekräftelse av Treatning: qPCR av protein-kodande gener
- cDNA-syntes
- Ta 500 ng eller 1 mikrogram av det totala RNA (i varje prov) och sätta i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Bringa volymen hos varje rör upp till 10 | al med användning av RNAs-fritt vatten.
- Lägg 2 pl av 50 pM slumpmässiga hexamer-primers och värmerören till 70 ° C under 10 min.
- Överför rören till is under 5 min.
- För varje prov, tillsätt 4 pl av 5x första strängen-buffert, 1 | il av 0,1 M DTT, 1 | il av 10 mM dNTP, 0,5 | il av upphöjd III och 1,5 | il RNas-fritt vatten.
- Placera rören i ett 25 ° C värmeblock eller vattenbad under 10 min.
- Överför rören till ett 46 ° C värmeblock under en timme. Sedan, för att överföra rör till en 70 ° C värmeblock i 15 min stoppa reaktionen.
- Späd cDNA till en 5 ng / ul lager (beräknat med användning total-RNA-ingång) med användning av RNas-fritt vatten för spädningar och förvara vid -20 ° C.
- qPCR
- Skaffa primers för gener av intresse och referensgener. Primers kan enkelt utformas med hjälp av primer utforma verktyg på NCBI: s Primer-BLAST-program 12. Detta genererar vanligtvis en framåt-och omvänd primer för varje gen av intresse. Primrarna bör vara 18 till 22 bp i längd, har en smälttemperatur av 52-58 ° C har en GC-halt av 40-60% och ett amplikon längd 100-180 bp.
- För varje qPCR reaktion väl, tillsätt 10 ng cDNA (2 pl från lager koncentration från steg 4.1.7), 1 pmol av var och en av de framåt och bakåt primers av genen av intresse (från steg 4.2.1), och 5 pl 2x cyaninfärgämne PCR Master Mix. Reaktionen för varje brunn bör ha en 10 | il slutlig reaktionsvolym.
- Säkerställ att det finns tre brunnar för varje prov för varje gen (av tekniska replikat). En 96-väl reaktionsplatta kan användas.
- På systemprogramvaran QRT-PCR, tilldela reportern och mål, anger reaktionsvolym väljer den jämförandetröskelcykeln (ΔΔCt)-metoden, och definiera provbrunnar.
- Se till att utföra smältkurvanalys för alla cyaninfärgämnet går att bekräfta den förstärkning av en specifik fragment. Kör plattor med standardinställningarna för körningen.
- Spara resultat efter körning, och exportera data (särskilt CT-värdena till MS Excel).
- qPCR analys av data med hjälp av ΔΔCT formel
Förändringen i relativa mRNA-uttryck kan beräknas som faldig förändring jämfört med kontroll på Excel för varje prov med hjälp av följande steg:- Alla exporterade resultat från qPCR ovan bör ha Ct-värdena inkluderade. Beräkna ΔCT värde enligt följande formel:
- ΔCT = CT (målgen) - CT (referens gen)
- Därefter, beräkna den totala standardavvikelsen (SD) för varje prov. Första beräknaSD för referensgenen och sedan beräkna SD för målgenen (detta kan göras på excel använder STD DEV-funktionen på CT-värden). Sedan beräkna den totala SD för varje prov med hjälp av denna formel:
- Totalt SD = (SD2 (mål) + SD2 (referens)) 1/2
- Beräkna ΔΔCT av varje prov i en gen (mål) av:
- ΔΔCT = ΔΔCT (behandlad / prov) - ΔΔCT (kontroll / kalibreringsprov)
- Slutligen beräkna fold-change (FC) värden för varje prov med hjälp av formeln:
- FC = 2-ΔΔCT
- Students t-test kan användas för statistisk analys med hjälp av två-tailed distribution och två prov olika variansparameters: (p <0,001 (***), P <0,01 (**) och P <0,05 (*)). Detta kan uppnås på Excel. Bekräfta att behandlingen ledde till regleringen av kända mål innan du fortsätter med miRNA profilering.
- Alla exporterade resultat från qPCR ovan bör ha Ct-värdena inkluderade. Beräkna ΔCT värde enligt följande formel:
5. miRNA profilanalys
- miRNA microarray
- Ta 5 mikrogram av isolerade RNA från celler som behandlats med antingen bil eller ligand, och plats i ett mikrocentrifugrör. Justera volymen i röret till 20 pl. Varje jämförelse bör utföras i dubbletter eller tripletter.
- Utför miRNA microarray med hjälp av RNA-proverna ovan. miRNA microarray uttryck profiler bör fastställas med hjälp av människans miRNA microarray tvåfärgad prov array av μParaflo mikroflödes Biochip Technology (Sånger miRBase Release 14,0) 13.
- Resultaten ska visa differentiellt uttryckta miRNA. Tänk betydande miRNA uttryck när p <0.05.p-värde <0,10 kan också övervägas för ytterligare samarbetenfirmatory analys med användning qPCR. Spara denna miRNA listan av ytterligare validering med qPCR.
- miRNA profilering: DLP-LDA
- Varje prov ska analyseras i dubbletter eller tripletter. Ta 700 ng av total RNA från celler som behandlats med antingen bil eller ligand, och placera i en mikrocentrifugrör. Justera volymen i röret till 3 pl.
- Utför cDNA-syntes med hjälp av Dual märkta prober miRNA analysmetod och 10x RT primers. Total volym för varje reaktion bör vara 7,5 | il.
- Placera reaktionsröret i PCR-systemet Thermocycler, och satt till rekommenderade parametrar som anges i Dual märkta prober miRNA analysmetod. Starta körningen. Detta kommer att generera cDNA. Observera att cDNA kan lagras vid -20 ° C under minst en vecka.
- Medan RT reaktion är igång, ta ut DLP-LDA plattorna och låt stå i rumstemperatur. Varje array plattan innehåller 384 brunnar som innehåller unika miRNA primers och kontrollgrundfärger.
- Ta 6 pl av cDNA (från 5.2.3) och placera i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Addera 450 pl av Dual märkta prober 2x Universal PCR Master Mix och tillsätt 444 | il RNas-fritt vatten.
- Vänd röret ungefär sex gånger för att blanda innehållet och centrifugera en kort stund.
- När DLP-LDA plattan har nått rumstemperatur, belastning 100 l in i var och en av de åtta "Fyll port" av plattan. Därefter centrifugera arrayen plattan.
- Öppna QRT-PCR-systemet och kontrollera att blocket är att för 384-brunnar. Konfigurera springa med hjälp av SDS-programvaran. Välj relativ kvantifiering (Ct), väljer väl nummer och array typ, och ange prov beskrivning för att definiera brunnar.
- Kör array med standard termisk cykling förhållanden. När körningen är klar, spara resultat och export till MS Excel och spara för vidare analys med hjälp av ΔΔCT formel (steg 4,3).
6. Bekräftelse av miRNA föreskrifter med hjälp av separatqPCR Analys
- Cyaninfärgämne qPCR analys
- Design primers för önskad miRNA analys. Sekvens av den mogna miRNA, vilket är lika med den framåtriktade primern, kan erhållas från mirbase.org 14. Konvertera alla "U" till "T".
- Förbered cDNA: ta 1 | ig av totalt RNA och placera i ett 1,5 ml centrifugrör. Följ instruktionerna för polyA svans och första strängen cDNA syntes av miRNA från en miRNA första strängen cDNA syntes och QRT-PCR-protokoll. Späd den resulterande cDNA (01:10) och förvara vid -20 ° C.
- Skaffa en 96-väl reaktionsplatta.
- För varje miRNA qPCR reaktion väl, tillsätt 16 ng polyA cDNA (från steg 6.1.2), 2 pmol av var och en av de specifika framåt primer (från steg 6.1.1) och den universella primern (ur satsen från steg 6.1.2 ) och 5 pl av 2x qPCR Master Mix. Slutlig reaktionsvolymen är 10 | il / brunn.
- Se till att det finns tre brunnar för varje prov för varje miRNA (för tekniska replikat). Också, Se till att en referens gen (vanligen U6 snRNA) ingår.
- På systemprogramvaran QRT-PCR, tilldela reportern och mål, anger reaktionsvolym väljer du jämförande tröskelcykeln (ΔΔCT)-metoden, och definiera provbrunnar.
- Kör plattor med standardinställningarna för körningen. Se till att utföra smältkurvanalys för alla cyaninfärgämne körningar. Varje smältkurva ska visa endast en viss topp för att bekräfta den förstärkning av en specifik fragment. Om mer än en topp eller ingen tydlig topp observeras, primrarna är inte specifika och data kan inte användas.
- Spara resultat efter körning, och exportera data (särskilt CT-värdena till MS Excel).
- Dubbelt märkta prober qPCR analys
- Ta 10 ng av varje total-RNA, var och en i en 5 | al volym och placera i 0,2 ml mikrocentrifugrör.
- Följ instruktionerna från protokollet om att utföra omvänd transkription (RT) med hjälp av Dual märkta prober MicroRNA omvänt transkriptas Kit 15. Varje total reaktionsvolym bör vara 15 pl. Observera att för de dubbla Märkta prober RT reaktioner, det finns specifika primers för varje miRNA som ska studeras.
- Placera reaktionsröret i PCR-systemet termocykler, och ställa in parametrar i enlighet med det protokoll som anges i steg 6.2.2 ovan. Starta körningen. Det bör ta ca 70-80 min.
- Efter RT-reaktionen skall provet spädas cDNA i en 01:05-förhållande, och lagra alla cDNA i mörker vid -20 ° C.
- Skaffa en 96-väl reaktionsplatta.
- För varje miRNA qPCR reaktion väl, lägg till följande: 10 pl Dual märkta prober 2x Universal PCR Master Mix (samma reagens som steg 5.2.5), 7.67 il RNas-fritt vatten, 1 pl av 20 × realtidsanalys primer (specifik för varje miRNA), och 1,33 l av cDNA från steg 6.2.4 ovan. Detta bör vara en 20 | il slutlig reaktionsvolym. Blanda innehållet försiktigt och centrifugera en kort stund.
- Se till att eere är triplikatbrunnar för varje prov för varje miRNA (för tekniska replikat). Se också till att en referens gen (vanligen U6 snRNA) ingår.
- På systemprogramvaran QRT-PCR, tilldela reportern (FAM) och släckare (NFQ-MGB) för varje miRNA (mål) av intresse, anger reaktionsvolym väljer du jämförande tröskelcykeln (ΔΔCt)-metoden, och definiera provbrunnar.
- Följ instruktionerna för att ställa in parametrar för qPCR går från Dual märkta prober mikroRNA analysprotokollet. Starta sedan loppet. Spara resultat efter körning, och exportera data (särskilt CT-värdena till MS Excel).
Representative Results
En översikt över det tillvägagångssätt presenteras i fig 1 och en jämförelse mellan de olika provberedningar och nukleinsyra-ändringar som krävs för varje teknik visualiseras i fig 2.
Villkoret och miljö av cellerna före behandling med ett hormon är viktigt för att fastställa de faktiska effekterna av hormonet 16. Vissa medium och serum innehåller tillväxtfaktorer som kan påverka resultaten, så cellerna serum svalt för att garantera att alla hormonella effekter har reducerats till ett minimum. Därför, när behandling med E2, det finns större säkerhet att de effekter som observerats är E2-tillhörande. En viktig faktor är att sammanflytning av celler, som påverkar cell-cellkontakt och beteenden såsom cell-cellsignalering och spridning. Cellerna fick vara 80% konfluenta (figur 3A) och väl fastsatt för att medge tillväxt och undvika förlust av celler under efterföljande tvättning och medie lmAnge.
Förhållandena under RNA-extraktion och lagring är viktigt för kvaliteten av RNA och efterföljande analys. Det är också känt att det antal celler, den brytningsmetod, och innehållet i miRNA GC kan påverka utbytet och kvaliteten av både mRNA och miRNA 17. Därför är det nödvändigt att utföra RNA-extraktion under RNas-fria förhållanden och för att kontrollera kvaliteten på RNA innan du fortsätter med experiment. Efter extraktion kvantifiering av RNA ger information om koncentrationen av total-RNA (innehållande både mRNA och miRNA), som möjliggör observation av utbyte. Det ger också en grafisk representation av resultat som kan ses i figur 3B, och detta gör det möjligt för observation av renheten hos provet (vanligtvis anges med en topp, övre panelen). Dålig avkastning av RNA skulle ge någon specifik absorption vid 260 nm (Figur 3B, nedre panelen). För att bestämma om RNA är av hög kvalitet, RNAintegritet mättes. Ett RNA integritet nummer (RIN) på mellan 9-10 säkerställer att RNA är inte försämras och är av bästa kvalitet. Dessutom bör observeras den grafiska representationen av RNA-och 18S-och 28S-rRNA bör ha toppar som visas i figur 4 (mittenpanelen). Jämförelse med stege (figur 4, övre panelen) anger storleken på topparna. En försämrad RNA skulle ha mindre tydliga toppar och en minskad relativ mängd av 18S och 28S rRNA (Figur 4, nedre panelen). Den fraktion av små RNA kan ytterligare säkerställas med hjälp av Agilent Small RNA Kit. Det rekommenderas att validera östrogensvar efter behandling under angivna experimentella förhållanden, innan du fortsätter till miRNA screening. En qPCR kan utföras på ett känt ER målgen såsom PS2 eller SPINK4 18, med användning av cDNA-mall. Sådana gener brukar uppregleras inom 1-24 timmar efter E2 behandling. När kvaliteten hos RNA och östrogenresponshar bedömts, ytterligare experiment kan utföras.
Microarray är fortfarande en allmänt använd teknik för storskalig screening för miRNA expression i celler. Till exempel miRNA microarray gång användes innehöll 894 mogna miRNA och 50 kontroller unika sonder i fyrlingar 1. Hybridiseringar utfördes i dubbletter med färgämne växlingsförfarande. Mirna microarray resultat brukar grafiskt representeras av värmekartor. Figur 5A visar en värmekarta, som representerar data från en microarray jämförelse miRNA mellan fordonet och E2 behandlade proverna. Den röda indikerar att miRNA uppregleras i E2-behandlade provet (högre expression), medan den gröna indikerade nedreglering av miRNA (lägre expression). Mirna valet beror oftast på deras betydelse i uttryck, och oftast ett p-värde mindre än 0,05 anses vara betydande. De miRNA som indikeras vara differentiellt uttryckta bör valideras ytterligare wed qPCR, för att skilja dem från falska positiva.
DLP-LDA-array, å andra sidan, använder en qPCR-baserad metod för att screena för reglerade miRNA i en 384-brunnsformat. Vanligtvis två 384-brunnsplattor (kort) är anordnade, pooler A och B. Grupp A innehåller vanligtvis bättre karaktäriserade och mer höggradigt uttryckt miRNA än poolen B. Den relativa nivån för varje miRNA bestäms av qPCR, där en miRNA analyseras per brunn (Figur 5B). Ett högre Ct-värde indikerar mindre miRNA uttryck. Ungefär som miRNA microarray, resultat som uppnåtts från DLP-LDA måste valideras ytterligare för att säkerställa noggrannheten.
Validations kan utföras med användning qPCR. Här är två qPCR detektionsmetoder som beskrivs för att förhindra metod partiskhet och för att möjliggöra noggrann bekräftelse och utredning av miRNA föreskrifter. Cyaninfärgämnet baserade detektionskemi fungerar annorlunda än DLP att DLP-LDA profilering bygger på, och är lämplig för att bekräftaation ändamål. Det kan vara mindre specifik eftersom den upptäcker allt förstärkt dubbelsträngat DNA, men homogenitet provet kan bedömas genom att utföra en smältkurva analys. Figur 6A (till vänster) visar smältkurvan analys av en miRNA, och en klart definierad enhetlig topp kan ses. Flera toppar skulle observeras om primern är ospecifika eller betydande mängder primer-dimer bildas (figur 6A, högra panelen). DLP miRNA analyser, å andra sidan, är mer specifikt eftersom bara amplifiering av mål-miRNA detekteras. Kan observeras Amplification plottar av varje mål miRNA, såsom exemplifieras i fig 6B. Möjligheten att kontrollera för förekomsten av flera amplifieringsprodukter använda smältkurvanalys det är dock inte tillgänglig med denna kemi och cyaninfärgämne qPCR är billigare. Cyaninfärgämne och DLP qPCR analyser kan ibland genererat något olika resultat. För båda qPCR analyser, jämförelse med en refekomst-genen krävs för att bestämma det relativa uttrycket av gener mellan två prover. Referens genen, även hänvisad till som keeping-gen, bör vara en gen vars expression inte ändras och som uttrycks på liknande nivåer som genen av intresse. Ett exempel på en lämplig referensgenen i dessa bröstcancercellinjer är ARHGDIA, en Rho GDP-Dissociation Inhibitor som fungerar BNP / GTP-utbytesreaktioner av Rho-proteiner. Såsom observerats i figur 6C (överst), är mRNA-nivån av ARHGDIA inte förändrats mellan fordonet och de ligand-behandlade prover. The 18S rRNA kan också användas, även om dess höga uttryck kräver en separat 1:500 utspädning av cDNA-lager och är därför mindre lämpliga. För miRNA analys, finns det fortfarande en debatt om en väldefinierad referensgenen. Hittills är det U6 snRNA en referens gen som är allmänt accepterat för miRNA analys. U6 snRNA är ~ 110 nukleotider långa, icke-kodande små nukleära RNA som fungerar i kärn pre-mRNA splisbildning 19. Som observerats i figur 6C (botten), U6 uttrycksnivåerna är ungefär samma för alla prover som visas, vilket möjliggör beräkningar av de variabla nivåer av miRNA. En grafisk framställning av en miRNA qPCR resultat för en jämförelse mellan fordonet och E2-behandlade celler som har normaliserats till referens U6 kan observeras i fig. 6D. Detta illustrerar en miRNA som upptäcktes som nonregulated efter 24 timmar E2 behandling, men som härbärgerar ER kromatin-bindningsställen som ligger nära dess iska plats och tidsserieanalys identifierade betydande reglering 72 timmar efter behandling.
Figur 1. En översikt av den metod som används för detektion av hormonell reglering av miRNA i bröstcancerceller.
Figur 2. Jämförelse av de olika prov förberedelser och nukleinsyra manipulationer för varje miRNA detektionsteknik. (A) miRNA microarray med användning av μParaflo teknik Förfarandet innefattar anrikning, poly-A-svans och ligering märkning. (B) Framställning DLP-teknik provet och detekteringsmetod inkluderar en sling cDNA-syntes-primer som sträcker sig efter denatureringssteget och ger en längre fragmentet som hyser vända primer och sondsekvens. (C) cyaninfärgämne teknik provberedningoch detektionsmetod innefattar poly-A-svans, och cDNA-syntes med oligo-dT-primrar inklusive en universell 5 '-sekvensen.
Figur 3. Cellodling och RNA-extraktion. (A) Odlade celler för att illustrera 80% sammanflytning behövs innan behandling med ligand. (B) Grafisk representation av RNA-koncentration och renhet efter extraktion. Varje topp motsvarar ett prov och en framgångsrik extraktion förfarande ger ren RNA (övre panelen). En dåligt extraherade RNA uppvisar ingen tydlig absorptionstopp vid 260 nm (nedre panelen).
Figur 4. & #160, RNA kvalitetskontroll Resultat från RNA integritet analys som visar grafisk representation för stegen (överst), en god kvalitet RNA (mitten) och en försämrad RNA-prov (botten)..
Figur 5. En illustration av miRNA profilering resultat. (A) En värme karta representation av miRNA microarray resultat för differentiellt uttryckta miRNA. miR-A, B, C är uppreglerad vid E2-behandlade-sampel såsom indikeras i rött, medan miR-D, E, F, G är nedreglerade i E2-behandlade provet såsom anges i grönt. (B) Amplification tomter för varje miRNA från DLP-LDA resultat. miRNA upptäckts förstärks vilket indikeras av ökning av Rn värde.
Figur 6. qPCR analys av miRNA föreskrifter. (A) Smält-kurva analys för en miRNA analyseras med hjälp av cyaninfärgämne upptäckt, visar homogenitet av alla prover (till vänster) och förstärkning av flera fragment (höger). (B) Amplification tomter för varje prov för en miRNA. Detta kan vara antingen från cyaninfärgämne eller DLP detektionsmetoder. (C) Stapeldiagram representation av lämpliga referensgener för mRNA-analys ARHGDIA (överst) och för miRNA analys snRNA U6 (botten), som visar någon signifikant differentialuttryck mellan prover. (D) miRNA qPCR resultat för att illustrera jämförelse av relativa uttryck nivåer av miR-135a under ett tidsförlopp. Figur 6D är omtryckt från 1 Katchy et al. med tillstånd från Elsevier. Värdena är vanligen genomsnittet av separat experiments (biologiska duplikat) ± SD. Students t-test används för att demonstrera betydelsen: * p <0,05.
Discussion
Fastställande av mekanismen för hormonell reglering av miRNA i bröstcancerceller kan ge en plattform för att förstå denna sjukdom och kan ge potentiell behandling för bröstcancer. Odling av dessa celler för att tillhandahålla det optimala villkoret för hormonverkan är mycket viktig. Här har ett protokoll som gör att hormonet av intresse (östrogen) uteslöts före behandling och att en optimal dos av E2 användes under en lämplig tid under behandlingen beskrivits. Andra hormonella och tillväxtfaktor effekter minimeras genom att gradvis sänka serumnivåerna och använda DCC-FBS, vilket är FBS som har berövats det mesta av sitt hormon, cytokiner och tillväxtfaktorer. Fenolrött fria media vidare används för att minimera andra nonhormonal effekter, eftersom fenolrött har rapporterats att ha östrogen aktivitet och påverkar vissa funktioner i cellinjer 20,21. Tiden för exponering av cellerna för hormonet är av stor betydelse. För östrogen-associerad reglering av gener, har det tidigare visat att 24-hrexposure producerar signifikant respons på direkta mål gener i bröstcancerceller 1,18. Sedan miRNA transkriberas av RNA-polymeras II, som mRNA, är det tänkbart att det är en lämplig tidpunkt för att detektera direkt reglering även av miRNA. Det är ännu inte fastställt om och hur dessa miRNA påverkar uttrycket av dessa kända ER mål i bröstcancerceller.
miRNA uttryck profilering kan vara en utmaning på grund av den relativt begränsade storleken på miRNA, det faktum att den mogna miRNA sekvensen finns även i den pri-miRNA och pre-miRNA, och på grund av heterogenitet i sin GC innehåll 22. Flera profileringstekniker och kemier har använts för att övervinna denna svårighet. Bland dessa finns olika metoder för microarray-och qPCR analys (Figur 2). Även microarray är allmänt accepterat för hela genom anallys, kan det ge falskt negativa resultat och det finns skillnader mellan de tillgängliga plattformar, allt från kemi till den tryckteknik 23. Även normaliseringsprocessen är en utmaning när man analyserar de relativt få miRNA gener, som är inräknade i tusental jämfört med de tiotusentals mRNA-transkript. qPCR, å andra sidan, är mer känsliga, och är bättre tillämpas när färre gener är att betrakta. Men när de utförs i stora 384-hålsplattor, med endast en teknisk replikera per platta, flera plåtar behöver analyseras för varje prov som gör analysen dyrt. Också i våra händer, många fler falska negativa resultat erhållits med DLP-LDA analysen jämfört med microarray. Med tanke på att det mogna miRNA-sekvensen är närvarande i den pri-miRNA och pre-miRNA sekvenser, är det av intresse att skilja mellan dessa transkript med användning av PCR-tekniker 24. DLP sonder finns även för pre-miRNA, och specific primers kan också utformas för att utesluta annan mogen eller prekursor varianter använder cyaninfärgämne qPCR teknik.
qPCR är en gyllene standard för validering av differentiellt uttryck från profilering resultat. Effektiviteten av qPCR dock beror på flera parametrar, bland annat RNA-extraktion, RNA integritet (kvalitet), cDNA-syntes, primer design, detektionsmetod (kemi), och referensgenen för data normalisering 1,22,25. Alternativen för primer design för miRNA analys är mycket begränsad, eftersom den korta miRNA sekvenslängden inte ger utrymme för mycket alternativ primer design, och endast en primer kan hyste i denna korta sekvens. Följaktligen är behovet av alternativa manipulationer såsom illustreras i figur 2. Tekniska replikat är viktigt att validera robusthet amplifieringsmetoden och processen används. Biologiska replikat erfordras för en representation av den allmänna biologiska Variation, inklusive varierande svar till ligand behandling, och för att visa att effekter i en cell är reproducerbar. Baserat på vår erfarenhet, kan variationer i miRNA uttryck mellan cellkulturer uppstår. Vanligtvis dessa skillnader är mindre än 1,3-faldigt, och genomsnittet av värden och motsvarande SD vilken fysisk och teknisk variation. Denna variation kan bero på olika faktorer, inklusive, celltäthet och det faktum att cellfunktioner kan ändras från passage till passage. För att identifiera statistiskt signifikanta uttryck som härrör från ligand behandling, är en allmänt accepterad betydelse då p-värdet är mindre än 0,05. Här har en students t-test på de biologiska och tekniska replikat med hjälp av tvåsidiga fördelningen och två prov ojämlika variansparametrar använts. Andra t-testparametrar existerar, och valet beror på den experimentella uppställningen 26.
Ett detaljerat protokoll för att utvärdera hormonella föreskrifter mogna miRNA i bröstcancerceller har lämnats. Viktig teknik och kemi i profilering och validera dessa miRNA uttryck har tydligt förklarat. Den teknik som väljs för studier av miRNA i bröstcancerceller beror ytterst på vad exakt utreds.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Dr Xiaolian Gao, University of Houston, för att ge råd till LC Sciences miRNA microarray-plattform, med dr Karin Edvardsson, Karolinska Institutet, Sverige, och Dr Eylem Aydogdu, University of Houston, för att dela deras miRNA expertis . Forskningen redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute i National Institutes of Health enligt Award Number R01CA172437. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health. Detta arbete stöddes också med bidrag från Texas Emerging Technology Fund, enligt avtal nr. 300-9-1958.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11885092 | |
| F12 | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 | |
| Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment | |
| DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| PBS tablet | Medicago, Accurate Chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
| ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML | |
| T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) | |
| T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 | |
| Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) | |
| Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 | |
| 100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 | |
| Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 | |
| Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 | |
| Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 | |
| Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 | |
| RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 | |
| Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) | |
| All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA | |
| First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate | Life Technologies | 4346906 | |
| Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 | |
| 2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 | |
| 7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 | |
| μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) | |
| DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 | |
| Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 | |
| GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 | |
| Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | |
| SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 | |
| NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 | |
| 10x DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA | |
| 20x DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |
References
- Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).
- Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).
- Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).
- Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).
- Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).
- Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).
- Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).
- Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
- Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).
- Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1 (1), 46-54 (1995).
- Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).
- Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32 (4), e43 (2004).
- Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
- Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).
