Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ardışık Published: May 23, 2014 doi: 10.3791/51289
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Stem Cell Institute, 2Wellman Center for Photomedicine and Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Summary

Kırık iyileşmesi kemik progenitör fonksiyonunun kantitatif ölçümü yüksek çözünürlüklü seri görüntüleme teknolojisini gerektirir. Burada, protokoller görseli sırayla ve kemik kırığı tamir sürecinde endojen osteojenik kök / progenitör hücrelerin hareketi, çoğalması ve farklılaşması ölçmek için intravital mikroskopisi ve osteo-dizi izleme kullanarak verilmiştir.

Abstract

Kemik sürekli devrediyor ve yüksek rejeneratif yaralanma takip ediyor. Osteojenik kök / progenitor hücreler uzun zaman var olduğu öne sürülmüştür, ancak bu hücrelerin in vivo gösteri ancak son zamanlarda elde edilmiştir. Burada, in vivo görüntüleme teknikleri, endojen osteojenik kök / progenitör hücrelerin rolünü (OSPCs) ve kemik tamir kendi soyu araştırmak için temin edilmiştir. Modelleri ve kalvarial kemik uyarılan mesafeli mikro Intravital görüntüleme izleme osteo-soy hücre kullanarak, OSPCs doğrudan erken onarım sürecinde kritik olaylar meydana geldiği yaralanma sonrası ilk birkaç gün boyunca görülebilir. Yaralanma siteleri sırayla OSPCs, yaralanma taşınmaya sayısındaki artış ve kemik oluşturan osteoblastlar farklılaştığı ortaya görüntülü olabilir. Bu yöntemler kemik rejenerasyonu ve onarımı için kök hücre-içsel ve dışsal moleküler düzenleyicilerin rolünü araştıran bir araç sunuyoruz.

Introduction

Dejeneratif kemik hastalıkları ve osteoporotik kırık riski yüksek yol yaşa bağlı kemik kaybı halk sağlığı 1 önemli bir sorun haline gelmiştir. Kemik bakım kemik oluşturucu osteoblastlar ve kemik erimesi ile ilgili osteoklastı tarafından kontrol edilir. Kemik oluşturan hücreler kusurlar, yaşa bağlı kemik kaybı, dejeneratif kemik hastalıkları 2,3 bir ana nedenidir. Kapsamlı araştırma kırık iyileşme iyileştirilmesi odaklanmış olsa da, güvenilir ilaçların keşfi dejeneratif kemik hastalıkları tedavi ve osteoporotik kırıkların zayıflığını tersine çevirmek için önemli bir sorun olmaya devam etmek. Böylece, kemik rejenerasyonu ve onarımı, kemik oluşturan hücreler ve onların denetim mekanizmalarının kaynağını inceleyerek iskelet yenilenmesini artırmak ve kemik kaybı hastalıkları tersine çevirmek için yeni bir fikir verir.

Kemik iliğinde multipotent mezenkimal hücrelerin varlığı clonogenic popülasyonlarının tanımlanması göre önerilmiştir ki farklı olabilirOsteogenik içine sokularak, adipogenic ve kondrojenik soylar ex vivo 4.. Son zamanlarda birçok çalışma iskelet / mezenkimal kök hücreler (DGM / MKH) osteoblast bir doğal kaynaktır ve kemik döngüsü, yeniden ve kırık onarımı 5,6 için kritik olduğunu bildirdi . Buna ek olarak, bizim soy izleme çalışması olgun osteoblastlar beklenmedik bir şekilde kısa yarı ömrü (~ 60 gün) var ve sürekli olarak normal homeostatik ve kırık tamiri koşullarda 6 hem kendi kök / progenitör hücreler tarafından doldurulan olduğunu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, in vivo kök hücre kimliği ve ne kadar bu gibi hücreler yaralanma parçalanması ve kemik oluşturan hücreler, belirsiz arz tepki. Bu nedenle, fizyolojik şartlar altında göç, çoğalmasını ve endojen DGM'ler / MKH'lerin farklılaşmasını analiz edebilir bir yöntem geliştirmek için önemlidir.

Kırık onarımı karmaşık bir dizi ile düzenlenen bir çok selüler ve dinamik bir süreçtirsitokinler ve büyüme faktörleri 7. Kırık çalışmaları için en popüler yaklaşım, uzun kemik kırığı olan bir hayvan modeli kullanmak ve kemik kesit ve imünoflöresan teknikleri 8-10 tarafından kemikleri analiz etmektir. Bu onarım işlemi mikro CT 11, yakın kızıl ötesi floresan 12 ve 13 kemilüminesans görüntüleme de dahil olmak üzere birden fazla görüntüleme teknikleri ile izlenebilir. Bununla birlikte, her bir teknik belirli sınırlamaları vardır ve in vivo olarak hücresel düzeyde DGM / MSC fonksiyonu izlemek için etkili bir yolu olmuştur. Son zamanlarda, konfokal / iki foton İntra vital mikroskopik geliştirilen ve hayvanlara 14, canlı da tek hücreli çözünürlükte kemik iliği mikro-bağlamında nakledilen kanser hücreleri ve hematopoietik kök hücreleri tespit etmek için kullanılmıştır. Soy izleme modelleri bir dizi ile bu teknolojiyi birleştirerek, osteojenik kök / progenitör hücreler genetik geçici ac ile işaretlenmiş olabilir tanımlamak başardıkmyxovirus direnç -1 (MX1) promoteri ve MX1 kaynaklı progenitörlerin tivasyon zaman içinde olgun osteoblastların çoğunluğu koruyabilir ama yetişkin fare 6 kondrositlerin nesil katılmazlar. Buna ek olarak, MX1 etiketli OSPCs kırık iyileşmesi 6 yeni osteoblastların çoğunluğu kaynağı olduğunu gösterdi.

Burada, osteo-dizi izleme modelleri ve intravital mikroskopi kullanılarak, bir protokol kırık onarımında MX1 + osteojenik kök / projenitör hücrelerin in vivo kinetiklerini belirlemek için sağlanır. Bu protokol kırık siteleri içine osteojenik kök / atalarıdır tehcir ve erken onarım süreci osteoprogenitör genişleme kantitatif ölçümünü izlemek için sıralı görüntüleme sunar. Bu yaklaşım, kemik onarım iyileştirmek için tedavi adayların değerlendirilmesi dahil olmak üzere birden bağlamlarda yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Fareler ve Önkoşullama

Not: Tüm fareler patojen-serbest koşullarda muhafaza ve tüm protokolleri Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm cerrahi otoklava steril ekipman kullanılarak steril koşullarda yapılmalıdır. MX1-Cre 15, Rosa26-loxp-stop-loxp-EYFP (Rosa-YFP), ve Rosa26-loxp-stop-loxp-tdTomato (Rosa-Domates) idi Jackson Laboratories'den satın alınmıştır. Osteokalsin-GFP farenin Henry Kronenberg tarafından temin edildi. In vivo OSPC göç ve çoğalması kantitatif analiz için, MX1-Cre + Rosa-YFP + (tek renk-muhabir) fareler kullanıldı. Osteokalsin + olgun osteoblast onların farklılaşma daha ayrıntılı izleme için, kullanılan trigenic MX1-Cre + Rosa-Domates + Ocn-GFP +fareler.

  1. , In vivo MX1 + hücreleri etiketlemek steril PBS çözeltisi içinde Poliinosinik-polisitidilik asit (PIPC, 2.5 mg / ml) hazırlamak ve 20 MX1-Cre + raportör fare g intraperitonal kez 10 gün boyunca her gün için 200 ul enjekte etmek için.
  2. Ikamet MX1 + hematopoietik hücrelerin ortadan kaldırılması için, 9.5 Gy tek bir doz ile ışın tedavisi fareler. Intravenöz 16 ışınlama, transplant vahşi tip kemik iliği hücreleri (1x10 6 hücre / fare) 24 saat sonra. Not: MX1-uyarılabilir hücreler hematopoietik hücrelerin ve hematopoietik türetilmiş osteoklastlar, MX1 + hematopoietik hücrelerin ortadan kaldırılması MX1 + osteojenik hücrelerin görüntü kalitesini geliştirir ve kantitatif içerir beri.
  3. Kemik iliği nakli sonrasında donör iliği hücrelerinin başarılı iskânından elde edilmesi amacıyla 4-6 hafta boyunca hayvanlar monitör.

2. Mohazirligi kullanın

  1. , IACUC onaylı bir prosedür kullanılarak, ketamin / ksilazin (100 mg / kg, xylazine 12 mg / kg vücut ağırlığı), 50 ul intraperitonal enjeksiyon ile fare anestezisi. Not: Etki süresi, ketamin / ksilazin ek bir doz ile uzatılabilir.
  2. Fare tam ayak ve / veya kuyruk tutam yanıt eksikliği ile anestezi olup olmadığını belirleyin. Fare anestezi zaman (İsteğe bağlı), bantlama ile burun üzerinde izofluran gaz maskesi güvenli. Hayvan tam sedasyon sağlamak için izofluran seviyesini ayarlayın.
  3. Bir elektrik düzenleyici veya küçük makas kullanarak saçınızı Clip. Saç parçaları çıkarın ve% 70 alkollü pamukla maruz kalan cildi sterilize. Kornea dehidratasyonu önlemek için göz yaşartıcı jeli uygulayın.

3.. Mikrokırık Yaralanma

  1. Hayvan tam sedasyon sağlandıktan sonra, kafa derisi cilt açmak için bir tek ters L şeklinde bir kesi yapmak. Kısaca, bir birinci enine bir kesi (en az 1 cm) starti yapmakBaşka kulağına bir kulaktan ng. 60 ° ~ ~ açın ve uzak burnundan 2-3 mm kadar burun doğru kesilirken devam ediyor. Not: Bu kesi yansıması için, alanı üzerinde yara dokularının oluşmasını önler.
  2. Forseps ile yanlara doğru çekerek cilt kapaklarını ayırın. Her iki frontal kemik ve sagital ve koronal sütür kesişme açıkça maruz olmalıdır.
  3. Kalan tüm kıllar ortadan kalkıncaya kadar steril PBS ve steril gazlı bez ya da pamuklu çubukla hafifçe silinerek ile temizlenerek açık yüzeyini temizleyin.
  4. Kalvaryumda mikro çatlaklar oluşturmak için, bir elinizle fare kafası ve başka bir el ile bir 30 G iğne tutun. Hafif basınç ile 30 G iğne ucu takarak ve hareket bükerek sagital ve koronal sütür kavşak yakınında sol frontal kemik üzerinde bir mikro-delinme (<1 mm derinlikte ~ 0.2 mm çapında bir yara) olun. Dikkat: Böylece, bleedi en aza indirmek, beyin içine nüfuz iğne önlemek için çok önemlidirng ve doku hasarı.
  5. Daha büyük bir iğne (20 veya 25 G) moduna geçmek ve iğne (~ 0.5 mm çap) çevirerek lastik deliği genişletmek.
  6. Kontralateral frontal kemik ikinci patlağı oluşturmak için adım 3,3-3,5 tekrarlayın.
  7. Kanama durana kadar PBS sürekli düşmesi ile yaralanan noktalar silin.
    Not: kırık sitelerinde Kanama uygun görüntüleme ile engel ve skar oluşumu neden olacaktır.
  8. Kurumasını önlemek için kafatası üzerinde steril fizyolojik tuzlu su çözeltisi ya da% 2 METHOCEL bir damla uygulanır. Not: görüntü netliğini azaltacak, kafatası yüzey kurumasına izin vermeyin. Bu alanı kapsayacak şekilde jel veya tuz yeterli bir miktarda kullanmak önemlidir.

4. Intravital Görüntüleme

  1. (İsteğe bağlı) görüntüleme önce, bir farenin kan damarları görselleştirmek için bir damar boya ile enjekte edilir. Uygun olmayan bir Qtracker 705 80 m seyreltildi (50 mM borat tamponu içinde 2 uM çözelti) ile 20 ul, retro-orbital enjektePBS l. Reaktif atıkları en aza indirmek için bir insülin şırınga kullanın. Sinyal yeterince parlak değilse, ilave miktarlarda gerekli olabilir.
  2. Tarayıcı açın. Not: Bir çokgen tabanlı lazer tarayıcı bir video hızında eşzamanlı çoklu kanal görüntü alma (saniyede 30 kare) sağlar. Video hız tarama canlı hayvan görüntüleme için çok önemlidir.
  3. (: Safir lazer Femto saniye titanyum) çoklu foton lazer açın. 880 nm dalga boyunu ayarlayın ve kemiğin ikinci harmonik nesil görüntüleme (440 nm) için gücünü ayarlamak. GFP ve tdTomato uyarma, 491 nm ve 561 nm katı hal lazerleri açın.
  4. PMT Her bir sinyal için (photomultiplier tüp) dedektörleri açın (ikinci harmonik üretimi için 435 ± 20 nm band geçiren filtre, GFP için 528 ± 19 nm band geçiren filtre ve tdTomato için 590 ± 20.) (İsteğe bağlı) Qtracker 705 sinyalini algılamak için bir 695 ± 27.5 nm bant geçiren filtre ile 638 nm helyum-neon lazer ve bir PMT kullanın.
  5. PlacBir XYZ-eksen motorize mikroskop sahnede hayvan e. (Bu hayvan kaybı riskini azaltır) vücut ısısını korumaya yardımcı bir elektrikli ısıtma pedi ile en rahat pozisyonda fare tutun. Görüntüleme sırasında hareketini en aza indirmek ve mümkün olduğunca yatay görüntülü alan tutmak için fare tutmak için bant kullanın.
  6. Kurumasını önlemek için kafatası sıcak% 2 metilselüloz jel ya da fizyolojik tuzlu su çözeltisi içinde bir damla uygulanır. Görüntüleme alanında bir cam kapak koyun. Calvaria taramak için (0.9 NA ile 30x su daldırma objektif) bir düşük büyütme lensi kullanın.
  7. XYZ-eksen kontrolörü kullanarak kemiklerden SHG sinyalini algılayarak calvaria yüzeyini bulmak ve bu sagital sütür ve koronal sütür arasındaki kesişme gibi çok önemli bir dönüm noktası konumunu tanımlamak. Jlalınır ve XYZ koordinatlarını kaydetmek.
  8. SHG ve floresan sinyallerini gözlemleyerek yaralanma konumu aramak için devam ediyor.
  9. Yaralanma siteler veya bölge o zamanf ilgi bulunan, ilgi konusu hücrelerden SHG ve floresan sinyalleri içeren en iyi odak düzlemi, bir görüntü elde. Kaydet XYZ koordinatları ve sagital ve koronal sütür kesiştiği için mesafe görüntüleme sonraki tur için kendi hassas konum tanımlamak için.
  10. Kırığı yaralanma 3D hücresel ve kemik yapıları toplamak için Z-yığınlar tarafından görüntü kaydı - Endosteal kemik yüzeyinden ~ 100 mikron derinliğinde (2 5 mikron aralığı). Yaralanma bir tarafının görüntüleme tamamlanmasından sonra, bir sonraki yaralanma siteleri için görüntüleme işlemini tekrarlayın.

5.. Mesaj Operasyon Prosedürleri

  1. Görüntüleme sonra kafatası metilselüloz jel kaldırmak için steril tuz çözeltisi ile görüntüleme sitesi yıkayın. Steril pamuklu çubuk kullanarak, yüzeyde üçlü antibiyotik merhem küçük bir miktar uygulanır. Deri kanatlar örtün ve cerrahi sütür tekniği ile saç derisini yeniden kapatın. Bu bir hipoalerjenik dikiş ipliği (emilebilir Polyglactin su ile yapılabilirTure) ve 5-0 boy dikiş iğnesi. Dikkat: İyi dikiş tekniği skar oluşumunu en aza indirir.
  2. / Kg buprenorfin, 48 saat boyunca her 12 saatte ameliyat sonrası 0.05-0.1 mg IP enjeksiyonu ile tüm hayvanları tedavi. Onlar yeterli bilince geri kazanana kadar sıcak bir kurtarma odasına hayvanları tutmak. 3 ila 5 gün sonra, dikiş yeniden ve kırık iyileşmesi sırasında hücresel değişiklik izlemek için Intravital görüntüleme adımları tekrarlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stabilize uzun kemik kırığı modeli kırık çalışmalarda popüler olmuştur. Ancak, uzun kemik kırığı veya büyük modeller birden fazla doku hasarına neden olabilir ve bu nedenle, kemik hücre fonksiyonu kantitatif ölçümü bir sınırlama var. Biz iğne delme (Şekil 1A-1C) ile kalvarial frontal kemiklerin üzerinde bir minimal invaziv yaralanma (dura mater içine az veya hiç işgali ile en az 1 mm çap) geliştirdi. Bu kemik (diğer dokuların müdahalesi olmadan net yaralı kemik görüntüleme, kemik hücreleri ve damarsal izin, kemik iliği ile düz ve ince kemik yapısına sahiptir çünkü mikro-kırık in vivo canlı görüntüleme için Kalvaryal frontal kemiklerin bir üst görünüşünü seçti Şekil 1C). Bu mikrofraktür mineral birikimi ve yeni kemik oluşumu (veriler gösterilmemiştir), ardından yumuşak bir yara dokusu formasyonu da dahil olmak üzere geniş bir kırılma yaralanma birçok özelliklere tekrarıdır görülmektedir.

MX1 + osteojenik kök progenitör hücrelerin in vivo görüntüleme "> Sıralı. Bu yöntem kırık iyileşmesi sırasında belirli bir osteojenik hücre popülasyonu izleme yeteneğine sahip olup olmadığını Biz sonraki test. Önce, tarafından trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP çift muhabiri fareler geliştirdi Rosa26-Domates muhabir ve osteokalsin-GFP farelerde (Şekil 2A) ile MX1-Cre fareler kapısı 6.. Bu modelin avantajı osteojenik kök / atalarıdır ve olgun osteoblastlar diferansiyel etiketleme olduğunu. PIPC idaresi tarafından, MX1 + OSPCs özel etiketli domates ifade ile, olgun osteoblastlar MX1 kaynaklı OSPCs ayırt oysa Domates ve GFP ifade. MX1 gelen Ancak, önceden varolan osteoblastlar ve olgun osteoblastlar olmayan uyarılabilir atalarıdır (Şekil 2B) yalnız GFP ifade. ışınlama ve kemik iliği değiştirildikten sonra, biz homoBu farelerin frontal kemikler üzerinde iki mikro çatlaklar ×. Her kırık alanı bizim 30x amacı ile görüş tek bir alan tarafından tespit edildiğini doğruladı. Mikro-kırık Sıralı 3D-İntravital görüntüleme günde 2 kırık ve 5. günde kendi genişleme sitesinde Domates + OSPCs tehcir gösterdi. Hiçbir veya belirlenemeyen GFP + osteoblast bu zamanda vardı. 12. günde, kırılma yüzeyine yakın osteoprogenitors bir alt osteoblastlar (Domates + GFP +) farklılaşmasını başlattı. Daha sonra, yeni Osteoblastlann birikimi ve (mavi ikinci harmonik üretimi ile analiz) yeni kemik oluşumu osteogenik progenitör hücrelerin göç ve çoğalması kırık iyileşmesi (Şekil katılan yeni osteoblastları tedarik için önemli bir mekanizma olduğunu belirten, 21. günde belli idi 2C).

Kırık onarım osteojenik kök / atalarıdır kinetiği. Te içinst bizim yöntem kırık iyileşmesi sırasında osteoprogenitör numaraları tutarlı ve kantitatif çıkışı sağlar mı, basit bir soy izleme model olarak Mx1/YFP fare kullanılır ve erken kırık onarımında MX1 + OSPCs izlenir. MX1 + kemik iliği hücreleri vahşi tip iliği tarafından değiştirildi sonra, biz Mx1/YFP fare kafatası üzerinde altı bağımsız mikro çatlaklar (iki / fare) oluşturulur. Mx1/YFP + OSPCs yaralanma sonrası 14 gün boyunca takip edildiğinde, biz sürekli atalarıdır küçük sayılar tarafından 3 gün yaralanma yerinde tespit edildiği gözlenmiştir. Sayılar sürekli olarak 10. günde en yüksek nüfus ulaşan ve 14 gün (Şekil 3A) ile sürdürmek, 7. günde artmıştır. Biz YFP sinyal yoğunluğu (görüntü işleme ve ImageJ programı ile analiz) ölçerek osteoprogenitör sayılar kinetik sayılabilir. Biz bizim yaklaşımımız (Şekil 3B) tutarlılık düşündüren, benzer bir çıkışı ile bu deneyi tekrarladı.

ss = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Şekil 1
Fare (CS) koronal ve sagital sütür (SS) ve ardışık Intravital görüntüleme kavşak yakınında fare frontal kemikler üzerinde mikro-kırık Şekil 1.. In vivo fare Kalvaryal yaralanma görüntüleme. (A) şematik gösterimi. (B) Cerrahi maruziyet kalvari yaralanma önce. (C) Intravital görüntüleme için fare kafatası üzerinde Temsilcisi mikrofraktür yaralanmalar. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

51289fig2.jpg "/>
Trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP fare Şekil 2.. Yaralanma sitelerinde OSPCs in vivo izleme. (A) şematik gösterimi. (B) Bu diyagram trigenic Mx1/Tomato yaralanması sitelerinde görünmesini mümkün floresan hücre popülasyonları gösterir / Ocn-GFP fare. Kırmızı Domates ifade MX1 + OSPCs temsil eder. Sarı yeşil önceden var olan osteoblastlar (GFP +) ya da uyanlabilir MX1 olmayan (MX1 -) yeni osteoblastlar temsil etmektedir MX1 + OSPCs farklılaşmış olgun osteoblastlar (Domates GFP + +) göstermektedir. Progenitorlar MX1 OSPCs + (C) Sıralı intravital görüntüleme ve yaralanma sitelerinde osteoblastlar. Domates + osteoprogenitors ve Mx1/Tomato/Ocn-GFP fare kafatası üzerinde yaralanma yakın GFP + osteoblast hemen yaralanma (gün 0) sonra t görüntülendiO yaralanma sonrası kez göstermektedir. Oklar MX1 + OSPCs (sarı) türetilen osteoblastları göstermektedir. Mavi, kemik. Noktalı daire tüm (tek) kırık bölgesini temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3.. Kırık iyileşmesi sırasında MX1 kaynaklı OSPCs tutarlı ve kantitatif ölçümü. (A) Mx1/YFP fare kafatası üzerinde üç bağımsız Sakatlıklar sırayla hemen yaralanma (gün 0) sonra ve yaralanma sonrası belirtilen zamanlarda görüntülendi. (B) Kantitatif MX1 + osteojenik kök / progenitör hücrelerin ölçümü. MX1 + OspC kinetiğiyaralanma sitelerinde genişletme ImageJ kullanarak YFP sinyal yoğunluğu ölçüldü. Grafikler, her bir deney içinde altı yaralanma ortalama iki bağımsız deney gösterir. Mavi, kemik; yeşil, MX1 + osteojenik kök / progenitör hücreleri; kırmızı, damar (Q-nokta). Ölçek çubukları 100 mikron (A) vardır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Iskelet kök hücrelerin düzenlenmesi kemik rejenerasyonu elde etmek için daha iyi yöntemler tanımlanması için büyük önem olabilir. Hücresel düzeyde nicel ve sıralı görüntüleme teknik açıdan zorlayıcı olmuştur. Fare uzun kemik kırığı modeli yaygın olarak kullanılan ve biyomekanik çalışmalar 17 için uygun olmasına rağmen, derin doku konumu, düzensiz kırık boyutu, yumuşak doku hasarı ve stabilize fiksatör uygulama sıralı Intravital görüntüleme sınırlıdır. Burada, konfokal / iki foton intravital mikroskopi ve bir fare kalvaryal kırılma modeli kombinasyonu ile, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için bir yöntem sağlanmaktadır. Osteojenik kök / progenitör soy takibi ile bu yaklaşım, kırık onarımında osteojenik kök / atalarıdır in vivo görüntüleme, gerçek zamanlı kapasitesini göstermektedir.

Bu yöntemde önemli bir teknik sorun zamanla tutarlı ve yüksek kaliteli görüntüler elde etmektir. Yüksek kaliteli immaksimum görüntüleme derinliği ile yaşları floresan gazetecilere ve görüntüleme alanının doku durumun parlaklığına bağlıdır. Buna ek olarak, doku hasarı ve photobleaching önlemek için laser maruz kalmayı minimuma indirerek uzun süreli sıralı görüntüleme için önemlidir. Video oranı platformunu kullanarak hızlı tarama, bu amaç için yararlı olduğunu. Görünümünde bir tek alan bütün hasarı kapsamaz yapamıyorsanız, bölge kırık sitelerin çoğunu kapsayacak montaj görüntüleri alarak eşlenebilir. Bu Z-yığını kalitesi ve tüm görüntüleme oturumu sırasında edinilen bilgilerin miktarı arasında uzlaşma önemlidir. Örneğin, birçok dilimleri (örneğin 1-2 um adımlar) ve yüksek çözünürlüklü Z-yığınları daha fazla analiz etmek daha kolaydır; ancak, lazer kaynaklı ışıkla ağartma daha yüksek bir derecesi için uzun vadeli bir lazer maruz gerektirir.

Kırık yaralanma in vivo görüntüleme ardışık deri ve kemik yüzeyinin tekrarlanan cerrahi açılmasını gerektirir, bu yanacalvaria yüzeyinde fibrotik skar oluşumu derin doku görüntüleme keser ve yüksek arka plan floresans verimleri yaygın bir sorundur. Nitelikli sütür teknikleri ve minimum kanama skar oluşumunu azaltmak için çok önemlidir. Genel olarak, 3-5 kez tekrar görüntüleme görüntü kalitesi önemli bir kayıp olmadan elde edilebilir.

Tekrar görüntüleme, kırık boyutu, kolay ve tam kontrol ve onarım kinetik tutarlılık olasılığı göz önüne alındığında, bu yöntem, kırık iyileşmesi, osteoporoz ve iskelet kası gibi diğer doku rejenerasyonu için terapötik hedefleri test etmek için uygun bir araç sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali İlgi olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Biz el yazması okumak için C. Park teşekkür ederim. Bu çalışma Ödül sayısı K01AR061434 ve DP'ye bir Lösemi ve Lenfoma Derneği Bursu Ödülü (5127-09) altında NIAMS tarafından desteklenen ve içeriği CPL ve DTS için Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe değil sadece yazarların sorumluluğundadır ve yok edildi mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).

Tags

Tıp Sayı 87 Osteojenik Kök Hücreler, Lineage izleme Kemik rejenerasyonu Kırık onarım MX1.
Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C.… More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter