Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

تسلسلي doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

القياس الكمي وظيفة السلف العظام في كسر الشفاء يتطلب عالية الدقة تكنولوجيا التصوير المسلسل. هنا، وتقدم بروتوكولات لاستخدام intravital المجهري وتتبع أستيو-النسب بالتسلسل الصورة وتحديد الهجرة وانتشارها وتمايز الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم الذاتية في عملية إصلاح كسور العظام.

Abstract

العظام يقلب باستمرار والتجدد للغاية بعد الاصابة. منذ فترة طويلة تم الافتراض الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم في الوجود، ولكن في مظاهرة المجراة من مثل هذه الخلايا مؤخرا فقط تم تحقيقه. هنا، يتم توفيرها في الجسم الحي تقنيات التصوير للتحقيق في دور الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم الذاتية (OSPCs) وذريتها في إصلاح العظام. باستخدام الخلايا أستيو-النسب تتبع نماذج وintravital التصوير من microfractures يتسبب في العظام قبي، OSPCs يمكن ملاحظتها مباشرة خلال الأيام القليلة الأولى بعد الإصابة، التي تحدث الأحداث الحاسمة في عملية الإصلاح في وقت مبكر. مواقع الإصابة يمكن تصويرها بالتتابع كاشفا أن OSPCs الانتقال إلى الإصابة، وزيادة في عدد وتفرق في العظام تشكيل بانيات. هذه الطرق توفر وسيلة للتحقق في دور المنظمين الجزيئية الخلايا الجذعية الذاتية وخارجي لتجديد وإصلاح العظام.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أمراض العظام التنكسية وفقدان العظام المرتبطة بالعمر مما يؤدي إلى ارتفاع مخاطر الاصابة بكسور هشاشة العظام أصبحت تشكل تحديا رئيسيا في مجال الصحة العامة 1. يتم التحكم بواسطة بانيات العظم الصيانة تشكيل العظام والخلايا الآكلة-resorbing العظام. عيوب تشكيل خلايا العظام هي السبب الرئيسي للالمرتبطة بالعمر فقدان العظام وأمراض العظام التنكسية 2،3. في حين ركزت بحوث واسعة النطاق على تحسين كسر الشفاء، واكتشاف العقاقير يمكن الاعتماد عليها لعلاج أمراض العظام التنكسية وعكس ضعف الكسور لا تزال مسألة هامة. وبالتالي، ودراسة مصدر خلايا العظام تشكيل وآليات الرقابة في تجديد وإصلاح العظام يوفر نظرة جديدة لتعزيز تجديد الهيكل العظمي وأمراض فقدان العظام عكس.

وقد اقترح وجود خلايا اللحمة المتوسطة متعددة القدرات في نقي العظام على أساس تحديد السكان مولد الرمع التي يمكن مختلفةIATE إلى المكونة للعظم، الأنساب مكون الشحم ومكون للغضروف فيفو السابقين 4. في الآونة الأخيرة، وأفادت الدراسات أن الخلايا الجذعية متعددة الهيكل العظمي / الوسيطة (جان معايير الأمان / اللجان الدائمة) هي مصدر طبيعي للبانيات وبالغة الأهمية بالنسبة لدوران العظام، يعيد البناء، وإصلاح الكسر 5،6 . بالإضافة إلى ذلك، كشفت دراستنا لتعقب النسب التي بانيات ناضجة لديها نصف حياة قصيرة بشكل غير متوقع (~ 60 يوما)، وتتجدد باستمرار عن طريق الخلايا الجذعية / السلف بهم في كل الظروف التماثل الساكن وإصلاح الكسر العادي 6. ومع ذلك، فإن الهوية في الجسم الحي من الخلايا الجذعية وكيف يمكن لهذه الخلايا تستجيب لكسر الإصابة وتزويد الخلايا المكونة للعظم غير واضحة. وبالتالي، فمن المهم وضع طريقة التي هي قادرة على تحليل الهجرة وانتشارها وتمايز جان معايير الأمان الذاتية / اللجان الدائمة في ظل الظروف الفسيولوجية.

إصلاح الكسر هو عملية متعددة الخلايا والحيوية التي تنظمها مجموعة معقدةالسيتوكينات وعوامل النمو 7. النهج الأكثر شعبية بالنسبة للدراسات الكسر هو استخدام نموذج حيواني مع كسور العظام الطويلة وتحليل العظام بواسطة باجتزاء العظام وتقنيات مناعي 8-10. يمكن رصد هذه العملية إصلاح بواسطة تقنيات متعددة بما في ذلك التصوير الجزئي-CT 11، الأشعة تحت الحمراء القريبة مضان 12، ومعان كيميائي التصوير 13. ومع ذلك، كل أسلوب له حدود معينة وكان هناك أي وسيلة فعالة لرصد وظيفة جان معايير الأمان / MSC على المستوى الخلوي في الجسم الحي. مؤخرا، تم تطوير متحد البؤر / ثنائي الفوتون intravital المجهري وتستخدم للكشف عن الخلايا السرطانية المزروعة والخلايا الجذعية المكونة للدم في سياق بهم المكروية نخاع العظم حتى في القرار وحيدة الخلية في الحيوانات الحية 14. من خلال الجمع بين هذه التكنولوجيا مع سلسلة من النسب نماذج البحث عن المفقودين، وكنا قادرين على تحديد أن الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف يمكن أن تكون علامة وراثيا من قبل ميلان عابرةtivation للمقاومة فيروس مخاطي -1 (MX1) المروج والأسلاف التي يسببها MX1 يمكن الحفاظ على أغلبية بانيات نضجا مع مرور الوقت ولكن لا تشارك في توليد غضروفية في الماوس الكبار 6. بالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن OSPCs MX1 المسمى تزويد غالبية بانيات جديدة في كسر الشفاء 6.

هنا، وذلك باستخدام نماذج تتبع أستيو-النسب وintravital المجهري، يتم توفير بروتوكول لتحديد حركية في الجسم الحي من MX1 + الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم في إصلاح الكسر. هذا البروتوكول يوفر التصوير المتتابع لتتبع نقل المكونة للعظم الساق / الأسلاف إلى مواقع الكسر والقياس الكمي للتوسع سليفة العظمية في عملية الإصلاح في وقت مبكر. قد يكون هذا النهج مفيدا في سياقات متعددة بما في ذلك تقييم المرشحين العلاجية لتحسين إصلاح العظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. الفئران وشروط مسبقة

ملاحظة: تم الحفاظ على جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في مستشفى ماساتشوستس العام. يجب أن يتم تنفيذ كل العمليات الجراحية تحت ظروف معقمة باستخدام معدات معقمة تعقيمها. MX1-15 لجنة المساواة العرقية،-توقف loxP-EYFP Rosa26 loxP (روزا-YFP)، و-توقف loxP-tdTomato Rosa26 loxP (روزا-الطماطم)، و تم شراؤها من معامل جاكسون. قدمت الفئران أوستيوكالسين-GFP الدكتور هنري كرونينبرج. للتحليل الكمي للهجرة OSPC والانتشار في الجسم الحي، واستخدمت لجنة المساواة العرقية MX1-+ روزا-YFP + (لون واحد، مراسل) الفئران. لتتبع أكثر تفصيلا من التمايز بهم في أوستيوكالسين + تنضج بانيات، استخدمنا trigenic MX1-+ لجنة المساواة العرقية روزا-الطماطم + صور +-GFPالفئران.

  1. لتسمية MX1 + الخلايا في الجسم الحي، وإعداد حمض polyinosinic-polycytidylic (pIpC، 2.5 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني العقيمة الحل وحقن 200 ميكرولتر لمدة 20 غرام من MX1-+ لجنة المساواة العرقية مراسل الماوس الغشاء البريتونى مرة واحدة كل يوم لمدة 10 يوما.
  2. للقضاء على الخلايا المكونة للدم MX1 + المقيمين، أشرق الفئران بجرعة واحدة من 9.5 غراي. بعد 24 ساعة من التشعيع، زرع نوع البرية خلايا نخاع العظام (الخلايا 1x10 6 / الماوس) عن طريق الوريد 16. ملاحظة: منذ خلايا MX1-محرض تشمل الخلايا المكونة للدم والخلايا الآكلة المستمدة المكونة للدم، والقضاء على MX1 + الخلايا المكونة للدم يحسن من جودة التصوير والكميات من الخلايا المكونة للعظم MX1 +.
  3. بعد زرع نخاع العظام، ومراقبة الحيوانات لمدة أربعة إلى ستة أسابيع من أجل تحقيق النجاح في إعادة تعمير خلايا نخاع المانحة.

2. مواستخدام إعداد

  1. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من 50 ميكرولتر من الكيتامين / زيلازين (100 ملغ / كغ، زيلازين 12 ملغ / كغ من وزن الجسم) باستخدام إجراء الموافقة IACUC. ملاحظة: مدة تأثير يمكن تمديدها جرعة إضافية من الكيتامين / زيلازين.
  2. تحديد ما إذا كان الفأر هو تخدير كامل بسبب عدم وجود استجابة إلى أخمص القدمين و / أو القرصات الذيل. (اختياري) عند الفأر هو تخدير، وتأمين قناع الغاز isoflurane وعلى الأنف عن طريق تسجيل. ضبط مستوى isoflurane ولضمان مخدرا الحيوان بالكامل.
  3. مقطع شعر فروة الرأس باستخدام الانتهازي الكهربائية أو مقص صغير. إزالة شظايا الشعر وتعقيم الجلد يتعرض مع 70٪ مسحة الكحول. تطبيق هلام المسيل للدموع لمنع الجفاف القرنية.

3. إصابة الكسر

  1. بعد التأكد من ومخدرا تماما الحيوان، وجعل واحدة العكسي على شكل حرف L لفتح شق الجلد فروة الرأس. لفترة وجيزة، وجعل أول شق عرضية (أقل من 1 سم) startiنانوغرام من الأذن إلى الأذن واحد آخر. بدوره ~ 60 درجة والاستمرار في شق نحو الأنف حتى ~ 2-3 ملم بعيدا عن الأنف. ملاحظة: هذا شق يقلل من تكوين الأنسجة ندبة فوق المنطقة المراد تصويرها.
  2. فصل اللوحات الجلد عن طريق سحب نحو الجانبين بالملقط. كلا العظام الأمامية وتقاطع الخيوط السهمي والإكليلي ينبغي أن يتعرض بوضوح.
  3. تنظيف السطح مفتوحة من قبل بيغ مع برنامج تلفزيوني العقيمة ومحو لطيف مع معقمة الشاش أو القطن مسحات حتى يتم القضاء على جميع الشعرات المتبقية.
  4. لتوليد microfractures على calvarium، عقد رئيس الفأر مع يد واحدة وإبرة G 30 مع جهة أخرى. جعل ثقب الدقيقة (~ 0.2 مم الجرح مع <1 مم العمق) على العظم الجبهي تركت بالقرب من تقاطع الخيوط السهمي والإكليلي عن طريق إدراج غيض من إبرة 30 G مع ضغط لطيف والتواء الحركة. الحذر: إنه أمر بالغ الأهمية لتجنب الإبرة من اختراق في الدماغ، وبالتالي تقليل bleediنانوغرام وتلف الأنسجة.
  5. التبديل إلى إبرة أكبر (20 أو 25 G) وتوسيع ثقب ثقب الإبرة من قبل التواء (~ 0.5 مم).
  6. كرر الخطوة 3،3-3،5 لتوليد ثقب الثانية على الجبهي العظم المقابل.
  7. تمحو البقع أصيب إسقاط المستمر من برنامج تلفزيوني حتى يتوقف النزيف.
    ملاحظة: سوف نزيف في مواقع كسر تتداخل مع التصوير المناسبة وتحفز تشكيل ندبة.
  8. تطبيق قطرة من محلول ملحي معقم الفسيولوجية أو 2٪ Methocel على الجمجمة لتجنب التجفيف. ملاحظة: لا تسمح للسطح الجمجمة لتجف، الأمر الذي سيقلل من وضوح الصورة. من المهم أن استخدام كمية كافية من هلام أو المالحة لتغطية المنطقة.

4. intravital التصوير

  1. (اختياري) قبل التصوير، ويتم حقن بعض الفئران مع صبغة الأوعية الدموية لتصور الأوعية الدموية. حقن الرجعية orbitally مع 20 ميكرولتر من غير المستهدفة Qtracker 705 (2 ميكرومتر حل في 50 ملي العازلة بورات) مخففة في 80 ملتر من برنامج تلفزيوني. استخدام حقنة الانسولين لتقليل النفايات كاشف. إذا كانت إشارة ليست مشرقة بما فيه الكفاية، قد تكون هناك حاجة مبالغ إضافية.
  2. تشغيل الماسح الضوئي. ملاحظة: A الماسح الضوئي بالليزر على أساس المضلع يسمح الحصول على الصور في وقت واحد متعدد القنوات في معدل الفيديو (30 لقطة في الثانية). المسح معدل الفيديو مهم جدا لتصوير الحيوانات الحية.
  3. بدوره على الليزر متعددة الفوتون (فيمتو ثانية والتيتانيوم: ليزر الياقوت). تعيين الطول الموجي إلى 880 نانومتر، وضبط السلطة لجيل التوافقي الثاني التصوير (440 نانومتر) من العظام. لGFP وtdTomato الإثارة، بدوره على نانومتر 491 و 561 نانومتر ليزر الحالة الصلبة.
  4. بدوره على PMT (أنبوب مضخم) كشف لكل إشارة (أ 435 ± 20 نانومتر تصفية الفرقة تمريرة لتوليد التوافقي الثاني، وهو 528 ± 19 نانومتر تصفية الفرقة تمريرة لGFP، و 590 ± 20 لtdTomato.) (اختياري) استخدام 638 نانومتر ليزر الهليوم نيون وPMT مع 695 ± 27.5 نانومتر الفرقة تمرير تصفية للكشف عن Qtracker 705 إشارة.
  5. PLACالبريد الحيوان على XYZ محور المسرح المجهر آلية. الحفاظ على الماوس في موقف أكثر راحة مع وسادة التدفئة الكهربائية للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الجسم (وهذا يقلل من مخاطر الخسارة الحيوان). استخدام شريط لعقد الماوس لتقليل الحركة أثناء التصوير وللحفاظ على المنطقة التي جرى تصويرها كما الأفقي وقت ممكن.
  6. تطبيق قطرة من الحارة 2٪ هلام ميثيل أو محلول ملحي الفسيولوجية على الجمجمة لتجنب التجفيف. وضع غطاء زجاجي على منطقة التصوير. استخدام عدسة التكبير المنخفض (30X الهدف الغمر بالمياه مع 0.9 NA) لمسح calvaria.
  7. باستخدام وحدة تحكم XYZ محور، والعثور على سطح calvaria عن طريق الكشف عن إشارة SHG من العظام وتحديد الموقع التاريخي الحاسم، مثل التقاطع بين الغرز السهمي والغرز الاكليلية. الحصول على صورة وتسجيل إحداثيات XYZ.
  8. مواصلة البحث عن مكان الإصابة من خلال مراقبة مجموعات المساعدة الذاتية ومضان إشارات.
  9. عندما مواقع الإصابة أو المنطقة ستم العثور على الفائدة و، والحصول على صورة من أفضل البؤري التي تحتوي على مجموعات المساعدة الذاتية وإشارات مضان من الخلايا في المصالح. حفظ XYZ إحداثيات والمسافة إلى تقاطع الخيوط السهمي والإكليل لتحديد موقعها الدقيق للجولات المقبلة من التصوير.
  10. لجمع الهياكل الخلوية والعظام 3D الإصابة بكسور، تسجيل صور بواسطة Z-المداخن (2-5 الفاصل ميكرون) مع ~ 100 ميكرومتر عمق من سطح العظام بطانة العظم. بعد الانتهاء من التصوير من جانب واحد من الإصابة، وتكرار عملية التصوير لمواقع الإصابة المقبل.

إجراءات 5. عملية مشاركة

  1. بعد التصوير، وشطف موقع التصوير مع محلول ملحي معقم لإزالة هلام من ميثيل الجمجمة. باستخدام قطعة من القطن المعقم، وتطبيق كمية صغيرة من مرهم مضاد حيوي الثلاثي على السطح. تغطية اللوحات الجلد وإعادة إغلاق-فروة الرأس عن طريق خياطة الجراحية. ويمكن أن يتم هذا مع موضوع خياطة هيبوالرجينيك (polyglactin امتصاص سوتلح) و 5-0 حجم خياطة الإبرة. الحذر: تقنية خياطة جيد يقلل من تشكيل ندبة.
  2. علاج جميع الحيوانات مع حقن IP من 0.05-0.1 ملغ / كغ كل 12 ساعة البوبرينورفين لمدة 48 ساعة بعد الجراحة. الحفاظ على الحيوانات في غرفة الإنعاش دافئ حتى يستعيد وعيه كافية. بعد 3 إلى 5 أيام، إعادة فتح الدرز وكرر الخطوات intravital التصوير لتتبع التغيير الخلوية خلال كسر الشفاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كان طويل نموذج كسر العظام استقرت شعبية في الدراسات الكسر. ومع ذلك، والعظام الطويلة أو نماذج كسر كبيرة يسبب تلف الأنسجة المتعدد، وبالتالي، لديها قيود في القياس الكمي للوظيفة الخلية العظام. وضعنا اصابة الغازية الحد الأدنى (أقل من 1 مم مع الحد الأدنى أو أي غزو في الأم الجافية) على العظام الأمامية قبي مع الحفر إبرة (أرقام 1A-1C). اخترنا وجهة نظر العلوي من عظام الجبهي لقبي في الجسم الحي التصوير الحي من microfractures لأن هذا العظم لديها بنية العظام المسطحة ورقيقة مع نخاع العظام، مما يتيح التصوير واضح من العظم المصاب، وخلايا العظام، والأوعية الدموية دون تدخل من الأنسجة الأخرى ( الشكل 1C). لاحظنا أن هذا الكسر الدقيق يلخص خصائص العديد من الإصابات كسر كبيرة بما في ذلك تشكيل الكالس لينة تليها ترسب المعادن وتكوين العظام الجديدة (لا تظهر البيانات).

"> متسلسل في مجال التصوير المجراة من MX1 الخلايا المكونة للعظم + السلف الجذعية. اختبرنا المقبل ما إذا كان هذا الأسلوب هو قادر على تتبع معين السكان الخلية المكونة للعظم كسر أثناء الشفاء. سابقا، قمنا بتطوير trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP الفئران مراسل مزدوج من قبل عبور الفئران MX1-لجنة المساواة العرقية مع مراسل Rosa26-الطماطم والفئران أوستيوكالسين-GFP (الشكل 2A) 6. وميزة هذا النموذج هو وضع العلامات التفضيلية للالمكونة للعظم الساق / الأسلاف وبانيات ناضجة. بواسطة إدارة pIpC، وصفت MX1 + OSPCs تحديدا من التعبير الطماطم، في حين بانيات ناضجة متباينة من OSPCs MX1 التي يسببها التعبير عن الطماطم وGFP. ومع ذلك، بانيات موجودة من قبل وبانيات ناضجة من MX1 الأسلاف غير محرض التعبير عن GFP وحدها (الشكل 2B). بعد التشعيع واستبدال نخاع العظام، ونحن ينايرated اثنين microfractures على العظام الأمامية من هذه الفئران. أكدنا أن تم الكشف عن مساحة كل كسر من قبل حقل واحد من عرض مع هدفنا 30X. أظهرت متتابعة-3D حيوي داخلي تصوير microfractures نقل الطماطم + OSPCs في موقع الكسر في يوم 2 وتوسعها في اليوم 5. لم تكن هناك لا يمكن الكشف عنها أو GFP + بانيات في هذا الوقت. في يوم 12، مجموعة فرعية من osteoprogenitors بالقرب من سطح الكسر بدأ تمايز الخلايا بانية العظم (الطماطم + GFP +). في وقت لاحق، كان تراكم الخلايا بانية العظم الجديد وتشكيل العظام الجديدة (تحليلها من قبل الجيل الثاني التوافقي والأزرق) واضحة في اليوم 21، مشيرا إلى أن الهجرة وانتشار الخلايا الاصلية المكونة للعظم هو آلية رئيسية لتزويد بانيات الجديدة المشاركة في كسر الشفاء (الشكل 2C).

حركية المكونة للعظم الساق / الأسلاف في إصلاح الكسر. إلى الشركة المصرية للاتصالات شارع سواء أسلوبنا يوفر خرج متسقة والكمي لأعداد سليفة العظمية خلال كسر الشفاء، استخدمنا Mx1/YFP الماوس كنموذج نسب بسيطة تتبع وتعقب MX1 + OSPCs في إصلاح كسر في وقت مبكر. بعد أن تم استبدال خلايا نخاع MX1 + حسب نوع البرية نخاع، ونحن ولدت ستة microfractures المستقلة (اثنين / الماوس) على Mx1/YFP calvaria الماوس. عندما كانت تتبع Mx1/YFP + OSPCs لمدة 14 أيام بعد الإصابة، لاحظنا باستمرار أن تم الكشف عن أعداد صغيرة من الأسلاف في موقع الإصابة بنسبة 3 أيام. زيادة أعداد مستمر في يوم 7، وبلغ عدد السكان الذروة في اليوم 10 وإدامة قبل 14 يوما (الشكل 3A). نحن كميا حركية أرقام سليفة العظمية عن طريق قياس كثافة إشارة YFP (معالجة الصور وتحليلها مع برنامج يماغيج). كررنا هذه التجربة مع إخراج مشابه، مما يشير إلى اتساق نهجنا (الشكل 3B).

ق ق = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. في الجسم الحي التصوير من الماوس إصابة قبي (أ) تمثيل تخطيطي للmicrofractures على العظام الأمامية الماوس بالقرب من تقاطع الغرز الاكليلية (CS) والسهمي (SS) وintravital التصوير المتتابع. (B) التعرض الجراحية من الماوس calvaria قبل الاصابة. (C) إصابات الكسر الدقيق الممثل على calvaria الماوس لintravital التصوير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

51289fig2.jpg "/>
الرقم 2. في الجسم الحي تتبع OSPCs في مواقع الإصابة. (A) تمثيل تخطيطي للtrigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP الماوس. (B) يوضح هذا الرسم البياني السكان الخلية الفلورسنت الممكن أن تظهر في مواقع إصابة trigenic Mx1/Tomato / صور-GFP الماوس. يمثل الحمراء MX1 + OSPCs معربا عن الطماطم. الأصفر يمثل بانيات ناضجة (الطماطم + + GFP) متباينة من MX1 + OSPCs في حين يمثل اللون الأخضر بانيات جديدة من بانيات الموجودة من قبل (GFP +) أو MX1 غير محرض (MX1 -). الأسلاف (C) intravital التصوير متسلسل من MX1 + OSPCs وبانيات في مواقع الإصابة. تم تصوير الطماطم + osteoprogenitors وGFP + بانيات بالقرب من إصابة على Mx1/Tomato/Ocn-GFP calvaria الماوس مباشرة بعد الإصابة (يوم 0) وعلى رأشار مرات بعد الاصابة. السهام تشير بانيات المستمدة من MX1 + OSPCs (الصفراء). الأزرق والعظام. يمثل الدائرة المتقطعة كامل (واحد) موقع الكسر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. قياس اتساقا والكمي لOSPCs MX1 التي يسببها كسر أثناء الشفاء. (A) ثلاثة إصابات المستقلة على Mx1/YFP calvaria الماوس تم تصويرها بشكل تسلسلي مباشرة بعد الإصابة (يوم 0)، وفي الأوقات المحددة بعد الاصابة. (B) الكمي قياس MX1 + الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم. حركية MX1 + OSPCوقد تم قياس التوسع في مواقع الإصابة بواسطة YFP كثافة إشارة باستخدام يماغيج. تظهر الرسوم البيانية تجربتين مستقلة مع متوسط ​​ستة إصابات في كل تجربة. الأزرق والعظام؛ ، MX1 + الخلايا الجذعية / السلف المكونة للعظم الخضراء؛ الأحمر والأوعية الدموية (Q-نقطة). أشرطة النطاق هي 100 ميكرون (A). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تنظيم الخلايا الجذعية الهيكل العظمي قد تكون ذات أهمية كبيرة لتحديد أفضل الطرق لتحقيق تجديد العظام. وقد تم التصوير الكمي ومتتابعة على المستوى الخلوي تحديا تقنيا. على الرغم من أن الماوس العظام الطويلة نموذج الكسر قد استخدمت على نطاق واسع ومناسبة للدراسات النشاط الحيوي 17، وموقعها الأنسجة العميقة، متفاوتة الحجم كسر، تلف الأنسجة الناعمة، وتطبيق التبعي استقرار حدت intravital التصوير المتتابع. هنا، يتم توفير وسيلة للتغلب على هذه القيود من خلال مزيج من متحد البؤر / ثنائي الفوتون intravital المجهري والفأر نموذج كسر قبي. هذا النهج مع المكونة للعظم تتبع الجذعية / السلف النسب يوضح قدرته في الوقت الحقيقي، في مجال التصوير المجراة من الجذعية المكونة للعظم / الأسلاف في إصلاح الكسر.

ويتمثل أحد التحديات التقنية الرئيسية في هذه الطريقة للحصول على صور عالية الجودة بما يتفق وعلى مر الزمن. جودة عالية ايمالأعمار مع أقصى عمق التصوير تعتمد على سطوع صحفيين الفلورسنت وحالة الأنسجة من منطقة التصوير. بالإضافة إلى ذلك، والتقليل من التعرض الليزر لتجنب تلف الأنسجة وphotobleaching من المهم للتصوير متتابعة طويلة الأجل. المسح السريع باستخدام منصة معدل الفيديو هو مفيد لهذا الغرض. إذا كان حقل واحد من عرض لا يمكن أن تغطي إصابة كله، ومنطقة يمكن تعيينها عن طريق اتخاذ الصور المونتاج لتغطية معظم المواقع الكسر. من المهم التوصل الى حل وسط بين جودة Z-مكدس وكمية المعلومات المكتسبة خلال الدورة التصوير كله. على سبيل المثال، Z-مداخن مع العديد من شرائح (على سبيل المثال 1-2 ميكرون الخطوات) وعالية الوضوح هي أسهل لمزيد من التحليل؛ ومع ذلك، فإنها تتطلب التعرض الطويل الأجل الليزر مما يؤدي إلى درجة أعلى من photobleaching من الليزر التي يسببها.

منذ متتابعة في مجال التصوير المجراة من إصابة كسر يستلزم افتتاح الجراحية المتكررة من الجلد وسطح العظم،تشكيل ندبة متليفة على سطح calvaria مشكلة شائعة أن يقطع التصوير الأنسجة العميقة وينتج عالية الإزهار الخلفية. تقنيات خياطة ماهرة والحد الأدنى من النزيف أمر بالغ الأهمية للحد من تشكيل ندبة. بشكل عام، لا يمكن أن يتحقق الساعة 04:57 تكرار التصوير دون خسارة كبيرة في جودة الصورة.

نظرا لإمكانية تكرار التصوير، ومراقبة سهلة ودقيقة لحجم الكسر واتساق حركية الإصلاح، ويمكن هذا الأسلوب يوفر وسيلة معقولة لاختبار الأهداف العلاجية للشفاء الكسر، وهشاشة العظام، وغيرها من تجديد الأنسجة مثل العضلات والهيكل العظمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أن لديهم أي تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

نشكر جيم بارك لقراءة المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل NIAMS تحت رقم K01AR061434 جائزة وجائزة اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية جمعية زمالة (5127-09) لموانئ دبي والمنح من المعاهد الوطنية للصحة لCPL و DTS المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تعبر بالضرورة عن وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
تسلسلي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف خلال اصلاح الكسر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter