Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Sekventiel doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

Kvantitativ måling af knogle stamfader funktion i frakturheling kræver høj opløsning seriel imaging-teknologi. Her bliver protokoller indeholdt bruge intravital mikroskopi og osteo-slægt sporing sekventielt billedet og kvantificere migration, spredning og differentiering af endogene osteogene stamceller / stamceller i færd med at reparere knoglebrud.

Abstract

Bone vender løbende og er stærkt regenerativ efter skade. Osteogene stamceller / stamceller har længe været en hypotese at eksistere, men in vivo demonstration af sådanne celler er først for nylig er nået. Her er in vivo imaging teknikker til at undersøge, hvilken rolle af endogene osteogene stamceller / stamceller (OSPCs) og deres afkom i knogle reparation forudsat. Brug osteo-afstamning celle opsporing modeller og intravital billeddannelse af inducerede mikrobrud i calvarie knogle kan OSPCs observeres direkte i løbet af de første par dage efter skaden, hvor kritiske hændelser i det tidlige reparationen forekomme. Skader sites kan sekventielt filmede afslører, at OSPCs flytte til skaden, stige i antal og differentierer til knogledannende osteoblaster. Disse metoder giver et middel til at undersøge betydningen af ​​stamcelle-indre og ydre molekylære regulatorer til knogle regenerering og reparation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Degenerative knogle sygdomme og aldersrelateret knogletab, der fører til en høj risiko for osteoporotisk fraktur er blevet en stor udfordring for folkesundheden 1.. Bone vedligeholdelse styres af knogledannende osteoblaster og knogleresorberende osteoklaster. Fejl af knogledannende celler er en hovedårsag til aldersrelateret knogletab og degenerative knoglesygdomme 2,3. Mens omfattende forskning har fokuseret på forbedring af frakturheling, til opdagelsen af ​​pålidelige lægemidler helbrede degenerative knogle sygdomme og til at vende den svage knoglebrud fortsat et vigtigt emne. Således studere kilden til knogledannende celler og deres kontrolmekanismer i knogleregenerering og reparation giver en roman indsigt at forbedre skelet regenerering og ophæve knogletab sygdomme.

Er blevet foreslået Eksistensen af ​​multipotente mesenchymalceller i knoglemarven baseret på identifikation af klonogene befolkninger, der kunne anderledesIATE i osteogent, Adipogeniske og chondrogene slægter ex vivo 4.. nylig, flere undersøgelser har rapporteret, at skelettet / mesenkymale stamceller (SSC'erne / MSC) er en naturlig kilde af osteoblaster og er afgørende for knogleomsætningen, ombygning og frakturreparation 5,6 . Desuden er vores slægt-tracing undersøgelse viste, at modne osteoblaster har en uventet kort halveringstid (~ 60 dages) og bliver kontinuerligt fyldt med deres stamceller / stamceller i både normale homeostatiske og fraktur reparation vilkår 6. Imidlertid in vivo identitet stamceller og hvordan sådanne celler reagerer til at bryde skade og levere knogledannende celler er uklare. Derfor er det vigtigt at udvikle en metode, der er i stand til at analysere migration, spredning og differentiering af endogene SSC'erne / MSC i under fysiologiske forhold.

Frakturreparation er en multi-cellulær og dynamisk proces reguleres af en række kompleksecytokiner og vækstfaktorer 7. Den mest populære metode til frakturer studier er at bruge en dyremodel med lange knoglebrud og analysere knogler af knogle sektionering og immunfluorescerende teknikker 8-10. Denne reparation proces kan overvåges af flere billeddannelsesteknikker, herunder mikro-CT 11, nær-infrarød fluorescens 12 og kemiluminescens billeddannelse 13. Men hver teknik har visse begrænsninger, og der har ikke været nogen effektiv måde at overvåge SSC'erne / MSC-funktion på det cellulære niveau in vivo. For nylig har konfokal / to-foton intravital mikroskopi blevet udviklet og anvendt til at detektere transplanterede cancerceller og hæmatopoietiske stamceller i forbindelse med deres knoglemarvens mikromiljø selv ved encellede opløsning i levende dyr 14. Ved at kombinere denne teknologi med en række afstamning sporing modeller, var vi i stand til at definere, at osteogent stamceller / stamceller kan genetisk præget af forbigående acvation af myxovirus modstand -1 (MX1) promotor og MX1-induceret progenitorer kan bevare de fleste af modne osteoblaster over tid, men ikke deltager i dannelsen af chondrocytter i den voksne mus 6. Desuden har vi påvist, at MX1-mærkede OSPCs levere hovedparten af de nye osteoblaster i frakturheling 6.

Her, ved hjælp af osteo-slægt sporing modeller og intravital mikroskopi, er en protokol, forudsat at definere in vivo kinetik MX1 + osteogene stamceller / stamceller i fraktur reparation. Denne protokol giver sekventiel billeddannelse til at spore flytning af osteogene stamceller / stamfædre i fraktur steder og kvantitativ måling af osteoprogenitor ekspansion i begyndelsen af ​​reparationsprocessen. Denne fremgangsmåde kan være anvendelig i flere sammenhænge, ​​herunder vurdering af terapeutiske kandidater til forbedring knogleheling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Mus og Prækonditionering

Bemærk: Alle mus blev opretholdt i patogenfrie forhold og alle protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Massachusetts General Hospital. Alle kirurgi bør udføres under sterile tilstand ved hjælp autoklaveres sterilt udstyr. MX1-Cre 15. Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP) og Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomat), var købt fra Jackson Laboratories. Osteocalcin-GFP-mus blev leveret af Dr. Henry Kronenberg. For den kvantitative analyse af OSPC migration og proliferation in vivo blev MX1-Cre + Rosa-YFP + (enkelt farve-reporter) mus anvendes. For mere detaljeret sporing af deres differentiering i Osteocalcin + modne osteoblaster, brugte vi trigenic MX1-Cre + Rosa-Tomat + Ocn-GFP +mus.

  1. At mærke MX1 + celler in vivo, forberede polyinosinic-polycytidylic syre (PIPC, 2,5 mg / ml) i steril PBS-opløsning og injicere 200 pi til 20 g MX1-Cre + reporter mus intraperitonealt en gang hver anden dag i 10 dage.
  2. For at eliminere hjemmehørende MX1 + hæmatopoietiske celler bestråles mus med en enkelt dosis på 9,5 Gy. Efter 24 timer af bestråling transplantation vildtype knoglemarvsceller (1x10 6 celler / mus) intravenøst ​​16. Bemærk: Da MX1-inducerbare celler omfatter hæmatopoietiske celler og bloddannende-afledte osteoklaster, afskaffelse af MX1 + hæmatopoietiske celler forbedrer billedkvalitet og kvantificering af MX1 + osteogene celler.
  3. Efter knoglemarvstransplantation overvåge dyr til fire til seks uger for at opnå en vellykket repopulation donor marvceller.

2. Mobruge Forberedelse

  1. Bedøver mus ved intraperitoneal injektion af 50 pi af ketamin / xylazin (100 mg / kg, xylazin 12 mg / kg legemsvægt) ved hjælp af en IACUC-godkendt procedure. Bemærk: Varighed af effekten kan forlænges med en ekstra dosis af ketamin / xylazin.
  2. Undersøg, om musen er fuldt bedøvet ved den manglende respons til tå og / eller hale trykker. (Valgfrit) Når musen er bedøvet, sikre en isofluran gas maske over næsen ved at tape. Juster isofluran-niveau for at sikre, at dyret er fuldstændigt bedøvet.
  3. Clip hovedbunden hår ved hjælp af en elektrisk trimmer eller en lille saks. Fjerne hår stykker og sterilisere eksponeret hud med 70% spritserviet. Anvend tåre gel for at forhindre hornhindens dehydrering.

3.. Mikrofraktur Injury

  1. Efter at have sikret dyret er fuldt bedøvet, lave en enkelt omvendt L-formet snit til at åbne hovedbunden huden. Kort fortalt gør en første tværgående indsnit (mindre end 1 cm) starting fra det ene øre til det andet øre. Drej ~ 60 ° C og fortsat incise mod næsen indtil ~ 2-3 mm væk fra næsen. Bemærk: Denne snit minimerer dannelsen af ​​ar væv over det område, der skal afbildes.
  2. Adskil hudlapper ved at trække mod siderne med en pincet. Både frontale knogler og skæringspunktet mellem sagittale og koronale suturer bør klart udsat for.
  3. Rengør åben overflade ved skylning med sterilt PBS og blid aftørring med steril gaze eller vatpinde, indtil alle de resterende hår er elimineret.
  4. For at generere mikrobrud på calvarium, hold musen hoved med den ene hånd og en 30 G nål med en anden hånd. Lav en mikro-punktering (~ 0,2 mm i diameter såret med <1 mm dybde) på den venstre frontal knoglen nær krydset mellem de sagittale og koronale suturer ved at indsætte spidsen af ​​en 30 G kanyle med blide tryk og dreje bevægelse. Forsigtig: Det er vigtigt at undgå, at nålen trænger ind i hjernen, og dermed minimere bleeding og vævsskader.
  5. Skift til en større nål (20 eller 25 G) og udvide punktering hul ved at dreje kanylen (~ diameter 0,5 mm).
  6. Gentag trin 3,3-3,5 at generere anden punktering på den kontralaterale frontal knoglen.
  7. Tør de sårede pletter ved kontinuerlig nedkastning af PBS indtil blødningen stopper.
    Bemærk: Blødning på fraktur sites vil forstyrre passende billeddannelse og fremkalde ardannelse.
  8. Påfør en dråbe steril fysiologisk saltopløsning eller 2% Methocel på kraniet for at undgå udtørring. Bemærk: Du må ikke tillade kraniet overflade for at tørre, hvilket vil reducere billedets klarhed. Det er vigtigt at anvende en tilstrækkelig mængde gel eller saltvand til at dække området.

4.. Intravital Imaging

  1. (Valgfrit) Før billeddannelse nogle mus injiceret med en vaskulær farvestof til at visualisere blodkar. Sprøjt retro transorbitalt med 20 ul ikke-målrettet Qtracker 705 (2 pM opløsning i 50 mM boratbuffer) fortyndet i 80 ml PBS. Brug en insulinsprøjte at minimere reagens affald. Hvis signalet ikke er tilstrækkeligt lys, kan yderligere beløb være påkrævet.
  2. Tænd scanneren. Bemærk: En polygon-baserede laserscanner muliggør samtidig billede erhvervelse multi-kanal på video sats (30 frames per sekund). Videohastigheden scanning er meget vigtigt for levende dyr billeddannelse.
  3. Tænd for multi-foton laser (femtosekund-titan: safir laser). Indstil bølgelængden til 880 nm og justere strømmen til anden harmonisk generation imaging (440 nm) af knoglen. For GFP og tdTomato excitation, tænd for 491 nm og 561 nm solid-state lasere.
  4. Tænd PMT (fotomultiplikatorrøret) detektorer til hvert signal (et 435 ± 20 nm båndpasfilter for anden harmonisk generation, en 528 ± 19 nm band-pass filter til GFP, og 590 ± 20 for tdTomato.) (Valgfri) Brug en 638 nm helium-neon-laser og en PMT med 695 ± 27,5 nm båndpasfilter til at detektere Qtracker 705 signal.
  5. Place dyret på en XYZ-aksen motoriseret mikroskop scenen. Hold musen i den mest behagelige stilling med en elektrisk varmepude at hjælpe med at opretholde kroppens temperatur (dette reducerer risikoen for dyre tab). Brug tape til at holde musen for at minimere bevægelse under billedbehandling og til at holde det afbildede område så vandret som muligt.
  6. Påfør en dråbe af varm 2% methylcellulose gel eller fysiologisk saltopløsning på kraniet for at undgå udtørring. Sæt et dækglas på imaging-området. Brug en lav forstørrelse linse (30x vand-immersionsobjektivet med 0,9 NA) for at scanne calvaria.
  7. Ved hjælp af XYZ-akse controller, finde overfladen af ​​calvaria ved påvisning af SHG-signal fra knogler og identificere en afgørende milepæl placering, såsom skæringspunktet mellem de sagittale suturer og koronale suturer. Anskaf et billede og optage XYZ koordinater.
  8. Fortsæt med at søge efter placeringen af ​​skaden ved at observere SHG og fluorescens signaler.
  9. When skade sites eller regionen ofindes f interesse erhverve et billede af det bedste fokale plan, som indeholder SHG og fluorescenssignaler fra cellerne af interesse. Gem XYZ koordinater og afstanden til skæringspunktet mellem de sagittale og koronale suturer til at definere deres præcise placering for de næste runder af billeddannelse.
  10. At indsamle 3D cellulære og knoglestrukturer af fraktur skade, optage billeder efter Z-stacks (2 - 5 m interval) med ~ 100 um dybde fra endosteale knogleoverflade. Efter afslutningen af ​​billeddannelse af den ene side af skade, skal du gentage imaging proces til næste skade sites.

5.. Indlæg Operation Procedures

  1. Efter billeddannelse, skylles billeddannelsesstedet med sterilt saltvand for at fjerne methylcellulose gel fra kraniet. Ved hjælp af en steril vatpind, anvende en lille mængde af triple antibiotisk salve på overfladen. Dæk hudlapper og re-lukke hovedbunden ved kirurgisk suturering. Dette kan gøres med en hypoallergen suturtråd (absorberbar polyglactin sutur) og 5-0 størrelse sutur nål. Forsigtig: God suturering teknik minimerer ardannelse.
  2. Behandle alle dyr med IP injektion af 0,05-0,1 mg / kg buprenorphin hver 12 timer til 48 timer efter operationen. Holde dyr i en varm opsving kammeret, indtil de genvinder tilstrækkelig bevidsthed. Efter 3 til 5 dage, genåbne sutur og gentag intravital billeddiagnostiske skridt til at spore cellulære forandringer under frakturheling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den stabiliserede lange knoglebrud model har været populær i frakturer studier. Men lang knogle eller store fraktur modeller forårsage flere skader væv, og derfor har en begrænsning i kvantitativ måling af knogle cellefunktion. Vi udviklede en minimalt invasiv skade (mindre end 1 mm i diameter med minimal eller ingen invasion i dura mater) på calvariale frontal knogler med nål boring (figur 1A-1C). Vi valgte et topbillede af calvariale frontal ben til in vivo til billeddannelse af mikrobrud fordi denne knogle har en flad og tynd knoglestruktur med knoglemarv, tillader klar billeddannelse af skadede knogle, knogleceller, og vaskulaturen uden indblanding af andre væv ( Figur 1C). Vi observerede, at denne mikrofraktur sammenfatter mange karakteristika store fraktur skader, herunder bløde callusdannelse efterfulgt af mineral deposition og dannelse af ny knogle (data ikke vist).

"> Sekventiel in vivo billeddannelse af MX1 + osteogenisk stilk stamceller. Vi næste testet, hvis denne metode er i stand til at spore en bestemt osteogen celle population under frakturheling. Tidligere vi udviklet trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP dobbelt reporter mus ved krydser MX1-Cre mus med Rosa26-tomat reporter og osteocalcin-GFP-mus (figur 2A) 6.. Fordelen ved denne model er forskellen mærkning af osteogene stamceller / stamfædre og modne osteoblaster. Af PIPC administration, er det MX1 + OSPCs specifikt mærket af tomat udtryk, mens modne osteoblaster differentieret fra MX1-inducerede OSPCs udtrykker Tomat og GFP., men præ-eksisterende osteoblaster og modne osteoblaster fra MX1 ikke-inducerbare stamfædre udtrykker GFP alene (figur 2B). Efter bestråling og knoglemarv udskiftning, vi genereltated to mikrobrud de frontale knogler af disse mus. Vi bekræftede, at arealet for hver fraktur blev påvist ved en enkelt synsfelt med vores 30x objektiv. Sekventiel 3D-intravital billeddannelse af mikrobrud viste flytningen af tomat + OSPCs i stedet for bruddet på dag 2 og deres ekspansion på dag 5. Der var ingen eller uopdaget GFP + osteoblaster på dette tidspunkt. På dag 12, en delmængde af osteoprogenitors nær brudfladen indledte differentiering af osteoblaster (Tomato + GFP +). Efterfølgende opbygning af nye osteoblaster og dannelse af ny knogle (analyseret ved anden harmonisk generation, blå) var tydelige på dag 21, hvilket indikerer at migrationen og proliferationen af osteogene stamceller er en vigtig mekanisme til at levere nye osteoblaster deltager i frakturheling (figur 2C).

Kinetik af osteogene stamceller / stamfædre i fraktur reparationer. Til test, om vores metode giver en ensartet og kvantitativ produktion af osteoprogenitorceller numre under frakturheling, brugte vi Mx1/YFP mus som en simpel afstamning sporing model og sporede MX1 + OSPCs i begyndelsen af fraktur reparation. Efter MX1 + marv celler blev erstattet af vildtype marv, vi genererede seks uafhængige mikrobrud (to / mus) på Mx1/YFP mus calvaria. Når Mx1/YFP + OSPCs blev sporet i 14 dage efter skaden, konsekvent overholdes vi, at et lille antal forfædre blev påvist på skaden site med 3 dage. Numrene steget kontinuerligt ved dag 7, når maksimal befolkning på dag 10 og fastholde med 14 dage (figur 3A). Vi kvantificerede kinetik osteoprogenitorceller numre ved at måle YFP signalintensiteten (billedbehandling og analyse med ImageJ programmet). Vi gentog dette eksperiment med en lignende effekt, hvilket tyder på sammenhæng i vores tilgang (figur 3B).

ss = "jove_content" fo: keep-together.within-side = "altid"> Figur 1
Fig. 1. In vivo billeddannelse af muse calvarie skade. (A) Skematisk repræsentation af mikrobrud på musen frontale knogler nær skæringspunktet af koronale (CS) og sagittale sutur (SS) og sekventiel intravital billeddannelse. (B) Kirurgisk eksponering af mus calvaria før skaden. (C) Repræsentative mikrofrakturhuller skader på mus calvaria for intravital billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

51289fig2.jpg "/>
Figur 2.. In vivo sporing af OSPCs på den skade sites. (A) Skematisk fremstilling af trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP mus. (B) Dette diagram illustrerer mulige fluorescerende cellepopulationer, der vises på skade lokaliteter af trigenic Mx1/Tomato / OCN-GFP mus. Rød repræsenterer MX1 + OSPCs udtrykker Tomat. Gul repræsenterer modne osteoblaster (tomat + GFP +) differentierede fra MX1 + OSPCs mens grøn repræsenterer nye osteoblaster fra allerede eksisterende osteoblaster (GFP +) eller MX1 ikke-inducerbare (MX1 -). Stamfædre (C) Sekventiel intravital billeddannelse af MX1 + OSPCs og osteoblaster ved de skade sites. Tomat + osteoprogenitors og GFP + osteoblaster nær skaden på Mx1/Tomato/Ocn-GFP mus calvaria blev afbildet umiddelbart efter skaden (dag 0) og ved than anførte tidspunkter efter skade. Pile angiver osteoblaster afledt af MX1 + OSPCs (gul). Blå, knogle. Den stiplede cirkel repræsenterer hele (single) fraktur site. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Konsekvent og kvantitativ måling af MX1 inducerede OSPCs under frakturheling. (A) Tre uafhængige skader på Mx1/YFP mus calvaria sekventielt afbildes umiddelbart efter skaden (dag 0) og på de angivne tidspunkter efter skade. (B) Kvantitativ måling af MX1 + osteogene stamceller / progenitorceller. Kinetik MX1 + OSPCekspansion på skade sites blev målt ved YFP signal intensitet ved hjælp ImageJ. Grafer viser to uafhængige forsøg med gennemsnittet af seks personskader i hvert forsøg. Blå, ben; grøn, MX1 + osteogene stamceller / stamceller; rød, vasculature (Q-prikker). Skalapanelerne er 100 um (A). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Reguleringen af ​​skelet stamceller kan være af stor vigtighed for at definere bedre metoder til at opnå knogleregenerering. Kvantitative og sekventiel billedbehandling på celleniveau har været teknisk udfordrende. Selvom musen lange knoglebrud model er blevet meget udbredt og velegnet til biomekaniske undersøgelser 17, har sin dybe væv placering, ujævn fraktur størrelse, blødt vævsskader, og anvendelsen af stabiliserende fiksatorer begrænset sekventiel intravital billeddannelse. Her er en metode til at overvinde disse begrænsninger ved kombinationen af ​​konfokal / to-foton intravital mikroskopi og en mus calvarie fraktur modellen. Denne tilgang med osteogent stilk / stamfader afstamning sporing demonstrerer sin evne til real-time, in vivo billeddannelse af osteogene stamceller / stamfædre i fraktur reparation.

En stor teknisk udfordring i denne metode er at opnå konsistente og billeder i høj kvalitet over tid. Høj kvalitet imaldre med maksimal imaging dybde afhænger af lysstyrken i de fluorescerende journalister og vævet tilstand imaging-området. Desuden minimerer laserstråling for at undgå vævsskade og fotoblegning er vigtigt for langvarig sekventiel billeddannelse. Hurtig scanning ved hjælp af video rate platform er nyttigt for dette formål. Hvis et enkelt synsfelt ikke kan dække hele skaden, kan området blive kortlagt ved at tage montage billeder til at dække det meste af fraktur sites. Det er vigtigt at gå på kompromis mellem kvaliteten af ​​Z-stakken og mængden af ​​information, der er opnået under hele imaging session. For eksempel Z-stakke med mange skiver (f.eks 1-2 um trin) og high definition er lettere at analysere yderligere; men de kræver langvarig laser eksponering fører til en højere grad af laser-induceret fotoblegning.

Da sekventiel in vivo billeddannelse af fraktur skade nødvendiggør gentagne kirurgiske åbning af hud og knogler overflade,fibrotisk ardannelse på overfladen af ​​calvaria er et fælles problem, der afbryder dybe væv billedbehandling og giver høj baggrund fluorescens. Dygtige sutur teknikker og minimal blødning er afgørende for at reducere ardannelse. I almindelighed kan 4:57 gang gentage billeddannelse opnås uden væsentligt tab af billedkvalitet.

På grund af muligheden for gentagelse billedbehandling, nem og præcis styring af fraktur størrelse og konsistens af reparations kinetik, kan denne metode give en rimelig middel til afprøvning terapeutiske mål for frakturheling, osteoporose og andre vævsregeneration såsom skeletmuskulatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker C. Park for at læse manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIAMS under Award nummer K01AR061434 og en Leukæmi & lymfom Society Fellowship Award (5127-09) til DP og tilskud på National Institutes of Health til CPL og DTS Indholdet er alene forfatternes ansvar og ikke nødvendigvis repræsenterer officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
Sekventiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Osteogene Stem / stamceller Under frakturreparation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter