Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

עוקב doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

מדידת כמותית של פונקצית אב עצם בריפוי שבר דורשת טכנולוגיית הדמיה סידורי ברזולוציה גבוהה. הנה, פרוטוקולים ניתנים לשימוש במיקרוסקופיה intravital ומעקב osteo שושלת ברצף תמונה ולכמת את ההגירה, השגשוג והתמיינות של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני בתהליך של תיקון שברים בעצמות.

Abstract

עצם מתהפך ברציפות, והוא מאוד משובי בעקבות פציעה. תאי גזע / אב osteogenic כבר מזמן שיערו להתקיים, אבל בהפגנת vivo של תאים כאלה יש רק לאחרונה הושגו. כאן, in vivo בטכניקות הדמיה כדי לחקור את תפקידם של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני (OSPCs) וצאצאיהם בתיקון עצם מסופקות. שימוש בתא osteo שושלת התחקות דגמים והדמיה intravital של microfractures המושרה בעצמות calvarial, OSPCs ניתן לצפות ישירות במהלך הימים הראשונים לאחר פציעה, שבאירועים קריטיים בתהליך התיקון מוקדם להתרחש. אתרי פגיעה יכולים להיות צילמו ברצף חושפים כי OSPCs לעבור לפציעה, עלייה במספר ולהתמיין לosteoblasts עצם טביעה. שיטות אלה מציעים אמצעי חוקר את התפקיד של רגולטורים מולקולריים גזע תאים פנימיים וחיצוניים להתחדשות עצם ותיקון.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחלות עצם ניווניות ואיבוד מסת עצם הקשור לגיל שמוביל לסיכון גבוה לשברי אוסטיאופורוזיס הפך אתגר גדול בתחום בריאות ציבור 1. תחזוקת עצם נשלטת על ידי אוסטאובלסטים יוצרי עצם וosteoclasts resorbing עצם. פגמים של תאי עצם ויוצרים הם גורם עיקרי לאובדן עצם הקשור לגיל ומחלות עצם ניווניות 2,3. בעוד מחקר מקיף התמקד בשיפור של ריפוי שבר, את הגילוי של תרופות אמינות כדי לרפא מחלות עצם ניווניות ולהפוך את החולשה של שברי אוסטיאופורוזיס נשאר נושא חשוב. כך, לומד את המקור לתאי עצם יוצר ומנגנוני הבקרה שלהם בהתחדשות עצם ותיקון מספק תובנה רומן כדי לשפר את התחדשות שלד ולהפוך מחלות איבוד מסת עצם.

קיומם של תאי mesenchymal multipotent במח עצם הוצע מבוסס על זיהוי של אוכלוסיות clonogenic שיכול שונהiate לosteogenic, שושלות adipogenic וchondrogenic vivo לשעבר 4. לאחרונה, מחקרים רבים דיווחו כי תאי גזע השלד / mesenchymal (SSCs / MSCs) הם מקור טבעי של אוסטאובלסטים והם קריטיים עבור מחזור עצם, שיפוץ ותיקון שבר 5,6 . בנוסף, מחקר התחקות השושלת שלנו גילה שיש לי osteoblasts הבוגר מחצית חיים קצרים באופן בלתי צפוי (~ 60 ימים) ומתחדשים ללא הרף על ידי תאי גזע / אביהם בשני תנאי homeostatic ותיקון שבר רגילים 6. עם זאת, זהות vivo של תאי גזע וכיצד כגון תאים מגיבות לשברי פציעה ולספק תאי יוצרי עצם אינם ברורים. לכן, חשוב לפתח שיטה שהוא מסוגל לנתח את ההגירה, השגשוג והתמיינות של SSCs / MSCs אנדוגני בנסיבות פיסיולוגיות.

תיקון שבר הוא תהליך רב תאי ודינמי מוסדר על ידי מערך של מתחםציטוקינים וצמיחת גורמי 7. הגישה הפופולרית ביותר ללימודי שבר היא להשתמש במודל של בעלי חיים עם שבר ארוך עצם ולנתח את עצמות על ידי חתך עצם וטכניקות immunofluorescent 8-10. תהליך תיקון זה יכול להיות פיקוח על ידי שיטות הדמיה מרובות כולל 11 מיקרו-CT, הקרינה אינפרא אדום קרובה 12, וההדמיה chemiluminescence 13. עם זאת, לכל טכניקה מגבלות מסוימות ולא הייתה שום דרך יעילה כדי לעקוב אחר תפקוד SSCs / MSC ברמה התאית בגוף חי. לאחרונה, confocal / מיקרוסקופיה intravital שני הפוטונים פותחה ומשמשת לאיתור תאים סרטניים מושתלים ותאי גזע hematopoietic בהקשר של microenvironment מח העצם שלהם אפילו ברזולוציה תא בודד חי חיות 14. על ידי שילוב של טכנולוגיה זו עם סדרה של דגמי התחקות שושלת, היינו יכול להגדיר שתאי גזע osteogenic / אב יכולים להיות מסומנים גנטי על ידי ac החולףtivation של התנגדות myxovirus -1 אמרגן (MX1) ואת אבות מושרה MX1 יכול לשמור על הרוב של osteoblasts הבוגר לאורך זמן, אך אינו משתתף בדור של כונדרוציטים בעכבר המבוגר 6. בנוסף, החוקרים הדגימו כי OSPCs כותרת MX1 לספק את רוב osteoblasts החדש בריפוי שבר 6.

כאן, תוך שימוש במודלי מעקב osteo שושלת ומיקרוסקופיה intravital, פרוטוקול מסופק להגדיר in vivo קינטיקה של + בתאי גזע / אב osteogenic MX1 בתיקון שבר. פרוטוקול זה מציע הדמיה רציפה כדי לעקוב אחר המעבר של גזע / אבות osteogenic לאתרי שבר ומדידת כמותית של התרחבות osteoprogenitor בתהליך התיקון מוקדם. גישה זו עשויה להיות שימושית בהקשרים רבים, כולל ההערכה של מועמדים טיפוליים לשיפור תיקון עצם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. עכברים ואכשור קד

הערה: כל העכברים נשמרו בתנאי הפתוגן ללא וכל הפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית החולים הכללי מסצ'וסטס. כל הניתוח צריך להתבצע בתנאים סטריליים באמצעות ציוד סטרילי autoclaved. 15 MX1-Cre, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), וRosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-עגבניות), היו נרכש ממעבדות ג'קסון. עכברי osteocalcin-GFP נמסרו על ידי ד"ר הנרי קרוננברג. לניתוח כמותי של הגירת OSPC ושגשוג in vivo, עכברי MX1-Cre + רוזה-YFP + (צבע כתב יחיד) היו בשימוש. למעקב מפורט יותר של הבידול שלהם לתוך osteoblasts osteocalcin בוגר +, השתמשנו trigenic MX1-Cre + רוזה-עגבניות + OCN-GFP +עכברים.

  1. לתייג MX1 + תאי in vivo, להכין חומצת polyinosinic-polycytidylic (PIPC, 2.5 מ"ג / מיליליטר) בפתרון PBS סטרילי ומזריק 200 μl ל20 גרם של עכבר + כתב MX1-Cre intraperitoneally פעם אחת בכל יום אחר ל10 ימים.
  2. כדי לחסל תאי MX1 + hematopoietic תושב, להקרין עכברים עם מנה בודדת של 9.5 Gy. לאחר 24 שעות של קרינה, תאים להשתלה מסוג בר מח עצם (1x10 6 תאים / עכבר) לווריד 16. הערה: מאחר ותאי MX1 המושרים כוללים תאי hematopoietic וosteoclasts נגזר hematopoietic, חיסול + תאי hematopoietic MX1 משפר את איכות ההדמיה ולכמת את תאים + osteogenic MX1.
  3. לאחר השתלת מח העצם, לעקוב אחר בעלי חיים לארבעה עד שישה שבועות כדי להשיג אכלוס מוצלח של תאים במח תורם.

2. מולהשתמש בתכשיר

  1. הרדימי עכבר על ידי זריקת intraperitoneal של 50 μl של קטמין / xylazine (100 מ"ג / קילוגרם, מ"ג xylazine 12 / קילוגרם משקל גוף) באמצעות הליך שאושר IACUC. הערה: משך ההשפעה ניתן להארכה למנה נוספת של קטמין / xylazine.
  2. לקבוע אם העכבר הוא בהרדמה מלאה על ידי חוסר התגובה לבוהן ו / או צובט זנב. (אופציונאלי) כאשר העכבר הוא הרדים, לאבטח את מסכת גז isoflurane מעל האף על ידי מקליט. התאם את הרמה של isoflurane כדי להבטיח את החיה היא מסוממת באופן מלא.
  3. קליפ שיער הקרקפת בעזרת גוזם חשמלי או מספריים קטנים. הסר את שברי השיער ולעקר את העור החשוף עם 70% ספוגית אלכוהול. החל ג'ל המדמיע על מנת למנוע התייבשות של קרנית.

3. Microfracture פגיעה

  1. לאחר הבטחת בעלי החיים הוא מסוממים לחלוטין, לעשות חתך בצורת אות הפוך בודד כדי לפתוח את עור הקרקפת. בקצרה, לעשות חתך רוחבי ראשון (סנטימטר פחות מ 1) starting מאוזן אחת לאוזן אחרת. הפעל ~ 60 מעלות וממשיכים לחתוך לכיוון האף עד ~ 2-3 מ"מ מאף. הערה: חתך זה ממזער את היווצרות רקמות צלקת מעל לאזור להיות צילם.
  2. הפרד את דשי עור על ידי משיכת כלפי הצדדים עם מלקחיים. שני עצמות קדמיות והצומת של תפרי sagittal ועטרה צריכים להיות ברורות חשופות.
  3. נקה את פני השטח הפתוחים על ידי שטיפה עם PBS סטרילי ומנגב בעדינות עם מטליות גזה או צמר גפן סטרילי עד שכל שערות השייר בוטלו.
  4. כדי ליצור microfractures על calvarium, להחזיק את ראש העכבר ביד אחת ומחט G 30 עם יד אחרת. הפוך מיקרו לנקב (פצע ~ 0.2 מ"מ קוטר עם <עומק 1 מ"מ) על העצם הפרונטלית השמאלי בסמוך לצומת של תפרי sagittal ועטרה על ידי החדרת קצה מחט 30 G עם לחץ עדין ומתפתל בתנועה. זהירות: זה קריטי כדי למנוע את המחט לחדור לתוך המוח, ובכך לצמצם bleeding ונזק לרקמות.
  5. לעבור למחט גדולה יותר (25 20 או G) ולהרחיב את החור לנקב על ידי סיבוב המחט (~ קוטר 0.5 מ"מ).
  6. חזור על שלב 3.3-3.5 ליצור לנקב שני על העצם החזיתי הנגדי.
  7. למחוק את הכתמים שנפגעו מצניחה המתמשכת של PBS עד שהדימום ייעצר.
    הערה: הדימום באתרים שבר יפריע להדמיה מתאימה ולגרום להיווצרות צלקת.
  8. החל ירידה של תמיסת מלח פיזיולוגית או 2% Methocel סטרילי על הגולגולת כדי למנוע התייבשות. שים לב: אין לאפשר למשטח הגולגולת לייבוש, אשר יפחית את בהירות תמונה. חשוב להשתמש בכמות מספקת של ג'ל או תמיסת מלח כדי לכסות את האזור.

4. הדמיה Intravital

  1. (אופציונאלי) לפני ההדמיה, כמה עכברים מוזרקים עם צבע של כלי דם כדי להמחיש את כלי הדם. הזרק רטרו orbitally עם 20 μl של Qtracker הלא ממוקד 705 (2 מיקרומטר פתרון ב50 מ"מ חיץ borate) בדילול מלא ב80 מl של PBS. השתמש במזרק אינסולין כדי לצמצם את הבזבוז מגיב. אם האות היא לא בהירה מספיק, סכומים נוספים ייתכן שיידרשו.
  2. הפעל את הסורק. הערה: סורק לייזר המבוסס על מצולע מאפשר רכישה בו זמנית רב ערוצית תמונה בשיעור וידאו (30 מסגרות לשנייה). סריקת שיעור וידאו היא מאוד חשובה עבור הדמיה חיה חיות.
  3. הפעל את הלייזר רב פוטון (טיטניום FEMTO השני: לייזר ספיר). קבע את אורך הגל ל880 ננומטר ולהתאים את הכוח להדמית דור שני הרמוני (440 ננומטר) של העצם. לעירור ה-GFP וtdTomato, הדלק את ננומטר 491 ו561 הלייזרים של מצב מוצק ננומטר.
  4. הפעל PMT גלאים (צינור מכפיל) עבור כל אות (± מסנן להקה עוברת 20 ננומטר 435 לדור שני הרמוני, ± מסנן להקה עוברת 19 ננומטר 528 עבור ה-GFP, ו590 ± 20 לtdTomato.) (אופציונאלי) השתמש בליזר הליום ניאון 638 ננומטר וPMT עם ± מסנן להקה עוברת 27.5 ננומטר 695 לזהות Qtracker 705 אות.
  5. Placדואר את החיה על במה מיקרוסקופ ממונע XYZ ציר. שמור את העכבר בעמדה הכי נוחה עם כרית חימום חשמלית כדי לעזור לשמור על טמפרטורת גוף (זה מפחית את הסיכון של אובדן של בעלי חיים). להשתמש בקלטת כדי להחזיק את העכבר כדי למזער את התנועה במהלך הדמיה וכדי לשמור על אזור הדמיה כאופקית ככל האפשר.
  6. החל ירידה של ג'ל החם 2% methylcellulose או תמיסת מלח פיזיולוגית בגולגולת, כדי למנוע התייבשות. שים את מכסה זכוכית באזור ההדמיה. השתמש בעדשה בהגדלה נמוכה (30x אובייקטיבי מים טבילה עם 0.9 NA) כדי לסרוק את מכסה הגולגולת.
  7. שימוש בבקר XYZ הציר, למצוא את פני השטח של מכסה גולגולת על ידי איתור את אות SHG מעצמות ולזהות מיקום ציון דרך חשוב, כגון צומת שבין תפרי sagittal ותפרי העטרה. לרכוש תמונה ולהקליט את קואורדינטות XYZ.
  8. תמשיך לחפש את המיקום של הפגיעה על ידי התבוננות אותות SHG וקרינה.
  9. כאשר אתרי פציעה או o האזורעניין f נמצא, לרכוש תמונה של מטוס המוקד הטוב ביותר המכיל SHG ואותות הקרינה מהתאים של עניין. שמור XYZ קואורדינטות והמרחק עד לצומת של תפרי sagittal ועטרה להגדיר את מיקומם המדויק לסיבובים הבאים של הדמיה.
  10. לאסוף מבנים הסלולר ועצם 3D של פציעת שבר, להקליט תמונות על ידי Z-ערימות (2 - 5 מרווח מיקרומטר) עם ~ 100 עומק מיקרומטר ממשטח עצם endosteal. לאחר השלמת הדמיה של צד אחד של פציעה, חוזר על תהליך הדמיה לאתרי פציעה הבאים.

נהלי 5. ההודעה מבצע

  1. לאחר הדמיה, לשטוף אתר הדמיה עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר את הג'ל methylcellulose מהגולגולת. באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי, למרוח כמות קטנה של משחה אנטיביוטית משולשת על פני השטח. כסה את שולי העור ומחדש לסגור את הקרקפת על ידי תפירה כירורגית. ניתן לעשות זאת עם חוט תפירה היפואלרגנית (polyglactin נספג suture) ו5-0 מחט תפר גודל. זהירות: טכניקת תפירה טובה ממזערת היווצרות צלקת.
  2. טיפול בכל בעלי החיים בהזרקת ה-IP של 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות כל שעות 12 ל48 שעות לאחר ניתוח. לשמור על בעלי חיים בחדר התאוששות חם עד שהם יחזרו להכרה מספקת. לאחר 3 עד 5 ימים, לפתוח מחדש את התפר ולחזור על שלבי הדמיה intravital כדי לעקוב אחר השינוי הסלולרי במהלך ריפוי שבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מודל שבר התייצב ארוך העצם היה פופולרי במחקרים שבר. עם זאת, עצם ארוך או דגמי שבר גדולים לגרום נזק לרקמות רב, ולכן, יש מגבלה במדידת כמותית של תפקוד תא עצם. פיתחנו פגיעה פולשנית (קוטר מ"מ פחות מ 1 עם פלישה מינימאלית או ללא למאטר הדורה) בעצמות קדמיות calvarial עם קידוח מחט (איורים 1 א-1C). בחרנו להציג את דף של העצמות הקדמיות calvarial הדמיה לחיות vivo של microfractures כי יש עצם זה מבנה עצם שטוח ודק עם מח עצם, המאפשר הדמיה ברורה של עצם פגוע, תאי עצם, כלי דם וללא ההתערבות של רקמות אחרות ( איור 1 ג). הבחנו כי microfracture זה משחזר מאפיינים רבים של פציעות שבר גדולות הכוללים השקעה ביבלת רכה אחריו בתצהיר מינרלים והיווצרות עצם חדש (מידע לא מוצג).

"סדרתית> בתחום ההדמיה vivo של תאים + אב גזע osteogenic MX1. בשלב הבא אנו בדקנו אם שיטה זו היא מסוגלת לעקוב אחר אוכלוסיית תא osteogenic בפרט במהלך ריפוי שבר. בעבר, פיתחנו עכברי כתב כפול Mx1/Tomato/Ocn-GFP trigenic ידי חציית עכברי MX1-Cre עם כתב Rosa26-עגבניות ועכברי osteocalcin-GFP (איור 2 א) 6. היתרון של המודל הזה הוא תיוג ההפרש של גזע / אבות osteogenic וosteoblasts הבוגר. ידי ממשל PIPC, MX1 + OSPCs מוגדרים מפורשות על ידי ביטוי העגבניות, ואילו osteoblasts הבוגר מובחן מOSPCs-Induced MX1 להביע את העגבניות וה-GFP. עם זאת, osteoblasts קיים מראש וosteoblasts הבוגר מMX1 אבות שאינם מושרה להביע GFP לבד (איור 2). לאחר החלפת מח העצם וקרינה, אנחנו generated שתי microfractures בעצמות הקדמיות של עכברים אלה. אנו מאשרים כי באזור של כל בר זוהה על ידי שדה בודד של נוף עם אובייקטיבי 30x שלנו. ההדמיה 3D-intravital רציף של microfractures הראתה העתקת העגבניות + OSPCs באתר של שבר ביום 2 ובהרחבתן ביום 5. היו בלתי ניתנת לגילוי ה-GFP + אוסטאובלסטים או לא בשלב זה. ביום 12, קבוצת משנה של osteoprogenitors קרוב לפני שטח שבר יזם את הבידול של osteoblasts (עגבניות + ה-GFP +). בהמשך לכך, ההצטברות של osteoblasts החדש והיווצרות העצם חדשה (נותחה על ידי דור השני הרמוני, כחולה) היו ברורות ביום 21, מצביעה על כך שההגירה והתפשטות של תאי אב osteogenic היא מנגנון עיקרי לאספקת osteoblasts החדש המשתתף בריפוי שבר (איור 2 ג).

קינטיקה של גזע / אבות osteogenic בתיקונים שבר. כדי te st אם השיטה שלנו מספקת תפוקה עקבית וכמותי של מספרי osteoprogenitor במהלך ריפוי שבר, השתמשנו בעכבר Mx1/YFP כמודל שושלת מעקב פשוט ומעקב MX1 + OSPCs בתיקון שבר מוקדם. לאחר תאי מח MX1 + הוחלפו במח מהסוג בר, יצר שש microfractures העצמאי (שני / עכבר) על מכסה גולגולת עכבר Mx1/YFP. כאשר Mx1/YFP + OSPCs היו במעקב במשך 14 ימים לאחר פציעה, אנחנו באופן עקבי ציינו כי מספר קטן של אבות התגלו באתר פגיעה על ידי 3 ימים. המספרים עלו ברציפות ביום 7, והגיעו לשיא אוכלוסייה ביום 10 ולשמר ידי 14 ימים (איור 3 א). אנחנו כמתנו את קינטיקה של מספרי osteoprogenitor על ידי מדידת עוצמת אות YFP (עיבוד תמונה וניתוח עם תכנית ImageJ). אנו חוזרים על הניסוי הזה עם תפוקה דומה, מה שמרמז על העקביות של הגישה שלנו (איור 3 ב).

ss = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 1
איור 1. בvivo הדמיה של פגיעת calvarial עכבר. (א) ייצוג סכמטי של microfractures על העצמות הקדמיות עכבר בסמוך לצומת של תפרי העטרה (CS) ועל sagittal (SS) וההדמיה intravital רציפה. (ב) חשיפה כירורגית של עכבר מכסה גולגולת לפני פציעה. (C) פציעות microfracture נציג על מכסה גולגולת עכבר להדמית intravital. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

51289fig2.jpg "/>
איור 2. מעקב vivo של OSPCs באתרי הפציעה. (א) ייצוג סכמטי של trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP עכבר. (ב) תרשים זה ממחיש אוכלוסיות תאי ניאון אפשריות המופיעות באתרי פציעתם של Mx1/Tomato trigenic / OCN-GFP עכבר. אדום מייצג MX1 + OSPCs להביע עגבניות. צהוב מייצג osteoblasts הבוגר (עגבניות + ה-GFP +) מובחן מMX1 + OSPCs אילו ירוק מייצג osteoblasts החדש מosteoblasts קיים מראש (+ GFP) או MX1 שאינו מושרה (MX1 -). אבות הדמיה intravital סדרתית (C) של MX1 + OSPCs וosteoblasts באתרי הפציעה. עגבניות osteoprogenitors + ו-GFP + osteoblasts ליד הפציעה על מכסה גולגולת עכבר Mx1/Tomato/Ocn-GFP היו צילמו מייד לאחר פציעה (יום 0) ועל tהוא הצביע פעמים לאחר פציעה. חצים מצביעים osteoblasts נגזר מMX1 + OSPCs (צהוב). כחול, עצם. המעגל המקווקו מייצג את האתר כולו שבר (יחיד). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. מדידה עקבית וכמותי של OSPCs-Induced MX1 במהלך ריפוי שבר. () שלוש פציעות עצמאיות על מכסה גולגולת עכבר Mx1/YFP היו צילמו ברצף מייד לאחר פציעה (יום 0) ובמועדים מצויינים לאחר פציעה. (B) כמותי מדידה של תאי גזע / אב osteogenic MX1 +. קינטיקה של MX1 + OSPCהתרחבות באתרי פציעה נמדדה על ידי עוצמת אות YFP באמצעות ImageJ. גרפים מראים שני ניסויים בלתי תלויים עם הממוצע של שש פציעות בכל ניסוי. כחול, עצם; , MX1 + בתאי גזע / אב osteogenic ירוק; אדום, כלי דם (Q-נקודות). ברים סולם הם 100 מיקרומטר (). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הרגולציה של תאי גזע שלד עשויה להיות בעל חשיבות רבה להגדרת שיטות טובות יותר להשיג התחדשות עצם. הדמיה כמותי ורציפה ברמה התאית הייתה מאתגרת מבחינה טכנית. למרות שמודל שבר ארוך עצם העכבר כבר בשימוש ומתאים למחקרים ביומכנית 17 נרחב, המיקום שלה רקמות עמוקות, גודל שבר לא אחיד, נזק לרקמות רכות, ואת היישום של תופסנים ייצוב מוגבלים הדמיה intravital רציפה. הנה, שיטה כדי להתגבר על מגבלות אלה על ידי השילוב של confocal / מיקרוסקופיה intravital שני פוטונים ומודל שבר calvarial עכבר מסופקת. גישה זו עם מעקב שושלת גזע / אב osteogenic מדגימה את יכולתה בזמן אמת, בתחום ההדמיה vivo של גזע / אבות osteogenic בתיקון שבר.

אתגר טכני עיקרי בשיטה זו הוא להשיג תמונות באיכות עקביות וגבוהות לאורך זמן. im באיכות גבוההגילים עם עומק הדמיה מרבי תלויים בבהירות של כתבי ניאון ומצב הרקמות של אזור ההדמיה. בנוסף, צמצום חשיפת לייזר כדי למנוע נזק וphotobleaching רקמות חשוב להדמיה רציפה לטווח ארוך. סריקה מהירה באמצעות פלטפורמת שיעור וידאו מועילה למטרה זו. אם שדה בודד מבט לא יכול לכסות את כל פציעה, האזור יכול להיות ממופה על ידי לקיחת תמונות מונטאז' כדי לכסות את רוב אתרי שבר. חשוב להתפשר בין איכות Z-המחסנית ואת כמות המידע שנרכש במהלך כל פגישת ההדמיה. לדוגמא, Z-ערימות עם פרוסות רבות (לדוגמא 1-2 מיקרומטר מדרגות) וחדות גבוהה הן קלים יותר לנתח עוד יותר; עם זאת, הם דורשים חשיפת לייזר לטווח ארוך שמוביל לרמה גבוהה יותר של photobleaching מושרה לייזר.

מאז רציף בתחום ההדמיה vivo של פציעת שבר מחייב פתיחה ניתוחית החוזרת ונשנית של עור ומשטח עצם,היווצרות צלקת fibrotic על פני השטח של מכסה גולגולת היא בעיה נפוצה שקוטעת הדמיה רקמות עמוקה ותשואות בתפרחת רקע גבוהה. טכניקות תפר מיומנת ודימום מינימאלי הוא קריטיות כדי להפחית היווצרות צלקת. באופן כללי, שלוש עד חמש הדמיה חוזרת זמן יכולה להיות מושגת ללא אובדן משמעותי של איכות תמונה.

בהתחשב באפשרות של הדמיה חוזרת, שליטה קלה ומדויקת של גודל שבר ואת העקביות של קינטיקה תיקון, שיטה זו יכולה לספק אמצעים סבירים לבדיקת מטרות טיפוליות לריפוי שברים, אוסטאופורוזיס, והתחדשות רקמות אחרת כגון שרירי שלד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לג פרק לקריאת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS תחת מספר פרס K01AR061434 ואגודת מלגת פרס לוקמיה ולימפומה (5,127-09) לשארית פליטה ובמענקים מהמוסד הלאומי לבריאות לCPL ו-DTS התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter