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Medicine

अनुक्रमिक doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

अस्थिभंग उपचार में हड्डी पूर्वज समारोह के मात्रात्मक माप उच्च संकल्प धारावाहिक इमेजिंग तकनीक की आवश्यकता है. इधर, प्रोटोकॉल छवि क्रमिक और हड्डी फ्रैक्चर की मरम्मत की प्रक्रिया में अंतर्जात osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रवास, प्रसार और भेदभाव यों तो intravital माइक्रोस्कोपी और आस्टियो वंश ट्रैकिंग का उपयोग के लिए प्रदान की जाती हैं.

Abstract

अस्थि लगातार खत्म हो जाता है और अत्यधिक पुनर्योजी चोट के बाद किया जाता है. Osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं लंबा करने के लिए मौजूद धारणा रही है, लेकिन इस तरह की कोशिकाओं का विवो प्रदर्शन में केवल हाल ही में प्राप्त किया गया है. इधर, vivo इमेजिंग तकनीक अंतर्जात osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की भूमिका (OSPCs) और हड्डी की मरम्मत में उनकी संतान की जांच के लिए प्रदान की जाती हैं. मॉडल और calvarial हड्डी में प्रेरित माइक्रोफ्रैक्चर की intravital इमेजिंग अनुरेखण आस्टियो वंश सेल का प्रयोग, OSPCs सीधे जल्दी मरम्मत की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण घटना होने में जो चोट के बाद पहले कुछ दिनों के दौरान देखा जा सकता है. चोट साइटों क्रमिक रूप से OSPCs, चोट करने के लिए स्थानांतरित संख्या में वृद्धि हुई है और हड्डी बनाने अस्थिकोरक में अंतर खुलासा कि imaged किया जा सकता है. इन विधियों हड्डी पुनर्जनन और मरम्मत के लिए स्टेम सेल आंतरिक और बाह्य आणविक नियामकों की भूमिका की जांच करने का एक साधन प्रदान करते हैं.

Introduction

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अपक्षयी हड्डी रोगों और ऑस्टियोपोरोटिक फ्रैक्चर के एक उच्च जोखिम के लिए अग्रणी उम्र से संबंधित हड्डी हानि सार्वजनिक स्वास्थ्य 1 में एक बड़ी चुनौती बन गया है. अस्थि रखरखाव बोन बनाने अस्थिकोरक और हड्डी resorbing osteoclasts द्वारा नियंत्रित किया जाता है. अस्थि कोशिकाओं के गठन के दोष उम्र से संबंधित हड्डी हानि और अपक्षयी हड्डी रोगों 2,3 का एक मुख्य कारण हैं. व्यापक अनुसंधान अस्थिभंग उपचार के सुधार पर ध्यान केंद्रित किया है, विश्वसनीय दवाओं की खोज के अपक्षयी हड्डी रोगों का इलाज और ऑस्टियोपोरोटिक भंग की कमजोरी रिवर्स करने के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा बनी हुई है. इस प्रकार, हड्डी पुनर्जनन और मरम्मत में अस्थि कोशिकाओं के गठन और उनके नियंत्रण तंत्र के स्रोत का अध्ययन कंकाल उत्थान को बढ़ाने और हड्डी हानि रोगों रिवर्स करने के लिए एक उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

अस्थि मज्जा में multipotent mesenchymal कोशिकाओं के अस्तित्व clonogenic आबादी की पहचान के आधार पर प्रस्तावित किया गया है कि सकता है अलगosteogenic में देर हो गई, वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला और chondrogenic प्रजातियों पूर्व vivo 4. हाल ही में, कई अध्ययनों कंकाल / mesenchymal स्टेम सेल (SSCs / MSCs) अस्थिकोरक की एक प्राकृतिक स्रोत हैं और हड्डी कारोबार, remodeling, और फ्रैक्चर की मरम्मत 5,6 के लिए महत्वपूर्ण हैं सूचित किया है कि . इसके अलावा, हमारे वंश अनुरेखण अध्ययन परिपक्व अस्थिकोरक एक अप्रत्याशित रूप से कम आधा जीवन (~ 60 दिन) है और लगातार सामान्य homeostatic और फ्रैक्चर की मरम्मत स्थितियां 6 दोनों में उनके स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से मंगाया जाता है कि पता चला. हालांकि, vivo में स्टेम कोशिकाओं की पहचान और कैसे इस तरह की कोशिकाओं को चोट फ्रैक्चर और हड्डी बनाने कोशिकाओं स्पष्ट नहीं कर रहे हैं की आपूर्ति करने के लिए प्रतिक्रिया. इसलिए, यह शारीरिक परिस्थितियों में प्रवास, प्रसार और अंतर्जात SSCs / MSCs के भेदभाव का विश्लेषण करने में सक्षम है कि एक विधि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

फ्रैक्चर की मरम्मत परिसर की एक सरणी द्वारा विनियमित एक बहु सेलुलर और गतिशील प्रक्रिया हैसाइटोकिन्स और वृद्धि 7 कारकों. फ्रैक्चर के अध्ययन के लिए सबसे लोकप्रिय दृष्टिकोण लंबी हड्डी फ्रैक्चर के साथ एक पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए और हड्डी सेक्शनिंग और Immunofluorescent तकनीक 8-10 से हड्डियों का विश्लेषण करने के लिए है. इस सुधार प्रक्रिया सूक्ष्म सीटी 11, लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति 12, और chemiluminescence इमेजिंग 13 सहित कई इमेजिंग तकनीक द्वारा नजर रखी जा सकती है. हालांकि, प्रत्येक तकनीक कुछ सीमाएँ हैं और इन विवो में सेलुलर स्तर पर SSCs / एमएससी कार्य की निगरानी के लिए कोई कारगर उपाय नहीं किया गया है. हाल ही में, confocal / दो फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी विकसित और जानवरों के 14 में रहने वाले भी एकल कोशिका प्रस्ताव पर उनके अस्थि मज्जा microenvironment के संदर्भ में प्रत्यारोपित कैंसर कोशिकाओं और hematopoietic स्टेम कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. वंश अनुरेखण मॉडल की एक श्रृंखला के साथ इस तकनीक के संयोजन से, हम osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से क्षणिक एसी द्वारा चिह्नित किया जा सकता है परिभाषित करने में सक्षम थेmyxovirus प्रतिरोध -1 (MX1) प्रमोटर और MX1 प्रेरित progenitors के tivation समय के साथ परिपक्व अस्थिकोरक के बहुमत बनाए रख सकते हैं, लेकिन वयस्क माउस 6 में chondrocytes की पीढ़ी में भाग नहीं लेते. इसके अलावा, हम MX1 लेबल OSPCs अस्थिभंग उपचार 6 में नया अस्थिकोरक का बहुमत है कि आपूर्ति का प्रदर्शन किया.

इधर, आस्टियो वंश ट्रैकिंग मॉडल और intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर, एक प्रोटोकॉल फ्रैक्चर की मरम्मत में MX1 + osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के vivo कैनेटीक्स परिभाषित करने के लिए प्रदान की जाती है. इस प्रोटोकॉल फ्रैक्चर साइटों में osteogenic स्टेम / progenitors के स्थानांतरण और जल्दी मरम्मत की प्रक्रिया में osteoprogenitor विस्तार की मात्रात्मक माप ट्रैक करने के लिए अनुक्रमिक इमेजिंग प्रदान करता है. यह दृष्टिकोण हड्डी की मरम्मत में सुधार करने के लिए चिकित्सकीय उम्मीदवारों के मूल्यांकन सहित कई संदर्भों में उपयोगी हो सकता है.

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Protocol

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1. चूहे और शर्त

नोट: सभी चूहों रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में बनाए रखा गया और सभी प्रोटोकॉल मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया. सभी सर्जरी autoclaved बाँझ उपकरणों का उपयोग कर बाँझ हालत के तहत किया जाना चाहिए. MX1-Cre 15, Rosa26-loxP बंद loxP-EYFP (रोजा-YFP), और Rosa26-loxP बंद loxP-tdTomato (रोजा-टमाटर), थे जैक्सन प्रयोगशालाओं से खरीदा. osteocalcin-GFP चूहों डॉ. हेनरी Kronenberg द्वारा प्रदान किया गया. विवो में OSPC प्रवास और प्रसार के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, MX1-Cre + रोजा-YFP + (एकल रंग संवाददाता) चूहों का इस्तेमाल किया गया. Osteocalcin + परिपक्व अस्थिकोरक में उनके भेदभाव के अधिक विस्तृत ट्रैकिंग के लिए, हम इस्तेमाल trigenic MX1-Cre + रोजा-टमाटर + OCN-GFP +चूहों.

  1. Vivo में MX1 + कोशिकाओं लेबल बाँझ पीबीएस समाधान में polyinosinic-polycytidylic एसिड (PIPC, 2.5 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करने और 20 MX1-Cre + संवाददाता माउस के ग्राम intraperitoneally एक बार 10 दिनों के लिए हर दूसरे दिन के लिए 200 μl इंजेक्षन.
  2. निवासी MX1 + hematopoietic कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, 9.5 Gy की एक खुराक के साथ चूहों चमकाना. नसों के 16 विकिरण, प्रत्यारोपण जंगली प्रकार अस्थि मज्जा की कोशिकाओं (1x10 6 कोशिकाओं / माउस) के 24 घंटे के बाद. नोट: MX1-inducible कोशिकाओं hematopoietic कोशिकाओं और hematopoietic व्युत्पन्न osteoclasts, MX1 + hematopoietic कोशिकाओं के उन्मूलन MX1 + osteogenic कोशिकाओं की इमेजिंग गुणवत्ता और quantitation को बेहतर बनाता है शामिल हैं.
  3. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद, दाता मज्जा की कोशिकाओं के एक सफल repopulation हासिल करने के लिए चार से छह सप्ताह के लिए जानवरों की निगरानी.

2. मोतैयारी का उपयोग

  1. एक IACUC को मंजूरी दी प्रक्रिया का उपयोग ketamine / xylazine (100 मिलीग्राम / किग्रा, xylazine 12 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के 50 μl की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize. नोट: प्रभाव की अवधि ketamine / xylazine की एक अतिरिक्त खुराक द्वारा बढ़ाया जा सकता है.
  2. माउस को पूरी तरह से पैर की अंगुली और / या पूंछ चुटकी के जवाब की कमी से anesthetized है निर्धारित करते हैं. माउस anesthetized है जब (वैकल्पिक), टेप से नाक पर एक isoflurane गैस मास्क सुरक्षित. जानवर पूरी तरह से बेहोश है यह सुनिश्चित करने के लिए isoflurane के स्तर को समायोजित करें.
  3. एक बिजली trimmer या छोटे कैंची का उपयोग खोपड़ी हेयर क्लिप. बाल टुकड़े हटाने और 70% शराब झाड़ू के साथ संपर्क में त्वचा बाँझ. कार्निया निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंसू जेल लागू करें.

3. Microfracture चोट

  1. जानवर पूरी तरह से बेहोश है यह सुनिश्चित करने के बाद, सिर की त्वचा को खोलने के लिए एक एकल रिवर्स एल के आकार का चीरा बनाते हैं. संक्षेप में, एक पहले अनुप्रस्थ चीरा (कम से कम 1 सेमी) starti बनानेएक और कान को एक कान से एनजी. 60 ° ~ मुड़ें और ~ दूर नाक से 2-3 मिमी तक नाक की ओर काटकर अलग कर देना जारी है. नोट: यह चीरा imaged किया जा क्षेत्र के ऊपर निशान ऊतकों के गठन को कम करता है.
  2. संदंश के साथ पक्षों की ओर खींच कर त्वचा फ्लैप अलग करें. दोनों ललाट हड्डियों और बाण के समान और राज्याभिषेक टांके के चौराहे स्पष्ट रूप से उजागर किया जाना चाहिए.
  3. सभी अवशिष्ट बाल समाप्त हो जाते हैं जब तक बाँझ पीबीएस और बाँझ धुंध या कपास swabs के साथ कोमल पोंछते साथ निस्तब्धता द्वारा खुले सतह को साफ.
  4. Calvarium पर माइक्रोफ्रैक्चर उत्पन्न करने के लिए, एक हाथ से माउस सिर और दूसरे हाथ से एक 30 जी सुई पकड़. कोमल दबाव के साथ एक 30 जी सुई की नोक डालने और गति घुमा द्वारा बाण के समान और राज्याभिषेक टांके के चौराहे के पास छोड़ दिया ललाट हड्डी पर एक माइक्रो पंचर (<1 मिमी गहराई के साथ ~ 0.2 मिमी व्यास घाव) बनाते हैं. सावधानी: यह इस प्रकार bleedi कम से कम, मस्तिष्क में प्रवेश करने से सुई से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैएनजी और ऊतकों को नुकसान.
  5. एक बड़ी सुई (20 या 25 ग्राम) स्विच और सुई (~ 0.5 मिमी व्यास) घुमा द्वारा पंचर छेद को चौड़ा.
  6. Contralateral ललाट हड्डी पर दूसरा पंचर उत्पन्न करने के लिए कदम 3.3-3.5 दोहराएँ.
  7. रक्तस्राव बंद हो जाता है जब तक पीबीएस के निरंतर छोड़ने से घायल स्पॉट बाहर साफ कर लें.
    नोट: फ्रैक्चर साइटों पर खून बह रहा उचित इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप और निशान गठन को प्रेरित करेगा.
  8. सुखाने से बचने के लिए खोपड़ी पर बाँझ शारीरिक खारा समाधान या 2% Methocel की एक बूंद लागू करें. नोट: छवि स्पष्टता कम हो जाएगा, जो खोपड़ी सतह शुष्क करने की अनुमति न दें. यह क्षेत्र को कवर करने के लिए जेल या खारा के लिए पर्याप्त मात्रा में उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.

4. Intravital इमेजिंग

  1. (वैकल्पिक) इमेजिंग से पहले, कुछ चूहों रक्त वाहिकाओं कल्पना करने के लिए एक नाड़ी डाई इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं. गैर लक्षित Qtracker 705 80 मीटर में पतला (50 मिमी borate बफर में 2 माइक्रोन समाधान) के 20 μl के साथ रेट्रो orbitally इंजेक्षनपीबीएस के एल. अभिकर्मक कचरे को कम करने के लिए एक इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग करें. संकेत पर्याप्त उज्ज्वल नहीं है, तो अतिरिक्त राशि की आवश्यकता हो सकती है.
  2. स्कैनर चालू करें. नोट: एक बहुभुज आधारित लेजर स्कैनर वीडियो दर पर एक साथ मल्टी चैनल छवि प्राप्ति (प्रति सेकंड 30 फ्रेम) की अनुमति देता है. वीडियो दर स्कैनिंग जीवित पशु इमेजिंग के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.
  3. (: नीलम लेजर femto सेकंड टाइटेनियम) बहु फोटॉन लेजर पर मुड़ें. 880 एनएम तरंगदैर्ध्य सेट और हड्डी की दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी इमेजिंग (440 एनएम) के लिए बिजली समायोजित करें. GFP और tdTomato उत्तेजना के लिए, 491 एनएम और 561 एनएम ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण पर बारी.
  4. पीएमटी प्रत्येक संकेत के लिए (photomultiplier ट्यूब) डिटेक्टरों पर मुड़ें (दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी के लिए एक 435 ± 20 एनएम बैंड पास फिल्टर, GFP के लिए एक 528 ± 19 एनएम बैंड पास फिल्टर, और tdTomato के लिए 590 ± 20.) (वैकल्पिक) Qtracker 705 संकेत का पता लगाने के लिए एक 695 ± 27.5 एनएम बैंड पास फिल्टर के साथ एक 638 एनएम हीलियम नीयन लेजर और एक पीएमटी का प्रयोग करें.
  5. Placएक XYZ-अक्ष मोटर चालित खुर्दबीन मंच पर पशु ई. (इस जानवर नुकसान के जोखिम को कम कर देता है) शरीर का तापमान बनाए रखने में मदद करने के लिए एक बिजली के हीटिंग पैड के साथ सबसे अधिक आरामदायक स्थिति में माउस रखें. इमेजिंग के दौरान आंदोलन को कम करने के लिए और संभव के रूप में क्षैतिज रूप में imaged क्षेत्र रखने के लिए माउस पकड़ करने के लिए टेप का प्रयोग करें.
  6. सुखाने से बचने के लिए खोपड़ी पर गर्म 2% methylcellulose जेल या शारीरिक खारा समाधान की एक बूंद लागू करें. इमेजिंग क्षेत्र पर एक कवर गिलास रखो. Calvaria स्कैन करने के लिए (0.9 एनए के साथ 30x पानी विसर्जन उद्देश्य) एक कम बढ़ाई लेंस का प्रयोग करें.
  7. XYZ अक्ष नियंत्रक का उपयोग करना, हड्डियों से एसएचजी संकेत पता लगाने के द्वारा calvaria की सतह लगता है और इस तरह के बाण के समान टांके और राज्याभिषेक टांके के बीच चौराहे के रूप में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर स्थान, पहचान. एक छवि मोल और XYZ निर्देशांक रिकॉर्ड.
  8. एसएचजी और प्रतिदीप्ति संकेतों को देख कर चोट के स्थान के लिए खोज जारी है.
  9. चोट साइटों या क्षेत्र ओ कबएफ ब्याज पाए जाते हैं, ब्याज की कोशिकाओं से स्वयं सहायता समूह और प्रतिदीप्ति संकेत युक्त सर्वश्रेष्ठ फोकल हवाई जहाज़ की एक छवि के अधिग्रहण. सहेजें XYZ निर्देशांक और बाण के समान और राज्याभिषेक टांके के चौराहे तक दूरी इमेजिंग के अगले दौर के लिए उनकी सटीक स्थान को परिभाषित करने के लिए.
  10. फ्रैक्चर की चोट के 3 डी सेलुलर और हड्डी संरचनाओं को इकट्ठा करने के लिए, Z-ढेर से रिकॉर्ड छवियों - endosteal हड्डी सतह से ~ 100 माइक्रोन गहराई के साथ (2 5 माइक्रोन अंतराल). चोट के एक तरफ की इमेजिंग के पूरा होने के बाद, अगले चोट साइटों के लिए इमेजिंग प्रक्रिया को दोहराने.

5. पोस्ट संचालन प्रक्रियाओं

  1. इमेजिंग के बाद, खोपड़ी से methylcellulose जेल दूर करने के लिए बाँझ खारा समाधान के साथ इमेजिंग साइट कुल्ला. एक बाँझ कपास झाड़ू का प्रयोग, सतह पर ट्रिपल एंटीबायोटिक मलहम की एक छोटी राशि लागू होते हैं. त्वचा फ्लैप कवर और शल्य suturing द्वारा खोपड़ी को फिर से बंद कर दें. यह एक hypoallergenic suturing धागे (absorbable polyglactin र के साथ किया जा सकता हैसंरचना) और 5-0 आकार सीवन सुई. सावधानी: अच्छा suturing तकनीक निशान गठन को कम करता है.
  2. / किलो buprenorphine 48 घंटे के लिए हर 12 घंटे की सर्जरी के बाद 0.05-0.1 मिलीग्राम के आईपी इंजेक्शन के साथ सभी पशुओं का इलाज. वे पर्याप्त होश में आने तक एक गर्म वसूली कक्ष में पशुओं को रखने के. 3 से 5 दिनों के बाद, सिवनी को फिर से खोलने और अस्थिभंग उपचार के दौरान सेलुलर परिवर्तन ट्रैक करने के लिए intravital इमेजिंग चरणों को दोहराएँ.

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Representative Results

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स्थिर लंबी हड्डी फ्रैक्चर मॉडल फ्रैक्चर पढ़ाई में लोकप्रिय हो गया है. हालांकि, लंबी हड्डी या बड़े फ्रैक्चर मॉडल कई ऊतकों को नुकसान का कारण है और इसलिए, हड्डी सेल समारोह के मात्रात्मक माप में एक सीमा है. हम सुई ड्रिलिंग (आंकड़े 1 ए -1 सी) के साथ calvarial ललाट हड्डियों पर एक न्यूनतम इनवेसिव चोट (ड्यूरा मेटर में कम या कोई आक्रमण के साथ कम से कम 1 मिमी व्यास) विकसित की है. इस हड्डी (अन्य ऊतकों के हस्तक्षेप के बिना स्पष्ट रूप से घायल हड्डी की इमेजिंग, अस्थि कोशिकाओं, और vasculature की अनुमति, अस्थि मज्जा के साथ एक फ्लैट और पतली हड्डी संरचना है क्योंकि हम माइक्रोफ्रैक्चर के vivo रहते इमेजिंग के लिए calvarial ललाट हड्डियों के एक शीर्ष देखने चुना चित्रा 1C). हम इस microfracture खनिज बयान और नई हड्डी गठन (नहीं दिखाया डेटा) के बाद मुलायम घट्टा गठन सहित बड़ी फ्रैक्चर चोटों के कई विशेषताओं का स्मरण दिलाता है कि मनाया.

MX1 + osteogenic स्टेम कोशिकाओं पूर्वज के vivo इमेजिंग में "> अनुक्रमिक. इस विधि अस्थिभंग उपचार के दौरान एक विशेष osteogenic सेल की आबादी पर नज़र रखने में सक्षम है, तो हम अगले परीक्षण किया. इससे पहले, हम द्वारा trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP दोहरी संवाददाता चूहों विकसित Rosa26-टमाटर रिपोर्टर और osteocalcin-GFP चूहों (2A चित्रा) के साथ MX1-Cre चूहों को पार 6. इस मॉडल का लाभ osteogenic स्टेम / progenitors और परिपक्व अस्थिकोरक का अंतर लेबलिंग है. PIPC प्रशासन द्वारा, MX1 + OSPCs विशेष रूप से चिह्नित कर रहे हैं टमाटर अभिव्यक्ति द्वारा, परिपक्व अस्थिकोरक MX1 प्रेरित OSPCs से भेदभाव जबकि टमाटर और GFP व्यक्त करते हैं. MX1 से हालांकि, पहले से मौजूद अस्थिकोरक और परिपक्व अस्थिकोरक गैर inducible progenitors (चित्रा 2B) अकेले व्यक्त GFP. विकिरण और अस्थि मज्जा प्रतिस्थापन के बाद, हम generइन चूहों के ललाट हड्डियों पर दो माइक्रोफ्रैक्चर पैदा. हम प्रत्येक फ्रैक्चर के क्षेत्र में हमारे 30x उद्देश्य के साथ देखने का एक ही क्षेत्र से पता चला था कि पुष्टि की. माइक्रोफ्रैक्चर की अनुक्रमिक 3 डी intravital इमेजिंग दिन 2 में फ्रैक्चर है और सुबह 5 बजे उनके विस्तार की साइट में टमाटर + OSPCs के स्थानांतरण से पता चला है. नहीं या undetectable + GFP अस्थिकोरक इस समय वहाँ थे. 12 दिन पर, अस्थिभंग सतह के पास osteoprogenitors की एक सबसेट अस्थिकोरक (टमाटर + + GFP) के भेदभाव शुरू की. बाद में, नई अस्थिकोरक के संचय और (नीला दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी द्वारा विश्लेषण,) नई हड्डी गठन osteogenic पूर्वज कोशिकाओं के प्रवास और प्रसार अस्थिभंग उपचार (चित्रा में भाग लेने वाले नए अस्थिकोरक की आपूर्ति करने के लिए एक प्रमुख तंत्र है कि यह दर्शाता है, दिन 21 पर स्पष्ट थे -2 सी).

फ्रैक्चर की मरम्मत में osteogenic स्टेम / progenitors के काइनेटिक्स. तेसेंट हमारे विधि अस्थिभंग उपचार के दौरान osteoprogenitor संख्या के अनुरूप एक और मात्रात्मक उत्पादन प्रदान करता है, चाहे हम एक सरल वंश ट्रैकिंग मॉडल के रूप में Mx1/YFP माउस का इस्तेमाल किया और जल्दी फ्रैक्चर की मरम्मत में MX1 + OSPCs लगाया है. MX1 + मज्जा की कोशिकाओं जंगली प्रकार मज्जा द्वारा बदल दिया गया था के बाद, हम Mx1/YFP माउस calvaria पर छह स्वतंत्र माइक्रोफ्रैक्चर (दो / माउस) उत्पन्न. Mx1/YFP + OSPCs चोट के बाद 14 दिनों के लिए लगाया गया है, जब हम लगातार progenitors की कम संख्या 3 दिनों से चोट स्थल पर पाया गया कि मनाया. संख्या लगातार 10 दिन में शिखर आबादी तक पहुँचने और 14 दिन (चित्रा 3) द्वारा बनाए रखना, सुबह 7 से वृद्धि हुई है. हम YFP संकेत तीव्रता (इमेज प्रोसेसिंग और ImageJ कार्यक्रम के साथ विश्लेषण) को मापने के द्वारा osteoprogenitor संख्या के कैनेटीक्स मात्रा. हम हमारे दृष्टिकोण (3B चित्रा) की स्थिरता, सुझाव एक समान उत्पादन के साथ इस प्रयोग को दोहराया.

एस एस = "jove_content" के लिए: रखने together.within पृष्ठ = "हमेशा"> चित्रा 1
माउस का (सीएस) राज्याभिषेक और बाण के समान टांके (एस एस) और अनुक्रमिक intravital इमेजिंग के चौराहे के पास माउस ललाट हड्डियों पर माइक्रोफ्रैक्चर की चित्रा 1. में vivo माउस calvarial चोट की इमेजिंग. (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (बी) सर्जिकल जोखिम calvaria चोट से पहले. (सी) intravital इमेजिंग के लिए माउस calvaria पर प्रतिनिधि microfracture चोटों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP माउस का चित्रा 2. चोट स्थलों पर OSPCs के vivo ट्रैकिंग. (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (बी) के इस चित्र trigenic Mx1/Tomato की चोट स्थलों पर दिखाई देते हैं कि संभव फ्लोरोसेंट सेल आबादी दिखाता है / OCN-GFP माउस. लाल टमाटर व्यक्त MX1 + OSPCs का प्रतिनिधित्व करता है. पीले हरे पूर्व मौजूदा अस्थिकोरक (GFP +) या MX1 गैर inducible (MX1 -) से नई अस्थिकोरक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि MX1 + OSPCs से भेदभाव परिपक्व अस्थिकोरक (टमाटर + + GFP) का प्रतिनिधित्व करता है. Progenitors MX1 + OSPCs (सी) अनुक्रमिक intravital इमेजिंग और चोट स्थलों पर अस्थिकोरक. टमाटर + osteoprogenitors और Mx1/Tomato/Ocn-GFP माउस calvaria पर चोट के पास GFP + अस्थिकोरक तुरंत चोट (0 दिन) के बाद और टी में imaged किया गयावह चोट के बाद कई बार संकेत दिया. तीर MX1 + OSPCs (पीला) से व्युत्पन्न अस्थिकोरक संकेत मिलता है. ब्लू, हड्डी. डॉटेड सर्कल पूरे (एकल) अस्थिभंग साइट का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. अस्थिभंग उपचार के दौरान MX1 प्रेरित OSPCs के अनुरूप और मात्रात्मक माप. (ए) Mx1/YFP माउस calvaria पर तीन स्वतंत्र चोटों क्रमिक रूप से तुरंत चोट (0 दिन) के बाद और चोट के बाद संकेत समय पर imaged थे. (बी) मात्रात्मक MX1 + osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की माप. MX1 + OSPC के कैनेटीक्सचोट स्थलों पर विस्तार ImageJ का उपयोग YFP संकेत तीव्रता से मापा गया था. रेखांकन प्रत्येक प्रयोग में छह घायल होने की औसत के साथ दो स्वतंत्र प्रयोगों चलता है. ब्लू, हड्डी; हरे, MX1 + osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं; लाल, वाहिका संरचना (क्यू डॉट्स). स्केल सलाखों 100 माइक्रोन (ए) हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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कंकाल स्टेम कोशिकाओं का विनियमन हड्डी पुनर्जनन को प्राप्त करने के लिए बेहतर तरीकों को परिभाषित करने के लिए काफी महत्व की हो सकती है. सेलुलर स्तर पर मात्रात्मक और अनुक्रमिक इमेजिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है. माउस लंबी हड्डी फ्रैक्चर मॉडल व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और biomechanical पढ़ाई 17 के लिए उपयुक्त किया गया है, अपनी गहरी ऊतक स्थान, असमान फ्रैक्चर आकार, मुलायम ऊतकों को नुकसान, और स्थिर fixators के आवेदन अनुक्रमिक intravital इमेजिंग सीमित है. इधर, confocal / दो फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी और एक माउस calvarial फ्रैक्चर मॉडल के संयोजन से इन सीमाओं को पार करने के लिए एक विधि प्रदान की जाती है. Osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष वंश ट्रैकिंग के साथ इस दृष्टिकोण फ्रैक्चर की मरम्मत में osteogenic स्टेम / progenitors के vivo इमेजिंग में, वास्तविक समय के लिए अपनी क्षमता को दर्शाता है.

इस विधि में एक प्रमुख तकनीकी चुनौती समय के अनुरूप और उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए है. उच्च गुणवत्ता Imअधिकतम इमेजिंग गहराई के साथ उम्र फ्लोरोसेंट पत्रकारों और इमेजिंग क्षेत्र के ऊतक हालत की चमक पर निर्भर करते हैं. इसके अलावा, ऊतकों को नुकसान और photobleaching से बचने के लिए लेजर जोखिम को कम लंबी अवधि अनुक्रमिक इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है. वीडियो दर मंच का उपयोग तेजी से स्कैनिंग इस उद्देश्य के लिए उपयोगी है. देखने के एक ही क्षेत्र में पूरे चोट को कवर नहीं कर सकते, तो इस क्षेत्र फ्रैक्चर साइटों के सबसे को कवर करने के लिए असेंबल छवियों को लेने से मैप किया जा सकता है. यह z-ढेर की गुणवत्ता और पूरे इमेजिंग सत्र के दौरान अर्जित जानकारी की मात्रा के बीच समझौता करने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, कई स्लाइस (जैसे 1-2 माइक्रोन कदम) और उच्च परिभाषा के साथ Z-ढेर आगे का विश्लेषण करने के लिए आसान कर रहे हैं; हालांकि, वे लेजर प्रेरित photobleaching के एक उच्च डिग्री के लिए अग्रणी लंबी अवधि लेजर जोखिम की आवश्यकता होती है.

फ्रैक्चर की चोट के vivo इमेजिंग में अनुक्रमिक त्वचा और हड्डी सतह के दोहराव शल्य उद्घाटन जरूरी है, चूंकिcalvaria की सतह पर fibrotic निशान गठन गहरी ऊतक इमेजिंग बीच में आता है और उच्च पृष्ठभूमि पुष्पन कि पैदावार एक आम समस्या है. कुशल सिवनी तकनीक और कम से कम खून बह रहा निशान गठन को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. सामान्य में, 3-5 बार दोहराएँ इमेजिंग छवि गुणवत्ता के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना हासिल किया जा सकता है.

दोहराने इमेजिंग, अस्थिभंग आकार का आसान और सटीक नियंत्रण और मरम्मत कैनेटीक्स की स्थिरता की संभावना को देखते हुए, इस विधि अस्थिभंग उपचार, ऑस्टियोपोरोसिस, और इस तरह के कंकाल की मांसपेशी के रूप में अन्य ऊतकों के उत्थान के लिए चिकित्सकीय लक्ष्य के परीक्षण के लिए एक उचित साधन प्रदान कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पढ़ने के लिए सी. पार्क धन्यवाद. इस काम के पुरस्कार संख्या K01AR061434 और डीपी को एक लेकिमिया और लिंफोमा सोसायटी फैलोशिप अवार्ड (5127-09) के तहत NIAMS द्वारा समर्थित और सामग्री सीपीएल और डीटीएस के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान का अनुदान नहीं केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता रहा था जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

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References

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अनुक्रमिक<em&gt; में विवो</em&gt; अस्थिभंग मरम्मत के दौरान osteogenic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की इमेजिंग
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Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

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