Summary
골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.
Abstract
뼈는 지속적으로 반전 높은 재생 부상을 따르고있다. 골 형성 줄기 / 전구 세포가 오랫동안 존재하는 가설이 있지만, 이러한 세포의 생체 내 데모 최근에 달성되었습니다. 여기에, 생체 이미징 기술 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 역할 (OSPCs)과 뼈 수리에 자신의 자손을 조사하기 위해 제공됩니다. 모델과 두 개관 뼈 유도 미세 균열의의 intravital 이미징을 추적 osteo-계보 세포를 사용하여, OSPCs 직접 초기 수리 과정에서 중요한 이벤트가 발생하는 부상 후 처음 몇 일 동안 관찰 할 수있다. 상해 사이트는 순차적으로 OSPCs가 부상으로 옮겨 놓을 수가 증가하고 뼈 형성하는 조골 세포로 분화 드러내는 이미지가 될 수있다. 이러한 방법은 뼈 재생 및 수리를위한 줄기 세포의 내장과 외부의 분자 규제의 역할을 조사하는 수단을 제공합니다.
Introduction
퇴행성 뼈 질환 및 골다공증 성 골절의 위험이 높은 선도 연령과 관련된 뼈 손실은 공중 보건의 1의 주요 과제가되고있다. 뼈의 유지 보수는 뼈가 형성 조골 세포와 뼈 resorbing 파골 세포에 의해 제어된다. 뼈 형성 세포의 결함은 연령과 관련된 뼈 손실 및 퇴행성 뼈 질환 2,3의 주요 원인입니다. 광범위한 연구는 골절 치료의 개선에 집중되었지만, 안정적인 약물의 발견은 뼈 퇴행성 질병을 치료 및 골다공증 성 골절의 약점을 취소하는 것은 중요한 문제가 남는다. 따라서, 골 재생 및 수리의 골 형성 세포 및 그 제어 메커니즘의 근원을 연구하면 골격 재생을 높이고 골 손실 질환을 반전하는 신규 한 통찰력을 제공한다.
골수에있는 다 능성 간엽 세포의 존재는 클론 원성 개체군의 식별에 기초하여 제안되었다 수 있었고 상이한골 형성에 늦었, 지방 형성과 연골 계보는 생체 4. 최근, 여러 연구는 골격 / 중간 엽 줄기 세포 (SSC가 / 엽 줄기 세포)는 조골 세포의 자연적인 원천 및 골 교체, 개조, 및 파괴 수리 5,6에 중요한 것으로보고있다 . 또한, 우리의 혈통 추적 연구는 성숙한 조골 세포가 예기치 않게 짧은 반감기 (~ 60 일)이 지속적으로 정상 항상성과 골절 수리 조건 6 모두 자신의 줄기 / 전구 세포에 의해 보충되는 것으로 나타났다. 그러나, 생체 내 줄기 세포의 정체성과 어떻게 이러한 세포는 부상 골절과 뼈 형성 세포가 불분명 공급하는 반응. 따라서, 생리적 상황에서 이주, 증식 및 내인성 개의 SSC / 엽 줄기 세포의 분화를 분석 할 수있는 방법을 개발하는 것이 중요하다.
골절 수리 복잡한의 배열에 의해 규제 다세포과 역동적 인 과정이다사이토 카인과 성장 7 요인. 골절 연구에 가장 인기있는 방법은 긴 뼈 골절 동물 모델을 사용하여 뼈 절편 및 면역 형광 기법 8-10로 뼈를 분석하는 것이다. 이 복구 프로세스는 마이크로 - CT (11), 근적외선 형광 (12) 및 화학 발광 영상 (13)을 포함하여 다수의 영상 기술로 모니터링 할 수있다. 그러나 각 기술은 특정 제한 사항이 생체 내에서 세포 수준에서 SSC가 / MSC 기능을 모니터링하는 효과적인 방법이 없었다. 최근에, 공 초점 / 이광자의 intravital 현미경이 개발 및 동물에게 14 리빙 심지어 단일 셀 해상도 그들의 골수 미세 환경의 컨텍스트에서 이식 된 암세포 및 조혈 줄기 세포를 검출하기 위해 사용되어왔다. 계보 추적 모델 시리즈 기술을 결합함으로써, 우리는 골 형성 줄기 / 전구 세포는 유전자 변이 (AC)에 의해 표시 될 수 있음을 정의 할 수 있었다믹소 바이러스 저항 -1 (MX1) 발기인 및 MX1 유도 조상의 tivation 시간이 지남에 성숙한 조골 세포의 대부분을 유지할 수 있지만, 성인 마우스 (6)에 연골 세포의 생성에 참여하지 않습니다. 또, MX1-표지 OSPCs은 골절 치료 6 새로운 골아 세포의 대부분을 공급하는 것을 보여 주었다.
여기에, osteo-혈통 추적 모델과의 intravital 현미경을 사용하여, 프로토콜은 골절 수리 MX1 + 골 형성 줄기 / 전구 세포의 생체 역학을 정의하기 위해 제공됩니다. 이 프로토콜은 골절 사이트에 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이전 및 초기 수리 과정에서 osteoprogenitor 확장의 정량적 측정을 추적하기 위해 순차적으로 영상을 제공합니다. 이 접근법은 골 수선을 향상시키는 치료 후보의 평가를 포함한 여러 상황에서 유용 할 수있다.
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Protocol
1. 마우스 및 전처리
참고 : 모든 마우스는 무균 상태로 유지하고, 모든 프로토콜은 매사 추세 츠 종합 병원에서 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 모든 수술은 오토 클레이브 멸균 장비를 사용하여 무균 조건 하에서 수행되어야한다. MX1-크레 15 Rosa26는 -에 loxP 스톱에 loxP - EYFP (로사 - YFP), 및 Rosa26 -에 loxP는 스톱에 loxP-tdTomato (로사 토마토)이었다 잭슨 연구소에서 구입. 오스테오칼신-GFP 마우스 박사 헨리 KRONENBERG에 의해 제공되었다. 생체 내에서 OSPC의 이동과 증식의 정량적 분석을 위해, MX1-크레 + 로사 - YFP + (단일 색상 기자) 마우스를 사용 하였다. 오스테오칼신 + 성숙한 조골 세포로 분화의 자세한 추적을 위해, 우리는 사용 trigenic MX1-크레 + 로사 - 토마토 + OCN-GFP +마우스.
- , 생체 내에서 MX1 + 세포에 라벨을 멸균 PBS 용액에 polyinosinic-polycytidylic 산 (PIPC, 2.5 ㎎ / ㎖)을 준비하고 20 MX1-크레 + 기자 마우스의 G 복강 한 번 10 일 동안 매일 200 μl를 주입합니다.
- 주민 MX1 + 조혈 세포를 제거하기 위해, 9.5 Gy의 단일 용량으로 쥐를 조사. 정맥 16 조사, 이식 야생형 골수 세포 (1 × 10 6 세포 / 마우스)의 24 시간 후. 주 : MX1 - 유도 세포가 조혈 세포 및 조혈 유래 파골, MX1 + 조혈 세포의 제거 MX1 + 조골 세포의 이미징 품질 및 정량을 개선을 포함하기 때문이다.
- 골수 이식 후 공여자 골수 세포의 성공적인 다시 채우기를 달성하기 위해 4-6주위한 동물을 모니터링한다.
2. 모준비에게 사용
- IACUC 승인 절차를 사용하여 케타민 / 자일 라진 (100 ㎎ / ㎏, 자일 라진 12 ㎎ / ㎏ 체중)의 50 μL의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 참고 : 효과 지속 시간이 케타민 / 자일 라진의 추가 투여에 의해 연장 될 수있다.
- 마우스가 완전히 발가락 및 / 또는 꼬리 핀치에 대한 응답의 부족에 의해 마취되어 있는지 확인합니다. 마우스를 마취하는 경우 (선택), 테이핑하여 코를 통해 이소 플루 란 가스 마스크를 고정합니다. 동물이 완전히 진정되어 있는지 확인하기 위해 이소 플루 란의 레벨을 조정합니다.
- 전기 트리머 또는 작은 가위를 사용하여 두피 머리를 클립. 머리 조각을 제거하고 70 % 알코올 면봉으로 노출 된 피부를 소독. 각막 탈수를 방지하기 위해 눈물 젤을 적용합니다.
3. 미세 균열 부상
- 동물이 완전히 진정되고 확인한 후, 두피의 피부를 열 수있는 하나의 역 L 자형 절개를합니다. 요약하면, 제 1의 가로 절개 (1cm 미만) starti을다른 귀 하나 귀에서 겨. 60 ° ~ 켜고 ~ 멀리 코에서 2-3mm 때까지 코를 향해 절개를 계속합니다. 주 :이 절개 묘화되는 영역 위에 흉터 조직의 형성을 최소화한다.
- 집게로 양쪽으로 잡아 당겨 피부 플랩을 분리합니다. 모두 정면 뼈와 시상 및 관상 봉합의 교차점 명확하게 노출되어야합니다.
- 모든 잔여 머리카락이 제거 될 때까지 멸균 PBS 및 멸균 거즈 또는 면봉과 부드러운 닦아로 세척하여 열린 표면을 청소합니다.
- 개관에 미세 균열을 생성하려면, 한 손으로 마우스의 머리와 다른 손으로 30 G 바늘을 개최합니다. 부드러운 압력으로 30 G 바늘의 끝 부분을 삽입하고 운동을 왜곡하여 시상 및 관상 봉합의 교차점 왼쪽 정면 뼈의 미세 구멍 (<1 mm 깊이와 ~ 0.2 mm 직경의 상처)를 확인합니다. 주의 :함으로써 bleedi 최소화 뇌로 관통 바늘을 피하기 위해 중요NG 및 조직 손상.
- 큰 바늘 (20 또는 25 G)로 전환하고 바늘 (~ 0.5 mm 직경)을 왜곡하여 구멍 구멍을 넓혀.
- 반대측 정면 뼈에 두 번째 구멍을 생성하는 단계 3.3-3.5를 반복합니다.
- 출혈이 멈출 때까지 PBS의 연속 낙하에 의한 부상 반점을 닦습니다.
주 : 골절 사이트에 출혈이 적절한 영상을 방해하고 흉터 형성을 유도 할 것이다. - 건조를 방지하기 위해 두개골에 멸균 생리 식염수 또는 2 % 토셀의 드롭을 적용합니다. 참고 : 이미지 선명도를 줄일 수있는 두개골 표면이 건조하지 않도록하십시오. 이 영역을 커버하는 젤 또는 식염수의 충분한 양을 사용하는 것이 중요하다.
4.의 intravital 이미징
- (선택 사항) 촬영하기 전에 일부 마우스는 혈관을 시각화하는 혈관 염료로 주입된다. 비 대상 Qtracker 705 80m에 희석 (50 mM의 붕산 버퍼에 2 μM 용액) 20 ㎕와 함께 복고풍 궤도 주입PBS의 L. 시약의 낭비를 최소화하기 위해 인슐린 주사기를 사용합니다. 신호가 충분히 밝지 않은 경우, 추가적인 양이 요구 될 수있다.
- 스캐너의 전원을 켭니다. 참고 : 다각형 기반의 레이저 스캐너 비디오 속도로 동시 다중 채널 이미지 수집 (초당 30 프레임)을 할 수 있습니다. 비디오 속도 스캐닝 라이브 동물 이미징을위한 매우 중요합니다.
- (: 사파이어 레이저 펨토초 티타늄) 다 광자 레이저의 전원을 켭니다. 880 nm의 파장을 설정하고 뼈의 두 번째 고조파 발생의 영상 (440 NM)의 전원을 조정합니다. GFP 및 tdTomato 여기를 들어, 491 ㎚, 561 nm의 고체 레이저의 전원을 켭니다.
- PMT 각 신호 (광전자 증 배관) 검출기를 켭니다 (두 번째 고조파 발생에 대한 435 ± 20 nm의 대역 통과 필터, GFP의 528 ± 19 nm의 대역 통과 필터 및 tdTomato 590 ± 20). (선택 사항) Qtracker보기 (705)의 신호를 검출하도록 695 ± 27.5 nm의 대역 통과 필터와 638 nm의 헬륨 - 네온 레이저 및 PMT를 사용한다.
- PLACXYZ 축 동력 현미경의 무대에서 동물을 전자. (이것은 동물 손실의 위험을 감소시킨다)의 체온을 유지할 수 있도록 전기 가열 패드를 가장 편안한 위치에 마우스를 유지한다. 촬영하는 동안 움직임을 최소화하기 위해 가능한 한 수평으로 몇 군데 지역을 유지하기 위해 마우스를 잡고 테이프를 사용합니다.
- 건조를 방지하기 위해 두개골에 따뜻한 2 % 메틸 셀룰로오즈 겔 또는 생리 식염수 용액의 방울을 적용한다. 이미징 영역에 커버 글래스를 넣어. 덮개 뼈를 스캔 (0.9 NA로 30 배 물 침지 목적) 낮은 배율의 렌즈를 사용합니다.
- XYZ 축 제어기를 사용하여 뼈 SHG 신호를 검출함으로써 덮개 뼈의 표면을 발견하고 시상 봉합과 관상 봉합의 교점으로서 중요한 랜드 마크의 위치를 식별한다. 이미지를 획득하고 XYZ 좌표를 기록한다.
- SHG 형광 신호를 관찰하여 손상의 위치를 검색하기 위해 계속합니다.
- 부상 사이트 또는 지역 오 때F 관심이 발견되어, 그 세포로부터 SHG 형광 신호를 포함하는 최적 초점 평면의 이미지를 획득. 저장 XYZ 좌표와 시상 및 관상 봉합의 교차점까지의 거리 이미징의 다음 라운드를 위해 자신의 정확한 위치를 정의 할 수 있습니다.
- 골절 부상의 3D 세포 및 뼈 구조를 수집, Z-스택으로 이미지를 기록 - 내막 뼈 표면에서 ~ 100 μm의 깊이 (5 μm의 간격). 부상의 한쪽의 촬상 종료 후, 다음 부상 사이트에 대한 촬영 처리를 반복한다.
5. 포스트 운전 설정
- 촬상 후, 두개골에서 메틸 셀룰로오스 겔을 제거 멸균 식염수로 촬상 사이트를 헹군다. 멸균 면봉을 사용하여 표면에 트리플 항생제 연고 묻혀. 피부 플랩 커버 및 수술 봉합하여 두피를 다시 닫습니다. 이것은 저자 극성 봉합사 (흡수 polyglactin 스와 함께 할 수있는진짜야)와 5-0 크기 봉합 바늘. 주의 : 좋은 봉합 기술은 흉터 형성을 최소화한다.
- / kg 부 프레 노르 핀 48 시간마다 12 시간이 수술 후 0.05 ~ 0.1 밀리그램의 IP 주입과 모든 동물을 치료. 그들은 충분한 의식을 되 찾을 때까지 따뜻한 복구 실에서 동물이 오지 않게하십시오. 3~5일 후 봉합을 다시 및 골절 치료시 세포의 변화를 추적 할의 intravital 이미징 단계를 반복합니다.
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Representative Results
안정화 된 긴 뼈의 골절 모델은 골절 연구에 인기가있다. 그러나, 긴 뼈의 골절 또는 큰 모델은 여러 조직의 손상을 야기하기 때문에, 뼈 세포 기능의 양적 측정에 제한이있다. 우리는 바늘 드릴링 (그림 1A-1C)와 두 개관 정면 뼈에 최소 침습 부상 (경막에없이 또는 최소한의 침윤 미만 mm 직경)를 개발했다. 이 뼈는 (다른 조직의 간섭없이 맑은 부상 뼈의 영상, 뼈 세포 및 혈관을 허용, 골수와 평평하고 얇은 뼈 구조를 가지고 있기 때문에 우리는 미세 균열의 생체 라이브 영상의 두 개관 정면 뼈의 평면도를 선택했다 그림 1C). 우리는이 미세 균열이 무기물 증착 및 새로운 골 형성 (데이터 미도시) 다음에 부드러운 캘러스 형성을 포함한 대규모 파괴 부상의 많은 특성을 되풀이되었습니다 것을 관찰했다.
MX1 + 골 형성 줄기 전구 세포의 생체 내 이미징 "> 연속.이 방법은 골절 치료시 특정 골 형성 세포 인구를 추적 할 수 있다면 우리는 다음 테스트는. 이전에, 우리는에 의해 trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP 듀얼 기자 마우스를 개발 Rosa26 토마토 기자와 오스테오칼신-GFP 마우스 (그림 2A)로 MX1-크레 마우스를 건너 6.이 모델의 장점은 골 형성 줄기 / 전구 세포와 성숙한 조골 세포의 차동 라벨입니다. PIPC 관리함으로써, MX1 + OSPCs 구체적으로 표시되어 있습니다 토마토 식으로, 성숙한 조골 세포가 MX1 유도 OSPCs에서 차별화 된 반면, 토마토와 GFP를 표현한다. MX1에서 그러나, 기존의 조골 세포와 성숙한 조골 세포가 아닌 유도 전구 세포 (그림 2B) 혼자 GFP를 표현한다. 조사 및 골수 교체 후, gener이 마우스의 정면 뼈에 두 개의 미세 균열을 ated. 우리는 각 골절의 영역이 우리의 30 배 목적으로보기의 단일 필드에 의해 검출 된 것을 확인했다. 미세 균열의 연속 차원의 intravital 이미징은 2 일에서 골절 5 일에서 자신의 확장의 사이트에 토마토 + OSPCs의 재배치를 보여 주었다. 없거나 탐지 GFP + 조골 세포가이 시간이 있었다. 하루에 12에서 파 단면 근처 osteoprogenitors의 일부는 조골 세포 (토마토 + GFP +)의 분화를 시작했다. 이어서, 새로운 골아 세포의 축적 및 (블루 제 고조파 발생에 의해 분석) 신생골 형성은 조골 세포 전구 세포의 이동과 증식은 골절 치료 (도 참여 새로운 골아 세포를 공급하는 주요 메커니즘 인 것을 나타내는, 21 일째 명백되었습니다 2C).골절 수리에 골 형성 줄기 / 전구 세포의 반응 속도. 테하려면세인트 우리의 방법은 골절 치료 중 osteoprogenitor 번호의 일관성 및 정량 출력을 제공하는지, 우리는 간단한 혈통 추적 모델로 Mx1/YFP 마우스를 사용하고 초기 골절 수리 MX1 + OSPCs을 추적. MX1 + 골수 세포를 야생형 골수로 대체 한 후, 우리는 Mx1/YFP 마우스의 두개골에 6 독립적 인 미세 균열 (2 개 / 마우스)를 생성합니다. Mx1/YFP + OSPCs가 부상 후 14 일 동안 추적했을 때, 우리는 지속적으로 조상의 작은 숫자은 3 일에 의해 부상 사이트에서 발견 된 것을 관찰했다. 숫자는 지속적으로 하루에 10에서 최대의 인구에 도달하는 14 일 (그림 3A)에 의해 유지, 7 일째에 증가했다. 우리는 YFP 신호 강도 (화상 처리 및 ImageJ에 프로그램으로 분석)을 측정함으로써 osteoprogenitor 번호의 속도론을 정량화. 우리는 우리의 접근 방식 (그림 3B)의 일관성을 제안, 비슷한 출력이 실험을 반복했다.
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마우스 (CS) 관상 및 시상 봉합 (SS)과 연속의 intravital 영상의 교차점 마우스 정면 뼈에 미세 균열의 그림 1. 생체 마우스 두 개관 부상의 영상. (A) 도식 표현. (B) 외과 노출 의 두개골 부상하기 전에. (C)의 intravital 이미징을위한 마우스의 두개골에 대표 미세 균열 부상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP 마우스의 그림 2. 부상 사이트에서 OSPCs의 생체 내 추적. (A) 도식 표현. (B)이 그림은 trigenic Mx1/Tomato의 부상 사이트에 표시 할 수 형광 세포 집단을 보여줍니다 / OCN-GFP 마우스. 빨간 토마토를 표현 MX1 + OSPCs를 나타냅니다. 노란색 녹색 기존의 조골 세포 (GFP의 +) 또는 MX1 비 유도 (MX1 -)의 새로운 조골 세포 나타내는 반면 MX1 + OSPCs 차별화 성숙한 조골 세포 (토마토 + GFP +)를 나타냅니다. 조상을 MX1 + OSPCs의 (C) 연속의 intravital 영상 그리고 부상 사이트에서 조골 세포. 토마토 + osteoprogenitors 및 Mx1/Tomato/Ocn-GFP 마우스의 두개골에 상해 근처 GFP + 조골 세포는 즉시 상해 (0 일) 후 t에 몇 군데 있었다그는 부상 후 시간을 표시. 화살표는 MX1 + OSPCs (노란색)에서 유래 골 모세포를 나타냅니다. 블루, 뼈. 점선은 전체 (단일) 골절 부위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 골절 치료시 MX1 유도 OSPCs의 일관되고 정량적 측정. (A) Mx1/YFP 마우스의 두개골에 세 개의 독립적 인 부상이 순차적으로 즉시 부상 (0 일) 후 부상 후 지정된 시간에 몇 군데 있었다. (B) 양 MX1 + 골 형성 줄기 / 전구 세포의 측정. MX1 + OSPC의 반응 속도손상 부위에서의 확장은 ImageJ에를 사용 YFP 신호 강도로 측정 하였다. 그래프는 각 실험에서 여섯 부상의 평균 두 개의 독립적 인 실험을 보여줍니다. 블루, 뼈; 녹색, MX1은 + 골 형성 줄기 / 전구 세포; 빨강, 혈관 (Q-점). 스케일 바는 100 μm의 (A)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
골격 줄기 세포의 조절은 골 재생을 달성하기 위해 더 나은 방법을 정의하기 위해 매우 중요 할 수있다. 세포 수준에서 정량 및 연속 촬영은 기술적으로 도전하고있다. 마우스 긴 뼈의 골절 모델이 널리 사용되는 생체 역학적 연구 (17)에 적합하였으나, 그 깊은 조직의 위치, 고르지 골절의 크기, 연부 조직 손상, 및 안정화 fixators의 응용 프로그램이 순차의 intravital 이미징을 제한했다. 여기서, 공 초점 / 이광자 현미경의 intravital 및 마우스 두 개관 골절 모델의 조합에 의해 이러한 한계를 극복하기위한 방법이 제공된다. 골 형성 줄기 / 전구 혈통 추적이 방법은 골절 수리 골 형성 줄기 / 전구 세포의 생체 내 이미징에서 실시간에 대한 능력을 보여줍니다.
이 방법에서 중요한 기술적 문제는 시간이 지남에 일관된 고품질의 화상을 얻을 수있다. 고품질 임최대 촬상 깊이와 나이는 형광성 리포터 및 이미징 영역의 조직 상태의 밝기에 의존한다. 또, 조직 손상 및 광표백을 피하기 위해 레이저 노출을 최소화하면 장기 순차 촬상을 위해 중요하다. 비디오 레이트 플랫폼을 사용하여 신속한 검사가이 목적을 위해 유용하다. 뷰의 단일 필드가 전체 부상을 커버 할 수없는 경우에, 면적은 골절 사이트의 대부분을 덮도록 몽타주 촬영에 의해 맵핑 될 수있다. 이는 Z-스택의 품질 및 전체적인 촬상 세션 중에 획득되는 정보의 양 사이에 타협하는 것이 중요하다. 예를 들어, 많은 조각 (예를 들어 1 ~ 2 μm의 단계) 및 높은 정의를 가진 Z-스택은 더 분석하기 쉽다; 그러나 이러한 레이저 유도 광표백의 높은 수준에 이르는 장기 레이저 노광을 필요로한다.
골절 부상의 생체 촬상 순차적 피부 및 뼈 표면의 반복적 인 개방 수술을 필요로, 이후덮개 뼈의 표면에 섬유 성 반흔 형성은 깊은 조직 이미징을 중단 높은 배경 개화를 산출 일반적인 문제입니다. 숙련 된 봉합 기술과 최소한의 출혈은 흉터 형성을 줄이는 것이 중요합니다. 일반적으로, 3-5 시간 반복 영상은 이미지 품질의 상당한 손실없이 달성 될 수있다.
반복 영상, 골절의 크기의 쉽고 정확한 제어 및 수리 역학의 일관성의 가능성을 감안할 때,이 방법은 골절 치료, 골다공증 등 골격 근육 등의 조직 재생을위한 치료 표적을 테스트하기위한 적절한 수단을 제공 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 금융 관심이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 원고를 읽는 C. 공원 감사합니다. 이 작품은 상 수 K01AR061434 및 DP에 백혈병과 림프종 사회 원정대 수상 (5127-09)에서 NIAMS에 의해 지원 내용은 CPL 및 DTS에 건강의 국립 연구소의 보조금을하지 전적으로 저자의 책임이며 않는 한 반드시 건강의 국립 연구소의 공식 견해를 나타냅니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
References
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