Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Последовательный doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

Количественное измерение функции костного предшественников в лечении переломов требуется технологию серийного изображений с высоким разрешением. Здесь, протоколы предназначены для использования прижизненной микроскопии и отслеживание костно-клонов, чтобы последовательно изображение и количественной оценки миграции, пролиферации и дифференцировки остеогенных эндогенных стволовых клеток / клеток-предшественников в процессе ремонта переломов костей.

Abstract

Кость переворачивается непрерывно и настоятельно регенеративная следующие травмы. Остеогенные стволовых клеток / предшественников уже давно предположили существование, но в естественных условиях демонстрации таких клеток только недавно были достигнуты. Здесь естественных условиях методы визуализации в исследовать роль эндогенных остеогенных стволовых клеток / клеток-предшественников (OSPCs) и их потомство в ремонте костной предоставляются. Использование костно-клонов клетки трассировки модели и прижизненной визуализации индуцированных микротрещин в свода черепа кости, OSPCs можно непосредственно наблюдать в течение первых нескольких дней после травмы, в которых критические события в начале процесса восстановления произойти. Сайты Травмы могут быть последовательно отображены показывая, что OSPCs переехать в травме, увеличение числа и дифференцируются в остеобласты костных формирования. Эти методы предлагают средства исследования роли стволовых клеток внутренних и внешних регуляторов молекулярной для регенерации и восстановления костей.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Дегенеративные заболевания костей и возрастная потеря костной приводит к высокому риску остеопороза переломов стала одной из основных проблем в области общественного здравоохранения 1. Обслуживание Кость контролируется, формирующие костную остеобластов и костных резорбции остеокластов. Дефекты клеток костного формирования являются основной причиной возрастной потери костной ткани и дегенеративных заболеваний костей 2,3. В то время как обширные исследования были направлены на улучшение заживления переломов, открытие надежных препаратов для лечения дегенеративных заболеваний костей и переломить слабость переломов остается важным вопросом. Таким образом, изучение источник клеток костного формирования и их механизмов контроля в регенерации и восстановления костей обеспечивает новый представление для повышения скелетных регенерацию и обратить вспять заболеваниями потери костной массы.

Существование мультипотентными мезенхимальных клеток в костном мозге была предложена на основании идентификации клоногенных населения, которые могли бы иначеИАТЭ в остеогенные, Adipogenic и хондрогенные клоны экс естественных 4. Недавно несколько исследования показали, что скелетные / мезенхимальные стволовые клетки (КСЭ / МСК) являются естественным источником остеобластов и имеют решающее значение для костной ткани, реконструкции и ремонта трещин 5,6 . Кроме того, наша линия трассировки исследование показало, что зрелые остеобласты имеют неожиданно короткий период полураспада (~ 60 дней) и постоянно пополняется за счет их стволовых клеток / клеток-предшественников как в нормальных гомеостатических и ремонт перелом условиях 6. Тем не менее, личность в естественных условиях из стволовых клеток и как такие клетки реагируют на перелом травмы и поставить клетки костного формирования неясны. Таким образом, важно разработать метод, который способен анализировать миграции, пролиферации и дифференцировки эндогенных SSCS / МСК в в физиологических условиях.

Перелом ремонт многоклеточным и динамичный процесс регулируется массив комплексацитокины и факторы роста 7. Самый популярный подход для изучения разрушения является использование животную модель с переломом долгосрочной кости и проанализировать кости, кости срезов и методов иммунофлуоресцентных 8-10. Этот процесс ремонта можно контролировать с помощью нескольких методов визуализации в том числе микро-КТ 11, ближней инфракрасной флуоресценции 12 и ХЛ изображений 13. Однако каждый метод имеет определенные ограничения и не было эффективного способа контролировать функцию КСЭ / MSC на клеточном уровне в естественных условиях. Недавно конфокальной / двухфотонного прижизненной микроскопии был разработан и используется для обнаружения трансплантированных раковых клеток и гемопоэтических стволовых клеток в контексте их микросреды костного мозга даже при разрешении одноклеточного в живых животных 14. Объединив эту технологию с серией моделей трассировки линии преемственности, мы смогли определить, что клетки остеогенной стволовых / предшественники могут быть генетически отмечен переходного переменного токативации сопротивления myxovirus -1 (Mx1) промоутер и MX1-индуцированной предшественников может поддерживать большинство зрелых остеобластов в течение долгого времени, но не участвуют в генерации хондроцитов у взрослых мышей 6. Кроме того, мы показали, что Mx1 меченные OSPCs поставлять большинство новых остеобластов в трещины исцеления 6.

Здесь, используя модели отслеживания костно-происхождение и прижизненный микроскопии, протокол обеспечивается определить Vivo кинетики в из MX1 + остеогенных стволовых клеток / клеток-предшественников в репарации переломов. Этот протокол предлагает последовательный воображение для того чтобы отслеживать перемещение остеогенных шток / предшественников в сайтах разрушения и количественное измерение расширения osteoprogenitor в начале процесса восстановления. Этот подход может быть полезен в нескольких контекстах, включая оценки терапевтических кандидатов для улучшения восстановления костей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Мыши и Предобусловливание

Примечание: Все Мышей содержали в свободных от патогенов условиях и все протоколы были одобрены уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) на Массачусетского общего госпиталя на. Все операции должны проводиться в стерильных условиях с использованием автоклавного стерильного оборудования. Mx1-Cre 15, Rosa26-LoxP-стоп-LoxP-EYFP (Rosa-YFP), и Rosa26-LoxP-стоп-LoxP-tdTomato (Rosa-Помидор), были приобретены у Jackson Laboratories. мышей Остеокальцин-GFP были предоставлены доктором Генри Кроненберга. Для количественного анализа OSPC миграции и пролиферации в естественных условиях, были использованы Mx1-Cre + Роза-YFP + (одиночный цвет-репортер) мышей. Для получения более подробной отслеживания их дифференцировки в остеокальцина + зрелые остеобласты, мы использовали тригенный Mx1-Cre + Роза-Помидор + Ocn-GFP +мышей.

  1. Чтобы пометить MX1 + клеток в живом организме, подготовить полиинозиновую-полицитидиловая кислоту (PIPC, 2,5 мг / мл) в стерильный раствор PBS и вводят 200 мкл на 20 г Mx1-Cre + репортера мыши внутрибрюшинно один раз через день в течение 10 дней.
  2. Для устранения резидентные MX1 + гемопоэтических клеток, облучать мышей с одной дозой 9,5 Гр. После 24 часов облучения трансплантации дикого типа клеток костного мозга (1x10 6 клеток / мышь) внутривенно 16. Примечание: С Mx1-индуцибельные клетки включают гемопоэтические клетки и гемопоэтические полученных остеокластов, ликвидацию MX1 + гемопоэтических клеток улучшает качество изображения и количественный анализ MX1 + остеогенных клеток.
  3. После трансплантации костного мозга, контролировать животных для четырех до шести недель для того, чтобы добиться успешного репопуляции клеток донора костного мозга.

2. Моприменению препарат

  1. Обезболить мышь внутрибрюшинной инъекцией 50 мкл кетамин / ксилазином (100 мг / кг, ксилазин 12 мг / кг веса тела) с использованием утвержденных IACUC процедуру. Примечание: Продолжительность эффекта может быть продлен на дополнительные дозы кетамина / ксилазина.
  2. Определите, если мышь полностью под наркозом в связи с отсутствием реакции на пальце ноги и / или хвоста пинчах. (Необязательно) Когда мышь находится под наркозом, обеспечить себе ИФ противогаз над носом, записывая на пленку. Отрегулируйте уровень изофлураном обеспечить животное полностью отключке.
  3. Клип волос головы с помощью электрического триммера или маленькие ножницы. Удалите фрагменты волос и стерилизовать открытые участки кожи с 70% спиртовым тампоном. Применить слезоточивый гель для предотвращения роговицы обезвоживание.

3. Микрофактуры Травма

  1. Убедившись, что животное полностью отключке, сделать один обратный Г-образный надрез, чтобы открыть кожу головы. Вкратце, сделать первый поперечный разрез (менее 1 см) ЗАПУСКнг от одного уха к другому уху. Включите ~ 60 ° и продолжают надрезать к носу, пока ~ 2-3 мм от носа. Примечание: Этот разрез минимизирует образование рубцовой ткани выше области для включения в образ.
  2. Отделите кожных лоскутов, потянув к сторонам щипцами. Оба лобные кости и пересечение сагиттальной и корональной швов должны быть четко подвергается.
  3. Очистите открытую поверхность с помощью промывки стерильной PBS и нежным вытирая стерильными марлевыми или ватными тампонами, пока все остаточные волосы не будут устранены.
  4. Для генерации микротрещины на свода черепа, держать голову мыши с одной стороны и 30 г иглу с другой стороны. Сделайте микро-прокола (~ 0,2 мм Диаметр рану <глубине 1 мм) на левой лобной кости недалеко от пересечения сагиттальной и корональной швов, вставив кончик иглы 30 G с легким нажимом и скручивания движение. Внимание: Очень важно, чтобы избежать иглу от проникновения в мозг, тем самым минимизируя bleediнг и повреждение тканей.
  5. Перейти к большей иглой (20 или 25 г) и расширить отверстие прокола, поворачивая иглу (~ диаметром 0,5 мм).
  6. Повторите шаг 3,3-3,5 генерировать второй прокол на противоположной лобной кости.
  7. Протрите раненых пятна от непрерывного падения ФСБ пока кровотечение не остановится.
    Примечание: Кровотечение на сайтах разрушения будут мешать соответствующей визуализации и вызывают образование рубцов.
  8. Нанесите каплю стерильного физиологического раствора соли или 2% Methocel на черепе, чтобы избежать высыхания. Примечание: Не дайте поверхности черепа, чтобы высохнуть, что позволит снизить четкость изображения. Важно использовать достаточное количество геля или физиологического раствора, чтобы покрыть область.

4. Прижизненной визуализации

  1. (Необязательно) Перед изображений, некоторые мыши инъецируют сосудистого красителя, чтобы визуализировать кровеносные сосуды. Введите ретро-орбитально с 20 мкл нецелевой Qtracker 705 (2 мкМ раствора в 50 мМ боратного буфера) разводили в 80 мл PBS. Используйте инсулиновый шприц, чтобы минимизировать реагента отходов. Если сигнал не достаточно яркий, дополнительные суммы могут потребоваться.
  2. Включите сканер. Примечание: Полигон основе лазерный сканер позволяет одновременно приобретение многоканального изображения в скорости видео (30 кадров в секунду). Сканирование Скорость видео очень важно для получения изображений живых животных.
  3. Включите многофотонной лазера (фемтосекундных титан-сапфирового лазера). Установите длину волны в 880 нм и регулировать мощность для генерации второй гармоники томографии (440 нм) кости. Для возбуждения GFP и tdTomato, включите 491 нм и 561 нм твердотельных лазеров.
  4. Включите ФЭУ (ФЭУ) детекторов для каждого сигнала (435 ± 20 нм полосовой фильтр для генерации второй гармоники, 528 ± 19 нм полосовой фильтр для GFP, и 590 ± 20 для tdTomato.) (Необязательно) Используйте 638 нм гелий-неоновый лазер и PMT с 695 ± 27,5 нм полосового фильтра для обнаружения Qtracker 705 сигнал.
  5. Плаце животное на XYZ-оси этапе моторизованный микроскоп. Держите мышь в наиболее удобном положении с электрическим грелку, чтобы помочь поддерживать температуру тела (это снижает риск потери животного). Используйте ленту, чтобы держать мышь, чтобы минимизировать движение во время съемки и сохранить изображаемого область в максимально горизонтальном положении.
  6. Нанесите каплю теплого 2% метилцеллюлозы гель или физиологического раствора на черепе, чтобы избежать высыхания. Поставьте покровного стекла на область изображения. Используйте низкий увеличения объектива (30x воды погружение объективную 0,9 NA) для сканирования черепа.
  7. Использование контроллера XYZ-оси, найти поверхность свода черепа по сигналу ГСП из костей и определить критическую местоположение ориентир, например, пересечении между сагиттальной швов и корональных швов. Приобретать изображение и записывать координаты XYZ.
  8. Продолжайте искать расположения травмы, наблюдая ГСП и сигналов флуоресценции.
  9. Когда сайты травмы или регион ое интерес найдены, получить изображение лучшего фокальной плоскости, содержащей SHG и флуоресценции сигналов от клеток, представляющих интерес. Сохранить XYZ координаты и расстояние до пересечения сагиттальной и корональной швов, чтобы определить их точное местоположение для следующих раундов изображений.
  10. Для сбора 3D клеточные и костных структур травмы перелома, запись изображений по Z-стеки (2 - 5 интервальных мкм) с ~ 100 мкм глубине от эндостальной поверхности кости. После завершения визуализации одной стороне травмы, повторите обработку изображения для соседних участков травмы.

5. Сообщение Операция Процедуры

  1. После обработки изображений, промыть сайт изображений с стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить метилцеллюлозы гель из черепа. Используя стерильный ватный тампон, нанесите небольшое количество тройной мазь с антибиотиком на поверхности. Обложка кожных лоскутов и вновь закрыть головы хирургическим наложения швов. Это может быть сделано с гипоаллергенным наложения швов нити (рассасывающиеся полиглактин сутуры) и 5-0 размер шва игла. Внимание: Хорошая техника наложения швов минимизирует образование рубцов.
  2. Лечить всех животных с IP инъекции 0,05-0,1 мг / кг бупренорфина каждые 12 ч в течение 48 ч после операции. Держите животных в теплом камеры восстановления, пока они не восстановить достаточную сознание. После 3 до 5 дней, снова откройте шов и повторите прижизненной шаги визуализации для отслеживания сотовый изменения во время заживления переломов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Стабилизировалась долго модель перелом кости был популярен в исследованиях разрушения. Тем не менее, длинная кость или большие модели разрушения вызвать многократное повреждение тканей и, следовательно, имеют ограничение в количественном измерении функции костных клеток. Мы разработали минимально инвазивной травмы (диаметр менее 1 мм с минимальным или вообще без вторжения в твердой мозговой оболочки) на свода черепа лобных костей с иглой бурения (1А-1С). Мы выбрали вид сверху на свода черепа лобных костей для в естественных живых изображений микротрещин, потому что это кости имеет плоскую и тонкую структуру кости с костным мозгом, что позволяет четкое изображение поврежденной кости, костные клетки и сосудистую без вмешательства других тканях ( Рисунок 1C). Мы наблюдали, что этот микроперелом повторяет многие характеристики больших травмах разрушения в том числе формирования мягкого каллуса с последующим осаждением минеральных и образования новой кости (данные не представлены).

"> Последовательный в естественных изображений MX1 клеток + остеогенный стволовых предшественников. Затем мы испытанию, если этот метод способен отслеживать конкретную остеогенный популяции клеток при лечении переломов. Ранее мы разработали тригенный Mx1/Tomato/Ocn-GFP двойного репортер мышей путем пересечения мышей Mx1-Cre с Rosa26-томатном репортера и мышей остеокальцина-GFP (рис. 2А) 6. Преимущество этой модели является дифференциалом маркировка остеогенных шток / предшественников и зрелых остеобластов. администрацией PIPC, Mx1 + OSPCs специально помечены выражением томатным, в то время как зрелые остеобласты отличается от Mx1-индуцированных OSPCs выразить Помидор и GFP. Однако предварительно существующие остеобласты и зрелые остеобласты из Mx1 неиндуцибельных предшественники выразить GFP в одиночку (рис. 2В). После замены облучения и костного мозга, мы вообще говоряованные два микротрещины на лобных костей этих мышей. Мы подтвердили, что площадь каждой трещины было обнаружено на одном поле зрения с нашим 30x цели. Последовательное 3D-прижизненной визуализации микротрещин не показал переселение Томатный + OSPCs в месте перелома в день 2 и их расширения в 5-й день. Были нет или обнаружить GFP + остеобласты в это время. На 12-й день, подмножество osteoprogenitors вблизи поверхности разрушения инициатором дифференцировку остеобластов (томат + GFP +). Впоследствии, накопление новых остеобластов и формирование новой кости (проанализированы генерации второй гармоники, синий) были очевидны на 21 день, указывая, что миграция и распространение остеогенных клеток-предшественников является основным механизмом для подачи новых остеобласты, участвующих в трещины исцеления (рис. 2C).

Кинетика остеогенных шток / предшественников в ремонт трещин. Для TEул обеспечивает ли наш метод последовательного и количественный выход номера osteoprogenitor при лечении переломов, мы использовали Mx1/YFP мышь как простой модели линия отслеживания и отслеживать MX1 + OSPCs в начале ремонта трещин. После клетки Mx1 + мозга были заменены дикого типа мозга, мы получили шесть независимых микротрещины (два / мышь) на Mx1/YFP свода черепа мыши. Когда Mx1/YFP + OSPCs отслеживались в течение 14 дней после травмы, мы последовательно заметил, что небольшое количество клеток-предшественников были обнаружены в месте повреждения на 3 дня. Цифры постоянно увеличивается на 7 день, достигнув пика населения в 10-й день и поддержания на 14 дней (рис. 3А). Мы количественно кинетики чисел osteoprogenitor путем измерения интенсивности сигнала YFP (обработка и анализ с программой ImageJ изображение). Мы повторили этот эксперимент с подобным выходом, что предполагает согласованность нашего подхода (рис. 3В).

сс = "jove_content" FO: держать-together.within-страницу = "всегда"> Рисунок 1
Рисунок 1. В естественных изображений мыши свода черепа травмы. (А) Схематическое изображение микротрещин на мыши лобных костей вблизи пересечения корональных (CS) и сагиттальной швов (ГЦБ) и последовательного прижизненной визуализации. (В) Хирургическое воздействие мыши свод черепа до травмы. (С) Представительства микрофактуры травм на своде черепа мыши для прижизненной визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

51289fig2.jpg "/>
Рисунок 2. В естественных условиях отслеживание OSPCs на участках травмы. (А) Схематическое изображение тригенный Mx1/Tomato/Ocn-GFP мыши. (В) Эта диаграмма иллюстрирует возможные населения флуоресцентные клетки, которые появляются на травмы сайтов тригенный Mx1/Tomato / Ocn-GFP мыши. Красный представляет MX1 + OSPCs выражающее Помидор. Желтый представляет зрелые остеобласты (Помидор + GFP +) отличается от Mx1 + OSPCs тогда зеленый представляет новые остеобласты из уже существующих остеобластов (GFP +) или MX1 неиндуцибельных (Mx1 -). Предшественники (С) Последовательная прижизненной визуализации Mx1 + OSPCs и остеобласты на объектах травмы. Томатный + osteoprogenitors и GFP + остеобласты вблизи травмы на Mx1/Tomato/Ocn-GFP свода черепа мыши были обследованы сразу после травмы (день 0) и в тон указал, раз после травмы. Стрелки указывают остеобласты, полученные из Mx1 + OSPCs (желтый). Синий, кости. Пунктирная окружность представляет весь (один) место перелома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Последовательное и количественное измерение Mx1-индуцированных OSPCs при лечении переломов. (А) Три независимых травм на Mx1/YFP свода черепа мыши последовательно отображены сразу после травмы (день 0) и в указанное время после травмы. (B) Количественный измерение Mx1 + остеогенных стволовых клеток / клеток-предшественников. Кинетика Mx1 + OSPCрасширение на участках травмы измерялась интенсивность YFP сигнала с использованием ImageJ. Графики показывают два независимых экспериментов с среднем шесть травм в каждом эксперименте. Синий, кости; зеленый, MX1 + остеогенные стволовых клеток / предшественников; красный, сосудистую (Q-точки). Масштабные бары 100 мкм (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Регулирование скелетных стволовых клеток может иметь большое значение для определения более совершенных методов для достижения регенерации кости. Количественный и порядковый изображений на клеточном уровне была технически сложной задачей. Хотя модель перелом длинных костей мыши широко используется и подходит для биомеханических исследований 17, его расположение глубоких тканей, неровный размер перелом, повреждение мягких тканей, а также применение стабилизирующих фиксаторов ограничили последовательный прижизненной визуализации. Здесь способ для преодоления этих ограничений на комбинации конфокальной / двухфотонного прижизненной микроскопии и свода черепа мыши модели трещины предоставляется. Такой подход с остеогенной отслеживания клонов стволовых / прародитель демонстрирует свои возможности в режиме реального времени, в естественных изображений остеогенных шток / предшественников в репарации переломов.

Основной технической проблемой в этом методе является получение последовательных и высокое качество изображения с течением времени. Высокое качество имвозраст с максимальной глубиной изображения зависит от яркости флуоресцентных репортеров и условия тканей области изображения. Кроме того, минимизируя лазерного воздействия, чтобы избежать повреждения тканей и фотообесцвечивания важно для долгосрочного последовательного изображений. Быстрое сканирование с использованием платформы Оценить видео полезно для этой цели. Если одно поле зрения не может охватить весь травмы, область может быть отображен путем принятия монтаж изображений, чтобы покрыть большинство сайтов разрушения. Важно компромисс между качеством Z-Stack и количества информации, полученной в течение всего сеанса изображения. Например, Z-стеки со многими кусочками (например, 1-2 мкм шагов) и высокой четкости легче анализировать дальше; однако, они требуют долгосрочного лазерного воздействия, ведущих к более высокой степени лазерно-индуцированной фотообесцвечивания.

Поскольку последовательный в естественных изображений травмы перелома требует повторных хирургических открытие кожи и костной поверхности,фиброзных рубцов на поверхности свода черепа является общей проблемой, что прерывает изображений глубоких тканей и дает высокий фон цветение. Опытные техники наложения швов и минимальное кровотечение имеет решающее значение для уменьшения образования рубцовой. В общем, 4:57 визуализации раз повтор может быть достигнуто без существенной потери качества изображения.

Учитывая возможность повторного изображений, легкой и точной контроля размера трещины и консистенции ремонтных кинетики, этот метод может обеспечить разумные средства для тестирования терапевтические цели для заживления переломов, остеопороза и других регенерации тканей, таких как скелетные мышцы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Мы благодарим С. парк за чтение рукописи. Эта работа была поддержана NIAMS под Award Количество K01AR061434 и лейкемии и лимфомы общества стипендий премии (5127-09) в DP и гранты Национальных Институтов Здоровья в CPL и DTS Содержание несут их авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
Последовательный<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация остеогенные стволовых / клеток-предшественников во время разрушения Ремонт
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter