Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Sekventiell doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

Kvantitativ mätning av ben progenitor funktion i frakturläkning kräver hög upplösning seriebildteknik. Här finns protokoll föreskrivs att använda intravital mikroskopi och osteo-härstamning spårning att sekventiellt bild och kvantifiera migration, proliferation och differentiering av endogena osteogena stamceller / progenitorceller i färd med att reparera benbrott.

Abstract

Bone vänder över kontinuerligt och är mycket regenerativ efter skada. Osteogena stam / föregångarceller har länge varit en hypotes att existera, men in vivo demonstration av sådana celler har först nyligen uppnåtts. Här är in vivo avbildningstekniker för att undersöka betydelsen av endogena osteogena stamceller / progenitorceller (OSPCs) och deras avkomma i ben reparation tillhandahålls. Med hjälp av osteo-härstamning cell spåra modeller och intravital avbildning av inducerade mikrosprickor i calvarial ben, kan OSPCs observeras direkt under de första dagarna efter skada, där kritiska händelser i den tidiga reparationen inträffar. Skade webbplatser kan sekventiellt avbildas avslöjar att OSPCs flytta till skadan, öka i antal och differentierar till benbildande osteoblaster. Dessa metoder är ett sätt att undersöka rollen av stamceller-inre och yttre molekylära regulatorer för benuppbyggnad och reparation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Degenerativa skelettsjukdomar och åldersrelaterad benförlust som leder till en hög risk för osteoporosfraktur har blivit en stor utmaning i folkhälso 1. Bone underhåll styrs av benbildande osteoblaster och benresorberande osteoklaster. Fel i benbildande celler är den huvudsakliga orsaken till åldersrelaterad benförlust och degenerativa bensjukdomar 2,3. Medan omfattande forskning har fokuserat på att förbättra frakturläkning, till upptäckten av tillförlitliga läkemedel bota degenerativa sjukdomar ben och att vända den svaga benskörhetsfrakturer är fortfarande en viktig fråga. Således, studera källan till benbildande celler och deras kontrollmekanismer i benuppbyggnad och reparation ger en ny insikt för att öka skelett förnyelse och vända benförlust sjukdomar.

Förekomsten av multipotenta mesenkymala celler i benmärgen har föreslagits utifrån identifieringen av klonogena populationer som kan olikasent i osteogent, adipogena och kondrogena härstamningar ex vivo 4. Nyligen, flera studier har rapporterat att skelett / mesenkymala stamceller (SSC / MSC) är en naturlig källa av osteoblaster och är avgörande för benomsättningen, ombyggnad, och fraktur reparation 5,6 . Dessutom visade vår släktlinje-spårning studie att mogna osteoblaster har ett oväntat kort halveringstid (~ 60 dagar) och kontinuerligt fyllas på av deras stam / progenitorceller i både normala homeostatiska och fraktur reparation förhållanden 6. Emellertid identiteten in vivo av stamceller och hur sådana celler reagerar till fraktur skada och leverera benbildande celler är oklara. Därför är det viktigt att utveckla en metod som kan analysera migration, proliferation och differentiering av endogena stålcentraler / MSC i under fysiologiska förhållanden.

Frakturreparation är en multi-cellulär och dynamisk process som regleras av en matris av komplexacytokiner och tillväxtfaktorer 7. Den mest populära metod för frakturstudier är att använda en djurmodell med lång benfraktur och analysera ben av ben sektione och immunofluorescerande teknik 8-10. Denna reparationsprocess kan följas av flera avbildningstekniker, inklusive mikro-CT 11, nära infraröda fluorescens 12, och kemiluminescens avbildning 13. Men varje teknik vissa begränsningar, och det har medfört några effektiva sätt att övervaka SSC / MSC-funktion på cellnivå in vivo. Nyligen har konfokala / två-foton intravital mikroskopi utvecklats och används för att upptäcka transplanterade cancerceller och hematopoetiska stamceller i samband med sin benmärg mikromiljö även vid encelliga upplösning i levande djur 14. Genom att kombinera denna teknik med en serie av härstamning spåra modeller, kunde vi fastställa att osteogena stam / progenitorceller kan genetiskt präglad av övergående acmotivation för myxovirus motstånd -1 (Mx1) promotor och Mx1-inducerad progenitorer kan bibehålla merparten av mogna osteoblaster över tid, men inte deltar i genereringen av kondrocyter i den vuxna musen 6. Dessutom visade vi att Mx1-märkta OSPCs levererar majoriteten av nya osteoblaster i frakturläkning 6.

Här, med hjälp av osteo-härstamning spårning modeller och intravital mikroskopi, är ett protokoll som att definiera vivo kinetik Mx1 + osteogena stam / progenitorceller i i fraktur reparation. Detta protokoll ger sekventiell avbildning att spåra flytten av osteogena stamceller / progenitorceller i brottplatser och kvantitativ mätning av osteoprogenitorcell expansion i början av reparationsprocessen. Detta tillvägagångssätt kan vara användbart i flera sammanhang, inklusive utvärderingen av terapeutiska kandidater för att förbättra benläkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Möss och Förkonditionering

OBS: Alla möss bibehölls i patogenfria förhållanden och alla protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Massachusetts General Hospital. All kirurgi bör utföras under sterila betingelser med hjälp av autoklav steril utrustning. Mx1-Cre 15, ROSA26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), och ROSA26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomat), var köptes från Jackson Laboratories. osteocalcin-GFP-möss tillhandahölls av Dr Henry Kronenberg. För den kvantitativa analysen av OSPC migration och proliferation in vivo, var Mx1-Cre + Rosa-YFP + (enda färg-reporter) möss användas. För mer detaljerad spårning av deras differentiering till Osteocalcinstandarder + mogna osteoblaster, använde vi trigenic Mx1-Cre + Rosa-Tomat + OCN-GFP +möss.

  1. För att märka Mx1 +-celler in vivo, förbereda polyinosinic-polycytidylsyra syra (PIPC, 2,5 mg / ml) i steril PBS-lösning och injicera 200 jil för 20 g Mx1-Cre + reporter mus intraperitonealt en gång varannan dag under 10 dagar.
  2. För att eliminera bosatta Mx1 + hematopoietiska celler bestråla-möss med en enda dos av 9,5 Gy. Efter 24 timmar av strålnings transplantation vild typ benmärgsceller (1x10 6 celler / mus) intravenöst 16. OBS: Eftersom Mx1-inducerbara celler inkluderar hematopoetiska celler och hematopoetiska-härledda osteoklaster, eliminering av Mx1 + hematopoetiska celler förbättrar bildkvaliteten och kvantifiering av Mx1 + osteogena celler.
  3. Efter benmärgstransplantation, övervaka djur för fyra till sex veckor för att uppnå en framgångsrik återplantering av donatorbenmärgsceller.

2. MoAnvänd Förberedelse

  1. Bedöva mus genom intraperitoneal injektion av 50 ul av ketamin / xylazin (100 mg / kg, xylazin 12 mg / kg kroppsvikt) under användning av en lACUC-godkända proceduren. OBS: varaktighet effekten kan förlängas med ytterligare en dos av ketamin / xylazin.
  2. Bestäm om musen är helt bedövad av bristen på respons på tå och / eller svans nypor. (Tillval) När musen är sövda, säkra en isofluran gas mask över näsan genom att tejpa. Justera nivån för isofluran för att säkerställa att djuret är helt sövd.
  3. Clip hårbotten håret med hjälp av en elektrisk trimmer eller en liten sax. Ta bort hår fragment och sterilisera exponerad hud med 70% alkoholservett. Applicera riva gel för att förhindra hornhinnan uttorkning.

3. Microfrac Injury

  1. Efter att se till att djuret är helt sövd, göra en enda omvänd L-formade snitt för att öppna hårbotten huden. I korthet gör en första tvärgående snitt (mindre än 1 cm) starting från ena örat till en annan örat. Vänd ~ 60 ° och fortsätta att incisionsfilm mot näsan tills ~ 2-3 mm från näsan. OBS: Detta snitt minimerar bildandet av ärr vävnader över området som ska avbildas.
  2. Separera flikarna huden genom att dra mot sidorna med pincett. Både pannben och skärningspunkten mellan sagittala och frontala suturer bör tydligt utsatt.
  3. Rengör den öppna ytan genom spolning med steril PBS och försiktig avtorkning med steril gasbinda eller bomullspinnar tills alla kvarvarande hårstrån elimineras.
  4. För att generera mikrosprickor på calvarium, håller musen huvudet med ena handen och en 30 G nål med en annan hand. Gör en mikro punktering (~ 0,2 mm sår diameter med <1 mm djup) på den vänstra pannbenet nära korsningen av de sagittala och koronala suturer genom att föra in spetsen på en 30 G nål med lätt tryck och vridande rörelse. Observera: Det är viktigt att undvika att nålen tränger in i hjärnan, vilket därigenom minimerar bleeding och vävnadsskada.
  5. Byt till en större nål (20 eller 25 G) och vidga punktionshålet genom att vrida nålen (~ 0,5 mm i diameter).
  6. Upprepa steg 3,3-3,5 för att generera andra punktering på den kontra pannben.
  7. Torka ur de skadade fläckarna genom kontinuerlig släppa PBS tills blödningen slutar.
    Anmärkning: Blödning på brottplatser kommer att störa lämplig bildbehandling och framkalla ärrbildning.
  8. Applicera en droppe steril fysiologisk koksaltlösning eller 2% Methocel på skallen för att undvika uttorkning. Obs: Låt inte skallen ytan torka, vilket minskar bildskärpa. Det är viktigt att använda en tillräcklig mängd av gel eller koksaltlösning för att täcka området.

4. Intravital Imaging

  1. (Valfritt) Innan avbildning, är några möss som injicerats med en vaskulär färgämne för att visualisera blodkärl. Spruta in retroorbitalt med 20 l av icke öron Qtracker 705 (2 ^ M lösning i 50 mM boratbuffert) utspätt i 80 mll PBS. Använd en spruta med insulin för att minimera reagensavfall. Om signalen inte är tillräckligt ljust, kan ytterligare mängder krävas.
  2. Slå på skannern. Anm: En polygon-baserade laserskanner tillåter samtidig flerkanals bild förvärv vid videohastighet (30 bilder per sekund). Skanning Video hastighet är mycket viktigt för levande djur avbildning.
  3. Slå på multifoton laser (femto-sekund titan: safir laser). Ställ in våglängden på 880 nm och justera strömmen för andra harmoniska generationens bildbehandling (440 nm) av benet. För GFP och tdTomato excitation, slå på 491 nm och 561 nm halvledarlasrar.
  4. Slå på PMT (fotomultiplikatorröret) detektorer för varje signal (en 435 ± 20 nm bandpassfilter för andra harmoniska generationen, en 528 ± 19 nm bandpassfilter för GFP, och 590 ± 20 för tdTomato.) (Tillval) Använd en 638 nm helium-neonlaser och en PMT med ett 695 ± 27,5 nm bandpassfilter för att detektera Qtracker 705 signal.
  5. Place djuret på en XYZ-axel motoriserade mikroskop scenen. Håll musen i det mest bekväma läget med en elektrisk värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen (detta minskar risken för att djuret förlust). Använd tejp för att hålla musen för att minimera rörelser under avbildning och för att hålla den avbildade området så horisontell som möjligt.
  6. Applicera en droppe av varm 2% metylcellulosa gel eller fysiologisk koksaltlösning på skallen för att undvika torkning. Sätt ett täckglas på bildområdet. Använd en låg förstoringslins (30x vattenimmersionsobjektiv med 0,9 NA) för att skanna calvaria.
  7. Användning av XYZ-axelstyrenheten finner ytan av calvaria genom att detektera SHG-signalen från ben och identifiera en avgörande milstolpe plats, såsom skärningen mellan de sagittala suturer och koronala suturer. Förvärva en bild och spela in XYZ koordinater.
  8. Fortsätt att söka efter platsen för skadan genom att observera SHG och fluorescens signaler.
  9. När skadeplatser eller regionen of intresse hittas, får en bild av den bästa fokalplanet innehållande SHG-och fluorescenssignaler från cellerna av intresse. Spara xyz-koordinater och avståndet till korsningen mellan de sagittala och koronala suturer att definiera exakt var för de kommande omgångarna av bildbehandling.
  10. Att samla 3D-cellulära och ben strukturer fraktur skada, spela in bilder av Z-stackar (2-5 ìm intervall) med ~ 100 ìm djup från endostala ben yta. Efter slutförandet av avbildning av en sida av skada, upprepa imaging process för nästa skadeplatser.

5. Inlägg rutiner

  1. Efter avbildning, skölj avbildningsstället med steril koksaltlösning för avlägsnande av metylcellulosa gel från skallen. Med hjälp av en steril bomullspinne, applicera en liten mängd trippel antibiotisk salva på ytan. Täck flikarna hud och åter stänga hårbotten med kirurgisk suturering. Detta kan göras med en allergitestad suturering tråd (absorber polyglactin suning) och 5-0 storlek sutur nål. Varning: Bra suturering teknik minimerar ärrbildning.
  2. Behandla alla djur med IP-injektion av 0,05 till 0,1 mg / kg buprenorfin varje 12 h under 48 h efter operation. Hålla djur i en varm återvinningskammare tills de återfår tillräcklig medvetenhet. Efter 3 till 5 dagar, öppna suturen och upprepa intravital imaging åtgärder för att spåra den cellförändringar under frakturläkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den stabiliserade lång benfraktur modellen har varit populärt i frakturstudier. Men långa ben eller stora brottmodeller orsakar flera vävnadsskada och därför har en begränsning i kvantitativ mätning av ben cellfunktion. Vi utvecklade en minimalt invasiv skada (mindre än 1 mm i diameter med minimal eller ingen invasion i dura mäter) på calvarial pannben med nål borrning (fig. 1A-1C). Vi valde en vy ovanifrån av de calvarial pannben för in vivo levande avbildning av mikrosprickor, eftersom detta ben har en platt och tunn benstruktur med benmärg, som medger tydlig avbildning av skadade ben, benceller och vaskulatur utan inblandning av andra vävnader ( Figur 1C). Vi observerade att denna mikrofraktur rekapitulerar många egenskaper hos stora frakturskador inklusive mjuk kallusbildning följt av mineralavsättning och ny benbildning (data visas ej).

"> Sekventiell in vivo avbildning av Mx1 + osteogen stam progenitorceller. Vi testade nästa om denna metod kan spåra en viss osteogen cellpopulation under frakturläkning. Tidigare utvecklade vi de trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP dubbel reporter möss genom korsar Mx1-Cre möss med ROSA26-Tomat reporter och osteocalcin-GFP möss (Figur 2A) 6. Fördelen med denna modell är differential märkning av osteogena stamceller / progenitorceller och mogna osteoblaster. Av PIPC administrering MX1 + OSPCs särskild märkning av tomat uttrycket, medan mogna osteoblaster differentierade från Mx1-inducerade OSPCs uttrycker Tomat och GFP. Men redan existerande osteoblaster och mogna osteoblaster från Mx1 icke-inducerbara stamceller uttrycker GFP ensam (Figur 2B). Efter bestrålning och benmärgsbyte, vi geneated två mikrosprickor på pannben av dessa möss. Vi bekräftade att området för varje fraktur upptäcktes av en enda synfält med vår 30x objektiv. Sekventiell 3D-intravital avbildning av mikrosprickor visade omlokalisering av tomat + OSPCs på platsen för frakturen på dag 2 och deras expansion på dag 5. Det fanns inga eller omätbara GFP + osteoblaster vid denna tid. På dag 12, en delmängd av osteoprogenitors nära brottytan initierade differentiering av osteoblaster (Tomat + GFP +). Därefter ackumuleringen av osteoblaster och bildning av nytt ben (analyserad genom andra harmoniska generationen, blå) var uppenbara på dag 21, vilket indikerar att migration och proliferation av osteogena prekursorceller är en viktig mekanism för att leverera nya osteoblaster som deltar i frakturläkning (Figur 2C).

Kinetik osteogena stamceller / progenitorceller i brott reparationer. För att test om vår metod ger en konsekvent och kvantitativ produktion av osteoprogenitorceller numren under frakturläkning, använde vi Mx1/YFP musen som en enkel härstamning-tracking modell och spårade Mx1 + OSPCs tidigt fraktur reparation. Efter Mx1 + benmärgsceller ersattes av vildtyp märg, vi genererade sex oberoende mikrosprickor (två / mus) på Mx1/YFP mus calvaria. När Mx1/YFP + OSPCs spårades under 14 dagar efter skada, konsekvent observerade vi att ett litet antal av progenitorceller detekterades vid skadestället av tre dagar. Siffrorna ökade kontinuerligt vid dag 7, och maximal befolkning på dag 10 och upprätthålla med 14 dagar (Figur 3A). Vi kvantifierade kinetiken av osteoprogenitorceller nummer genom att mäta YFP signalintensitet (bildbehandling och analys med ImageJ programmet). Vi upprepade detta experiment med en liknande utgång, vilket tyder på konsekvensen i vår strategi (Figur 3B).

ss = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "alltid"> Figur 1
Figur 1. In vivo avbildning av mus calvarial skada. (A) Schematisk bild av mikrosprickor på pannben musen nära korsningen av koronalt (CS) och sagittala suturer (SS) och sekventiell intravital avbildning. (B) Kirurgisk exponering av mus calvaria före skadan. (C) Representativa mikrofraktur skador på mus calvaria för intravital avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

51289fig2.jpg "/>
Figur 2. In vivo-spårning av OSPCs på skadeplatser. (A) Schematisk bild av trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP mus. (B) Detta diagram illustrerar möjliga fluorescerande cellpopulationer som visas på skadeplatser av trigenic Mx1/Tomato / OCN-GFP mus. Rött representerar Mx1 + OSPCs uttrycker Tomato. Gult står mogna osteoblaster (Tomat + GFP +) differentierade från Mx1 + OSPCs medan grönt representerar nya osteoblaster från redan existerande osteoblaster (GFP +) eller Mx1 icke-inducerbar (Mx1 -). Gångare (C) Sekventiell intravital avbildning av Mx1 + OSPCs och osteoblaster på skadeplatser. Tomat + osteoprogenitors och GFP + osteoblaster nära skadan på Mx1/Tomato/Ocn-GFP mouse calvaria avbildades omedelbart efter skada (dag 0) och vid tHan indikerade tider efter skada. Pilar indikerar osteoblaster härrörande från Mx1 + OSPCs (gul). Blå, ben. Den streckade cirkeln representerar hela (singel) frakturen. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Konsekvent och kvantitativ mätning av Mx1-inducerade OSPCs under frakturläkning. (A) Tre oberoende skador på Mx1/YFP mus calvaria sekventiellt avbildas direkt efter skadan (dag 0) och vid de angivna tiderna efter skada. (B) Kvantitativ mätning av Mx1 + osteogena stam / progenitorceller. Kinetiken för Mx1 + OSPCexpansion vid skadeplatser mättes med YFP signalintensitet med ImageJ. Grafer visar två oberoende experiment med medelvärdet av sex skador i varje experiment. Blå, ben; grön, Mx1 + osteogena stam / progenitorceller; rött, kärlsystemet (Q-punkter). Skala barer är 100 nm (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Regleringen av skelett stamceller kan vara av stor betydelse för att definiera bättre metoder för att uppnå benregenerering. Kvantitativ och sekventiell avbildning på cellnivå har varit en teknisk utmaning. Även musen lång benfraktur modellen har använts i stor omfattning och som lämpar sig för biomekaniska studier 17, har sitt djup vävnad läge, ojämn fraktur storlek, mjukvävnadsskada, och tillämpningen av stabiliserande fixators begränsad sekventiell intravital avbildning. Här beskrivs en metod för att övervinna dessa begränsningar genom kombinationen av konfokala / två-foton-intravital mikroskopi och en mus calvarial fraktur modell tillgänglig. Detta tillvägagångssätt med osteogent stam / progenitorceller härstamning spårning visar sin förmåga till realtid, in vivo imaging av osteogena stamceller / progenitorceller i fraktur reparation.

En stor teknisk utmaning i denna metod är att få konsekventa och högkvalitativa bilder med tiden. Hög kvalitet imåldrar med maximal bilddjupet beror på ljusstyrkan på fluorescerande reportrar och vävnaden kondition avbildningsområdet. Dessutom minimerar laserexponering för att undvika vävnadsskada och fotoblekning är viktigt för långsiktig sekventiell avbildning. Snabb scanning med hjälp av videohastigheten plattform är bra för detta ändamål. Om en och samma synfält inte kan täcka hela skadan, kan området kartläggas genom att ta montage bilder för att täcka de flesta av de brottplatser. Det är viktigt att kompromissa mellan kvalitet Z-stack och mängden information som förvärvats under hela avbildning session. Till exempel, Z-stackar med många skivor (t.ex. 1-2 ìm steg) och high definition är lättare att analysera vidare; men de kräver långvarig laserexponering som leder till en högre grad av laser-inducerad fotoblekning.

Eftersom sekventiell in vivo avbildning av frakturskada nödvändiggör upprepade kirurgiska öppningen av skinn och ben yta,fibrotisk ärrbildning på ytan av calvaria är ett vanligt problem som avbryter djup vävnad avbildning och ger höga bakgrunds blomningstid. Skickliga sutur tekniker och minimal blödning är avgörande för att minska ärrbildning. I allmänhet kan 3-5 gång upprepa avbildning uppnås utan signifikant förlust av bildkvalitet.

Med tanke på möjligheten att upprepa avbildnings, enkel och noggrann styrning av fraktur storlek och konsistensen av reparations kinetik kan denna metod ge ett rimligt sätt för testning av terapeutiska mål för frakturläkning, osteoporos, och andra vävnadsregenerering, såsom skelettmuskel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar C. Park för att läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIAMS enligt Award Antal K01AR061434 och en leukemi och lymfom Society Fellowship Award (5127-09) till DP och bidrag från National Institutes of Health till CPL och DTS Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
Sekventiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av Osteogena Stem / progenitorceller Under Fracture Repair
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter