Summary
진단 초음파 영상은 사람과 동물을 대상으로 각종 호흡기 질환을 진단하는 데 효과적 일 수있다. 우리는 구체적으로 마우스 모델에서 다이아 프램 역학을 분석하는 박사 ZUO의 실험실에 의해 이용 포괄적 인 초음파 프로토콜을 보여줍니다. 이것은 또한 마우스 호흡기 근육의 기능에 대한 정량적 인 정보를 제공 할 수있는 비 침습적 연구 기법이다.
Abstract
설치류 호흡 골격근의 기능 분석, 특히 다이어프램은 일반적 침습 수술 절차를 이용하여 근육의 스트립을 분리하여 수행된다. 이 체외 조임 활동 평가하는 효율적인 방법이지만, 비 생존 수술을 포함한다. 생체 절차와 같은 비 침습적 초음파 영상의 응용 프로그램은 희생 동물의 수를 줄일뿐만 아니라 이후 유익 아니라 살아있는 마우스에서 질병의 진행을 모니터링하기에 적합하다. 따라서, 우리의 초음파 촬상 방법은 가능성 다양한 호흡기 질환에 의해 유도 근육 손상을 완화 신규 치료법의 개발에 도움이있다. 특히, 폐색 성 폐 질환의 임상 진단에서, 초음파 영상은 격막의 근육 피로의 조기 개시를 검출하기 위해 다른 표준 시험과 함께 사용될 수있는 잠재력을 갖는다. 현재 프로토콜에서, 우리는 정확하게 다이어프램 contracti을 평가하는 방법에 대해 설명합니다진단 초음파 이미징 기술을 사용하여 마우스 모델에서의 lity.
Introduction
최근에는 초음파 영상 진단 기법은 신 혈관성 고혈압 및 췌장암 1,2의 마우스 모델에 적용되어왔다. 그러나, 이러한 기술이 널리 설치류 호흡기 근육의 기능 분석에 사용되지 않았다. 따라서, 우리는 생쥐의 다이어프램 이동성의 생체 종 평가를위한 유용한 도구로 진단 초음파 영상 방법을 개발했습니다.
진단 초음파 영상에 대한 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 비 침습적 안전 장치, 휴대용, 및 상대적으로 낮은 비용으로 3에서 실시간 측정을 허용한다. 특히, 특정 저주파 초음파 장치는 공기 폐색 심한 기류 제한 4 가벼운 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 임상 적 특징을 검출 할 수 있었다. 따라서, 진단 초음파 영상은 실시간 모니터링을 위해 쉽게 접근 할 수있는 재생 가능한 검사 방법으로 역할을 할 수있다 호흡기 질환.
진단 초음파 영상 기술은 자주 큰 동물이나 인체에 적용됩니다. 그러나, 소규모의 주제에 초음파를 수행하는 문제에 대한 가능성이 마우스 모델에서 초음파 이미징 연구, 제한된 수의가 있었다. 현재 프로토콜은 마우스에 조임 기능을 측정하기위한 새로운 절차를 설명. 조임 기능에 여러 가지 설치류 연구가되었지만 또한, 결과의 대부분은 안락사 동물 5-7에서 직접 근육 스트립을 분리하여 생성 하였다. 대조적으로, 조임 작업을 분석하는 생체 내 진단 초음파 촬상 방법을 사용하여 동물의 수는 실험에 희생 줄일 것이다. 또한, 다이아 프램의 수축력을 강화에 초점을 맞춘 장기 치료가 정확하게 동물을 희생하지 않고 설치류 모델에서 초음파를 통해 평가 될 수있다.
ntent는 "> 본 연구실에서는 구상뿐만 아니라, 생체 내에서 조임 기능의 이해에 도움이 동물 침습적 방법을 피하고, 치료제의 개발 제품 초음파 기계를 사용하여 마우스 조임 활성을 분석하기위한 효과적인 방법을 개발했다 호흡 부전에 대한 치료.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동물을 대상으로 한 모든 절차를 승인하고 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 규정 및 지침에 따라 규정 준수에 완료되었다.
1. 마우스 마취
- 수술 수건에 싸서 가열 된 등온 패드 청소 절차 테이블을 설정합니다. 가열 패드가 동물에 잠재적 인 스트레스를 줄이고 동물의 코어 온도를 안정시키기 위해 30 ° C와 34 ° C 사이에서 유지되어야한다.
- 다음의 파라미터로 마취 유도 챔버에 놓고 마우스 : 산소 유량은 1.5 L / 분으로 3.5 %로 설정하고 이소 플루 란 기화기로 설정. 완전한 진정 작용은 1 ~ 2 분 이내에 자리를 대신한다. 유도 챔버를 사용할 수없는 경우, 벨자은 이소 플루 란과 직접 동물의 접촉을 피하기 위해 하부에 위치하는 와이어 메쉬로 사용될 수있다.
- 즉시 유도 챔버에서 마우스를 제거하려면 한 번완전히 (마우스가 자발적인 운동 기능을 잃을 때 달성) 마취. 마취의 유지 보수를 위해 동물에 코 콘을 적용합니다. 산소 유량은 약 0.5 L / 분으로 감소되어야하고 이소 플루 란 기화기는 1.5-2.5 %의 범위로 설정되어야한다.
- 눈의 건조 8을 줄이기 위해 직접 각막에 안과 연고의 작은 금액을 적용합니다. 또한, 마취시, 마우스가 페달 철수 반사의 부재를 유지해야한다, 점막은 핑크 색상을 유지해야하며, 호흡이 안정 나타납니다.
2. 진단 초음파 이미징 절차 준비
- 수술 용 테이프와 같은 이동식 접착제로 가열 된 프로 시저 테이블에 마우스의 각 다리를 억제합니다.
- 전기 면도기를 사용하여 흉강까지 복부 절반 방법 사이의 복부 신체 표면에 머리를 제거합니다. 또 다시 제모 크림을 적용합니다면도칼로 절단되지 않은 나머지 머리를 이동합니다. 2 ~ 3 분 후 젖은 거즈 패드로 크림을 닦아냅니다.
- 물에 적신 거즈 패드를 사용하여 여분의 머리를 제거하고 70 % 알코올이나 방부제 동등한 면도 영역을 청소합니다. 초음파 프로브는 조리개 기능을 시각화하는이 영역에 적용한다. 국소 진통제로 인해 머리 제거에 약간의 피부 자극을 경험하는 동물에 제공 될 수있다.
3. 진단 초음파 이미징 프로토콜
- 초음파 장치의 전원을 켜고 최적의 해상도를 얻을 수 비율에 의해 장치의 출력 전력을 필요한 경우 조정합니다.
- 마우스 횡경막 수축의 적절한 시각화 수 있습니다 B (밝기) 모드, M (모션) 모드, 또는 두 가지 모두 이미징 전에, 하나에 초음파 기계를 설정합니다.
- 마우스의 상단 복부에 초음파 젤의 작은 금액을 적용하고 흉강쪽으로 젤 마사지.
- 초를 배치마음으로이 지역 상향 각도로의 변환기를 소리. 화상의 최적 해상도가 달성 될 때까지 탐침을 조정한다. 참고 :이 프로토콜에 대한, 마이크로 볼록한 배열 또는 선형 위상 배열 변환기 인해 작은 풋 프린트와 우수한 축 해상도 (9)에 사용하기에 이상적인 프로브입니다; 주파수 대역폭에 걸쳐 조정되어야하고 이러한 실험 6.5-12 MHz의 범위가 이용 될 수있다 필요로한다.
- 일시적으로 다이어프램 이미지를 저장하고 선택 수축을 볼 수 정지 버튼을 누릅니다.
- 횡격막 소풍뿐만 아니라, 호흡 속도의 이상 측정 할 수있는 영화 반복으로 기록을 저장합니다. 참고 : 이미지의 프레임이 미래 분석 9의 컴퓨터 메모리 나 외장 하드 드라이브에 저장할 수 있습니다.
- 정확하게 초음파 소프트웨어의 일부인 전자 캘리퍼스를 사용하여 수축 이완로부터 다이어프램의 움직임의 깊이를 측정한다.
- 변환시네 루프 MPEG 파일에 파일과 기록 기간 횡격막 수축의 수를 카운트하여 호흡 속도를 결정한다. 대안 적으로, 분 (호흡률) 당 수축의 수가 M-모드 영상으로부터 계산 될 수있다.
4. 포스트 마취 동물 복구
- 마우스가 완전히 1 시간 안에 마취에서 회복해야합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오.
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Representative Results
마우스 다이어프램의 일반적인 초음파 영상은 그림 1A에 표시됩니다. 마우스 조리개 최대 수직 변위를 기록했다. 이 거리를 정확하게 초음파 소프트웨어. 표 1 디스플레이 세 가지 다른 생쥐에서 횡격막 수축이 거리 측정의 일부인 전자 캘리퍼스를 사용하여 수축 이완에서 다이어프램의 움직임의 깊이를 측정하여 계산 하였다. MPEG 파일로 시네 루프 파일을 변환 한 후, 호흡률은 여섯 제 2 기록 기간 횡격막 수축의 수를 계수함으로써 결정 하였다. 이 분석은 B-모드를 사용하여 수행 될 수있다. 도 1b에 도시 된 바와 같이 대안 적으로, M-모드는 시각화 다이어프램 상하 운동의 이미지뿐만 아니라 호흡 속도를 제공한다. 이러한 결과는이 방법이 정확하게 마우스 다이어프램의 수축을 관찰하는 효과가 있음을 보여줍니다. 또한, 녹음기로 조리개 기능을 겨,이 프로토콜은 또한 격막 소풍 및 호흡 수 등의 두 가지 중요한 매개 변수를 평가 할 수 있습니다. 이 영상 법은 건강하고 병에 걸린 격막 근육 사이의 직접 비교에 유용합니다. 그러나, 그림 2는 진단 초음파 이미징을 수행 할 때 발생할 수있는 잠재적 인 이미지 아티팩트를 보여줍니다.
그림 1. A. 마우스 격막 근육 (B-모드)의 대표적인 초음파 영상. 고체 및 파선은 각각 계약을 체결하고 편안한 상태 동안 다이어프램을 묘사. B. 계약 마우스 다이어프램 (M 모드)의 대표적인 초음파 영상.PG "대상 ="_blank "는>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 가능 잔향 (A)와 혜성 꼬리 (화살표로 표시) (B) 유물의 존재와 마우스 격막 근육의 초음파 영상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1 차 측정 (mm) | 2 차 측정(mm) | 3 차 측정 (mm) | 보통 (mm) ± SD | |
| 마우스 1 | 0.96 | 0.92 | 1.06 | 0.980 ± 0.072 |
| 마우스 2 | 0.93 | 0.99 | 1.01 | 0.977 ± 0.042 |
| 마우스 3 | 0.91 | 0.93 | 0.89 | 0.910 ± 0.020 |
마우스 다이어프램 움직임 표 1. 거리 측정치. 평균화ES는 각각의 마우스에 대한 별도의 세 가지 기록 값으로부터 계산되었습니다. 표준 편차는 표준 편차로 정의된다. 동물의 분산이 다이어프램 수축 (P = 0.1224)의 측정에 큰 영향을주지 않습니다.
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Discussion
현재 실험 프로토콜은 비 침습적 생체 내 접근법을 통해 마우스 모델에서 다이어프램 액티비티 특정 진단 초음파 이미징 기술을 개발한다. 마취 장치 설정은 개별 쥐가 마취에 다르게 반응 할 수 있기 때문에 약간 각 동물에 대해 조정할 수있다 근사 값입니다. 부적당 마취 투여를 방지하기 위해, 정기적으로 심박수, 호흡 수, 체온 등 마우스의 생체 신호를 모니터링하는 것이 중요하다. 면도 머리 이미지를 흐리게 다이어프램 수축의 정확한 시각화를 방지 할 수 있기 때문에 또한, 머리는 초음파 검사 전에 제거해야합니다.
우리는 마우스 진동판의 단면 화상을 이차원 (2D)을 제공하기 위하여 B-모드 초음파 이미지를 사용하고 조임 모션 동력학을 모니터하는 M-모드를 사용했다. 때문에 프로 그것은 2D 이미지에 대한 마이크로 볼록한 배열 트랜스 듀서를 사용하는 것이 중요합니다Vides의 전통적인 선형 배열 센서 (10)에 비해 표면적있는 해부학 적 구조의 축 방향의 해상도를 개선. 이 초점 길이가 15를 확장으로서 화상의 초점이 전자가 저하주의하는 것도 중요하다. 또, 초음파 겔의 적당량은 별개의 이미지를 획득하기위한 마우스의 복부에 적용되어야한다. 겔은 피부와 높은 해상도 이미지 (11)를 생성하는 트랜스 듀서 사이의 공기 주머니의 가능성을 제한한다.
진단 초음파 영상의 응용이 유망하지만,이 기술을 연구 도구로서 사용에 제한이있다. 예를 들어, 최종 사용자가 정확하고 재현성있는 이미지를 획득하는데 잘 훈련이며 일관 조임 활동을 해석 할 수있는 것이 중요하다. 이러한 다이어프램 같은 하나 해부 구조가, 모니터에 표시 될 때 회 한층 거울상 아티팩트가 발생. 이것은 생각입니다ED 부적절 초음파 운영체제 12,13 내에 위치되는 반사 전파 이슈 및 결과. 예를 들어, 초음파 트랜스 듀서는 메인 빔 (12, 14)의 통로에없는 해부 구조를 반영 할 수있는 몇개의 축외 광선을 생성 할 수있다. 또한, 때문에 굴절에, 빔은 항상 반사 직선을 기준으로 여행 할 수 있습니다. 초음파는 트랜스 듀서에 반환 신호를 처리 할 수 있고 굴절의 타이밍을 결정할 수 있기 때문에, 모니터는 아마 다른 거리에서 두 번 같은 해부학 적 구조를 표시하고, 따라서 거울상 아티팩트를 나타낼 수있다.
발생 추가적인 전파 이슈는 잔향입니다. 이 이슈를 표시 균등 일반적으로 초음파 빔 (그림 2A) (15)에 수직으로 위치하는 평행선 간격. 이슈이 유형의 진정한 필드를 방해 할그 비전과 마스크 특정 해부학 적 구조. 데이터를 분석 할 때 따라서주의를 기울여야합니다. 잔향 유물의 일부가 혜성의 꼬리 또는 B 라인입니다. 이것들은 (도 2b에 도시 된 바와 같이) 초음파 화면 (16)의 가장자리로부터 연장되는 조임 밀도 에코의 수직 궤도를 형성 잔향 아티펙트의 유형이다. 이 유물은 거울 17 개체와 수직 접촉을 방지하기 위해 트랜스 듀서를 구부림을 최소화 할 수있는 구조와 트랜스 듀서 (13) 사이에 또는 내에서 발생하는 다중 반사에 의해 생성된다. 이러한 한계에도 불구하고, 진단 초음파 영상은 잠재적 설치류 조리개 기능 장애를 평가하고 호흡기 질환에 대한 새로운 사전 임상 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다 마우스 모델에서 조리개 기능, 안전 민감하고 신속한 분석이 가능합니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 OU 일반 기금 G110 및 생물 의학 연구 및 OSU-HRS 기금 013,000의 우수 연구 기금의 교부금에 의해 지원된다. 저자는이 원고를 준비하는 그녀의 도움 로렌 첸에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
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