Summary
诊断超声成像已经被证明是有效的诊断在人类和动物对象的各种呼吸系统疾病。我们证明了左博士的实验室用于分析膜片动力学特别是在小鼠模型进行全面的超声波协议。这也是一种非侵入性研究的技术，它可以提供对小鼠呼吸肌功能的定量信息。
Abstract
啮齿类动物呼吸骨骼肌功能分析，尤其是隔膜，通常是使用微创外科手术分离肌条执行。尽管这是评估在体外膈肌活动的一种有效的方法，它涉及非存活手术。的非侵入性超声成像作为体内过程的应用是有益的，因为它不仅降低了动物的数量处死，但也适合用于监测疾病的进展在活体小鼠。因此，我们的超声成像方法可能会有助于新型疗法，缓解肌肉损伤引起的各种呼吸系统疾病的发展。特别地，在阻塞性肺疾病的临床诊断，超声成像具有与其它标准测试结合使用，以检测早期发作的隔膜肌肉疲劳的可能性。在目前的协议中，我们描述了如何准确地评估隔膜contracti利蒂在使用诊断超声成像技术的小鼠模型。
Introduction
最近，诊断超声成像技术已被应用到的肾血管性高血压和胰腺癌1,2小鼠模型。然而，这些技术还没有被广泛应用在啮齿动物呼吸肌功能测定法。因此，我们开发了一个诊断超声成像方法作为隔膜的流动性在小鼠体内纵向评估的重要工具。
有几个优点诊断超声成像。例如，它是无创的，安全，便携，并允许以相对低的成本3的实时测量。特别是，某些低频超声设备能够探测到空气滞留，慢性阻塞性肺疾病（COPD）与轻度至重度的气流受限4的临床特征。因此，诊断超声成像可作为实时监控的方便和可重复性的检查方法呼吸系统疾病。
诊断超声成像技术经常被应用到更大的动物或人体实验对象。然而，一直在小鼠模型超声成像的研究，这可能是由于在小规模的主题进行超声波挑战的数量有限。当前协议概括了一种新颖的方法，用于测量膜片功能的鼠标。此外，虽然有过对膈肌功能几个啮齿动物的研究，大多数结果是通过直接从动物安乐死5-7隔离肌条产生。与此相反，使用体内诊断超声成像的方法，用于分析隔膜的活性会降低牺牲用于实验动物的数量。此外，围绕提升隔膜收缩，长期治疗可准确地通过超声在啮齿类动物模型评估在不牺牲动物。
ntent“>在我们的实验室，我们已经开发了一种有效的方法用于可视化以及使用超声波机，这有助于膈肌功能的理解在体内 ，避免了侵入性的方法，以动物，并协助治疗的发展分析小鼠膈肌活动治疗呼吸功能障碍。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有涉及动物受试者的程序获得批准，并按照和遵守美国俄亥俄州立大学实验动物管理和使用委员会（IACUC）规例及指引完成。
1，鼠标麻醉
- 建立一个干净的过程表与等温加热垫裹在手术巾。加热垫应保持在30℃和34℃下，以稳定动物的核心温度，同时降低潜在的应力的动物。
- 把鼠标在麻醉诱导室使用以下参数：氧流量为1.5升/分钟和异氟烷蒸发器设定为3.5％。完整的镇静应该采取在1-2分钟的地方。如果一个感应腔不可用，钟罩可以用于金属丝网安置在底部，以避免与异氟醚直接接触动物。
- 立即从感应室移开鼠标，一旦它完全麻醉（实现当鼠标自愿丧失运动功能）。应用鼻锥的动物进行麻醉维持。氧流量应减少到约0.5升/分钟和异氟烷蒸发器应为1.5〜2.5％的范围内进行设定。
- 取少量眼药膏直接到眼角膜，以减轻眼睛干燥8。另外，在麻醉过程中，鼠标应保持无踏板屈腿反射时，粘膜应保持一个粉红色的颜色，呼吸应该会出现稳定。
2，准备诊断超声波扫描程序
- 抑制小鼠的每个腿在加热过程表具有一个可移动的粘合剂，如外科胶带。
- 使用电动剃须刀，去除腹部和半山腰胸腔之间的腹面体表的毛发。申请脱毛膏进一步再将剩余的头发不被剃刀切割。擦掉霜后2-3分钟潮湿的纱布垫。
- 用微湿的纱布垫去除多余的毛发，并用70％酒精或同等防腐清洁剃光区域。超声波探头将被应用到该区域的可视化隔膜的功能。局部用镇痛药可被提供给动物经历轻微的皮肤刺激因脱毛。
3，诊断超声成像协议
- 把超声设备上，并通过百分比调整输出功率（如果需要）上的装置，以获得最佳的分辨率。
- 超声设备设置为B（亮度）模式，M（运动）模式，或两者之前成像，其允许鼠标隔膜收缩适当的可视化。
- 取少量超声波凝胶对鼠标的上腹部按摩对胸腔凝胶。
- 把超在这方面，向上的角度向对方的心脏声换能器。调节探头，直到图像的一个优化的分辨率实现的。注：此协议，微凸阵或线相控阵换能器是一种理想的探头使用，由于占地面积小和优良的轴向分辨率9;频率需要跨越带宽进行调整，并为这些实验的范围6.5-12兆赫可以使用。
- 按FREEZE按钮临时保存隔膜图像并查看所选择的收缩。
- 保存的记录作为电影回放，这使得购买膈肌偏移以及呼吸速率的测量。注：图像的帧可以保存在计算机存储器或外部硬盘驱动器上，供日后分析9。
- 精确测量膜片运动从松弛的深度使用电子卡尺是超声波软件的一部分收缩。
- 转换电影回放文件转换为MPEG文件，并在记录期间计数膈肌收缩的次数决定了呼吸速率。可替代地，每分钟（呼吸率）收缩的数目可以从M模式图像计数。
4，麻醉后动物恢复
- 鼠标应该完全从麻醉1小时内恢复。不要让动物无人看管，直到它已恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。
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Representative Results
鼠标膜片的一个典型的超声波图像显示在图1A中 。鼠标膜片最大垂直位移记录。这个距离计算通过使用电子卡尺是超声波软件。 表1显示从三个不同的小鼠膈肌收缩这些距离测量的一部分精确测量膜片运动的深度放松收缩。在电影回放的文件转换成MPEG文件后，呼吸速率是由在一个六第二记录期间计数膈收缩的数目来确定。该分析可以使用B模式来执行。或者，M-模式提供的隔膜的垂直运动的可视化图像以及呼吸速率， 如图1B所示 。这些结果表明，该方法是有效的准确观察小鼠隔膜收缩。此外，通过recordi纳克膈肌功能，该协议还允许评估的两个重要参数，包括隔膜偏移和呼吸速率。该成像方法是一种用于健康和患病膈肌之间的直接比较是有用的。然而， 图2演示了在执行诊断超声成像时可能出现的潜在成像伪影。
图1：A的小鼠膈肌（B型）的一位代表超声图像。的实线和虚线期间收缩和松弛状态中描绘的隔膜，分别乙 。承包鼠标膜片（M-模式）的一位代表超声图像。PG“目标=”_blank“>请点击这里查看此图的放大版本。
图2的鼠标膈肌可能的混响（A）和彗星尾（B）文物（箭头所指）的存在下超声图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 第一尺寸（mm） | 第二次测量（毫米） | 3 次测量（毫米） | 中评（毫米）±标准差 | |
| 鼠标1 | 0.96 | 0.92 | 1.06 | 0.980±0.072 |
| 2鼠标 | 0.93 | 0.99 | 1.01 | 0.977±0.042 |
| 鼠标3 | 0.91 | 0.93 | 0.89 | 0.910±0.020 |
鼠标移动隔膜表1。距离测量。求均值ES计算从三个独立的记录的值对每个个别小鼠。标准偏差被定义为SD。请注意，动物方差对膈肌的收缩性（P = 0.1224）的计量并无显著作用。
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Discussion
当前的实验方案开发专用于在小鼠模型中的活动隔膜诊断超声成像技术通过非侵入式体内的方法。麻醉装置的设置是近似值，其可以稍微调整每个动物自小鼠个体可能对麻醉的反应不同。为了防止不当的麻醉管理，定期监察鼠标的生命体征，包括心脏速率，呼吸速率，体温是很重要的。此外，头发之前必须超声波扫描被删除，因为未刮脸的头发可能会模糊的图像，并防止隔膜收缩的准确可视化。
我们用B-模式超声波成像提供一种二维（2D）鼠标隔膜的横截面图像，并使用M-模式来监测隔膜运动动力学。使用一个微型凸阵换能器的二维图像是非常重要的，因为它的亲完善志愿组织位于表面解剖结构的轴向分辨率比传统的线性阵列换能器10。同样重要的是要注意，电子聚焦的图像的劣化的焦距延长9。此外，超声凝胶足够量的，应适用于该小鼠的腹部，用于获取鲜明的图像。将凝胶限制了皮肤和换能器，以产生一个高分辨率图像11之间的气泡的可能性。
虽然诊断超声成像的应用是有前途的，有限制使用这种技术作为一种研究工具。例如，最终用户是训练有素获得准确和可重复的图像，并能始终如一地解释膜片活动是至关重要的。此外，当一个人的解剖结构，如膜片，被显示在监视器上两次反射镜的图像伪像发生。这是考虑编辑传播工件并产生反射位于所述超声操作系统12,13内不正常。例如，超声换能器可以产生多个离轴光束可 以反射离开的解剖结构，它是不是在主梁12,14的通路。此外，由于折射，光束可能不总是在从所述反射器直线移动。由于超声只能处理被返回到换能器的信号，并不能确定折射的定时时，显示器可能会在不同的距离显示相同的解剖结构的两倍，因而表现出的镜像工件。
遇到了一个额外的传输神器是混响。此工件显示器均匀间隔是通常位于垂直于超声波束（ 图2A）15平行线。这种类型的神器可能破坏的真实场感兴趣的愿景和屏蔽特定解剖结构。因此，应谨慎分析数据时服用。混响神器的一个子集是彗星的尾巴或B线。这些是形成致密的回波的垂直轨迹，从隔膜延伸到超声波屏幕16的边缘（ 如图2B所示 ），一种类型的混响伪像的。这些工件由所之间或之内的结构和换能器13，这可以通过钓鱼换能器，以避免与垂直接触镜面物体17被最小化发生的多次反射产生的。尽管有这些限制，诊断超声成像可使膈肌功能的安全，敏感和快速分析的小鼠模型，这有可能评价灭鼠隔膜功能障碍，并帮助开发新的临床前治疗的呼吸系统疾病。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由欧普通基金G110和生物医学研究和OSU-HRS基金013000的卓越研究基金的资助。作者要感谢陈劳伦为她协助编制本手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
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