Summary
Diagnostisk ultralyd imaging har vist sig at være effektiv til at diagnosticere forskellige respiratoriske sygdomme i mennesker og dyr. Vi demonstrerer en omfattende ultralyd protokol anvendes af Dr. Zuo laboratorium til at analysere membran kinetik specifikt i musemodeller. Dette er også en non-invasiv forskning teknik, der kan give kvantitative oplysninger om mus respiratoriske muskelfunktion.
Abstract
Funktion analyse af gnaver respiratoriske skeletmuskulatur, især membran, udføres almindeligvis ved at isolere muskel strimler ved hjælp af invasive kirurgiske procedurer. Selv om dette er en effektiv metode til vurdering af in vitro-membran aktivitet, er det ikke drejer overlevelse kirurgi. Anvendelsen af ikke-invasiv ultralydsscanning som en in vivo metode er fordelagtig, da det ikke alene reducerer antallet af dyr aflivet, men er også egnet til overvågning af sygdomsudvikling i levende mus. Således kan vores ultralydsscanning metode sandsynligvis bidrage til udviklingen af nye behandlingsformer, der lindrer muskel skade induceret af forskellige luftvejssygdomme. Især i kliniske diagnoser af obstruktive lungesygdomme, ultralydsscanning har potentialet til at blive anvendt sammen med andre standard tests til påvisning af tidlig indtræden af membranen muskeltræthed. I den nuværende protokol, beskriver vi, hvordan man præcist vurdere membran contractiheden i en musemodel ved hjælp af en diagnostisk ultralyd billeddannelse teknik.
Introduction
For nylig har diagnostisk ultralyd billeddannende teknikker blevet anvendt til musemodeller af renovaskulær hypertension og bugspytkirtelkræft 1,2. Men disse teknikker ikke har været udbredt i gnaver respiratorisk muskelfunktion assay. Derfor har vi udviklet en diagnostisk ultralydsscanning metode som et værdifuldt værktøj til in vivo langsgående vurderinger af mellemgulvet mobilitet i mus.
Der er flere fordele ved at diagnostisk ultralyd scanning. For eksempel er non-invasiv, sikker, bærbare, og giver mulighed for tidstro målinger ved en relativt lav pris 3. Især var visse lavfrekvente ultralyd-enheder i stand til at detektere luft fældefangst, en klinisk karakteristisk for kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) med mild til svær luftstrøm 4. Således kan diagnostisk ultralyd scanning tjene som en lettilgængelig og reproducerbar screeningsmetode til real-time overvågning af luftvejslidelser.
Diagnostisk ultralyd imaging teknikker der ofte anvendes til større dyr eller mennesker. Der har dog været et begrænset antal ultralyd billeddiagnostiske undersøgelser på musemodeller, hvilket sandsynligvis skyldes de udfordringer, der udfører ultralyd på små emner. Den nuværende protokol skitserer en ny procedure for måling membran funktion i mus. Desuden, selv om der har været flere gnavere på membranen funktion, de fleste af de resultater, blev genereret ved isolering af muskel strimler direkte fra aflivet dyr 5-7. Derimod vil anvendelse af en in vivo-diagnostisk ultralydsbilleddannelse metode til at analysere membran aktivitet formindske antallet af dyr ofret for eksperimenter. Endvidere kan langvarige behandlinger med fokus på at øge membran kontraktilitet nøjagtigt vurderet via ultralyd i gnavermodeller uden at ofre dyr.
ntent "> I vores laboratorium har vi udviklet en effektiv metode til at visualisere samt analysere mus mellemgulvet aktivitet ved hjælp af en ultralyd maskine, som hjælper forståelsen af mellemgulvet funktion in vivo, undgår invasive metoder til dyr, og hjælpemidler i udviklingen af terapeutiske behandlinger for respiratorisk dysfunktion.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr emner blev godkendt og udfyldt i overensstemmelse og overholdelse af The Ohio State University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og retningslinjer.
1.. Mouse Anæstesi
- Oprette en ren procedure bord med en opvarmet, temperaturreguleret pad svøbt i et kirurgisk håndklæde. Varmepuden bør holdes mellem 30 ° C og 34 ° C for at stabilisere dyret kernetemperatur samtidig reducere potentiel stress for dyret.
- Anbring musen i et narkosemiddel kammer med følgende parametre: oxygenstrømningshastighed sat til 1,5 l / min, og isofluran fordamper sat til 3,5%. Komplet sedation bør finde sted inden 1-2 min. Hvis en induktion kammer ikke er tilgængelig, kan en glasklokke anvendes med et trådnet anbragt ved bunden for at undgå direkte dyr kontakt med isofluran.
- Fjern øjeblikkeligt musen fra induktion kammeret, når deter helt bedøvet (opnås, når musen mister frivillig motorisk). Anvend en næse-kegle til dyret til vedligeholdelse af anæstesi. Den ilt flow bør reduceres til cirka 0,5 l / min og isofluran fordamper skal indstilles inden for området 1,5 til 2,5%.
- Anvende en lille mængde af ophthalmisk salve direkte til hornhinder at reducere tørhed øje 8. Hertil kommer, under anæstesi bør musen opretholde et fravær af tilbagetrækning pedal refleks bør slimhinderne forblive en lyserød farve, og åndedrættet skal vises konstant.
2.. Forberedelse til Diagnostic Ultralydbilleddannelse Procedure
- Holde hvert ben af musen på den opvarmede procedure bordet med et aftageligt klæbemiddel, såsom kirurgisk tape.
- Ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, fjerne hår på den ventrale kroppens overflade mellem maven og halvvejs op brysthulen. Påfør hårfjerning creme til yderligere reflytte de resterende hår, der ikke er skåret af barbermaskine. Tør creme med en fugtig gaze efter 2-3 min.
- Fjern den overskydende hår ved hjælp af en vand-gaze pad og rense barberede område med 70% alkohol eller tilsvarende antiseptisk. Ultralydsonden vil blive anvendt til dette område til at visualisere membran funktion. Et aktuelt smertestillende kan gives til dyr, der oplever mindre hudirritation grundet hårfjerning.
3.. Diagnostic Ultralydbilleddannelse Protocol
- Tænd ultralydsanordningen og justere udgangseffekten (om nødvendigt) på apparatet i procent for at opnå optimal opløsning.
- Indstil ultralyd maskine til enten B (lysstyrke)-tilstand, M (bevægelse)-mode, eller både før billeddannelse, der giver mulighed for korrekt visualisering af muse membran sammentrækning.
- Anvende en lille mængde af ultralyd gel på musens øvre del af maven og massere gelen mod brysthulen.
- Placer ultralydtransduceren på dette område og vinkel det opad mod hjertet. Juster sonde indtil en optimeret opløsning af billedet er opnået. Bemærk: For denne protokol, en mikro-konveks matrix eller lineær fasede transducer er en ideel sonde til at bruge på grund af den lille fodaftryk og fremragende aksial opløsning 9; frekvensen skal justeres over båndbredden og til disse eksperimenter en række 6,5-12 MHz kan anvendes.
- Tryk på fryse-knappen for at midlertidigt at gemme mellemgulvet billederne og se de udvalgte sammentrækninger.
- Gemme optagelsen som en cine løkke, som giver mulighed for senere målinger af diafragma udflugt samt respirationsraten. Bemærk: rammer af billeder kan gemmes i computerens hukommelse eller på en ekstern harddisk til fremtidig analyse 9.
- Præcist at måle dybden af mellemgulvet bevægelse fra afslapning til sammentrækning ved hjælp af de elektroniske calipre, der er en del af ultralyd software.
- Konvertercine loop fil i en MPEG-fil, og bestemme respirationsraten ved at tælle antallet af diafragma sammentrækninger under indspilningen periode. Alternativt kan antallet af sammentrækninger per minut (respirationsfrekvens) regnes fra M-mode billede.
4.. Indlæg Anæstesi Animal Recovery
- Musen skal helt komme fra anæstesi inden for 1 time. Lad ikke dyret uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk ultralyd billede af en mus membran er vist i figur 1A. Musen membran maksimal lodret forskydning blev registreret. Denne afstand blev beregnet ved nøjagtigt at måle dybden af mellemgulvet bevægelse fra afslapning til sammentrækning ved hjælp af de elektroniske calipre, der er en del af ultralyd software. Tabel 1 viser disse målinger af diafragma sammentrækninger fra tre forskellige mus distance. Efter konvertering af cine loop fil i en MPEG-fil, blev respirationsraten bestemmes ved at tælle antallet af diafragma sammentrækninger i løbet af en seks anden optagelse periode. Denne analyse kan udføres ved hjælp af B-mode. Alternativt M-tilstand giver en visualiseret billede af membranen lodret bevægelse samt respirationsraten som vist i figur 1B. Disse resultater viser, at denne metode er effektiv til præcist at observere mus membraner sammentrækninger. Desuden ved recordi ng membran funktion, denne protokol giver også mulighed for at vurdere to vigtige parametre, herunder mellemgulvet udflugt og respiration sats. Denne billeddannelse metode er nyttig for direkte sammenligning mellem sunde og syge membran muskel. Men Figur 2 viser de potentielle imaging artefakter, der kan opstå ved udførelse af diagnostisk ultralyd-billeddannelse.
Figur 1. A. En repræsentativ ultralyd billede af en mus membran muskel (B-tilstand). De massive og stiplede linjer skildrer mellemgulvet under kontraherede og afslappet stater, hhv. B. Et repræsentativt ultralyd billede af en ordregivende mus membran (M-mode).pg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. En ultralyd billede af mus mellemgulvet muskler med tilstedeværelsen af mulige efterklang (A) og komet-hale (B) artefakter (angivet med pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
| 1. måling (mm) | 2. måling(Mm) | 3. måling (mm) | Gennemsnit (mm) ± SD | |
| Mus 1 | 0,96 | 0,92 | 1.06 | 0,980 ± 0,072 |
| Mouse 2 | 0,93 | 0.99 | 1.01 | 0,977 ± 0,042 |
| Mouse 3 | 0.91 | 0,93 | 0,89 | 0,910 ± 0,020 |
Tabel 1. Afstandsmålinger af muse membran bevægelse. Averages blev beregnet ud fra tre separate registrerede værdier for hver enkelt mus. Standardafvigelse er defineret som SD. Bemærk, dyr varians har ingen væsentlig effekt på målingen af membranventiler sammentrækninger (P = 0,1224).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende forsøgsprotokol udvikler diagnostisk ultralyd billeddannende teknikker specifikke for membranen aktivitet i en musemodel via en non-invasiv, in vivo-fremgangsmåde. Anæstesi apparater indstillinger er tilnærmede værdier, der kan være lettere justeret for hvert dyr da individuel mus kan reagere forskelligt på anæstesi. For at forhindre forkert anæstesi administration, er det vigtigt regelmæssigt at overvåge musens livstegn, herunder puls, respirationsfrekvens, og kropstemperaturen. Desuden skal hår fjernes inden ultralydsscanning fordi unshaved hår kan sløre billedet og forhindre præcis visualisering af mellemgulvet sammentrækninger.
Vi anvendte B-mode ultralydsscanning for at tilvejebringe en todimensional (2D) tværsnit billede af muse membran og anvendes M-mode til at overvåge membran bevægelse kinetik. Det er vigtigt at anvende en mikro-konveks transducer for 2D-billeder, fordi det probestemmer forbedret aksial opløsning af overfladisk beliggende anatomiske strukturer i forhold til traditionelle lineære system transducere 10. Det er også vigtigt at bemærke, at elektronisk fokusering af billedet nedbrydes som brændvidden forlænges 9. Desuden bør anvendes en passende mængde af ultralyd gel til musens mave for at erhverve forskellige billeder. Gelen begrænser muligheden for luftlommer mellem huden og transduceren til at frembringe en høj opløsning 11.
Selvom anvendelse af diagnostisk ultralyd imaging er lovende, der er begrænsninger for at bruge denne teknik som et forsknings-værktøj. For eksempel er det afgørende, at slutbrugeren er veluddannede i at få nøjagtige og reproducerbare billeder, og er i stand til at fortolke mellemgulvet aktivitet konsekvent. Desuden spejl billedfejl opstår, når en anatomisk struktur, såsom mellemgulvet, vises to gange på skærmen. Dette er overvejeed en formering artefakt og resultater i de overvejelser der sker uretmæssige beliggende i ultralyddriftssystem 12,13. For eksempel kan ultralydstransducere producere flere off-axis bjælker, der kan afspejle off en anatomisk struktur, som ikke er i vejen for fjernlys 12,14. Desuden, på grund af brydning, strålen ikke altid i en lige linje fra reflektoren. Da ultralyd kun kan behandle det signal, der er vendt tilbage til transduceren og kan ikke bestemme timingen af brydning, kan skærmen sandsynligvis vise den samme anatomiske struktur to gange på forskellige afstande og dermed udstille et spejlbillede artefakt.
En yderligere formering artefakt, der er stødt på, er efterklangstiden. Dette artefakt viser jævnt fordelt parallelle linjer, der generelt placeret vinkelret på ultralydbølgen (figur 2A) 15. Denne type artefakt kan forstyrre en sand områdevision og maske specifikke anatomiske strukturer af interesse. Derfor bør der udvises forsigtighed, når man analyserer data. En delmængde af efterklang artefakt er kometen-hale-eller B-linjer. Dette er en type efterklang artefakt, der danner en lodret bane af tætte ekkoer, der strækker sig fra membranen til kanten af ultralyd skærmen 16 (som illustreret i figur 2B). Disse artefakter er produceret af flere refleksioner, der opstår mellem eller inden for en struktur og transduceren 13, som kan minimeres ved at vinkle transduceren for at undgå en vinkelret kontakt med spejlende objekter 17. På trods af disse begrænsninger, diagnostisk ultralyd scanning muliggør en sikker, følsom og hurtig analyse af membran funktion i en musemodel, som potentielt kan evaluere gnaver membran dysfunktion og bidrage til at udvikle nye prækliniske behandlinger for luftvejslidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af tilskud fra OU General Fund G110 og forskning Excellence Fund of Biomedical Research og OSU-HRS Fund 013 tusind. Forfatterne vil gerne takke Lauren Chen for hendes assistance i udarbejdelsen af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8 (2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J. Artifacts in ultrasound imaging. Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6 (2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
